DE112012005960T5

DE112012005960T5 - Softwaredefiniertes Mikroskop

Info

Publication number: DE112012005960T5
Application number: DE112012005960.3T
Authority: DE
Inventors: Manuel c/o Agilent Technologies Inc. Moertelmaier; Michael c/o Agilent Technologies Inc. Dieudonne
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2012-02-29
Filing date: 2012-02-29
Publication date: 2014-11-06
Also published as: WO2013130077A1; JP2015510150A; JP6061958B2

Abstract

Es wird ein Mikroskop offenbart, das einen ersten Beleuchtungs-Licht-Raum-Modulator (Beleuchtungs-SLM) aufweist, der Licht einer ersten Wellenlänge von einer Beleuchtungsquelle empfängt und dieses Licht auf eine Weise verarbeitet, die Licht durch einen Kaltlichtreflektor hindurch, der Licht der ersten Wellenlänge durchlässt, in eine Objektivlinse transferiert. Das Mikroskop umfasst ein Bilderzeugungssystem, das Licht von der Objektivlinse empfängt und auf einer Kamera ein Bild erzeugt, sowie eine Steuerung, die eine grafische Nutzereingabe aufweist, die einem Nutzer das Bild anzeigt und den ersten Beleuchtungs-SLM dahin gehend steuert, die Verarbeitung des Lichts ansprechend auf Befehle von dem Nutzer zu verändern. Der Beleuchtungs-SLM wird dahin gehend gesteuert, Funktionen bereitzustellen, die bei dem Beleuchtungsstrahlengang eines herkömmlichen Mikroskops normalerweise durch eine oder mehrere Linsen oder ein oder mehrere Prismen erfüllt würden, und/oder dahin gehend, Ausrichtungsfehler bei der Beleuchtungsquelle zu korrigieren.

Description

Hintergrund
Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie, beispielsweise leistungsstarke Laser und empfindliche Kameras, ermöglichen mittlerweile die Erfassung einzelner Farbstoffmoleküle in einer lebenden Zelle. Der Farbstoff bindet sich entweder direkt an eine Komponente der Zelle oder ist an einem Targeting-Molekül angebracht, das sich an die Zellkomponente bindet. Jedoch stellt eine Implementierung einer derartigen Abbildung eines einzelnen Moleküls bei einem herkömmlichen Mikroskop beträchtliche Herausforderungen dar.
Die Beleuchtungsquelle muss eine Anzahl von Merkmalen bereitstellen, die über ein bloßes Beleuchten eines interessierenden Bereichs auf einer Probe hinausgehen. Um innerhalb einiger weniger Millisekunden ein ausreichend starkes Signal (Hunderte bis Tausende von Photonen) von einem einzigen Farbstoffmolekül aufzufangen, sind Beleuchtungsintensitäten von mehr als 1 kW/cm² erforderlich. Jedoch erzeugt die typische Laserlichtquelle weniger als 100 mW. Lediglich ein Teil dieser Leistung kann durch das Objektiv hindurch projiziert werden. Somit weist der maximale Bereich, der beleuchtet werden kann, einen Durchmesser weniger als 100 Mikrometern auf. In der Praxis wird vorzugsweise ein großer Bereich beleuchtet, um die interessierenden Zellen zu finden. Dann wird eine intensivere, örtlich begrenzte Beleuchtung in einem kleineren Bereich um die interessierende Zelle herum verwendet, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, mit der ein Bild der interessierenden Zelle erstellt werden kann, und um den photoinduzierten Schaden an umliegenden Zellen, die derzeit nicht abgebildet werden, zu verringern. Somit müssen die Größe, die Position und die Intensität des Beleuchtungslichtflecks variabel sein.
Außerdem muss die Wellenlänge der Beleuchtungsquelle je nach dem betreffenden Farbstoff eventuell variiert werden. Falls die Probe mehrere Farbstoffe mit verschiedenen Anregungswellenlängen umfasst, muss die Beleuchtungsquelle während der Aufnahme desselben Bildes eventuell mehrere Wellenlängen bereitstellen.
Zusätzlich zu den durch die Erfassung einzelner Moleküle hervorgerufenen Problemen muss bei manchen Arten der Bilderstellung auch der Winkel, in dem das Beleuchtungslicht auf die Probe trifft, gesteuert werden. Beispielsweise muss das einfallende Licht bei einem Beleuchtungsmodus auf die Grenze zwischen dem Objektträger, auf dem sich die Probe befindet, und der Probe in einem Winkel auftreffen, der gewährleistet, dass das Beleuchtungslicht von dieser Grenze vollständig reflektiert wird. Dieses Beleuchtungsverfahren führt dazu, dass ein geringes Volumen nahe bei dem Glas angeregt wird, was das Signal/Rausch-Verhältnis des Bildes verbessert.
Schließlich sind für verschiedene Bilderzeugungsmodi verschiedene Beleuchtungsmuster erforderlich. Je nach dem Bilderzeugungsmodus können Modi erforderlich sein, bei denen die Probe mit einem Muster beleuchtet wird, das aus Streifen, Kreisen, Ringen oder Flecken (engl.: spots) besteht.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Mikroskop, das einen ersten Beleuchtungs-Licht-Raum-Modulator (Beleuchtungs-SLM, SLM = spatial light modulator) aufweist, der Licht einer ersten Wellenlänge von einer Beleuchtungsquelle empfängt und dieses Licht auf eine Weise verarbeitet, die Licht durch einen Kaltlichtreflektor hindurch, der Licht der ersten Wellenlänge durchlässt, in eine Objektivlinse transferiert. Das Mikroskop umfasst ferner ein Bilderzeugungssystem, das Licht von der Objektivlinse empfängt und auf einer Kamera ein Bild erzeugt, sowie eine Steuerung, die eine grafische Nutzereingabe aufweist, die einem Nutzer das Bild anzeigt und den ersten Beleuchtungs-SLM dahin gehend steuert, die Verarbeitung des Lichts ansprechend auf Befehle von dem Nutzer zu verändern. Der Beleuchtungs-SLM wird dahin gehend gesteuert, Funktionen bereitzustellen, die bei dem Beleuchtungsstrahlengang eines herkömmlichen Mikroskops normalerweise durch eine oder mehrere Linsen oder ein oder mehrere Prismen erfüllt würden. Außerdem kann die Steuerung den Beleuchtungs-SLM dazu nutzen, Ausrichtungsfehler bei einer Lichtquelle, die das Licht der ersten Wellenlänge erzeugt, zu korrigieren, indem sie das Kamerabild dazu verwendet, die Programmierung des SLM zu optimieren. Das Bilderzeugungssystem kann einen Bilderzeugungs-SLM umfassen, der durch die Steuerung gesteuert wird, wobei der Bilderzeugungs-SLM Licht von dem Kaltlichtreflektor auf die Kamera abbildet. Die Steuerung kann den Bilderzeugungs-SLM dazu verwenden, Aberrationen bei der Objektivlinse zu korrigieren und eine polarisierungsabhängige Verarbeitung des Lichts von der Objektivlinse durchzuführen. Die Steuerung kann ferner den Bilderzeugungs-SLM dazu verwenden, für Objekte, die mittels der Objektivlinse betrachtet werden, Bilder zu erzeugen, die verbesserte Spektralinformationen aufweisen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 veranschaulicht ein Ausführungsbeispiel eines Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 veranschaulicht ein Verfahren zur Verwendung eines Phasenmodulations-SLM, um ein optisches Element zu ersetzen.
3 veranschaulicht eine Lichtquelle, die zwei monochromatische Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen aufweist.
4 veranschaulicht ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Lichtquelle zur Verwendung bei einem Mikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung.
5 veranschaulicht das Sichtfeld eines Objektträgers, wie es in dem auf der GUI (grafische Nutzerschnittstelle, graphical user interface) angezeigten Kamerabild zu sehen ist.
6 veranschaulicht, wie ein Bilderzeugungsmodus einer inneren Totalreflexion bei einem herkömmlichen Mikroskop implementiert ist.
7 veranschaulicht, wie ein SLM bei einem Mikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um eine außeraxiale Fokussierung bereitzustellen, ohne eine bewegliche Fokussierlinse zu erfordern.
8A und 8B veranschaulichen ein weiteres Ausführungsbeispiel einer optischen Eingangskette zur Verwendung bei einem Mikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung.
9A und 9B veranschaulichen einen Teil der Emissionslichtverarbeitungsoptik gemäß zwei Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung.
10A und 10B veranschaulichen die Beugungsmuster für eine herkömmliche Daisylinse (Gänseblümchenlinse; engl.: daisy lens) und eine superauflösende Daisylinse.
11 veranschaulicht einen fluoreszierenden Fleck in dem Sichtfeld des Mikroskops, wenn der SLM dazu programmiert ist, das Prismamuster bereitzustellen.
Beschreibung von Ausführungsbeispielen der Erfindung
Die Art und Weise, wie die vorliegende Erfindung ihre Vorteile liefert, wird unter Bezugnahme auf 1 leichter verständlich, die ein Ausführungsbeispiel eines Mikroskops gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Ein Mikroskop 20 erstellt ein Bild einer Probe 25, die interessierende Zellen auf einem Objektträger 25' enthält. Die Probe wird durch eine Lichtquelle 21 beleuchtet, die eine Mehrzahl von Lichtquellen diskreter Wellenlängen umfassen kann, die durch eine Steuerung 28 gesteuert werden, die über eine grafische Nutzerschnittstelle (GUI – graphical user interface) 29 mit einem Nutzer des Mikroskops 20 kommuniziert. Das Licht von der Lichtquelle 21 wird durch einen SLM 22 verarbeitet, der die Phase des Lichts von der Lichtquelle 21 in unterschiedlichem Ausmaß verändert, je nach der Position, mit der das Licht auf den SLM 22 trifft. Der SLM 22 wird nachstehend ausführlicher erörtert. Das verarbeitete Licht von dem SLM 22 wird in die Objektivlinse 24 abgebildet, die das Licht auf die Probe fokussiert. Ein optionales Teleskop 32 verringert die Größe des aus dem SLM 22 ausgegebenen Lichtstrahls derart, dass der Lichtstrahl seitens der Eingangsöffnung der Objektivlinse 24 aufgenommen wird.
Der Kaltlichtreflektor 23 lässt Licht der einfallenden Wellenlänge hindurch. Ein SLM 26 verändert auch die Phase des darauf auftreffenden Lichts. Das durch den SLM 26 verarbeitete Licht wird auf eine Kamera 27 abgebildet, deren Ausgabe in die Steuerung 28 eingegeben wird. Das Bild wird auf eine Weise auf der GUI 29 angezeigt, die es dem Nutzer ermöglicht, verschiedene Steuerparameter zu kommunizieren, die dazu verwendet werden, die durch die SLMs 22 und 26 bereitgestellte Verarbeitung anzupassen.
Wie oben erwähnt wurde, wird die Ausgabe der Lichtquelle 21 durch den SLM 22, der ein Phasenmodulations-SLM ist, verarbeitet. Nun sei auf 2 verwiesen, die einen Phasenmodulations-SLM veranschaulicht. Ein SLM 40 kann als Array von durchsichtigen Pixeln 41 auf einem reflektierenden Substrat 42 angesehen werden. Der Brechungsindex jedes Pixels kann individuell variiert werden, indem an Elektroden in dem Pixel, die jedem Pixel zugeordnet sind, eine entsprechende Steuerspannung angelegt wird. Bei dieser Konfiguration können SLMs implementiert werden, indem ein Flüssigkristallmaterial auf ein Siliziumsubstrat abgeschieden wird, das die Steuerschaltungsanordnung und Elektroden zum Steuern der einzelnen Pixel umfasst. SLMs dieses Typs sind im Handel erhältlich und werden deshalb hier nicht ausführlich erörtert. Für die Zwecke der vorliegenden Erörterung genügt es anzumerken, dass von dem Standpunkt aus gesehen, dass Licht durch das Pixel gelangt, ein Pixel mit einem Brechungsindex 3 und einer Dicke einer Einheit denselben Effekt auf das Licht aufweist wie ein Pixel mit einem Brechungsindex von 1,5 und einer Dicke von 2 Einheiten. Somit kann ein derartiger SLM eine Fresnel-Linse, wie sie bei 43 gezeigt ist, emulieren, die wiederum Licht auf im Wesentlichen dieselbe Art verarbeitet wie eine Linse 44.
Desgleichen kann ein Phasenmodulations-SLM ein Prisma zum Umlenken eines Lichtstrahls und zum Aufteilen einer Lichtquelle mit breitem Spektrum in die Wellenlängen, aus denen sie besteht, emulieren. Es ist zu erwähnen, dass ein einzelner SLM im Prinzip eine optische Anordnung simulieren kann, die eine Mehrzahl von Linsen und Prismen aufweist. Wenn die gewünschte optische Verarbeitung gegeben ist, kann das äquivalente Phasenverschiebungsmuster als Eingabe in den SLM abgeleitet werden.
Ein SLM kann auch dazu verwendet werden, innerhalb der Grenzen optischer Auflösung eine nahezu willkürliche Intensitätsverteilung in der Brennebene einer Linse zu erzeugen. Der SLM wird konjugiert zu der Linsenebene platziert, wobei Licht, das von dem SLM reflektiert wird, durch die Linse gelangt. Die Intensitätsverteilung in der Brennebene der Linse ist die Fourier-Transformierte des Phasenmusters auf dem SLM. Es existieren mehrere veröffentlichte Verfahren zum Berechnen von SLM-Einstellungen auf der Basis der gewünschten Intensitätsverteilung.
Im Prinzip kann ein SLM bei beträchtlich verringerten Kosten dieselbe Eingangslichtverarbeitung bereitstellen wie herkömmliche optische Anordnungen, die bei keinen SLM enthaltenden Mikroskopen verwendet werden. Herkömmliche Eingangsstrahlengänge müssen für Komponenten gebaut sein, die achromtische Linsen und Elemente verwenden müssen, da die Wellenlänge des Eingangslichts je nach der jeweiligen Anwendung variieren kann. Außerdem ist die Ausrichtungstoleranz der Elemente gering, da der Endnutzer die Ausrichtung nicht ohne weiteres verändern kann.
Ein SLM kann die effektive Brennweite der simulierten Linse elektronisch verändern, wenn die Wellenlänge der Lichtquelle verändert wird. Außerdem kann der SLM die Position der Linse elektrisch „bewegen” oder den Winkel eines Reflektors relativ zu den anderen feststehenden optischen Elementen verändern. Somit können diese Parameter während des Aufbaus und der Durchführung eines Experiments entweder automatisch oder ansprechend auf eine Eingabe von dem Nutzer verändert werden.
Beispielsweise können die Position und Größe des Beleuchtungsflecks in dem Sichtfeld des Mikroskops unter Verwendung von Software gesteuert werden, die das Muster von Pixeln an dem SLM anpasst, um in dem Sichtfeld, wie es mittels der Kamera gesehen wird, eine gewünschte Strahlform und -größe bereitzustellen. Man betrachte den Fall, in dem die Lichtquelle 21 aus einer Mehrzahl von monochromatischen Lichtquellen wie beispielsweise Lasern aufgebaut ist. Üblicherweise erfordert das Experiment, dass die Laser in dem Sichtfeld des Mikroskops Flecken an derselben Position mit derselben Form erzeugen. Die Ausrichtung der einzelnen Lichtquellen stellt bei einem herkömmlichen Mikroskop beträchtliche Herausforderungen dar, da die Ausrichtung durch irgendeine Art mechanischer Anordnung gesteuert werden muss, die Ausrichtungsfehler korrigieren kann.
Nun sei auf 3 verwiesen, die eine Lichtquelle 50 veranschaulicht, die zwei monochromatische Lichtquellen unterschiedlicher Wellenlängen aufweist. Man betrachte den Fall, in dem immer nur lediglich eine der Lichtquellen aktiv ist und die andere der Lichtquellen nicht ausgerichtet ist. Das Licht von den zwei bei 51 und 52 gezeigten Quellen wird mithilfe eines Kaltlichtreflektors 53 und eines Spiegels 54 kombiniert. Im Idealfall erzeugt jede Lichtquelle einen Lichtstrahl in der bei 57 gezeigten Richtung. Aufgrund eines Ausrichtungsfehlers wird das Licht von der Lichtquelle 52 falsch ausgerichtet, wie bei 56 gezeigt ist. Die Fehlausrichtung wird durch einen SLM 55 korrigiert. Wenn die Lichtquelle 52 aktiv ist, wird die Position des resultierenden Flecks in dem Sichtfeld mit einer in 1 gezeigten Kamera 27 gemessen. Das SLM-Programm ist so eingestellt, dass sich der Fleck an der gewünschten Position befindet, indem der SLM dahin gehend programmiert wird, ein Prisma sowie einen Reflektor zu emulieren. Das Prisma korrigiert die Fehlausrichtung. Wenn die Lichtquelle 51 aktiv ist, ist der SLM dahin gehend programmiert, ein einfacher Reflektor zu sein. Wie oben erwähnt wurde, kann der SLM auch eine Linse in Verbindung mit einem Prisma emulieren, und somit kann der SLM, falls die Strahlen fokussiert werden sollen, auch die gewünschte Linsenemulation bereitstellen. Da außerdem das Licht von jeder Quelle monochromatisch ist, kann der SLM dahin gehend programmiert sein, das Prisma und/oder die Linse, das bzw. die auf dieser Wellenlänge ordnungsgemäß arbeitet, bereitzustellen, und somit wird keine teure achromatische Linse benötigt.
Diese Anordnung ermöglicht auch Experimente, bei denen Licht schnell von einer Wellenlänge zu einer anderen gewechselt wird, ohne dass sich die Position des beleuchteten Flecks ändert. Experimente, bei denen die Probe mit einer Wellenlänge vorbereitet (geprimt) wird und anschließend mit einer zweiten Wellenlänge betrachtet wird, können ohne weiteres ermöglicht werden.
Falls mehrere Lichtquellen gleichzeitig betrieben werden sollen, kann eine Anordnung verwendet werden, bei der jede Lichtquelle ihren eigenen SLM aufweist. Nun sei auf 4 verwiesen, die ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Lichtquelle zur Verwendung bei einem Mikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Eine Lichtquelle 60 weist eine Anzahl monochromatischer Lichtquellen auf, für die Lichtquellen 61 und 62 typisch sind. Jede Lichtquelle weist einen entsprechenden SLM auf, wie bei 65 und 66 gezeigt ist. Die SLMs sind dahin gehend programmiert, Ausrichtungsfehler und jegliche Fokussierungsanforderungen für die zugeordnete Lichtquelle zu korrigieren, indem sie den Fleck auf der Kamera beobachten und das SLM-Programm korrigieren, bis sich der Fleck an der gewünschten Position befindet und die gewünschte Form aufweist. Die durch die einzelnen Lichtquellen erzeugten Lichtstrahlen werden anschließend unter Verwendung von Kaltlichtreflektoren wie beispielsweise Reflektoren 63 und 64 kombiniert.
Die Fähigkeit, die Position, Größe und Form des Beleuchtungsflecks in dem Sichtfeld des Mikroskops zu steuern, ermöglicht es einem Mikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung, auf effizientere Weise und mit Komponenten zu arbeiten, die im Vergleich zu herkömmlichen Mikroskopen geringere Kosten aufweisen.
Bei einem herkömmlichen Mikroskop untersucht der Nutzer zuerst das Sichtfeld durch eine Objektivlinse mit geringer Vergrößerung und verschiebt den Objekttisch zu einer interessierenden Region, die interessierende Zellen umfassen kann. Anschließend geht der Nutzer zu einer stärkeren Vergrößerung über, um interessierende Zellen zu finden. Der Nutzer zentriert anschließend eine interessierende Zelle über einen motorisierten x-y-Objekttisch derart, dass sich die interessierende Zelle in der Mitte des Sichtfeldes befindet und die Beleuchtung auf einem entsprechend hohen Niveau liegt, um die gewünschten Messungen durchzuführen. Dann schaltet der Nutzer das optische System zu der Kamera um, um die gewünschten Messungen vorzunehmen. Die Kosten des Präzisionsobjekttischs sind beträchtlich. Zudem ist der Vorgang des Zentrierens der interessierenden Zellen zeitaufwändig.
Bei einem Mikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung führt der Nutzer all diese Operationen durch, indem er die Kameraausgabe und die Objektivlinse bei der höchsten Vergrößerung betrachtet. Die Kamera weist eine ausreichende Auflösung auf, um ein digitales Zoomen auf jeglichen interessierenden Teilbereich zu ermöglichen. Der SLM ist dazu programmiert, den gesamten Bereich, der seitens des Nutzers auf der Kamera betrachtet werden kann, zu beleuchten. Der Nutzer wählt unter Verwendung einer Maus oder einer anderen Zeigevorrichtung, die Bestandteil der GUI ist, interessierende Zellen aus. Anschließend verändert der SLM die Größe des Flecks und die Position zu der seitens des Nutzers angegebenen Position. Da nun das gesamte Licht in der seitens des Nutzers angegebenen Region konzentriert ist, ist die Beleuchtungsintensität beträchtlich höher, was zu einer schnelleren Bilderzeugung führt. Außerdem ist die erforderliche Genauigkeit des Mikroskopobjekttischs beträchtlich verringert, da die Feinabstimmung der Position durch den seitens des Nutzers ausgewählten Bereich des Kamerasichtfeldes bereitgestellt wird und nicht durch ein festgelegtes Sichtfeld, in dem der Nutzer die interessierende Zelle zentrieren muss.
Die Fähigkeit des SLM, die Form des Flecks auf dem Probestück zu steuern sowie die Position zu bewegen, ermöglicht eine effizientere Beleuchtung des interessierenden Objekts sowie eine Vermeidung nahe gelegener Objekte, die die interessierende Messung beeinträchtigen könnten. Nun wird auf 5 Bezug genommen, die das Sichtfeld eins Objektträgers veranschaulicht, wie es in dem auf der GUI angezeigten Kamerabild zu sehen ist. Das Bild wird so aufgenommen, dass die Beleuchtungsfleckgröße dahin gehend eingestellt ist, alle Objekte in dem Sichtfeld 78 zu beleuchten. Exemplarische Zellen sind bei 71 und 72 gezeigt. Der Nutzer kann einen Bereich auswählen, der mit hoher Intensität beleuchtet werden soll, indem er die Grenzen des zu beleuchtenden Teilfeldes markiert, wie bei 73–75 gezeigt ist. Der Nutzer kann auch die Form des Beleuchtungsteilfeldes festlegen. Die Formen können aus einer vorbestimmten Auswahl von Formen wie beispielsweise Quadraten, Rechtecken oder Kreisen ausgewählt werden. Außerdem könnten bestimmte freie Formen bereitgestellt werden, beispielsweise die bei 76 gezeigte Grenze. Durch Auswählen einer Form, die genauer mit der Grenze des interessierenden Objekts übereinstimmt, wird das Licht dort konzentriert, wo es benötigt wird, und Hintergrundlicht wird verringert.
Anschließend gibt der Nutzer an, dass eines der ausgewählten Teilfelder einer höheren Beleuchtung mit einer festgelegten Wellenlänge ausgesetzt werden soll. Die Steuerung wandelt die Position und Grenze des Flecks in ein Muster um, das an den SLM angelegt werden soll, und die Kamera nimmt das Bild auf. Während dieser späteren Phase wird lediglich der durch den Nutzer angegebene Bereich beleuchtet. Im Fall vorbestimmter Formen kann das Muster in der Steuerung gespeichert werden. Für ein Muster einer freieren Form müsste die Steuerung das erforderliche SLM-Muster berechnen. Computerprogramme zum Bestimmen eines SLM-Musters, um eine bekannte Fleckgröße an einer bekannten Position zu erzeugen, sind in der Technik bekannt und werden somit hier nicht ausführlich erörtert.
Bei manchen Experimenten ist der Winkel, in dem das Beleuchtungslicht auf die Unterseite des Objektträgers, auf dem sich das Probestück befindet, trifft, kritisch. Beispielsweise trifft bei der Bilderzeugung einer inneren Totalreflexion das Beleuchtungslicht in einem solchen Winkel auf den Objektträger, dass das Licht an der Grenzfläche zwischen dem Glas und dem Probestück aufgrund des unterschiedlichen Brechungsindizes des Glases und des das Probestück enthaltenden Fluids reflektiert wird. Diese Anordnung führt zu einem abklingenden elektrischen Feld in dem Probestück, das das Probestück zur Bilderzeugung anregt. Die resultierenden Bilder weisen einen höheren Kontrast auf als Bilder, die mit einer herkömmlicheren Beleuchtung aufgenommen werden. Um diese Versuchsanordnung bereitzustellen, muss der Objektträger in einem Winkel, der größer ist als der kritische Winkel, mit einem parallelen Lichtstrahl beleuchtet werden.
Nun sei auf 6 Bezug genommen, die veranschaulicht, wie ein Bilderzeugungsmode einer inneren Totalreflexion bei einem herkömmlichen Mikroskop implementiert wird. Die Probe 88 wird auf einem Objektträger 84 angebracht, der von unten beleuchtet wird, um eine Region eines abklingenden elektrischen Feldes 87 zu erzeugen. Das Beleuchtungssystem erfordert eine separate Fokussierlinse 81, die den parallelen Lichtstrahl von dem Laser auf die hintere Brennebene 82 der Objektivlinse 83 fokussiert. Licht, das die Objektivlinse bei dieser Anordnung verlässt, tut dies in einem parallelen Strahl. Der Winkel des parallelen Strahls relativ zu der Achse der Objektivlinse wird durch die Verschiebung des Brennpunkts in der hinteren Brennebene 82 relativ zu der Achse 88 der Objektivlinse bestimmt. Diese Verschiebung erfordert, dass die Fokussierlinse 81 lateral bewegt wird, wie durch Pfeile 86 gezeigt ist. Die Kosten dieser Anordnung sind beträchtlich. Erstens muss die Fokussierlinse 81 achromatisch sein, da eventuell alle einer Anzahl verschiedener Anregungswellenlängen benötigt werden. Zweitens muss die Fokussierlinse 81 in einer beweglichen Halterung angebracht sein, deren Position ohne weiteres angepasst werden und die entfernt werden kann, wenn eine herkömmliche Beleuchtung gewünscht wird.
Nun sei auf 7 Bezug genommen, die veranschaulicht, wie ein SLM bei einem Mikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden kann, die gewünschte Fokussierung bereitzustellen, ohne eine bewegliche Fokussierlinse zu benötigen. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist der in 1 gezeigte SLM 22 dazu programmiert, eine außeraxiale Fokussierlinse bereitzustellen, die das Laserlicht 89 auf die richtige Position auf der hinteren Brennebene der Objektivlinse 83 fokussiert. Wenn das Beleuchtungssystem in einem herkömmlichen Modus verwendet wird, wird der SLM lediglich auf das entsprechende Muster in diesem Modus umprogrammiert.
Falls der SLM den engen Fokus, der für den Modus der inneren Totalreflexion benötigt wird, nicht bereitstellen kann und dabei dennoch die für eine herkömmliche Beleuchtung benötigten Beleuchtungsmuster bereitstellen kann, kann in der Eingangsbeleuchtungskette ein zweiter SLM bereitgestellt werden. Für den Modus der inneren Totalreflexion muss der SLM weiter von der Objektivlinse entfernt sein als im Fall einer Beleuchtung, die darauf abzielt, einen Fleck zu beleuchten, der in dem Sichtfeld bewegt werden kann. Den zwei unterschiedlichen Entfernungen kann man gerecht werden, indem in dem Eingangslichtabschnitt zwei unterschiedliche beabstandete SLMs verwendet werden.
Nun sei auf 8A und 8B Bezug genommen, die ein weiteres Ausführungsbeispiel einer optischen Eingangskette zur Verwendung bei einem Mikroskop gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. 8A veranschaulicht die Eingangskettenverarbeitung, wenn eine herkömmliche Beleuchtung gewünscht wird, und 8B veranschaulicht die Eingangskettenverarbeitung, wenn eine Beleuchtung der inneren Totalreflexion gewünscht wird. Bei diesem Ausführungsbeispiel werden zwei SLMs verwendet. Unter Bezugnahme auf 8A verwendet die Eingangskette SLM 91 und SLM 92. Wenn er nicht in einem Modus der inneren Reflexion arbeitet, fungiert der SLM 91 lediglich als Reflektor, und der SLM 92 ist dahin gehend programmiert, das gewünschte Beleuchtungsmuster auf dem Probestück bereitzustellen. Bei einem Aspekt der Erfindung ist der SLM 92 in einer Ebene positioniert, die im Wesentlichen konjugiert zu der hinteren Brennebene 82 des Objektivs ist. Unter Bezugnahme auf 8B wird der SLM 91 dann, wenn er im Modus der inneren Totalreflexion arbeitet, dazu verwendet, das exzentrische Fresnel-Linsenmuster bereitzustellen, um den Laserstrahl auf die hintere Brennebene der Objektivlinse 24 zu fokussieren, und der SLM 93 ist dazu programmiert, ein einfacher Reflektor zu sein.
Es sei erneut auf 1 verwiesen. Bei einem Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst der Emissionslichtleiter auch einen SLM zum Bereitstellen einer programmierbaren Optik in dem Emissionspfad. Eine Verwendung eines SLM in dem Emissionspfad wird durch das Erfordernis, dass ein SLM polarisiertes Licht verarbeiten soll, verkompliziert. Dies stellt bei dem Eingangslichtpfad kein beträchtliches Problem dar, da die Polarisation der Laserquelle ordnungsgemäß ausgerichtet werden kann. Bei dem Emissionspfad kann die verfügbare Lichtintensität nicht so kompensiert werden, dass dadurch Verluste wettgemacht würden, die durch Polarisationsfilter entstehen, die das verfügbare Licht um einen Faktor zwei verringern.
Nun sei auf 9A Bezug genommen, die einen Teil der Emissionslichtverarbeitungsoptik gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Um die folgende Erörterung zu vereinfachen, wurden diejenigen Elemente des Mikroskops 100, die analoge Funktionen erfüllen wie Elemente in 1, mit denselben numerischen Bezeichnungen versehen. Das Mikroskop 100 umfasst einen Spiegel 111, der den optischen Pfad faltet, um eine kompaktere Vorrichtung bereitzustellen.
Bei dieser Anordnung empfängt ein polarisationsabhängiger Strahlenteiler 101 das Licht von der Probe. Der polarisationsabhängige Strahlenteiler 101 teilt das Licht in zwei Strahlen auf, die in unterschiedliche Richtungen wandern und die unterschiedliche orthogonale Polarisationen aufweisen, wie bei 102 und 103 gezeigt ist. Ein Teleskop 110 gleicht die Ausgabe der Objektivlinse mit der Eingabe des polarisationsabhängigen Strahlenteilers 101 ab. Ein Polarisationsdrehelement 104 dreht die Polarisation eines der Strahlen zu der gewünschten Polarisation für einen SLM 105. Dieser Strahl trifft auf eine Region 106 des SLM 105 auf, die von der Region 107, an der der Strahl 103 auf den SLM 105 auftrifft, separat ist. Der SLM 105 ist durch die Steuerung 120 dahin gehend programmiert, zwei separate SLMs bereitzustellen, die nebeneinander angeordnet sind. Die Ausgaben jedes Abschnitts können auf verschiedene Regionen der Kamera 112 abgebildet werden, um zwei Bilder mit Licht, das unterschiedliche Polarisationen aufweist, bereitzustellen. Alternativ dazu können die zwei Lichtstrahlen nach einer Verarbeitung neu kombiniert werden, indem ein anderes Drehelement und ein anderer polarisationsabhängiger Strahlenteiler verwendet werden, um den zum Trennen der zwei Lichtstrahlen verwendeten Prozess umzukehren.
Bei den in 9A gezeigten Ausführungsbeispielen wird der Bilderzeugungs-SLM-Prozess beider Bilder, die durch den polarisationsabhängigen Strahlenteiler erzeugt wurden, durch verschiedene Abschnitte des SLM 105 verarbeitet. Dies teilt die Pixel des SLM 105 zwischen den zwei Bildern auf und verringert somit die Auflösung des SLM, die an jedes Bild angelegt werden kann.
Nun sei auf 9B Bezug genommen, die einen Teil der Emissionslichtverarbeitungsoptik gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung veranschaulicht. Um die folgende Erörterung zu vereinfachen, wurden diejenigen Elemente des Mikroskops 130, die analoge Funktionen erfüllen wie Elemente in 9A, mit denselben numerischen Bezeichnungen versehen. Das Mikroskop 130 unterscheidet sich von dem Mikroskop 100 darin, dass der SLM 105 zum Verarbeiten des Lichts von dem Strahl 103 verwendet wird und das Licht von dem Strahl 102 durch den Spiegel 131 lediglich in die Kamera reflektiert wird. Diese Anordnung liefert zwei nebeneinander liegende Bilder in der Kamera – eines, das durch den SLM 105 verarbeitet wurde, und eines, das nicht so verarbeitet wurde. Beispielsweise stellen die Bilder in dem Fall, in dem der SLM 105 verwendet wird, um die Tiefenschärfe der Objektivlinse zu verändern, ein herkömmliches Bild und ein Bild dar, das auf ein schmaleres Band von Positionen in der Probe begrenzt ist.
Bei einem Aspekt der Erfindung wird der SLM in dem Emissionspfad auch als programmierbare Linse verwendet, um Fehler in der Objektivlinse wie beispielsweise eine sphärische Aberration, Koma und Astigmatismus zu korrigieren. Die Korrektur wird bewerkstelligt, indem die Kamerabilder bezüglich eines bekannten Kalibrierungsziels analysiert werden und indem das SLM-Muster iterativ verbessert wird, bis eine ausreichende Kompensation erzielt ist. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine Verwendung einer kostengünstigeren Objektivlinse bei dem Mikroskop. Ferner ist zu beachten, dass das verwendbare Sichtfeld des Mikroskops sogar bei einer qualitativ hochwertigen Objektivlinse durch die oben beschriebenen optischen Unvollkommenheiten begrenzt ist, und somit ermöglicht dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung auch ein größeres Sichtfeld.
Bezüglich eines weiteren Aspekts der Erfindung ist der SLM in dem Emissionspfad derart programmiert, dass die Kombination der Objektivlinse und des SLM eine „Superauflösungslinse” emulieren. Bei einer Superauflösungslinse ist die Mittenregion der Linse blockiert. Dies führt zu einem Bild, bei dem höhere räumliche Frequenzen in dem Bild zu dem Preis des Einführens einiger Artefakte in das Bild verbessert werden. Die Artefakte können durch Verwendung einer so genannten Superauflösungs-Daisylinse weniger unangenehm gemacht werden. Das Fourier-Beugungsmuster für eine herkömmliche Daisylinse und eine Superauflösungs-Daisylinse sind in den 10A bzw. 10B gezeigt.
Der Aspekt der programmierbaren Linse der Erfindung kann auch dazu verwendet werden, die fluoreszierenden Moleküle bezüglich der Tiefe der Moleküle in der Probe zu lokalisieren. Hier verändert die durch den SLM bereitgestellte zusätzliche Brennlinse die Brennweite der Kombination der SLM-Linse und der Objektivlinse. Außerdem wird die Tiefenschärfe derart verringert, dass lediglich Moleküle, die sich in einer bekannten Entfernung von der Unterseite des Objektträgers befinden, scharfgestellt sind.
Bezüglich eines weiteren Aspekts der Erfindung wird der SLM in dem Emissionspfad auch dazu verwendet, für jeden der Eliminierungspunkte in dem Bild eine spektroskopische Anzeige zu erzeugen. Der SLM ist bei diesen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung mit einem Fresnel-Prismamuster programmiert. Nun sei auf 11 Bezug genommen, die einen fluoreszierenden Fleck in dem Sichtfeld des Mikroskops veranschaulicht, wenn der SLM zum Bereitstellen des Prismamusters programmiert ist. Das Prisma streut das Licht an jedem Punkt 121 in einen „Streifen” 122, wobei die Positionen in dem Streifen verschiedenen Wellenlängen entsprechen. Somit misst die Kamera ein Spektrum, das jedem der beleuchteten Punkte in dem Bild entspricht. Da das Spektrum des Fluoreszenzfarbstoffs bekannt ist, kann dieses Spektrum dazu verwendet werden, das Signal/Rausch-Verhältnis zu verbessern, indem das Spektrum an das bekannte Spektrum plus einen Hintergrund angepasst wird.
Es ist zu beachten, dass zwei SLM-Muster als zwei nebeneinander liegende Muster auf dem SLM implementiert werden können, was zu nebeneinander liegenden Bildern auf der Kamera führt. Die zwei Muster könnten zwei Linsen unterschiedlicher Brennweiten bereitstellen, sodass das Ausmaß einer Defokussierung zum Lokalisieren von Objekten in drei Dimensionen verwendet werden kann. Alternativ dazu oder in Kombination kann eine der Linsen das Prismamuster in Verbindung mit einem Linsenmuster umfassen, um das Originalbild und eines mit Spektren zu zeigen.
Die Fähigkeit des Systems, sich rein durch Softwareveränderungen neu zu konfigurieren, ermöglicht rasche Veränderungen zwischen Messmodi. Auch kann das System nach dem Ersteinsatz zu neuen Messmodi aufgerüstet werden. Der Nutzer kann außerdem neue Modi und Protokolle entwerfen, ohne Modifikationen an der Hardware vornehmen zu müssen.
Die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung wurden bereitgestellt, um verschiedene Aspekte der Erfindung zu veranschaulichen. Jedoch versteht es sich, dass verschiedene Aspekte der vorliegenden Erfindung, die in verschiedenen spezifischen Ausführungsbeispielen gezeigt sind, kombiniert werden können, um andere Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Außerdem werden diverse Modifikationen der vorliegenden Erfindung aus der vorstehenden Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen ersichtlich. Demgemäß soll die vorliegende Erfindung lediglich durch den Schutzumfang der folgenden Patentansprüche eingeschränkt sein.

Claims

Ein Mikroskop, das Folgendes aufweist: einen ersten Beleuchtungs-Licht-Raum-Modulator (Beleuchtungs-SLM), der Licht einer ersten Wellenlänge von einer Beleuchtungsquelle empfängt und dieses Licht auf eine Weise verarbeitet, die Licht durch einen Kaltlichtreflektor hindurch, der Licht der ersten Wellenlänge durchlässt, in eine Objektivlinse transferiert; ein Bilderzeugungssystem, das Licht von der Objektivlinse empfängt und auf einer Kamera ein Bild erzeugt; eine Steuerung, die eine grafische Nutzereingabe aufweist, die einem Nutzer das Bild anzeigt und den ersten Beleuchtungs-SLM dahin gehend steuert, die Verarbeitung des Lichts ansprechend auf Befehle von dem Nutzer zu verändern.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Steuerung selektiv eine Region der Probe, die durch einen Nutzer auf der GUI festgelegt ist, beleuchtet.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der erste Beleuchtungs-SLM bei einem Beleuchtungsmodus eine Fresnel-Linse emuliert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der erste Beleuchtungs-SLM bei einem Beleuchtungsmodus ein Fresnel-Prisma emuliert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Lichtquelle eine Mehrzahl von Lichtquellen aufweist und bei dem die Steuerung Ausrichtungsfehler bei den Lichtquellen unter Verwendung des Bildes von der Kamera korrigiert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Objektivlinse durch eine hintere Brennebene und eine Linsenachse, die durch die Mitte der Objektivlinse verläuft, gekennzeichnet ist und bei dem die Steuerung bewirkt, dass der erste Beleuchtungs-SLM eine Linse emuliert, die das Licht in einer von der Linsenachse versetzten Position auf die hintere Brennebene fokussiert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem die Steuerung das Licht derart verarbeitet, dass eine mittels des Mikroskops betrachtete Probe bei einem einer Mehrzahl von Mustern, das seitens des Nutzers mit der GUI ausgewählt wird, beleuchtet wird.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 7, bei dem die Steuerung das Licht derart verarbeitet, dass die Kamera ein erstes Bild eines ersten Sichtfeldes der Probe empfängt, wobei das Bild auf der GUI angezeigt wird.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 8, bei der die Steuerung das Licht derart verarbeitet, dass das Licht an einem Teilfeld des ersten Sichtfeldes in einer durch die GUI unter Bezugnahme auf das erste Bild eingegebenen Position konzentriert wird, wobei das Teilfeld kleiner ist als das erste Sichtfeld.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 6, das ferner einen zweiten Beleuchtungs-SLM aufweist, wobei der zweite Beleuchtungs-SLM von dem ersten Beleuchtungs-SLM verschoben ist und Licht empfängt, das durch den ersten Beleuchtungs-SLM verarbeitet wird, wobei die Steuerung den ersten und den zweiten Beleuchtungs-SLM derart steuert, dass einer des ersten und des zweiten Beleuchtungs-SLMs dahin gehend positioniert ist, das Licht an der von der Linsenachse versetzten Position auf die hintere Brennebene zu fokussieren, und der andere des ersten und des zweiten Beleuchtungs-SLMs im Wesentlichen in einer Ebene positioniert ist, die zu einer hinteren Brennebene des Objektivs konjugiert ist.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 1, bei dem das Bilderzeugungssystem einen Bilderzeugungs-SLM aufweist, der durch die Steuerung gesteuert wird, wobei der Bilderzeugungs-SLM Licht von dem Kaltlichtreflektor auf die Kamera abbildet.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der Bilderzeugungs-SLM Aberrationen in der Objektivlinse korrigiert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, das ferner eine Polarisationsstrahlenteilungsanordnung aufweist, die Licht von dem Kaltlichtreflektor empfängt, dieses Licht derart aufteilt, dass Licht einer ersten Polarisation in einer ersten Region des Bilderzeugungs-SLM auf den Bilderzeugungs-SLM trifft und Licht der orthogonalen Polarisation durch eine Polarisationsdrehanordnung gelangt und in einer zweiten Region, die von der ersten Region getrennt ist, auf den Bilderzeugungs-SLM auftrifft.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, das ferner eine Polarisationsstrahlenteilungsanordnung aufweist, die Licht von dem Kaltlichtreflektor empfängt, dieses Licht derart aufteilt, dass Licht einer ersten Polarisation auf den Bilderzeugungs-SLM auftrifft und Licht einer orthogonalen Polarisation auf die Kamera abgebildet wird.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 13, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der Bilderzeugungs-SLM aus dem Licht, das in der ersten Region auf der Kamera auf den Bilderzeugungs-SLM auftrifft, ein erstes Bild erzeugt und aus Licht, das in der zweiten Region auf den Bilderzeugungs-SLM auftrifft, ein zweites Bild erzeugt, wobei in der Kamera das erste Bild von dem zweiten Bild getrennt ist.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der Bilderzeugungs-SLM ein Fresnel-Prisma emuliert, das ein spektrales verbessertes Bild einer mit dem Mikroskop betrachteten Probe erzeugt.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, bei dem die Objektivlinse und der Bilderzeugungs-SLM durch eine Tiefenschärfe in der Probe gekennzeichnet sind und bei dem die Steuerung bewirkt, dass der Bilderzeugungs-SLM diese Tiefenschärfe verändert.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 11, bei dem die Steuerung bewirkt, dass der Bilderzeugungs-SLM eine Linse emuliert, bei der ein Mittenabschnitt blockiert ist.
Das Mikroskop gemäß Anspruch 19, bei dem die Linse eine Superauflösungs-Daisylinse ist.