DE102012201268B4

DE102012201268B4 - Verfahren zur Herstellung von Hohlkörpern aus mikrobieller Cellulose

Info

Publication number: DE102012201268B4
Application number: DE102012201268.0A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Fried; Dieter Klemm; Victoria Kopsch; Daniel Koth; Friederike Kramer; Sebastian Moritz; Thomas Richter; Dieter Schumann; Ulrike Udhardt
Original assignee: KKF UG
Current assignee: KKF UG
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2021-01-21
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: DE102012201268A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:a) in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,b) Unterbrechen des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,c) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,d) in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gemischvorrat,e) Unterbrechen des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,f) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, dadurch gekennzeichnet, dassdas Template zumindest während Schritt c) und Schritt f), um mehrere Raumachsen rotiert wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose und einen Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der nach dem Verfahren erhältlich ist.
Um Blutgefäße und andere Hohlorgane im menschlichen oder tierischen Körper zu ersetzen, werden heute in der klinischen Praxis neben körpereigenen Gefäßen Prothesen aus synthetischen Polymeren eingesetzt. Die Präparation körpereigener Gefäße bedeutet für den Patienten einen zusätzlichen operativen Eingriff, welcher ebenfalls mit beachtlichem Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Außerdem verfügen viele, vor allem ältere Patienten, nicht über ein ausreichendes Maß an gesundem, zur Revaskularisation geeignetem Gefäßmaterial. Kommerzielle, synthetische Prothesematerialien aus Dacron® und Teflon®, die in der allgemeinen Gefäß- und Thoraxchirurgie für den Ersatz von großlumigen Gefäßen (Gefäßdurchmesser > 6mm) wie der Aorta oder der Beckenbeinarterien (Iliacalarterien) Verwendung finden, unterliegen aufgrund von deutlicher Thrombogenität, unzureichender mechanischer Belastbarkeit, geringer Elastizität/ verminderter Compliance sowie unzureichender Resistenz gegenüber Infektionen bezüglich ihres Einsatzgebietes und ihrer Einsatzdauer starken Beschränkungen. Für den kleinkalibrigen Gefäßersatz (Gefäßdurchmesser 3,0-6,0 mm) z. B. der Herzkranzgefäße sowie für den Mikrogefäßersatz (Gefäßdurchmesser 1,0-3,0 mm) können diese Materialien bisher nicht verwendet werden.
Alle natürlichen Blutgefäße sind mehr oder weniger elastische Röhren mit einer endothelialen Auskleidung. Der Aufbau der Gefäßwände entspricht in ihrer quantitativen und qualitativen Beschaffenheit den unterschiedlichen Funktionen der einzelnen Blutkreislaufabschnitte. Grundlegend sind die Wände aller natürlichen Arterien und Venen durch einen 3-Schichten-Aufbau gekennzeichnet:

- Die Tunica intima besteht aus einer glatten, lumenseitigen Endothelschicht aus langgestreckten, parallel zur Blutstromrichtung angeordneten Zellen und einem daruntergelegenen Bindegewebe. Sie wird direkt über den Blutstrom mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt.
- Die Tunica media ist die mittlere Wandschicht. Sie besteht aus dicht gefügten glatten Muskelzellen mit zirkulärem oder spiralförmigem Verlauf und elastischen und kollagenen Fasern.
- Die Tunica externa (Adventicia) ist die äußere dünne Bindegewebsschicht, die das Gefäß in dem umgebenden Gewebe verankert. In dieser Schicht befinden sich kleinere Blutgefäße für die Ernährung der Gefäßwand (Ausnahme Intima) und Nervengeflechte.

Während die Venen durch nur undeutlich voneinander abgrenzbare Schichten charakterisiert sind, existieren bei den Arterien elastische Schichten zwischen Intima und Media (Membrana elastica interna) und zwischen Media und Adventitia (Membrana elastica externa). Da Venen im Blutkreislauf nur geringen Druckbelastungen ausgesetzt sind, sind ihre Gefäßwände dünner und muskuläre Elemente zugunsten des Bindegewebes reduziert. Der Wandaufbau ermöglicht eine starke Dehnung der Venen, Venenklappen verhindern einen Rückfluß des Blutes und gewährleisten einen herzwärts gerichteten Blutstrom.
Herznahe Arterien müssen sehr hohen Druckbelastungen standhalten. Sie sind vom „elastischen“ Typ, d.h. ihre Media besteht aus wechselnden Lagen von elastischen Membranen und glatter Muskulatur. Die Anordnung der elastischen Elemente in einander überkreuzenden Spiralsystemen ermöglicht die zirkuläre und longitudinale, rhythmische Dehnung des Gefäßes (elastische Verformbarkeit). In den herzferneren Arterien ändert sich entsprechend der andersartigen Funktion der Bau der Gefäßwände. In den Gefäßen vom „muskulären“ Typ verringern sich die elastischen Bauelemete, die muskulären nehmen zu bis das elastische Material auf die Lamina elastica interna und externa beschränkt ist.
Die Gefäße sind so in der Lage, sich den jeweils herrschenden Blutdruckverhältnissen anzupassen (Roche Lexikon Medizin, Hrg. Hoffmann-La Roche AG und Urban & Schwarzenberg, U & S München, Wien, Baltimore, 1998, 4. Auflage; K. Sommer (Hrsg.) Der Mensch-Anatomie, Physiologie, Ontogenie. Volk und Wissen, Berlin, 1983, 5. Auflage).
Ein Blutgefäßimplantat, auch bezeichnet als „vascular graft“, sollte deshalb den folgenden Anforderungen entsprechen:

- Es soll eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur (biomimetische Struktur) aufweisen.
- Es soll biokompatibel sein, d.h. es darf keine Thrombogenität und Immunogenizität besitzen. Es sollte resistent gegenüber Infektionen sein und in den Körper integriert werden, so dass im Idealfall das Blutgefäßimplantat nicht mehr vom nativen Gefäß unterschieden werden kann.
- Es soll über die biologische Funktionalität der nativen Blutgefäße verfügen und den Aufbau körpereigener Strukturen anregen (Bioaktivität). Die innere Oberfläche des Implantats soll so beschaffen sein, dass sie keine thrombogenen Eigenschaften aufweist, die Anlagerung von körpereigenen Endothelzellen und die Ausbildung einer glatten konfluierenden Endothelschicht im künstlichen Gefäß ermöglicht. Die Wandung des Implantats soll einen Stoffaustausch, vergleichbar mit den natürlichen Austauschprozessen, gestatten.
- Es soll eine angemessene mechanische Stabilität aufweisen, um den statischen, dynamischen und punktuellen Belastungen (z.B. Blutdruck, Körperbewegungen, Kräfte an der Verbindungsstelle zu den natürlichen Gefäßen) standzuhalten. Darüber hinaus soll es in einem Hochdrucksystem dauerhaft funktionieren.
- Es soll ausreichend elastisch, einfach sterilisierbar und chirurgisch sehr gut handhabbar sowie in den erforderlichen Abmessungen verfügbar und lagerfähig sein.

Derartige Gefäßimplantate, die hinsichtlich Struktur, Eigenschaften und Funktionalität einem biomimetischen und bioaktiven Implantat entsprechen und deren Dimensionen (innerer Durchmesser von etwa 1 - 30 mm, Länge von 5 - 500 mm) hinsichtlich des Einsatzgebietes variiert werden können, sind bisher nicht bekannt.
Bakterielle Nanocellulose (BNC) - auch mikrobielle Cellulose genannt und nachfolgend in dieser Beschreibung noch erläutert - bietet aufgrund ihrer exzellenten Materialeigenschaften ideale Voraussetzungen für den Einsatz als Gefäßimplantat mit dem vorstehend beschriebenen Anforderungsbild.
BNC unterscheidet sich in ihrer Morphologie deutlich von der Cellulose pflanzlichen Ursprungs. Sie besteht aus Fasern mit einem Durchmesser im Nanometerbereich (20-100nm), die 100mal feiner als herkömmliche Pflanzencellulosefasern (Zellstoff) sind. Das natürliche Nanofaser-Netzwerk zeigt eine dem menschlichen Gewebe (Kollagen) vergleichbare Gerüststruktur. Es enthält bis zu 99% Wasser und ist in der Lage, intensive Wechselwirkungen mit der Umgebung einzugehen. BNC ist auch im feuchten Zustand mechanisch stabil. BNC ist ein hochreines Polymer, frei von pflanzlichen Begleitkomponenten wie Lignin, Pektin und Hemicellulosen. Sie zeichnet sich durch ein hohes Molekulargewicht (Polymerisationsgrad von ca. 4.000 - 10.000) und hohe Kristallinität (80-90%) aus. BNC wird im menschlichen und Säugetierorganismus nicht abgebaut, löst keine Abwehrreaktionen des Körpers aus und wird von körpereigenen Zellen wirksam besiedelt (Klemm D, Kramer F, Moritz S, Lindström T, Ankerfors M, Gray D, Dorris A: Nanocelluloses: a new family of nature-based materials. Angew. Chem. Int. Ed. (2011) 50, 5438-5466).
Es sind mehrere Methoden bekannt, bakterielle Nanocellulose (BNC) insbesondere als Hohlkörper für chirurgische Anwendungen wie Blutgefäße oder Gewebeimplantate zu formen. Entsprechend den beschriebenen Formgebungsverfahren werden unterschiedliche BNC-Hohlkörper mit unterschiedlicher Dimension, Struktur und Oberflächengüte sowie mechanischer Belastbarkeit und Festigkeit erhalten.
Es ist bekannt, dass mikrobielle Cellulose direkt im Herstellungsprozess, insbesondere zu einem Hohlkörper geformt werden kann. Folgende Methoden der Herstellung hohlzylindrischer Celluloseformkörper werden beschrieben:

EP 396 344 A2 beschreibt die Herstellung eines mikrobiellen Cellulosehohlkörpers mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser. Die Glasröhren werden ineinander gefügt, und im Raum zwischen den beiden Rohrwandungen wird die Kultivierung des Cellulose-bildenden Mikroorganismus statisch innerhalb von 30 Tagen durchgeführt. Dieses Verfahren erfolgt entsprechend der sogenannten horizontalen statischen Kultivierungsmethode. Es entsteht eine mikrobielle Cellulose mit hohlzylindrischer Gestalt. Das Beispiel zeigt allerdings, z.B. anhand von Thrombenbildung, dass die innere Oberfläche des nach diesem Verfahren mikrobiell hergestellten Hohlzylinders den Qualitätsansprüchen an ein Gefäßimplantat nicht umfassend genügt. Die übliche statische Kultivierung schließt das Abwärtsschieben des Celluloseproduktes entlang der Wandungen des verwendeten Kultivierungsgefäßes ein. Dieser Vorgang kann zur Bildung von Oberflächeninhomogenitäten wie z.B. Falten führen. Der Einsatz als Gefäßprothese ist daher eher bedenklich.

WO 01/61026 A1 / US 2003/013163 A1 offenbart ein Herstellungsverfahren für geformte Biomaterialien, insbesondere für mikrochirurgische Anwendungen als Ersatz von Blutgefäßen mit 1-3 mm Durchmesser und kleiner. Die Herstellung eines Cellulosehohlkörpers erfolgt mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser, die in die mit den Cellulose-bildenden Bakterien beimpfte Nährlösung eintauchen, so dass die Nährlösung in den Zwischenraum der Glasmatrix durch Kapillarkraft eingezogen und Nährlösungs- sowie Luftzirkulation möglich wird. Im Kultivierungsgefäß ist während des gesamten Kultivierungsprozesses ein feuchtes, aerobes Milieu zur Cellulosebildung gewährleistet. Nach 7-14 Kultivierungstagen bildet sich im Kultivierungsgefäß entsprechend der üblichen statischen Kultivierung ein anisotropes, schichtartiges BNC-Vlies aus. Im Zwischenraum zwischen den beiden Glasrohren bildet sich gleichzeitig unter den modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen ein Cellulosehohlzylinder aus einem Mikrofibrillar/Nanocellulosenetzwerk rotationssymmetrisch um den Glaskern entlang der Längsachse des hohlzylindrischen Innenraums der Glasmatrix. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, dass die auf diesem Wege produzierten Hohlkörper nur eine Länge von wenigen Zentimetern (bis zu 3 cm) erreichen.
WO 2007/093445 A1 / US 2009/011161 A1 beschreibt einen Prozess zur Herstellung eines langen Cellulosehohlkörpers, indem ein Cellulose-bildender Organismus im Innenraum eines hohlen Formkörpers kultiviert wird und der lange Cellulosehohlkörper in diesem Innenraum wächst. Im Rahmen der Erfindung wird auf die Rotationssymmetrie um die zylindrische Achse des hohlzylindrischen Innenraumes verzichtet, indem der Cellulosehohlkörper nicht entlang der Längsachse eines Innenraumes sondern im Wesentlichen senkrecht dazu von einer Längsseite des hohlen Formkörpers zur gegenüberliegenden Längsseite entsteht. Das bedeutet, dass die Länge des Cellulosehohlkörpers nicht länger durch die Schichtdicke limitiert wird, die durch den statischen Wachstumsprozess erreicht werden kann und so jede gewünschte Länge denkbar ist.
Der Nachteil dieser Methode besteht zum einen im Herstellungsaufwand. Zunächst wird eine übliche statische Kultivierung zum Aufbau einer Celluloseschicht 7-10 Tage durchgeführt. Danach wird der hohle Formkörper mit den entsprechenden Öffnungen auf die wachsende und mit einem Trägernetz unterstützte Celluloseschicht gelegt, so dass die Bakterien in den Hohlkörper von außen eindringen und die Cellulose unter modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen parallel aber nicht rotationssymmetrisch zur Längsachse des Formkörperinnenraumes, also von unten nach oben, in dem Formkörper innerhalb von 2 bis 3 Wochen gebildet wird. Während der Kultivierung ist darauf zu achten, dass verbrauchte Nährlösung ersetzt wird. Die durch einen unteren Schlitz der Matrix einwandernden Bakterien müssen sich im Verlauf der Kultivierung an die kontinuierliche Veränderung der Biosyntheseflächen (Wechsel zwischen Vergrößerung und Verkleinerung) anpassen. Insbesondere das Verbinden der beidseits des Matrixkerns getrennt voneinander aufgebauten Bakteriencellulose-Halbzylinder zu einer homogenen Einheit ist problematisch.
Die strukturellen Gegebenheiten des Formkörpers variieren sowohl längs als auch senkrecht zur Achse. Diffussionsprozesse der Kulturlösung zum Biosyntheseort durch die primär aufgebaute Celluloseschicht sowie die sich aufbauende sekundäre Celluloseschicht innerhalb des Formkörpers führen zur Ausbildung zusätzlicher struktureller Inhomogenitäten. Die isolierten Cellulosehohlkörper sind dadurch vermindert formstabil sowie unzureichend mechanisch stabil, was zu großen Problemen z.B. der Druckstabilität führt. Auch die innere und äußere Begrenzung des Cellulosehohlkörpers sind deshalb als inhomogen und instabil anzusehen, so dass die innere und äußere Wand einem angelegten Druck gar nicht oder nicht gleichmäßig entgegenwirken kann. Das Lumen wird geweitet, es entstehen Beulen und Mulden, was die Bildung von Thromben begünstigen sollte. Darüber hinaus ist der im Patent beschriebene Bildungsprozess nur sehr schwer reproduzierbar zu gestalten und kaum für die Produktion großer Stückzahlen zu realisieren.
Desweiteren gibt es Schriften, die sich mit der Herstellung von BNC-Hohlkörpern an gaspermeablen Oberflächen beschäftigen.
Nach EP 186 495 A2 wird geformte mikrobielle Cellulose an gaspermeablen Materialien (z.B. PVC, Cellulose, Cellulosederivate, Polyethylen, Silikon, PTFE) aufgebaut, indem die eine Seite des Materials mit einem Sauerstoff-enthaltenden Gas in Kontakt steht und die andere mit der Nährlösung, so dass die mikrobielle Cellulose an dieser Seite gebildet und anschließend isoliert wird. Wird z.B. ein entsprechender Dialyseschlauch aus herkömmlicher Cellulose mit Nährmedium und Cellulose-bildenden Mikroorganismen befüllt und die Kultivierung über einer geringen Menge destillierten Wassers in geschlossenen Glasgefäßen zur Gewährleistung feuchter aerober Bedingungen durchgeführt, bildete sich innerhalb von 2 Tagen bei 25°C im Inneren des Dialyseschlauches zylindrisch geformte mikrobielle Cellulose. Wird hingegen ein Luftgefüllter Dialyseschlauch in ein mit Kulturlösung befülltes abgeschlossenes Gefäß gegeben, findet man nach 3 Kultivierungstagen eine Ummantelung des permeablen Materials mit einer dünnen Celluloseschicht.
Der in EP 396 344 A2 beschriebene Prozess zur Herstellung mikrobieller Cellulosehohlkörper schließt ebenfalls die Kultivierung eines Cellulose-produzierenden Mikroorganismus an der inneren und/oder äußeren Oberfläche eines Sauerstoff-permeablen Hohlträgers aus Cellophan, Teflon, Silikon, Keramik oder einem nichtgewebten bzw. einem gewebten Material ein. Ein Cellulose-produzierender Mikroorganismus und ein Kulturmedium werden der inneren und/oder äußeren Seite des Hohlträgers zugeführt. Die Kultivierung erfolgt unter Zuführung eines Sauerstoff-haltigen Gases (oder Flüssigkeit) ebenfalls an der besagten inneren und/oder äußeren Seite des Hohlträgers. Es bildet sich eine gallertartige Cellulose mit einer Schichtstärke von 0,01 bis 20 mm an der Oberfläche des Hohlträgers. Auf Grund der Wechselwirkung des Cellulose-produzierenden Mikroorganismus, der produzierten Cellulose und des Hohlträgers entsteht innerhalb von 1-2 Monaten ein Komposit von Cellulose und Hohlträger. Ist die Cellulose nicht an den Träger gebunden, wird dieser nach der Synthese der Cellulose entfernt. Ein hohl geformter Artikel, der ausschließlich aus Cellulose besteht, kann erhalten werden.
WO 2008/040729 A2 beschreibt eine Methode zur Herstellung von Cellulosehohlkörpern durch Kultivierung von Cellulose-produzierenden Mikroorganismen an der äußeren, gleichmäßig glatten Oberfläche eines hoch Sauerstoff-permeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie Dimethylsilikon, Vinylmethylsilikon, Fluorosilikon, Diphenylsilikon, Nitrilsilikon. Der Innenraum des Hohlträgers wird mit einem Sauerstoff-enthaltendem Gas, dessen Sauerstoffgehalt über dem des Atmosphärensauerstoffs liegt (bevorzugt 100% Sauerstoff), beliefert, so dass der Cellulose-produzierende Mikroorganismus kontinuierlich und im notwendigen Umfang mit Sauerstoff versorgt wird. Der SauerstoffPartialdruck wird ebenfalls variiert. Es können Cellulosehohlkörper verschiedener Dimension und Form sowie mit Verzweigungen aufgebaut werden, die zum Einsatz in der Chirurgie von Mensch und Tier zum Ersatz oder zur Reparatur von inneren Hohlorganen wie Harnröhre, Harnleiter, Luftröhre, Verdauungstrakt, Lymphgefäße oder Blutgefäße gedacht sind. Die Cellulosehohlkörper sind aus einzelnen Schichten parallel zur Gefäßwand aufgebaut, und weisen eine dichte innere und eine poröse äußere Oberfläche auf. Berstdrücke bis zu 880 mmHg werden in Beispielen angegeben. Es ist angegeben, dass durch die Konzentration vom Sauerstoff im Gas, das durch die nicht-porösen, Sauerstoff-permeablen Hohlträger geleitet wird, die Festigkeit der aufgebauten Bakterielle Cellulose (BC)-Röhrchen steuerbar ist.
Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2 , was man bei einem Vergleich der Abbildungen beider Publikationen ersieht. Die potentiellen Gefäßprothesen erreichten einen Berstwert von 880 mmHg, wenn sie in Gegenwart von 100% Sauerstoff produziert werden. Innerhalb von ca. 5-7 Kultivierungstagen ist es möglich, BC-Röhrchen variabler Längen und Durchmesser (z.B. 1,5 -6,0 mm) sowie mit Verzweigungen zu produzieren. Zusätzlich zu WO 2008/040729 A2 offenbart Bodin et al. mechanische Tests der hergestellten Hohlkörper. Ein Spannungs-Dehnungs-Test weist darauf hin, dass die Hohlkörper aus Schichten aufgebaut sind, die nicht fest miteinander verbunden sind, erkennbar an verschiedenen Peaks im Spannungs-Dehnungs-Diagramm in 8.
Bäckdahl et al. (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2 , was man aus dem Material-und-Methoden-Teil ersieht. REM-Untersuchungen und Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie an ungereinigten BC-Röhrchen zeigen hohe Bakterienkonzentrationen dicht am Lumen.
Die oben zitierte Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen ist vergleichbar mit der statischen Horizontal-Kultivierung. Abweichend davon erfolgt die Biosynthese nicht unmittelbar an der Grenzfläche Nährmedium-Luft sondern an der Grenzfläche Nährmediumsauerstoffpermeabler Hohlträger. Die BNC-Bildung ist nicht mehr auf nur eine Richtung beschränkt, sondern erfolgt in alle Raumrichtungen. Der Aufbau von BNC-Körpern mit fast unbegrenzter Hohlkörperlänge/ Dimension wird somit möglich, allerdings sind aufgrund des diffusionsbestimmten Nährstofftransports und der Material-bestimmten Sauerstoffversorgung Limitierungen der Wandstärken zu erwarten. Im Vergleich zur Nährmedium-Luft Grenzflächenkultivierung geben Putra et al. eine Reduzierung der Celluloseschichtdicke um Zweidrittel an (A Putra, A Kakugo, H Furukawa, JP Gong, Y Osada: Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface. Polymer (2008) 49, 1885-1891).
Bekannt ist auch die BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben „rotating disc reactors“ ( WO 9705271 A1 , Mormino R, Bungay H: Composites of bacterial cellulose and paper made with a rotating disk bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62, 503-506). Die Grundidee dieses Verfahrens besteht darin, wachsende Zellen an Strukturelemente eines Bioreaktors zu heften, um einen Biofilm zu bilden. Indem diese Strukturelemente durch eine stationäre Nährlösung bewegt werden, fördert man weiterhin das Zellwachstum. Eine oder mehrere ständig rotierende - z.B. perforierte oder aufgerauhte - Scheiben tauchen partiell aber dauerhaft in eine Kulturlösung, die Cellulose-produzierende Mikroorganismen enthält, ein. Auf der Oberfläche dieser Scheiben bildet sich eine stark gelatisierte und stark hydratisierte Cellulose, die sich deutlich von mikrobieller Cellulose unterscheidet, die unter statischen Bedingungen hergestellt wurde. So ist diese Cellulose durch eine lockerere Struktur und eine höhere Wasserabsorptionskapazität sowie reduzierte mechanische Kenngrößen (Elastizitätsmodul, Zugfestigkeit) gekennzeichnet. Die äußeren Kräfte, die durch die Rotationsbewegung während der Kultivierung auftreten, bewirken Störungen im gesamten Kristallisationsprozess und somit eine lockerere und ungeordnetere BC-Faserstruktur. Der Austausch der Scheiben gegen eine horizontal angeordnete Walze macht es zwar möglich, Röhren unterschiedlicher Durchmesser herzustellen Krystynowicz A, Czaja W, Wiktorowska-Jezierska A, Goncalves-Miskiewicz M, Turkiewicz M, Bielecki S: Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 29, 189-195), eine Verwendung als Gefäßersatz scheint aufgrund des Eigenschaftsprofils aber nicht möglich. Eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der unter dynamischen Bedingungen hergestellten Cellulose-Tubes konnte nur durch den Einbau eines Verstärkungsmaterials (Polyesterschlauch) erreicht werden (Ciechanska D, Wietecha J, Kazmierczak D, Kazmierczak J: Biosynthesis of modified bacterial cellulose in a tubular form. Fibres and Textiles in Eastern Europe (2010) 18, 98-104).
In WO 2000/023516 A1 wird ein Prozess zur Herstellung eines extrudierten Celluloseproduktes (Film, Rohr/Schlauch, Faser) beschrieben, der die Herstellung einer Celluloselösung aus nicht-bakterieller und bakterieller Cellulose in einem Aminoxid-Lösungsmittel einschließt. Der Anteil der bakteriellen Cellulose beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der Endprodukte. Die Bildung der genannten Produkte erfolgt durch ein rein technisches Verfahren. Durch den hierfür notwendigen Löseprozess wird die einzigartige Struktur der Bakteriencellulose zerstört.
Die CN 201 809 342 U bezieht sich auf eine Vorrichtung zur dynamischen Herstellung eines bakteriellen Cellulosematerials mit profiliertem Hohlraum. Die Vorrichtung umfasst eine Thermometeröffnung, eine Säure-Base-Flottenzufuhröffnung, einen Griff, eine Entlüftungsöffnung, eine pH-Meter-Öffnung, eine Nährmaterialzufuhröffnung, eine rotierende Welle, einen Gärtank, einen Motor, eine Wasserbadvorrichtung und eine Düse, wobei ein Ende der rotierenden Welle fest mit einer Ausgangswelle des Motors verbunden ist und das andere Ende der rotierenden Welle durch die Mittelposition einer Endfläche des Fermentationstanks in den Fermentationstank hineinragt. Die Düse ist auf der rotierenden Welle im Gärtank befestigt. In dem Gebrauchsmuster dreht sich die Matrize oder die Matrize auf einem Drehteller um die Mitte der rotierenden Welle, so dass die Matrize bakterielle Cellulose in einer Fermentationsflüssigkeit aufwickelt, um das hohle bakterielle Cellulosematerial in einer bestimmten Form auf der Oberfläche zu bilden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein verbessertes Verfahren anzugeben, womit Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose hergestellt werden können. Die Hohlkörper sollten möglichst in beliebiger Form herstellbar sein. Weiterhin war es eine Aufgabe, einen verbesserten Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose bereitzustellen, insbesondere für medizinische Anwendungen.
Eine oder mehrere dieser Aufgaben werden gelöst mit einem Verfahren und einem Hohlkörper, wie in den unabhängigen Ansprüchen angegeben, oder mit vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung, wie in den Unteransprüchen angegeben.
Angegeben wird ein Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst:

a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,
c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,
d) das in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gem ischvorrat,
e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,
f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,

Die Folge der Schritte d), e) und f) kann optional ein- oder mehrmals wiederholt werden.
Als weiteren optionalen Schritt weist das Verfahren auf:

g) die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template.

Der Begriff „mikrobielle Cellulose“ bezeichnet eine Cellulose, die durch einen Mikroorganismus produziert wird. Beispielhafte Mikroorganismen sind Pilze, Bakterien und Algen. Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Cellulose herzustellen. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Algen wie Valonia und Boergesenia, Pilze wie Dictyostelium discoideum und Bakterien wie Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Sarcina, Pseudomonas, Rhizobium und Zoogloea. Beispiele von Gluconacetobacter spezies sind Acetobacter xylinum, Acetobacter pasturianus, Acetobacter aceti, Acetobacter ransens. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus ist Gluconacetobacter, insbesondere Gluconacetobacter xylinus.
Mikrobielle Cellulose wird herkömmlich durch Mikroorganismen an der Grenzfläche zwischen Luft und einem z.B. D-Glucose-haltigen Nährmedium in Form eines Biofilms (Vlies) hergestellt. Die Bakterien stoßen die Cellulose als Fibrillen aus. Diese lagern sich zu Fasern zusammen. Durch die Verflechtung der Fasern entsteht ein dreidimensionales, hoch wasserhaltiges Nanofaser-Netzwerk, das aus ca. 99% Wasser und 1% Cellulose besteht (Jonas R, Farah LF: Production and application of microbial cellulose. Polym. Degrad. Stab (1998), 59(1-3), 101-106; Hirai A, Horii F: Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum. ICR Annual Report (1999) 6, 28-29; Klemm D, Heublein B, Fink H-P, Bohn A: Cellulose: fascinating biopolymer as sustainable raw material. Angew. Chem. Int. Ed. (2005) 44, 3358-3393).
Das Kulturmedium, auch bezeichnet als „Nährlösung“ oder „Nährmedium“ enthält übliche Bestandteile zur Kultivierung eines Cellulose produzieren Mikroorganismus, wie z.B. Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Natriumhydrogenphosphat und Citronensäure in wässriger Lösung (Hestrin-Schramm-Medium). Ein alternatives saures Medium besteht aus einer wässrigen Lösung von Glucose, Pepton, Hefe, Essigsäure und Ethanol.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40°C durchgeführt.
Mikrobielle Cellulose wird, sofern sie von Bakterien hergestellt wird, auch mit den Begriffen „bakterielle Cellulose“ und „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) bezeichnet. Der Begriff „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) ist daraus hergeleitet, dass bakteriell produzierte Cellulose wie oben erwähnt ein Nanofasernetzwerk bildet.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach dem Stand der Technik sind unter anderem folgende:

I. Wird die Cellulose an der inneren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die innere Formkörperwandung ohne Begrenzung aber in ständigem Kontakt zur Kulturlösung „frei“ im Raum entwickelt und stellt die ursprünglich erste (älteste) und lockerere Cellulosegelschicht dar. Im Verlauf der Kultivierung steht der an der inneren Hohlträgeroberfläche gebildeten Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt, immer weniger Platz zur Verfügung. Die Ausbildung von Störstellen (Faltungen, Verdichtungen) innerhalb des Schichtsystems und am Lumen ist die Folge. Weitere wesentliche Nachteile dieser Methoden bestehen demnach darin, dass die auf diese Weise hergestellten Hohlzylinder keine hinreichend glatte, homogene innere Oberfläche aufweisen. Da neben der Ausbildung von gravierenden Oberflächeninhomogenitäten durch Falten- oder Muldenbildung auch die Gefahr der Ablösung von Teilen der Cellulose gegeben ist, bergen diese Hohlzylinder ein sehr großes Thromboserisiko. Die Qualität des inneren Lumens kann den Anforderungen an einen Blutgefäßersatz nicht entsprechen.
II. Wird die Cellulose an der äußeren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die jüngste Celluloseschicht immer zwischen bereits gebildeten Celluloseschichten und der äußeren Oberfläche des Hohlträgers gebildet. Daher entspricht das Lumen des BNC-Hohlkörpers, wenn der Hohlträgers entfernt wurde, der aktuell synthetisierten jüngsten, festeren Celluloseschicht, die eine hohe Bakterienzahl enthält (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21). Im Verlauf der Kultivierung muss die an der äußeren Hohlträgeroberfläche gebildete Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt und damit nach außen ortsverlagert wird, eine immer größere Fläche abdecken. Morphologische Veränderungen können die Folge sein. Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) berichten von einem, die Gefäßwand aufbauendem Schichtensystem aus sehr vielen, nicht fest miteinander verbundenen Einzelschichten ähnlicher Morphologie, so dass die Gefahr des Ablösens bzw. Verschiebens einzelner Schichten gegeben ist.
III. Außerdem kann davon ausgegangen werden, dass die Oberflächentopgraphie (Rauhigkeit) des inneren Lumens sehr stark von der Oberflächenstruktur des eingesetzten gas-permeablen Materials (Poren, Spalten, Kanäle und andere Unregelmäßigkeiten) bestimmt wird. Poröses Material erlaubt nur die Passage von Mikrosauerstoffblasen, die die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen nicht gleichmäßig über die gesamte Wachstumsebene gewährleisten und somit die Cellulosebildung stören und zu Defekten/Inhomogenitäten in der gesamten aufgebauten hohlen Cellulose, insbesondere aber auch im Lumen der hohlen Cellulose führen können.
IV. Nicht-poröses Material soll die gleichmäßige Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen gewährleisten und die Gasblasenbildung unterbinden. Als mögliche Folge kann eine zu starke Haftung der BNC am Trägermaterial angenommen werden. Die Isolierung des Cellulosetubes führt zu Verletzungen der inneren Oberfläche.
V. Durch die Erhöhung des angelegten partiellen Sauerstoffdrucks an der äußeren Wandung eines gaspermeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie in WO 2008/040729 A2 beschrieben, wird ein Gasüberdruck an der inneren Wandung des gebildeten Cellulosehohlkörpers initiiert. Dieser Gasüberdruck wirkt zum einen der Diffusion der Kulturlösung durch die gebildete Cellulose entgegen, zum anderen können auch Ablöseprozesse der sich bildenden Cellulose vom Träger während der Kultivierung nicht ausgeschlossen werden. Das Einschließen von Gasblasen führt zu Fehlstellen/Inhomogenitäten innerhalb der Cellulose sowie an der inneren Oberfläche.
VI. Die hohe Konzentration an Cellulose-synthetisierenden Bakterien über die gesamte innere Oberfläche der Cellulosehohlkörper stellt hohe Anforderungen an eine sich an Produktion und Isolierung anschließende Reinigung, da bei Verwendung der so hergestellten Cellulosehohlkörper als Blutgefäßersatz diese innere Oberfläche der Kontaktfläche mit dem Blut entspricht. Trotz intensiver Reinigung können Reaktionen des Immunsystems auf Verunreinigungen nicht ausgeschlossen werden.
VII. Wird BNC an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen kultiviert, ist von verminderter Biokompatibilität, -stabilität sowie fehlender Bioaktivität des Materials auszugehen. Außerdem ist das Kultivierungsverfahren an sich nur sehr eingeschränkt steuerbar. Lediglich die Sauerstoffzufuhr und der Durchmesser der Hohlkörper-Membranen bieten die Möglichkeit, auf die Morphologie des BNC-Hohlkörpers und damit auf mechanische Eigenschaften Einfluss zu nehmen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Kultivierung nicht rein statisch, sondern in sogenannter „bewegt-statischer“ Form, wobei das Template oder das Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus, oder beides, gesteuert so bewegt werden, dass die Oberfläche des Templates benetzt wird. Ein dauerhafter Kontakt des Templates mit dem Gemischvorrat wird jedoch ausgeschlossen. Das Template und der Gemischvorrat, der das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, werden relativ zueinander bewegt und dabei zeitweise, aber nicht ständig, in Kontakt gebracht.
Kennzeichen des Verfahrens sind ein periodisch aber nicht dauerhaft mit Kulturlösung und Mikroorganismus in Kontakt gebrachtes Template, die Ausbildung eines Films, der Kulturmedium und Mikroorganismus enthält, auf dem Template und die Biosynthese der Cellulose auf dem Template ausschließlich in und/oder auf dem Film - außerhalb des Gemischvorrats. Der Begriff „Unterbrechung des Kontakts“ bedeutet, dass der Kontakt zwischen Template und Gemischvorrat so unterbrochen wird, dass kein Teil der Oberfläche des Templates während der Unterbrechung Kontakt zum Gemischvorrat hat.
Es wird in dem Verfahren die Innenkontur des Hohlkörpers durch ein geeignet geformtes Template vorgegeben, auf dessen Oberfläche sich bei Durchführung des Verfahrens ein Flüssigkeitsfilm befindet, in welchem die Biosynthese der Cellulose abläuft. Somit bildet die direkt auf der Templateoberfläche erzeugte Cellulose später die innere Oberfläche des Hohlkörpers. Auf dieser auf der Templateoberfläche erzeugten Cellulose kann durch das Verfahren weitere Cellulose erzeugt werden.
Durch periodischen, aber vorzugsweise kurzzeitigen Kontakt mit dem Kulturmedium wird eine Versorgung der Mikroorganismen mit Nährstoffen etc. sichergestellt. Die äußere Formung des Hohlkörpers erfolgt erfindungsgemäß berührungsfrei, ausschließlich durch den Einfluss der Schwerkraft. Nach dem Benetzungsvorgang befindet sich das benetzte Template frei in der umgebenden Sauerstoff-haltigen Atmosphäre und der Cellulosebildungsprozess erfolgt in und/oder auf dem Film.
Bei dem Verfahren ist kein äußerer Formkörper vonnöten wie z.B. bei Verfahren der statischen Kultivierung, wo mikrobielle Cellulose durch Kultivierung eines Cellulose-bildenden Mikroorganismus in einem Raum zwischen zwei Wandungen gebildet wird. Die äußere Formgebung des Hohlkörpers wird ausschließlich durch die Wahl der Kultivierungsbedingungen definiert. Zu den Kultivierungsbedingungen zählen beispielsweise die Richtung der Schwerkrafteinwirkung, die Häufigkeit und der Abstand einzelner Drehungen, das Zeitintervall zwischen den Benetzungen, die Benetzungszeit, die Verweilzeit, wie nachfolgend noch erläutert, die Temperatur, und die Kultivierungsdauer. Während des Verfahrens ist ein Kulturlösungs- und Sauerstoffaustausch zwischen der sich bildenden Schicht des Hohlkörpers und dem Kultivierungsmillieu gegeben, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist.
Bei dem Verfahren werden Prozesse vermieden, bei welchen Stoffe durch eine bereits gebildete Celluloseschicht hindurchtreten müssen, was zu Störungen im Aufbau dieser Schichten führen kann.
Erfindungsgemäß erfolgen eine kurzzeitige Benetzung und damit die erforderliche Zufuhr der Kulturlösung an den Ort der Biosynthese. Damit ist die Zufuhr der Kulturlösung im Gegensatz zu den genannten und diskutierten Publikationen nicht mehr diffusionsbestimmt. Bei der Benetzung werden alle für die Biosynthese notwendigen Nährstoffe sowie Bakterien übertragen.
Bei der BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben wird zwar die Diffusionsbarriere überwunden, was durch eine ständige rotierende Bewegung des Templates in der Kulturlösung erreicht wird. Der dauerhafte Kontakt der Mikroorganismen mit der Kulturlösung führt aber zu BNC-Produkten mit strukturellen Nachteilen, wie bei der Würdigung des Standes der Technik genannt. Durch die gesteuerte Zufuhr der Kulturlösung wird erfindungsgemäß die Cellulosebildungsgeschwindigkeit so geregelt, dass optimale Verdichtungs- und Verfestigungsprozesse ermöglicht werden.
Überraschend bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Bedingungen für die Anlagerung von Bakterien an ein Template und deren gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig wird die BNC mit in der Kulturlösung freibeweglichen Bakterienzellen beladen.
Der Ort der Biosynthese und damit der Ort der höchsten Bakterienkonzentration befinden sich in der äußeren Grenzschicht des Hohlkörpers und damit nicht auf der Seite des Hohlraums, der bei einem künstlichen Blutgefäß das perspektivisch mit Blut in Kontakt stehende Lumen bildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren, kann in der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Es wird vorzugsweise in einer zuvor sterilisierten Vorrichtung durchgeführt und mit sterilem Kulturmedium. In einer Variante können das Kulturmedium und die Vorrichtung getrennt voneinander sterilisiert werden. In einer anderen Variante werden das Kulturmedium und die Vorrichtung gemeinsam sterilisiert und anschließend der Mikroorganismus zugeführt.
Mit dem Verfahren wird die Herstellung von Cellulosehohlkörpern mit verschiedenen Mikro- und Nanostrukturen ermöglicht. Es ist möglich, Mikro- und Nanostrukturen gezielt aufzubauen. Es können biomimetische Hohlkörper erzeugt werden. Der Begriff „biomimetisch“ bedeutet, dass ein menschliches oder tierisches Hohlorgan, beispielsweise ein Blutgefäß, durch den erfindungsgemäß hergestellten Hohlkörper strukturell und/oder funktionell nachgebildet wird, wobei die strukturellen/funktionellen Eigenschaften der natürlichen Vorlage nicht notwendigerweise exakt erfüllt sein müssen. Der Begriff „biomimetische Struktur“ bezeichnet insbesondere eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur.
Mit dem Verfahren hergestellte BNC-Implantate sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet.
Unter einem Hohlkörper ist ein Körper zu verstehen, der eine Wand aufweist, die einen Hohlraum umgibt. Die Wand kann eine oder mehrere Öffnungen haben, durch welche der Hohlraum zugänglich ist.
Grundsätzlich kann der Hohlkörper beliebig geformt sein. Die Form wird dem späteren Einsatzzweck angepasst. Für medizinische Verwendungen als Implantat kann der Hohlkörper z.B. die Form eines Blutgefäßes, einer Speiseröhre, eines Teils des Verdauungstrakts, einer Luftröhre, einer Harnröhre, eines Gallengangs, eines Harnleiters, eines Lymphgefäßes oder einer Manschette (cuff) haben. Diese natürlichen Formen können exakt oder annähernd erreicht sein.
In einer Ausführungsform hat der Hohlkörper die Form einer Röhre oder eines Hohlzylinders. Ferner kann der Hohlkörper eine oder mehrere Biegungen aufweisen, beispielsweise eine Röhre mit einer oder mehreren Biegungen sein. Weiterhin kann der Hohlkörper eine oder mehrere Verzweigungen bzw. Verästelungen aufweisen, beispielsweise kann der Hohlkörper eine Y-Form haben.
Länge und Innendurchmesser des Hohlkörpers sind variabel und variabel miteinander kombinierbar. Beispielhafte Innendurchmesser sind 1-30 mm, vorzugsweise 2 bis 8 mm, und beispielhafte Längen sind 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Das Längen-Durchmesser-Verhältnis ist vorzugsweise größer 1. Der Innendurchmesser kann auch innerhalb eines Hohlkörpers variieren.
Der Hohlkörper, insbesondere sein Hohlraum, kann statt eines runden auch einen anders geformten Querschnitt, beispielsweise einen quadratischen, rechteckigen, dreieckigen, oder sternförmigen Querschnitt aufweisen.
Das Template, oder auch „Templat“, ist wie bereits erwähnt die Negativform des Hohlraums des Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums. Der Begriff „Negativform“ bezeichnet das Hilfsmittel, die Positivform ist das gewünschte Ergebnis, in diesem Fall der/die Hohlkörper/Hohlraum/Hohlraumwand. Das Template ist komplementär zur Form des gewünschten herzustellenden Hohlraums geformt und wird entsprechend vorgegeben. Entsprechend ist über die Form der oben angegebenen Hohlkörper auch die Form des Templates definiert. Das Template gibt die Innengeometrie des Hohlkörpers vor. Beispielsweise ist das Template zylinderförmig, mit einem Durchmesser von 1-30 mm, vorzugsweise 2-8 mm, und einer Länge von 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Wie der Hohlkörper oder Hohlraum kann das Template aber einen beliebigen Querschnitt besitzen, wie rund, eckig, insbesondere quadratisch, rechteckig, dreieckig, oder stern- oder schneeflockenförmig. Ebenso wie der Hohlkörper kann das Template Verzweigungen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform hat das Template eine 2-dimensionale oder 3-dimensionale gitterartige Struktur.
In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist. Die Strukturen sind beispielsweise Erhebungen oder Vertiefungen oder beides. Die Strukturen können verschiedene Geometrien aufweisen. Über eine Templateoberfläche können gleichartige oder verschiedene Strukturen regelmäßig oder unregelmäßig verteilt sein.
Die Templateoberfläche kann so ausgeführt sein, dass die bei dem Hohlkörper erzeugte innere Oberflächenstruktur, d.h. die Struktur der Oberfläche, die an den Hohlraum angrenzt, der späteren Funktion des Hohlkörpers angepasst ist. Sollen z.B. Hohlkörper als Blutgefäßersatz synthetisiert werden, so kann die Oberfläche des Templates so strukturiert sein, dass die innere Oberfläche des synthetisierten Hohlkörpers später eine gute Endothelisierung ermöglicht.
Das Material, woraus die Oberfläche des Templates gefertigt ist, ist prinzipiell nicht beschränkt. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, wie Aluminium, Edelstahl oder Titan, Kunststoff, Keramik, synthetischen Polymeren wie Polypropylen, Polyestern, Polyamiden oder Teflon, Papier Textilgewebe oder Glas. Es kann auch das gesamte Template aus einem der genannten Stoffe bestehen. Das Template selbst kann ein Hohlkörper oder massiv (Vollkörper) sein.
Die Oberfläche des Templates kann unbehandelt sein oder vorbehandelt sein. Beispielsweise kann die Vorbehandlung eine Veränderung der Oberflächenmorphologie sein, z.B. durch ätzen, polieren, aufrauen. Die Oberfläche kann beschichtet oder mit chemischen Verbindungen vorbehandelt oder überzogen sein
Das Template ist so beschaffen, dass zum einen optimale Bedingungen für die Bindung und Versorgung des Mikroorganismus an seiner Oberfläche und eine Haftung der Cellulose erreicht werden. Zum anderen wird das Template so gewählt, dass das Produkt auf einfache Weise vom Template gelöst werden kann, um den Hohlkörper zu erhalten. Die Oberfläche des Templates ist so beschaffen, dass die Oberflächenqualität der bei Implantation in Kontakt mit Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, tretenden Oberfläche des Hohlkörpers reproduzierbar ist.
In einer speziellen Ausführungsform wird in dem Verfahren eine Anordnung aus mehreren Templates eingesetzt, auch bezeichnet als Template-Matrix. Es können Templates mit gleicher oder unterschiedlicher Geometrie, insbesondere unterschiedlicher Querschnitte, und/oder aus gleichem oder unterschiedlichem Material eingesetzt werden. Dadurch können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere gleiche oder unterschiedliche Hohlkörper erhalten werden. Ein Beispiel für eine Anordnung aus mehreren Templates ist eine Anordnung aus mehreren zylinderförmigen Templates zur Herstellung mehrerer hohlzylinderförmiger bzw. röhrenförmiger Hohlkörper. Mehrere Templates gleicher oder unterschiedlicher Geometrie können in einer Einspannvorrichtung fixiert sein (Template-Matrix), welche mit einer Benetzungseinrichtung und/oder Bewegungseinrichtung verbunden ist, wie in den Ausführungsbeispielen erläutert.
In dem Verfahren wird das Template periodisch, vorzugsweise kurzzeitig, mit dem Gemisch, das die Kulturlösung und den Mikroorganismus umfasst, benetzt. Hierbei bildet sich ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates. Die Form dieses Flüssigkeitsfilmes wird durch die Lage des Templates im Raum bestimmt, da die Schwerkraft auf diesen Film einwirkt.
Auf der Oberfläche des Templates wird ein Flüssigkeitsfilm gebildet, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst. In und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm wird mikrobielle Cellulose gebildet. Der Flüssigkeitsfilm wird auf dem Template verteilt, indem das Template um mehrere Raumachsen rotiert wird, z.B. mittels der Bewegungseinrichtung wie in den Beispielen erläutert. Durch eine vorgegebene Bewegung des Templates wird eine noch bessere Verteilung der Flüssigkeit auf der Oberfläche des Templates erreicht. Die Verteilung der Flüssigkeit kann durch die Art der vorgegebenen Rotationsbewegung des Templates beeinflusst werden, wobei die Rotationsbewegung auch unterbrochen werden kann. Die äußere Geometrie des Hohlkörpers wird somit durch eine definierte Verteilung eines Flüssigkeitsfilmes und durch eine definierte Bewegung unter dem Einfluss der Schwerkraft bestimmt.
Vorzugsweise hat das Template eine Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1. Beispielsweise hat das Template eine stab-, kegel- oder zylinderförmige Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1, zur Herstellung eines röhren- oder hohlzylinderförmigen Hohlkörpers, wobei Verzweigungen vorgesehen sein können. Bei dieser Geometrie weist das Template eine Längsachse auf. Das Verfahren wird dann so durchgeführt, dass das Template um mehrere Raumachsen rotiert wird, die vorzugsweise quer, mehr bevorzugt senkrecht zur Längsachse des Templates ist/sind.
Wie erwähnt, wird ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates gebildet. Der Flüssigkeitsfilm wird dadurch gebildet, dass das Template und das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, relativ zueinander bewegt und dabei in Kontakt gebracht werden. Grundsätzlich kann die Relativbewegung derart sein, dass das Template, oder das Gemisch, welches Kulturmedium und Mikroorganismus aufweist, oder das Template und das Gemisch bewegt werden.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Template in das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht wird. Eine Bewegung des Templates um mehrere Raumachsen kann einer Ein- und Austauchbewegung des Templates überlagert sein.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus dem ersten Gemischvorrat über das Template gegossen wird. Nach dem Gießen des Gemisches über das Template wird vorzugsweise nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch aufgefangen und für ein weiteres Übergießen wieder verwendet.
In einer Variante erfolgt das in Kontakt Bringen der Oberfläche eines Templates mit dem Gemisch derart, dass das Gemisch aus Kulturmedium und Mikroorganismus auf das Template gesprüht wird.
Die sauerstoffhaltige Atmosphäre ist vorzugsweise Luft oder reiner Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gasgemisch. Mikrobielle Cellulose wird in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm gebildet wird, wenn dieser mit Sauerstoff in Kontakt kommt.
Der Kontakt zwischen dem Template und dem Gemischvorrat wird bei dem Verfahren unterbrochen und die Synthese der Cellulose erfolgt nur in oder auf dem Flüssigkeitsfilm, der von dem Gemischvorrat getrennt wurde. Dadurch spielen etwaige Diffussionsprozesse von Kulturlösung und Sauerstoff eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Überraschenderweise wurde gefunden, dass keinerlei Cellulose-Bildung innerhalb bzw. auf der Flüssigkeitsoberfläche des Gemischvorrats stattfindet.
Am Ende des Verfahrens können Template und Cellulose voneinander getrennt werden, um den Hohlhörper ohne Kern zu erhalten. Daher erfolgt als optionaler Schritt die Trennung des Templates von der gebildeten Cellulose, sodass ein Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose ohne Template erhalten wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren als „Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose“ bezeichnet. Nach Trennung von dem Template kann der BNC-Hohlkörper gereinigt und sterilisiert werden.
Die mikrobille Cellulose kann alternativ auf dem Template verbleiben, ohne dass der beschriebene optionale Trennungsschritt durchgeführt wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren als „Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose“ bezeichnet. Das Vorprodukt bezeichnet das Template mit darauf befindlicher mikrobieller Cellulose. Die mikrobielle Cellulose kann auf dem Template gereinigt und sterilisiert werden, ohne dass sie zuvor von dem Template entfernt wird. Desweiteren kann die mikrobielle Cellulose mit dem Template zusammen gelagert werden, ohne dass sie von dem Template entfernt wird. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon. Zur endgültigen Verwendung kann dann die mikrobielle Cellulose vom Template getrennt werden, um einen Hohlkörper zu erhalten. Die Trennung erfolgt z.B. dadurch, dass die gebildete Cellulose von dem Template abgezogen wird oder das Template auf andere Art und Weise entnommen wird. Beispielsweise wird die Cellulose von einem zylinderförmigen Template abgestreift und ein Hohlzylinder ohne Template-Kern erhalten. Durch eine Reinigungsflüssigkeit kann, wenn die Cellulose damit auf dem Template gereinigt wird, die Ablösung der Cellulose von dem Template befördert werden. Je nach verwendetem Material kann das Template nach schonender Reinigung seiner Oberfläche wieder verwendet werden. Es ist aber auch möglich, das Template zum Zweck der Trennung von der Cellulose zu zerstören.
Das Template wird zumindest während Schritt c) und/oder dem Schritt f), oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um mehrere Raumachsen rotiert. Mit dieser Maßnahme kann die Form und Verteilung des Flüssigkeitsfilms und die Form des sich bildenden Produktes beeinflusst werden. Anders ausgedrückt wird dabei das Template mit einem definierten Flüssigkeitsfilm überzogen, was wiederum zu einer definierten Form des sich bildenden Produktes führt. Die Rotation kann auch bereits während Schritt a) und b) und/oder während der Schritte d) und e), erfolgen. Wenn beispielsweise das Template zur Benetzung relativ zu dem Gemischvorrat bewegt und mit diesem in Kontakt gebracht wird, dann kann zusätzlich eine der Bewegung des Templates überlagerte Relativbewegung um mehrere Raumachsen erfolgen.
Diese Folge der Schritte d)-f) kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, bis eine gewünschte Menge Cellulose auf der Oberfläche des Templates erzeugt ist und die Cellulose eine gewünschte Gesamtschichtdicke erreicht hat. Die sogenannte Gesamtschicht kann aus mehreren Einzelschichten bzw.-Phasen zusammengesetzt sein. Bei dieser Verfahrensvariante erfolgt eine Synthese weiterer mikrobieller Cellulose auf bereits gebildeter Cellulose.
Die oben beschriebene Rotation kann bei jedem der Schritte f) (erster Schritt f und Wiederholungen davon, wenn die Schrittfolge d)-f) wiederholt wird) erfolgen. Anders ausgedrückt, erfolgt das Rotieren um mehrere Raumachsen nicht zwingend nach jedem Benetzungsvorgang. In einer Verfahrensvariante wird die Folge der Schritte d)-f) 1-40 mal, vorzugsweise 1 - 30 mal durchlaufen ohne dass eine Rotationsbewegung des Templates zur Verteilung des Flüssigkeitsfilms erfolgt und in zumindest einem darauffolgenden Schritt f), wenn die Folge der Schritte d)-f) erneut durchlaufen wird, erfolgt eine Rotation um mehrere Raumachsen.
Die Zeiten des in Kontakt Bringens der Oberfläche eines Templates (Schritt a) mit einem Gemischvorrat und des in Kontakt Bringens des in Schritt c) erzeugter mikrobieller Cellulose mit dem Gemischvorrat (Schritt d) werden als „Benetzungszeiten“ bezeichnet. Die Zeiten des in Kontakt Bringens des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre (Schritte c und f) werden als „Verweilzeiten“ bezeichnet. Benetzungszeiten und Verweilzeiten können von einander unabhängig gesteuert werden. Die Verweilzeit beträgt in einer Ausführungsform 1-60 Minuten, vorzugsweise 5-40 min.
Die Gesamtkultivierungszeit beträgt vorzugsweise 1-7 Tage. Die Gesamtkultivierungszeit entspricht der gesamten Prozesszeit, innerhalb welcher alle Schritte des Verfahrens, wie Dreh-, Benetzungs- und sonstige Schritte ablaufen. Die Dauer des Verfahrens bestimmt die Dicke der auf dem Template gebildeten Cellulose-Gesamtschicht, die der Wandstärke des isolierten Hohlkörpers entspricht und die wie oben erwähnt aus mehreren Einzelschichten zusammengesetzt sein kann.
Die mit dem Verfahren hergestellten Hohlkörper können gereinigt werden, um Reste und Bestandteile des Kulturmediums und Mikroorganismen zu entfernen. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon.
Die mit dem Verfahren erhaltenen Hohlkörper können ohne Trocknung nach einem Reinigungsprozess und Sterilisation als feuchte Implantate eingesetzt werden.
Andererseits können die Hohlkörper zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet werden, wobei die Struktur und die Wiederquellbarkeit von Nanocellulose erhalten bleiben. Vor einer chirurgischen Anwendung kann das Implantat beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum wieder gequollen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, der durch das vorangehend beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Wie bereits zuvor beschrieben unterscheidet sich das Verfahren grundsätzlich von den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Der Aufbau von Cellulose findet nach einem gänzlich verschiedenen Mechanismus statt. Bei der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach WO 2008/040729 A2 wird während des Biosyntheseprozesses die jeweils jüngste Schicht an der Grenzfläche Nährmedium/sauerstoffpermeabler Hohlträger gebildet. Die jüngste Schicht wird also auf der Seite des späteren Hohlraums des Hohlkörpers gebildet und ältere Schichten wandern nach außen. Der Sauerstoffeintrag erfolgt von der Seite des Lumens und Nährstoffe müssen von der Außenseite zugeführt werden und bereits gebildete Cellulose-Schichten durchdringen. Bei diesem Verfahren ist keine Zufuhr von Mikroorganismen von außen möglich, da diese nicht durch die Poren passen. Cellulose wird durch die immer gleichen Mikroorganismen gebildet, die bereits am Ort der Cellulosebildung lokalisiert sind. Es könnte lediglich eine Vermehrung durch Zellteilung erfolgen.
Abweichend davon erfolgt die Biosynthese im vorliegenden Verfahren auf der Außenseite des Hohlkörpers, an der Grenzfläche von Gemischfilm zu umgebender sauerstoffhaltiger Atmosphäre. Dadurch ist die jüngst gebildete Cellulose außenseitig lokalisiert und bereits gebildete Cellulose bleibt während der Synthese ortsfest. Der Sauerstoffeintrag erfolgt im Gegensatz zu WO 2008/040729 A2 von der Außenseite, und auch die Mikroorganismen und Nährstoffe werden der Außenseite zugeführt, müssen also bereits gebildete Cellulose-Schichten nicht durchdringen. Im vorliegenden Verfahren ist eine Zufuhr von Mikroorganismen von der Außenseite im Gegensatz zu WO 2008/040729 A2 möglich.
Durch diese unterschiedlichen Bildungsprozesse wird ein Produkt mit neuartiger Struktur erhalten.
Insbesondere weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche eine identische oder ähnliche Bedeckung durch Fasern aus mikrobieller Cellulose pro Flächeneinheit aufweisen. Wie erwähnt, bilden BNC Fasern mehr oder weniger dichte bzw. mehr oder weniger poröse Netzwerke aus. Mit Methoden der Bildauswertung ist es möglich, Oberflächenbereiche, in denen sich Fasern befinden (in einer REM Aufnahme beispielsweise heller) von Oberflächenbereichen, in denen sich keine Fasern befinden (Lücken, in einer REM Aufnahme beispielsweise dunkler) abzugrenzen und die Bereiche ins Verhältnis zur betrachteten Gesamtfläche zu setzen. Die Bedeckung pro Flächeneinheit ist angegeben als $\begin{array}{l} Bedeckung = \\ Teil des betrachteten Flächenausschnitts, der von Fasern bedeckt ist / Gesamtfläche des \\ betrachteten Flächenausschnitts \end{array}$
Die Bedeckung kann als Prozentzahl angegeben werden. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich die Bedeckung auf der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Eine ähnliche Bedeckung wie oben definiert bedeutet eine ähnliche Porosität der inneren und äußeren Oberfläche, wobei die Porosität mit Bezug auf eine Oberfläche zweidimensional definiert ist als $\begin{array}{l} Porosität (zweidimensional) = \\ Teil der des betrachteten Flächenausschnitts, der nicht von Fasern bedeckt ist/ \\ Gesamtfläche des betrachteten Flächenausschnitts \end{array}$
Die nicht Fasern bedeckte Fläche kann als „offenporige Fläche“ oder „Porenfläche“ bezeichnet werden.
Für den Zusammenhang zwischen Bedeckung und zweidimensionaler Porosität gilt: $Porosität + Bedeckung = 1,$
oder ausgedrückt in Prozentzahlen: Porosität (%) + Bedeckung (%) = 100 %,
Bei der Bedeckung und Porosität können BNC Fasern mit berücksichtigt werden, die etwas außerhalb einer als zweidimensional angenommen inneren/äußeren Oberfläche liegen. Bei einer elektronenmikroskopischen Aufnahme erhält man eine zweidimensionale Darstellung der äußeren bzw. inneren Oberfläche der Wand des Hohlkörpers. Die abgebildeten BNC-Fasern liegen aber nicht immer in einer Ebene, da die Oberflächen eine gewisse Rauigkeit aufweisen können und/oder gegebenenfalls BNC Fasern mit abgebildet werden die aus Blickrichtung des Betrachters hinter der Oberfläche liegen. Es hat sich gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Hohlkörper die äußere Oberfläche der Wand rauer sein kann als die innere Oberfläche. Bei der Ermittlung der Bedeckung und Porosität werden vorzugsweise alle BNC Fasern mit berücksichtigt, die auf einer REM Aufnahme (10.000fache Vergrößerung) sichtbar sind und sie werden so behandelt als lägen sie in einer Ebene, da die Bedeckung/Porosität auf eine Flächeneinheit bezogen werden.
Somit weist der Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität, wie oben definiert aufweisen. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die Porosität, dass sich die zweidimensionale Porosität der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Eine gleichartige Porosität von innerer und äußerer Oberfläche seiner Wand macht den Hohlkörper der vorliegenden Erfindung aufgrund des gleichmäßigen Faseraufbaus insbesondere geeignet zur Verwendung als Tunica media, insbesondere von herznahen Arterien. Die Erfindung stellt einen Hohlkörper bereit, der durch Schichten hoher und funktionsrelvanter Oberflächenqualität begrenzt ist. Die Oberflächen sind vorzugsweise frei von Störstellen und Inhomogenitäten.
Bei dem Verfahren nach WO 2008/040729 A2 erhält man ausschließlich Hohlkörper mit einer glatten inneren Oberfläche und einer relativ dazu sehr porösen äußeren Oberfläche, wie in den 4A und 4B gezeigt. Die Porosität der inneren und äußeren Oberfläche, bzw. deren Bedeckungen mit Fasern, sind als nicht ähnlich beurteilt. Dies ist möglicherweise darin begründet, dass bei dem Verfahren nach WO 2008/040729 A2 die jüngste Schicht auf der Seite des späteren Hohlraums des Hohlkörpers gebildet wird und ältere Schichten nach außen wandern und aufgrund des zunehmenden Radius gedehnt werden. Der Wandaufbau besteht generell aus vielen Schichten, die rasterelektronenmikroskopisch deutlich unterscheidbar/voneinander abgegrenzt sind (5 der WO 2008/040729 A2 ).
Insbesondere weist der erfindungsgemäße Hohlkörper eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche auf, wobei die Wand mehrere Schichten aus mikrobieller Cellulose umfasst, welche parallel zur der inneren und äußeren Oberfläche der Wand verlaufen. Diese Schichten werden nachfolgend auch als „Phasen“ bezeichnet. Die Schichten entsprechen den oben bereits genannten „Einzelschichten bzw.-Phasen“ der Wand des Hohlkörpers. Die Phasen der Wand des erfindungsgemäßen Hohlkörpers stellen sich im Gegensatz zu den in WO 2008/040729 A2 offenbarten Schichten als in der Raserelektronenmikroskopie über größere Bereiche einheitliche Strukturen dar, weshalb in Abgrenzung zu WO 2008/040729 A2 hierin der Begriff „Phase“ gebraucht wird
Diese Phasen müssen nicht durch einen Verfahrenszyklus von Benetzung/Filmbildung und anschließender Cellulosebildung in oder auf dem Film erhalten sein. Eine Phase kann durch mehrere solche Verfahrenszyklen gebildet sein. Die Phasen sind mittels Rasterelektronenmikroskopie, beispielsweise bei 24facher Vergrößerung, optisch voneinander unterscheidbar. Die Phasen sind aus einem Netzwerk aus Fasern bakterieller Nanonocellulose aufgebaut, wobei die Faserstrukturen der Phasen beim Vergleich der Phasen gleich oder unterschiedlich sein können.
Vorzugsweise sind die Phasen in ihrer Dichte über die gesamte Phasendicke homogen. D.h. sie weisen keinen Dichtegradienten auf. Ferner sind die Phasen vorzugsweise auch frei von Störstellen (siehe auch 4 bis 6, 2.000fache Vergrößerung).
Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper, dessen Wand aus Schichten, auch bezeichnet als Phasen aufgebaut ist wie oben beschrieben, wobei eine der Schichten die innere Oberfläche, d.h. die hohlraumseitige Oberfläche, der Wand aufweist und eine weitere Schicht die äußere Oberfläche der Wand aufweist und wobei diese beiden Schichten eine identische oder ähnliche Porosität aufweisen. Die Schicht/Phase, die die innere Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als „Lumen-seitige Schicht/Phase“ oder „hohlraumseitige Schicht/Phase“ bezeichnet. Die Schicht/Phase, die die äußere Oberfläche der Wand aufweist, wird auch als „außenseitige Schicht/Phase“ bezeichnet.
Mit Bezug auf die räumlich ausgebildeten Schichten/Phasen ist die Porosität räumlich definiert als: $Porosität (räumlich, dreidimensional) = Hohlraumvolumen/Gesamtvolumen$
Bei dem Gesamtvolumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten und diesen Volumenteil zum Zweck der Messung der Porosität als „Gesamtvolumen“ zu betrachten. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die räumliche Porosität, dass sich die Porosität der Lumen-seitigen Phase und die Porosität der außenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: Unterschied (%) = (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert)/ zahlenkleinerer Wert * 100.
Eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert bedeutet, dass die Lumen-seitige Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche Dichte aufweisen. Ferner bedeutet eine identische oder ähnliche dreidimensionale/räumliche Porosität wie oben definiert, dass die Lumen-seitige Schicht/Phase und die außenseitige Schicht/Phase eine identische oder ähnliche Faserdichte aufweisen. Die Dichte wird vorzugsweise angegeben als Masse/Volumen und die Faserdichte wird angegeben als Anzahl Fasern/Volumen. Bei dem Volumen kann das Volumen der gesamten Schicht/Phase herangezogen werden. Es ist aber auch möglich, und bevorzugt, zur Bestimmung der Dichte oder der Faserdichte nur einen Teil des Volumens der Schicht/Phase zu betrachten. Der Begriff „ähnlich“ bedeutet mit Bezug auf die Dichte und Faserdichte, dass sich die Dichte/Faserdichte der Lumen-seitigen Phase und die Dichte/Faserdichte der außenseitigen Phase" relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, vorzugsweise maximal 10%, am meisten bevorzugt maximal 5%. Der Prozentwert des Unterschieds zwischen den Werten wird wie folgt ermittelt: $\begin{array}{l} Unterschied (%) = \\ (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert) /zahlenkleinerer Wert * 100. \end{array}$
Vorzugsweise sind zwischen der Lumen-seitigen Phase und der außenseitigen Phase eine oder mehrere weitere Phasen angeordnet. Besonders bevorzugt weisen diese eine oder mehrere weiteren Phasen eine identische oder ähnliche Porosität, Dichte und Faserdichte auf wie die Lumen-seitige Phase und die außenseitige Phase.
Vorzugsweise sind die Phasen so fest miteinander verbunden, dass sie bei mechanischer Beanspruchung in einem Zugversuch nicht voneinander delaminieren. Dies bedeutet insbesondere, dass keine Delamination in Form verschiedener Peaks im Zug-Dehnungsdiagramm sichtbar sind, wenn ein Zugversuch mit der Methode durchgeführt wird, wie sie in Bodin A et al., Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434 auf Seite 427 unter der Überschrift „Tensile Measurement“ beschrieben sind. Hierbei wird ein Ring aus BNC mit 4 mm Innendurchmesser und 5 mm Breite geschnitten und radial mit einer Geschwindigkeit von 0,25 mm/s gestreckt.
Insbesondere ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer Mittelachse, die mittig und längs der Zylinderausdehnung durch den Hohlraum verläuft. Insbesondere ist der Hohlkörper aus mindestens zwei, rotationssymmetrisch um die Hauptachse angeordneten, parallel zueinander verlaufenden, miteinander verbundenen, BNC-Phasen gekennzeichnet. Auf diese Weise kann ein biomimetischer Aufbau der Wand des Hohlkörpers erzeugt werden. Im Gegensatz zu WO 2008/040729 A2 sind die Phasen fest miteinander verbunden. Desweiteren besitzen die Phasen vorzugsweise einen homogenen Aufbau, ohne Störstellen und Strukturgradienten.
Überraschender Weise wurde gefunden, dass dieser Aufbau dem Hohlkörper über die gesamte Länge Formstabilität und gleichmäßig hohe mechanische Reiß- und Druckfestigkeit sowie ausreichende Elastizität unabhängig vom inneren Durchmesser des Hohlkörpers verleiht. Die Phasen sind vorzugsweise charakterisiert durch ein gleichmäßiges (isotropes), gut verzweigtes Fasernetzwerk. Anzahl und Stärke der Phasen sind kontrolliert einstellbar. Sie sind so angeordnet, dass sie der einem natürlichen Gefäß nahe kommenden Struktur insbesondere der Media entsprechen (biomimetische Struktur) und den Aufbau körpereigener Strukturen (Adventitia und Intima) sowie den Stoffaustausch vergleichbar mit dem natürlicher Austauschprozesse (bioaktives Material) anregen. Der Aufbau als geschichtete Phasenstruktur hat mutmaßlich, und ohne auf diese Erklärung festgelegt zu sein, eine mechanischen Stabilität, Biokompatibilität durch Endothelisierbarkeit der inneren Oberfläche, und eine Integration in die körpereigene Gewebestruktur zur Folge.
Der Hohlkörper weist vorzugsweise eine oder mehrere Öffnungen auf, durch die der Hohlraum des Hohlkörpers zugänglich ist. Bei den Öffnungen kann es sich z.B. um die Zufluss und die Abflussöffnung eines Blutgefäßteils handeln.
Geometrien des Hohlkörpers wurden bereits anhand des Herstellungsverfahrens weiter oben erläutert. In einer speziellen Ausführungsform ist der Hohlköper ausgewählt aus einer Röhre oder einem Hohlzylinder, der eine oder mehrere Verzweigungen aufweisen kann.
Die erfindungsgemäßen Hohlkörper sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften, gezielt einstellbare Mikrostrukturen (biomimetischer Aufbau) und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet. Weitere bevorzugte mechanische Eigenschaften, die beliebig mit den oben bereits beschriebenen mechanischen, strukturellen und geometrischen Eigenschaften kombinierbar sind, sind nachfolgend beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch einen Hohlkörper mit einer Nahtausreißfestigkeit im Bereich von 5 - 15 N, vorzugsweise 8-10 N, insbesondere einen Hohlzylinder oder eine Röhre mit einer solchen Nahtausreißfestigkeit. Die Nahtausreißfestigkeit wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist.
Ferner wird auch ein Hohlkörper mit einem Berstdruck von mindestens 400 mm Hg angegeben, vorzugsweise mindestens 600 mm Hg und am meisten bevorzugt mindestens 800 mm Hg. Der Berstdruck wird nach der Methode bestimmt, die in den Beispielen angegeben ist.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung auch ein künstliches Gefäß, insbesondere zur Anwendung als Implantat im menschlichen oder tierischen Körper, aufweisend einen Hohlkörper wie zuvor beschrieben. Der Hohlkörper kann als Komposit mit weiteren Stoffen vorliegen, beispielsweise mit anderen Polymeren als BNC wie z.B. Cellulosederivate, Alginat oder Proteine, beispielsweise zum Zweck der Verbesserung der mechanischen Eigenschaften. Der Hohlkörper kann zusätzlich Wachstums- und/oder Rekrutierungsfaktoren und/oder andere biologisch wirksame Stoffe enthalten, beispielsweise zum Zweck der Verbesserung ihrer Bioaktivität durch Anlagerung und Einwanderung körpereigener Zellen.
Wenn der Hohlkörper als künstliches Blutgefäß eingesetzt werden soll, dann kann er direkt in den Körper eingesetzt werden. Der Hohlkörper kann auch einer Vorbehandlung unterzogen werden, beispielsweise kann eine Adhäsion von Endothelzellen an die Oberfläche des Hohlkörpers erfolgen.
In noch einem Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Hohlkörpers oder eines künstlichen Gefäßes, wie vorangehend beschrieben, als medizinisches Implantat. Die Hohlkörper und künstlichen Gefäße können in medizinischen Anwendungen als innere Hohlstrukturen und -gefäße, wie Blutgefäße, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäße oder als Manschette (cuff) zur Umhüllung von körpereigenen Strukturen wie Hohlorganen oder Nervenfasern, oder als Interponat eingesetzt werden, wobei die Hohlkörper direkt oder nach Adaption an die Organspezifik eingesetzt werden können. Weitere Verwendungen sind die Verwendung als medizinisches Übungsmaterial, insbesondere für das realitätsnahe Training chirurgischer Techniken, in der cardiovaskulären Medizin und der Viszeralchirurgie, wozu die Hohlkörper auch mechanisch bearbeitet werden kann.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen

1 eine erste Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und eine statische Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht
2 eine alternative Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dynamischer Anordnung des Templates und dynamischer Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht
3 rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme eines erfindungsgemäßen BNC-Hohlzylinder-Querschnitts mit 3-Phasenaufbau
4 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase a
5 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase b
6 REM-Aufnahme des BNC-Netzwerks der Phase c

Beispiel 1: Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens
Die Vorrichtung 1 der 1 ist als Bioreaktor ausgeführt, mit einem Gehäuse 15, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Das Gefäß 9 ist mit der Abdeckung 8 verschließbar und hier im geschlossenen Zustand gezeigt. Das Gefäß 9 und die Abdeckung 8 können aus Edelstahl sein. In dem Bioreaktor befindet sich ein separates Reservoir 2 für das Gemisch 10, bestehend aus einer Kulturlösung und einem Mikroorganismus. Das Reservoir 2 und das Gemisch 10 können durch die Öffnung 17 des Gefäßes 9 eingebracht werden, wenn die Abdeckung 8 vom Gefäß 9 entnommen wird.
Eine weitere verschließbare Öffnung 19 ist in der Abdeckung 8 vorgesehen und mit einem Verschluss 20 verschlossen. Alternativ ist es daher auch möglich, das Reservoir 2 in das Gefäß 9 einzusetzen, die Abdeckung 8 zu schließen und die Kulturlösung bzw. das Gemisch durch die Öffnung 19 zuzugeben.
Mehrere Templates 3, hier Zylinder aus Metall oder Holz, sind zwischen zwei Einspannvorrichtungen 4 eingespannt und bilden eine Anordnung aus mehreren Templates (Template-Matrix).
Die Templates 3 sind über eine Kupplung 6, hier stabförmig, mit einem Motor 7 verbunden. Der Motor 7 kann den Stab 6 und die Templates 3 absenken und in das Gemisch 10 in dem Reservoir 2 eintauchen. In einer Gegenbewegung können die Templates wieder angehoben und ausgetaucht werden. Beim Austauchen verbleibt ein Film aus dem Gemisch 10 auf den Templates 3. Der Motor 7 und die Kupplung 6 bilden eine Benetzungseinrichtung. In der hier gezeigten schematischen und nicht maßstäblichen Darstellung ist die Kupplung 6 stark vereinfacht gezeichnet. Er ist so lang ausgeführt, dass die Eintauch- und Austauchbewegung möglich ist. Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist durch eine dynamische Anordnung der Templates 3 und eine statische Anordnung des Gemisches 10 aus Kulturlösung und Mikroorganismus gekennzeichnet: Das Gemisch 10 wird nicht bewegt, während zur Benetzung die Templates 3 durch eine Ab- und Aufwärtsbewegung in das Gemisch 10 ein- und ausgetaucht werden. Die Ein- und Austauchbewegung erfolgt translatorisch entlang der dargestellten Z-Achse.
Die Kupplung 6 ist durch die Öffnung in der Abdeckung 8 geführt. Der Spalt zwischen dem Rand der Öffnung und dem Stab ist durch die Dichtung 16 verschlossen, sodass der Innenraum 14 gegen die Umgebung 18 dicht verschlossen ist.
Durch eine schematisch dargestellte Bewegungseinrichtung 5 wird eine Bewegung der Templates 3 innerhalb des Innenraums 14 realisiert. Der Antrieb der Bewegungseinrichtung erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 wird um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind. Die Bewegungseinrichtung kann so ausgestaltet sein, dass der Zusammenbau statt um die X-Achse, oder zusätzlich dazu, um die eingezeichnete Y-Achse, oder um weitere Achsen, rotierbar ist. Denkbar ist beispielsweise eine kardanische Aufhängung des Zusammenbaus.
In der 2 weist die Vorrichtung 1 ein Gehäuse 15 auf, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Im Innenraum 14 befinden sich der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, ein erstes Reservoir 2 und ein zweites Reservoir 2' für das Gemisch 10. Das erste Reservoir 2 und das zweite Reservoir 2' sind gegenüber liegend, beidseitig des Zusammenbaus aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 angeordnet. Die Reservoire 2, 2' können in Richtung der Templates geöffnet werden. Mit Verschlusseinrichtungen 13, 13' können die Öffnungen der Reservoire 2, 2' wahlweise geöffnet oder geschlossen werden. Die Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind kein zwingendes Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung, aber vorteilhaft um ein ungewolltes Austreten von Gemisch 10, 10' aus den Reservoiren 2, 2' zu verhindern. Die schematisch dargestellten Verschlusseinrichtungen 13, 13' können beispielsweise mechanisch oder elektromagnetisch gesteuerte Ventile sein.
Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, das erste Reservoir 2, das zweite Reservoir 2' und die Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind von einer Umhüllung 12 umgeben und relativ zu dieser und relativ zueinander fixiert. Die Bewegungseinrichtung 5 greift an der Umhüllung 12 an.
Der Antrieb der Bewegungseinrichtung 5 erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus Hülle 12, Einspannvorrichtungen 4, Templates 3, Reservoirs 10, 10' im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Die Einspannvorrichtung 4 mit den Templates 3 werden um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind.
Im dargestellten Zustand der Vorrichtung ist das erste Reservoir 2 mit Gemisch 10 gefüllt. Bei einer Drehung im Uhrzeigersinn um 180° um die X-Achse wird das erste Reservoir 2 mitsamt Gemisch 10 in die obere Stellung bewegt, wo sich in dieser Darstellung noch das Reservoir 2' befindet. Dabei wird die Verschlusseinrichtung 13 geöffnet und das Gemisch 10 ergießt sich über die Templates 3. Nicht an der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch ergießt sich in das in die untere Stellung bewegte zweite Reservoir 2', dessen Verschlusseinrichtung 13' ebenfalls geöffnet wurde, und wird darin als Gemisch 10' aufgefangen (in der Darstellung der 2 bezeichnet 10' noch den Raum in den das Gemisch 10' fließt, noch nicht das Gemisch selbst). An der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch bildet dort einen Film aus. Der beschriebene Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden und findet bei der nächsten Drehung um die X-Achse um 180° in umgekehrter Richtung statt: das Gemisch 10', wird aus dem zweiten Reservoir 2' über die Templates 3 gegossen und nicht an der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch wird in dem ersten Reservoir 2 aufgefangen.
Die Benetzungseinrichtung (6, 7) und die Bewegungseinrichtung 5, welche die Templates 3 dreht, sind in der Ausführungsform der 2 zusammen gefasst: Die Bewegungseinrichtung (5) dreht die Reservoirs 2, 2' und die Templates 3 wie oben angegeben, wodurch wie erläutert eine Benetzung erfolgt. Zusätzlich zu der erwähnten Drehung um die X-Achse werden die Templates 3 und die Reservoirs 2, 2' auch um weitere Raumachsen gedreht, beispielsweise um die Y-Achse. In den Zeiträumen zwischen den Benetzungsvorgängen werden die Reservoirs 2, 2' mittels der Verschlusseinrichtungen 13, 13' verschlossen und die Templates 3 können mit der Bewegungseinrichtung 5 gedreht werden, ohne dass sich Gemisch 10 über die Templates ergießt. In dieser Zeit wird in und/oder auf dem Film auf der Oberfläche der Templates 3 die Cellulose gebildet.
Die Vorrichtung der 2 ist durch eine dynamische Anordnung der Templates und eine dynamische Anordnung der Kulturlösung gekennzeichnet. Die Vorrichtung ermöglicht ein Verfahren zum Aufbau von BNC-Implantaten bei dem gleichzeitig die Templates 3 und das Gemisch 10 periodisch bewegt werden.
Beispiel 2: Verfahren - Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose:
Allgemeines Vorgehen:
Zur Herstellung der Produkte werden Templates 3 zwischen Einspannvorrichtungen 4 angeordnet und in die Bewegungseinrichtung 5 eingesetzt. Der Reaktor wird daraufhin mit der Abdeckung 8 verschlossen und sterilisiert. Nach erfolgter Sterilisation des gesamten Reaktors wird/werden das Reservoir 2 oder die Reservoire 2, 2' unter sterilen Bedingungen mit einem Gemisch 10 aus Cellulose bildende Mikroorganismen und getrennt sterilisierter Kulturlösung 10 befüllt.
Es ist auch möglich, das Reservoir 2 / die Reservoire 2, 2' vor dem Sterilisationsvorgang mit Kulturlösung zu befüllen und zusammen mit allen anderen Einbauten im Bioreaktor zu sterilisieren und anschließend Mikroorganismen zuzugeben, beispielsweise durch eine verschließbare Öffnung im Gehäuse unter sterilen Bedingungen.
Daraufhin wird der Motor 7 gestartet, der die Bewegungseinrichtung 5 und die Benetzungseinrichtung 6, 7 in Bewegung gesetzt und die Template-Matrix 3, 4 entsprechend den vorgegebenen Kultivierungsbedingungen bewegt. Die Bewegungsarten der verschiedenen Ausführungsformen einer Vorrichtung wurden in Beispiel 1 erläutert. Die Bewegung erfolgt vorzugsweise diskontinuierlich mit Frequenzen vorzugsweise kleiner 0,01 Hz dahingehend, dass die Templates auf definierte Weise mit Kulturmedium 10 benetzt werden. Daraufhin oder gleichzeitig sorgt die Bewegungseinrichtung 5 durch gezielt überlagerte Bewegungen für eine definierte Verteilung des Flüssigkeitsfilmes. Während dieser Bewegung erfolgt die Kultivierung der bakteriellen Nanocellulose auf dem Template 3 an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeitsfilm und sauerstoffhaltiger Atmosphäre im Innenraum 14. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis das Produkt die gewünschte Form angenommen hat.
Sodann kann der Reaktor geöffnet, die Templates 3 mit den darauf gebildeten Hohlkörpern aus bakterieller Nanocellulose entnommen und der Aufarbeitung zugeführt werden. Die Hohlkörper werden von den Templates abgestreift, gereinigt und feucht gelagert oder getrocknet, wie im allgemeinen Beschreibungsteil beschrieben.
Mit einer abgewandelten Vorrichtung ist es auch möglich die Sterilisation und Aufarbeitung der synthetisierten Hohlkörper im Reaktor derart vorzunehmen, dass beim Öffnen des Reaktors das fertige Produkt entnommen werden kann. Durch eine nicht gezeigte Einrichtung könnte durch eine weitere Öffnung das Kulturmedium 10 durch entsprechende Reinigungs- bzw. Spülflüssigkeiten ersetzt werden.
Methoden:
Nahtausreißfestigkeit:
Durch die Wandung eines rohrförmigen Cellulosehohlkörpers wie im Bespiel beschrieben werden mit chirurgischem Nahtmaterial (z.B. PROLENE 5/0 (1 metric)) Schlingen derart angebracht, dass von der Außenseite in Richtung Lumen durch die Wandung des Hohlkörpers gestochen, das Nahtmaterial hindurchgezogen und danach verknotet wird.
Dieses Vorgehen entspricht der Herstellung einer sog. Einzelknopfnaht. Dieser Vorgang wird einige Mal (z.B. sechs Mal) wiederholt, so dass auf dem Umfang des Hohlkörpers sechs Schlingen angebracht sind.
In einer Zugprüfmaschine wird das den Schlingen entgegengesetzte Ende des Hohlkörpers fixiert und eine der Schlingen mit einem Haken erfasst, welcher mit dem Kraftaufnehmer der Prüfmaschine verbunden ist. Die Prüfmaschine wird in Funktion gesetzt, so dass sich Kraftaufnehmer und Fixierungspunkt voneinander entfernen. Hierbei ergibt sich ein Zug an der eingehängten Schlinge, welche beim Überschreiten einer bestimmten Zugkraft aus dem Hohlkörper herausgerissen wird. Diese Kraft wird an der Prüfmaschine abgelesen und der Versuch zur statistischen Absicherung des Meßwertes mit allen weiteren Schlingen in der beschriebenen Weise wiederholt. Der Mittelwert der ermittelten Kräfte ist die Nahtausreißfestigkeit des Hohlkörpers.
Berstdruck
Ein rohrförmiger Cellulosehohkkörper wie im Bespiel beschrieben wird waagerecht auf zwei Schlaucholiven mit Kabelbindern derart fixiert, dass eine abrutschsichere und weitgehend flüssigkeitsdichte Verbindung gegeben ist. Der Abstand der Oliven beträgt 100 mm. Eine der Schlaucholiven ist mit mit einem Ventil verbunden, die andere mit einem Reservoir, welches Wasser enthält und durch Druckluft mit Druck beaufschlagt werden kann. Der Druck in diesem Reservoir wird auf 200 mbar (ü) erhöht, bis der Celluloshohlkörper vollständig mit Wasser gefüllt ist. Danach wird das Ventil geschlossen und der Druck im Reservoir in einer Geschwindigkeit von 0,1-0,2 bar/s erhöht, bis der Cellulosehohlkörper versagt, was an einem starken Austritt von Wasser an einer eng begrenzten Stelle erkennbar ist. Der zum Zeitpunkt des Versagens im System herrschende Druck wird an einem Manometer abgelesen.
REM
REM-Untersuchungen wurden durchgeführt, um den biomimetischen Aufbau der BNC-Hohlzylinder zu belegen, dafür wurde das Material für 24 Stunden einer Gefriertrocknung unterzogen und mit Gold besputtert.
Beispiel 2.1
4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1,15 g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121°C für 20 min im Autoklaven dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung 1 wurde mit dem so hergestellten Gemisch befüllt.
Als Template 3 wurde ein bakteriophiles Rundmaterial (Holz) mit einem Durchmesser von 5 mm verwendet. Das periodische Benetzen die in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates mit der Kulturlösung, enthaltend den Mikroorganismus, wurde mit Hilfe des Motors 7 realisiert. Während des Kultivierungsprozesses wurden die in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates in einem Zeitintervall von 10 Minuten benetzt. Die überlagerte Drehbewegung um die Drehachsen 11 erfolgte nach jedem Benetzungsvorgang.
Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 6 Tagen wurde der Bioreaktor 1 einschließlich Template-Matrix demontiert, die hergestellten BNC-Hohlzylinder von ihren Templates 3 isoliert, sterilisiert und gereinigt.
Die Synthese lieferte BNC-Hohlzylinder mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 5 mm und einer Länge von 15 cm.
Die Struktur des erhaltenen BNC Hohlzylinders ist in den 3, 5-9 gezeigt, die rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen darstellen.
3 zeigt die REM-Aufnahme des Querschnitts eines BNC-Hohlzylinders in der Übersicht. Der Hohlzylinder ist aus 3 parallelen rotationssymmetrisch zur Achse gelegenen und untereinander fest verbundenen Schichten (a, b, c), hier bezeichnet als Phasen (a, b, c), aufgebaut. Die Phasenübergänge sind deutlich erkennbar.
Die Phase a weist die innere Oberfläche (hohlraumseitige Oberfläche) der Wand auf und wird auch als „Lumen-seitige Phase“ bezeichnet. Die Phase c weist die äußere Oberfläche der Wand auf und wird auch als „außenseitige Phase“ bezeichnet.
Bei der Lumen-seitigen Phase a ist sowohl die Querschnittsfläche als auch die dazu abgewinkelte Seitenfläche, die an die Phase b angrenzt, sichtbar. Der Schriftzug „Phase a“ ist auf die Querschnittsfläche gezeichnet. Die Seitenfläche der Phase a befindet sich rechts angrenzend dazu. Von den Phasen b und c sind nur Querschnittsflächen sichtbar, welche bei diesem Präparat gegenüber der Querschnittsfläche der Phase a nach hinten, in die Bildebene hinein, versetzt sind. Der Streifen rechts der Phase c ist ein Präparations-Artefakt und kein Teil der Wand oder einer Oberfläche davon. Der BNC-Hohlzylinder ist durch 2 Schichten/Grenzflächen hoher Oberflächenqualität begrenzt.
4-6 zeigen REM-Aufnahmen der Fasernetzwerkstrukturen der den BNC-Hohlzylinder aufbauenden Phasen a-c. Alle Phasen zeichnen sich durch einen sehr gleichmäßigen Faseraufbau ähnlicher Faserdichte aus. Alle drei Phasen a, b, c weisen eine ähnliche räumliche Porosität auf, definiert als Hohlraumvolumen/Gesamtvolumen. Der Aufbau der BNC-Hohlzylinder ist vergleichbar mit dem der Tunica media herznaher Arterien aus wechselnden Lagen elastischer (die von uns beschriebenen Phasenübergänge) und muskulärer Bauelemente (die von uns beschriebenen Phasen).
Die lumenseitige Phase a weist die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlkörpers auf, und die äußere Phase c weist die äußere Oberfläche des Hohlkörpers auf. Aufgrund des sehr gleichmäßigen Faseraufbaus und der ähnlichen Faserdichte der Phasen a und c weisen sehr wahrscheinlich die innere lumenseitige Oberfläche des Hohlzylinders und die äußere Oberfläche eine ähnliche Porosität und eine ähnliche Bedeckung mit Fasern auf, wobei bezüglich der Oberflächen die Porosität zweidimensional definiert ist wie in der Beschreibung angegeben.
Anwendungstests:
Die beabsichtigte Verwendung ist die Verwendung als Gefäßprothese. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke im Bereich von 800mmHg und höher. Die Nahtausreißfestigkeit lag im Bereich von 8-10N.
Die Blutverträglichkeit der Gefäßprothese aus Beispiel 2 wurde durch einen tierexperimentellen Test beurteilt, in dem Teile der Arteria carotis communis von Schafen mit dem hergestellten BNC-Implantat ersetzt wurden. Die BNC-Implantate überzeugten im chirurgischen Handling. Sie zeichneten sich durch vollständige Stabilität im Hochdrucktier aus (keine Risse oder Rupturen). Unmittelbar nach der Operation konnte ein ungehinderter Blutfluß beobachtet werden. Nach 3 Monaten wurde das künstliche Blutgefäß entnommen, das durch die Einbettung in Bindegewebe und die Ausbildung kleiner Blutgefäße innerhalb des Bindegewebes sehr gut in den tierischen Körper integriert war. Histologisch konnte eine „Biologisierung“ des Implantatmaterials nachgewiesen werden.
Lichtmikroskopische Untersuchungen nach tierexperimenteller Testung zeigen einen 3-Schichten-Wandaufbau des entnommenen BNC-Implantat-Komplexes, wobei die BNC als Media erhalten blieb, sich eine innere Endothelschicht und eine äußere Bindegewebsschicht ausbildeten.
Beispiel 2.2
4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1,15g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium) und bei 121°C für 20min im Autoklaven dampfsterilisiert wurde, wurden mit 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter beimpft. Die sterilisierte Vorrichtung 1 wurde mit dem so hergestellten Gemisch befüllt.
Als Templates (3) wurde ein bakteriophiles Rundmaterial (Holz) mit einem Durchmesser von 5mm verwendet. Das periodische Benetzen der in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates 3 mit der Kulturlösung, enthaltend den Mikroorganismus, wurde mit Hilfe des Motors 7 realisiert.
Während des Kultivierungsprozesses wurden die in einer Matrix-Anordnung zusammengefassten Templates 3 in einem Zeitintervall von 30 Minuten benetzt. Die überlagerte Drehbewegung um die Drehachsen 11 erfolgte nach jedem 30sten Benetzungsvorgang.
Nach Ablauf des Biosynthesezeitraums von 10 Tagen wurde der Bioreaktor 1 einschließlich Template-Matrix demontiert, die hergestellten BNC-Hohlzylinder von ihren Templates 3 isoliert, sterilisiert und gereinigt.
Die Synthese lieferte Gefäßprothesen mit einem inneren Durchmesser von 5 mm, einer Wandstärke von 3 mm und einer Länge von 15 cm. Untersuchungen zur Berstfestigkeit der Gefäßprothese ergaben Berstdrücke größer 800mmHg.
Bezugszeichenliste

1: Vorrichtung
2: Reservoir für Kulturlösung/Gemisch
3: Template
4: Einspannvorrichtungen
5: Bewegungseinrichtung
6: Kupplung
7: Motor
8: Abdeckung
9: Gefäß
10: Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus
11: Drehachsen
12: Umhüllung
13: Verschlusseinrichtung
14: Innenraum (mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre)
15: Gehäuse
16: Dichtung
17: Öffnung
18: Umgebung
19: Öffnung
20: Verschluss

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Vorprodukts eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, das die folgenden Schritte umfasst: a) in Kontakt bringen der Oberfläche eines Templates, das eine Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen Cellulose bildenden Mikroorganismus umfasst, b) Unterbrechen des Kontakts zwischen dem Template und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, c) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, d) in Kontakt bringen der in Schritt c) erhaltenen mikrobiellen Cellulose mit dem Gemischvorrat, e) Unterbrechen des Kontakts zwischen der mikrobiellen Cellulose und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche der mikrobiellen Cellulose ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, f) in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobieller Cellulose in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, dadurch gekennzeichnet, dass das Template zumindest während Schritt c) und Schritt f), um mehrere Raumachsen rotiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche hat, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, Kunststoff, Keramik, synthetischem Polymer, Papier Textilgewebe oder Glas hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei in den Schritten a) und d) eine Anordnung mehrerer Templates in den Gemischvorrat eingetaucht wird, und in den Schritten b) und e) die Anordnung mehrerer Templates aus dem Gemischvorrat ausgetaucht wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend ein einmaliges oder mehrmaliges Wiederholen der Folge der Schritte d), e) und f).
Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose, umfassend die Verfahrensschritte nach einem der Ansprüche 1-5, und weiterhin umfassend die Trennung der mikrobiellen Cellulose von dem Template.
Hohlkörper aus mikrobieller Cellulose, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 6.
Hohlkörper nach Anspruch 7, aufweisend eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche, wobei die innere Oberfläche und die äußere Oberfläche einen identischen oder ähnlichen Grad Bedeckung durch Fasern aus mikrobieller Cellulose pro Flächeneinheit aufweisen, wobei die Bedeckung angegeben ist als Teil eines betrachteten Flächenausschnitt, der von Fasern bedeckt ist / Gesamtfläche des betrachteten Flächenausschnitts, und ein ähnlicher Grad Bedeckung bedeutet, dass sich die Bedeckung auf der inneren Oberfläche und der äußeren Oberfläche relativ zueinander um maximal 20% unterscheiden, wobei der Prozentwert des Unterschieds wie folgt ermittelt ist: $\begin{array}{l} Unterschied (%) = \\ (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert) /zahlenkleinerer Wert * 100. \end{array}$
Hohlkörper nach Anspruch 7 oder 8, aufweisend eine Wand mit einer inneren Oberfläche und einer äußeren Oberfläche, wobei die Wand mehrere Schichten aus mikrobieller Cellulose umfasst, wobei die Schichten parallel zur der inneren und äußeren Oberfläche der Wand verlaufen.
Hohlkörper nach Anspruch 9, wobei die Schichten in ihrer Dichte über die gesamte Schichtdicke homogen sind.
Hohlkörper nach Anspruch 9 oder 10, wobei eine Schicht die innere Oberfläche der Wand aufweist und eine weitere Schicht die äußere Oberfläche der Wand aufweist und wobei diese beiden Schichten eine identische oder ähnliche Porosität aufweisen, wobei die Porosität angegeben ist als Hohlraumvolumen/Gesamtvolumen und eine ähnliche Porosität bedeutet, dass sich die Porositäten der Schichten um maximal 20% unterscheiden, wobei der Prozentwert des Unterschieds wie folgt ermittelt ist: $\begin{array}{l} Unterschied (%) = \\ (zahlengrößerer Wert - zahlenkleinerer Wert) /zahlenkleinerer Wert * 100. \end{array}$
Hohlkörper nach einem der Ansprüche 7-11, der eine oder mehrere Öffnungen aufweist, durch die der Hohlraum des Hohlkörpers zugänglich ist.
Hohlkörper nach einem der Ansprüche 7-12, der ausgewählt ist aus einer Röhre oder einem Hohlzylinder.
Hohlkörper nach Anspruch 13, der eine oder mehrere Verzweigungen aufweist.
Künstliches biologisches Gefäß, insbesondere Implantat, aufweisend einen Hohlkörper nach einem der Ansprüche 7-14.
Verwendung eines Hohlkörpers nach einem der Ansprüche 7-14 oder eines Gefäßes nach Anspruch 15 als medizinisches Implantat, insbesondere als Hohlgefäß, Blutgefäß, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäß oder Manschette.