DE102012201272B4

DE102012201272B4 - Vorrichtung zur Herstellung von Hohlkörpern aus mikrobiellem Polymer

Info

Publication number: DE102012201272B4
Application number: DE102012201272.9A
Authority: DE
Inventors: Dieter Klemm; Victoria Kopsch; Daniel Koth; Friederike Kramer; Sebastian Moritz; Thomas Richter; Udhart Ulrike; Wolfgang Fried
Original assignee: KKF UG
Current assignee: KKF UG
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2012-01-30
Publication date: 2019-05-09
Anticipated expiration: 2032-01-31
Also published as: DE102012201272A1

Abstract

Vorrichtung (1) zur Herstellung von Hohlkörpern aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, aufweisend- ein Template (3), das die Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,- ein erstes Reservoir (2), das mit einem Gemisch (10), welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer-bildenden Mikroorganismus umfasst, befüllbar ist,- eine Benetzungseinrichtung (6, 7) zur Benetzung des Templates (3) mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch (10), wobei mit der Benetzungseinrichtung ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates erzeugbar ist,- ein Gehäuse (15), welches zumindest das Template (3) und das Reservoir (2) so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung (18) des Gehäuses verhinderbar ist, gekennzeichnet durch- eine Bewegungseinrichtung, womit das Template (3) um mehrere Raumachsen rotierbar ist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer, die verwendbar ist in einemVerfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer oder zur Beschichtung eines Gegenstands mit einem mikrobiellen Polymer.
Um Blutgefäße im menschlichen oder tierischen Körper zu ersetzen, werden heutzutage neben explantierten körpereigenen Gefäßen Prothesen aus unterschiedlichen Kunststoffen eingesetzt. Letztere haben bei Gefäßdurchmessern im Bereich 6 mm und kleiner das bisher ungelöste Problem, dass sie sich durch Thrombenablagerungen nach einer gewissen Zeit wieder verschließen. Ein als Blutgefäß einsetzbares Implantat muss daher von seinem Aufbau folgende Eigenschaften eines natürlichen Blutgefäßes in möglichst guter Weise aufweisen:

- eine innere Oberfläche, welche homogen, frei von Aneurysmen ist, eine Anlagerung von körpereigenen Endothelzellen ermöglicht und nicht thrombogen ist
- eine Wandung, welche einen Stoffaustausch, welcher den natürlichen Stoffaustauschprozessen in Blutgefäßen vergleichbar ist, ermöglicht
- eine genügende mechanische Stabilität in der äußeren Schicht oder der gesamten Wandung aufweisen, um den statischen, dynamischen und punktuellen Belastungen z.B. durch Blutdruck, Körperbewegungen und den Kräften an der Verbindungsstelle zu den natürlichen Gefäßen standzuhalten

Ein bekanntes Implantat-Material mit hohem Anwendungspotential für die Medizin ist bakterielle Nanocellulose (BNC) (siehe z.B. D. Klemm et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 5438-5466), auch mikrobielle Cellulose genannt. Es sind mehrere Methoden bekannt, bakterielle Nanocellulose (BNC) insbesondere als Hohlkörper für chirurgische Anwendungen wie Blutgefäße oder Gewebeimplantate zu formen. Entsprechend den beschriebenen Formgebungsverfahren werden unterschiedliche BNC-Hohlkörper mit unterschiedlicher Dimension, Struktur und Oberflächengüte sowie mechanischer Belastbarkeit und Festigkeit erhalten.
Es ist bekannt, dass mikrobielle Cellulose direkt im Herstellungsprozess, insbesondere zu einem Hohlkörper geformt werden kann. Folgende Methoden der Herstellung hohlzylindrischer Celluloseformkörper werden beschrieben:
EP 396 344 A3 beschreibt die Herstellung eines mikrobiellen Cellulosehohlkörpers mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser. Die Glasröhren werden ineinander gefügt, und im Raum zwischen den beiden Rohrwandungen wird die Kultivierung des Cellulose-bildenden Mikroorganismus statisch innerhalb von 30 Tagen durchgeführt. Dieses Verfahren erfolgt entsprechend der sogenannten horizontalen statischen Kultivierungsmethode. Es entsteht eine mikrobielle Cellulose mit hohlzylindrischer Gestalt. Das Beispiel zeigt allerdings, z.B. anhand von Thrombenbildung, dass die innere Oberfläche des nach diesem Verfahren mikrobiell hergestellten Hohlzylinders den Qualitätsansprüchen an ein Gefäßimplantat nicht umfassend genügt. Die übliche statische Kultivierung schließt das Abwärtsschieben des Celluloseproduktes entlang der Wandungen des verwendeten Kultivierungsgefäßes ein. Dieser Vorgang kann zur Bildung von Oberflächeninhomogenitäten wie z.B. Falten führen. Der Einsatz als Gefäßprothese ist daher eher bedenklich.
WO 01/61026 A1 / US2003013163 offenbart ein Herstellungsverfahren für geformte Biomaterialien, insbesondere für mikrochirurgische Anwendungen als Ersatz von Blutgefäßen mit 1-3 mm Durchmesser und kleiner. Die Herstellung eines Cellulosehohlkörpers erfolgt mittels zweier Glasröhren unterschiedlicher Durchmesser, die in die mit den Cellulose-bildenden Bakterien beimpfte Nährlösung eintauchen, so dass die Nährlösung in den Zwischenraum der Glasmatrix durch Kapillarkraft eingezogen und Nährlösungs- sowie Luftzirkulation möglich wird. Im Kultivierungsgefäß ist während des gesamten Kultivierungsprozesses ein feuchtes, aerobes Milieu zur Cellulosebildung gewährleistet. Nach 7-14 Kultivierungstagen bildet sich im Kultivierungsgefäß entsprechend der üblichen statischen Kultivierung ein anisotropes, schichtartiges BNC-Vlies aus. Im Zwischenraum zwischen den beiden Glasrohren bildet sich gleichzeitig unter den modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen ein Cellulosehohlzylinder aus einem Mikrofibrillar/Nanocellulosenetzwerk rotationssymmetrisch um den Glaskern entlang der Längsachse des hohlzylindrischen Innenraums der Glasmatrix. Der Nachteil dieser Methode besteht darin, dass die auf diesem Wege produzierten Hohlkörper nur eine Länge von wenigen Zentimetern (bis zu 3 cm) erreichen.
WO2007/093445A1 / US2009011161 beschreibt einen Prozess zur Herstellung eines langen Cellulosehohlkörpers, indem ein Cellulose-bildender Organismus im Innenraum eines hohlen Formkörpers kultiviert wird und der lange Cellulosehohlkörper in diesem Innenraum wächst. Im Rahmen der Erfindung wird auf die Rotationssymmetrie um die zylindrische Achse des hohlzylindrischen Innenraumes verzichtet, indem der Cellulosehohlkörper nicht entlang der Längsachse eines Innenraumes sondern im Wesentlichen senkrecht dazu von einer Längsseite des hohlen Formkörpers zur gegenüberliegenden Längsseite entsteht. Das bedeutet, dass die Länge des Cellulosehohlkörpers nicht länger durch die Schichtdicke limitiert wird, die durch den statischen Wachstumsprozess erreicht werden kann und so jede gewünschte Länge denkbar ist.
Der Nachteil dieser Methode besteht zum einen im Herstellungsaufwand. Zunächst wird eine übliche statische Kultivierung zum Aufbau einer Celluloseschicht 7-10 Tage durchgeführt. Danach wird der hohle Formkörper mit den entsprechenden Öffnungen auf die wachsende und mit einem Trägernetz unterstützte Celluloseschicht gelegt, so dass die Bakterien in den Hohlkörper von außen eindringen und die Cellulose unter modifizierten statischen Kultivierungsbedingungen parallel aber nicht rotationssymmetrisch zur Längsachse des Formkörperinnenraumes, also von unten nach oben, in dem Formkörper innerhalb von 2 bis 3 Wochen gebildet wird. Während der Kultivierung ist darauf zu achten, dass verbrauchte Nährlösung ersetzt wird. Die durch einen unteren Schlitz der Matrix einwandernden Bakterien müssen sich im Verlauf der Kultivierung an die kontinuierliche Veränderung der Biosyntheseflächen (Wechsel zwischen Vergrößerung und Verkleinerung) anpassen. Insbesondere das Verbinden der beidseits des Matrixkerns getrennt voneinander aufgebauten Bakteriencellulose-Halbzylinder zu einer homogenen Einheit ist problematisch.
Die strukturellen Gegebenheiten des Formkörpers variieren sowohl längs als auch senkrecht zur Achse. Diffussionsprozesse der Kulturlösung zum Biosyntheseort durch die primär aufgebaute Celluloseschicht sowie die sich aufbauende sekundäre Celluloseschicht innerhalb des Formkörpers führen zur Ausbildung zusätzlicher strukturellen Inhomogenitäten. Die isolierten Cellulosehohlkörper sind dadurch vermindert formstabil sowie unzureichend mechanisch stabil, was zu großen Problemen z.B. der Druckstabilität führt. Auch die innere und äußere Begrenzung des Cellulosehohlkörpers sind deshalb als inhomogen und instabil anzusehen, so dass die innere und äußere Wand einem angelegten Druck gar nicht oder nicht gleichmäßig entgegenwirken kann. Das Lumen wird geweitet, es entstehen Beulen und Mulden, was die Bildung von Thromben begünstigen sollte. Darüber hinaus ist der im Patent beschriebene Bildungsprozess nur sehr schwer reproduzierbar zu gestalten und kaum für die Produktion großer Stückzahlen zu realisieren.
Desweiteren gibt es Schriften, die sich mit der Herstellung von BNC-Hohlkörpern an gaspermeablen Oberflächen beschäftigen.
Nach EP 186 495 A2 wird geformte mikrobielle Cellulose an gaspermeablen Materialien (z.B. PVC, Cellulose, Cellulosederivate, Polyethylen, Silikon, PTFE) aufgebaut, indem die eine Seite des Materials mit einem Sauerstoff-enthaltenden Gas in Kontakt steht und die andere mit der Nährlösung, so dass die mikrobielle Cellulose an dieser Seite gebildet und anschließend isoliert wird. Wird z.B. ein entsprechender Dialyseschlauch aus herkömmlicher Cellulose mit Nährmedium und Cellulose-bildenden Mikroorganismen befüllt und die Kultivierung über einer geringen Menge destillierten Wassers in geschlossenen Glasgefäßen zur Gewährleistung feuchter aerober Bedingungen durchgeführt, bildete sich innerhalb von 2 Tagen bei 25 °C im Inneren des Dialyseschlauches zylindrisch geformte mikrobielle Cellulose. Wird hingegen ein Luftgefüllter Dialyseschlauch in ein mit Kulturlösung befülltes abgeschlossenes Gefäß gegeben, findet man nach 3 Kultivierungstagen eine Ummantelung des permeablen Materials mit einer dünnen Celluloseschicht.
Der in EP 396 344 A3 beschriebene Prozess zur Herstellung mikrobieller Cellulosehohlkörper schließt ebenfalls die Kultivierung eines Cellulose-produzierenden Mikroorganismus an der inneren und/oder äußeren Oberfläche eines Sauerstoff-permeablen Hohlträgers aus Cellophan, Teflon, Silikon, Keramik oder einem nichtgewebten bzw. einem gewebten Material ein. Ein Cellulose-produzierender Mikroorganismus und ein Kulturmedium werden der inneren und/oder äußeren Seite des Hohlträgers zugeführt. Die Kultivierung erfolgt unter Zuführung eines Sauerstoff-haltigen Gases (oder Flüssigkeit) ebenfalls an der besagten inneren und/oder äußeren Seite des Hohlträgers. Es bildet sich eine gallertartige Cellulose mit einer Schichtstärke von 0,01 bis 20 mm an der Oberfläche des Hohlträgers. Auf Grund der Wechselwirkung des Cellulose-produzierenden Mikroorganismus, der produzierten Cellulose und des Hohlträgers entsteht innerhalb von 1-2 Monaten ein Komposit von Cellulose und Hohlträger. Ist die Cellulose nicht an den Träger gebunden, wird dieser nach der Synthese der Cellulose entfernt. Ein hohl geformter Artikel, der ausschließlich aus Cellulose besteht, kann erhalten werden.
WO 2008/040729 A2 beschreibt eine Methode zur Herstellung von Cellulosehohlkörpern durch Kultivierung von Cellulose-produzierenden Mikroorganismen an der äußeren, gleichmäßig glatten Oberfläche eines hoch Sauerstoff-permeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie Dimethylsilikon, Vinylmethylsilikon, Fluorosilikon, Diphenylsilikon, Nitrilsilikon). Der Innenraum des Hohlträgers wird mit einem Sauerstoff-enthaltendem Gas, dessen Sauerstoffgehalt über dem des Atmosphärensauerstoffs liegt (bevorzugt 100% Sauerstoff), beliefert, so dass der Cellulose-produzierende Mikroorganismus kontinuierlich und im notwendigen Umfang mit Sauerstoff versorgt wird. Der Sauerstoff-Partialdruck wird ebenfalls variiert. Es können Cellulosehohlkörper verschiedener Dimension und Form sowie mit Verzweigungen aufgebaut werden, die zum Einsatz in der Chirurgie von Mensch und Tier zum Ersatz oder zur Reparatur von inneren Hohlorganen wie Harnröhre, Harnleiter, Luftröhre, Verdauungstrakt, Lymphgefäße oder Blutgefäße gedacht sind. Die Cellulosehohlkörper sind aus einzelnen Schichten parallel zur Gefäßwand aufgebaut, und weisen eine dichte innere und eine poröse äußere Oberfläche auf. Berstdrücke bis zu 880 mmHg werden in Beispielen angegeben. Es ist angegeben, dass durch die Konzentration vom Sauerstoff im Gas, das durch die nicht-porösen, Sauerstoff-permeablen Hohlträger geleitet wird, die Festigkeit der aufgebauten Bakterielle Cellulose (BC)-Röhrchen steuerbar ist.
Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech. Bioeng. (2007) 97, 425-434) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2 , was man bei einem Vergleich der Abbildungen beider Publikationen ersieht. Die potentiellen Gefäßprothesen erreichten einen Berstwert von 880 mmHg, wenn sie in Gegenwart von 100% Sauerstoff produziert werden. Innerhalb von ca. 5-7 Kultivierungstagen ist es möglich, BC-Röhrchen variabeler Längen und Durchmesser (z.B. 1,5 -6,0 mm) sowie mit Verzweigungen zu produzieren. Zusätzlich zu WO 2008/040729 A2 offenbart Bodin et al. mechanische Tests der hergestellten Hohlkörper. Ein Spannungs-Dehnungs-Test weist darauf hin, dass die Hohlkörper aus Schichten aufgebaut sind, die nicht fest miteinander verbunden sind, erkennbar an verschiedenen Peaks im Spannungs-Dehnungs-Diagramm in 8.
Bäckdahl et al. (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21) betrifft den gleichen Gegenstand wie WO 2008/040729 A2 , was man aus dem Material-und-Methoden-Teil ersieht. REM-Untersuchungen und Untersuchungen mittels konfokaler Mikroskopie an ungereinigten BC-Röhrchen zeigen hohe Bakterienkonzentrationen dicht am Lumen.
Die oben zitierte Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen ist vergleichbar mit der statischen Horizontal-Kultivierung. Abweichend davon erfolgt die Biosynthese nicht unmittelbar an der Grenzfläche Nährmedium-Luft sondern an der Grenzfläche Nährmediumsauerstoffpermeabler Hohlträger. Die BNC-Bildung ist nicht mehr auf nur eine Richtung beschränkt, sondern erfolgt in alle Raumrichtungen. Der Aufbau von BNC-Körpern mit fast unbegrenzter Hohlkörperlänge/ Dimension wird somit möglich, allerdings sind aufgrund des diffussionsbestimmten Nährstofftransports und der Material-bestimmten Sauerstoffversorgung Limitierungen der Wandstärken zu erwarten. Im Vergleich zur Nährmedium-Luft Grenzflächenkultivierung geben Putra et al. eine Reduzierung der Celluloseschichtdicke um Zweidrittel an (A Putra, A Kakugo, H Furukawa, JP Gong, Y Osada: Tubular bacterial cellulose gel with oriented fibrils on the curved surface. Polymer (2008) 49, 1885-1891).
Bekannt ist auch die BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben „rotating disc reactors“ ( WO 9705271 A1 , Mormino R, Bungay H: Composites of bacterial cellulose and paper made with a rotating disk bioreactor. Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003) 62, 503-506). Die Grundidee dieses Verfahrens besteht darin, wachsende Zellen an Strukturelemente eines Bioreaktors zu heften, um einen Biofilm zu bilden. Indem diese Strukturelemente durch eine stationäre Nährlösung bewegt werden, fördert man weiterhin das Zellwachstum. Eine oder mehrere ständig rotierende - z.B. perforierte oder aufgerauhte - Scheiben tauchen partiell aber dauerhaft in eine Kulturlösung, die Cellulose-produzierende Mikroorganismen enthält, ein. Auf der Oberfläche dieser Scheiben bildet sich eine stark gelatisierte und stark hydratisierte Cellulose, die sich deutlich von mikrobieller Cellulose unterscheidet, die unter statischen Bedingungen hergestellt wurde. So ist diese Cellulose durch eine lockerere Struktur und eine höhere Wasserabsorptionskapazität sowie reduzierte mechanische Kenngrößen (Elastizitätsmodul, Zugfestigkeit) gekennzeichnet. Die äußeren Kräfte, die durch die Rotationsbewegung während der Kultivierung auftreten, bewirken Störungen im gesamten Kristallisationsprozess und somit eine lockerere und ungeordnetere BC-Faserstruktur. Der Austausch der Scheiben gegen eine horizontal angeordnete Walze macht es zwar möglich, Röhren unterschiedlicher Durchmesser herzustellen (Krystynowicz A, Czaja W, Wiktorowska-Jezierska A, Goncalves-Miskiewicz M, Turkiewicz M, Bielecki S: Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2002) 29, 189-195), eine Verwendung als Gefäßersatz scheint aufgrund des Eigenschaftsprofils aber nicht möglich. Eine Verbesserung der mechanischen Eigenschaften der unter dynamischen Bedingungen hergestellten Cellulose-Tubes konnte nur durch den Einbau eines Verstärkungsmaterials (Polyesterschlauch) erreicht werden (Ciechanska D, Wietecha J, Kazmierczak D, Kazmierczak J: Biosynthesis of modified bacterial cellulose in a tubular form. Fibres and Textiles in Eastern Europe (2010) 18, 98-104).
In WO 2000023516 wird ein Prozess zur Herstellung eines extrudierten Celluloseproduktes (Film, Rohr/Schlauch, Faser) beschrieben, der die Herstellung einer Celluloselösung aus nicht-bakterieller und bakterieller Cellulose in einem Aminoxid-Lösungsmittel einschließt. Der Anteil der bakteriellen Cellulose beeinflusst die mechanischen Eigenschaften der Endprodukte. Die Bildung der genannten Produkte erfolgt durch ein rein technisches Verfahren. Durch den hierfür notwendigen Löseprozess wird die einzigartige Struktur der Bakteriencellulose zerstört.
GB 2 169 543 A offenbart ein Verfahren, in dem sowohl eine flüssige Kultur bereitgestellt wird, die einen Cellulose produzierenden Mikroorganismus umfasst, als auch eine Struktur mit einer ersten Seite und einer zweiten Seite, die ein für Gase durchlässiges Material umfasst. Die erste Seite der Struktur wird mit einem Sauerstoff enthaltenden Gas in Kontakt gebracht. Die zweite Seite der Struktur wird mit der Flüssigkultur in Kontakt gebracht, sodass auf der zweiten Seite mikrobielle Cellulose erzeugt wird. Die Zufuhr von Sauerstoff zu cellulosebildenden Mikroorganismen durch gasdurchlässiges Material und die resultierende Ablagerung von Cellulose auf diesem Material ermöglicht die Herstellung geformter Gegenstände oder eine kontinuierliche Celluloseproduktion.
WO 2011 038 373 A2 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von 3-D-Strukturen auf Nanocellulosebasis auf Basis statischer Kulturtechnik, umfassend: Bereitstellen von Bakterien, die zur Erzeugung von Nanocellulose fähig sind; Bereitstellung von Medien, die in der Lage sind, die Bakterien für die Herstellung von Nanocellulose zu erhalten; Steuern der mikrobiellen Produktionsrate durch Verabreichen von Medien mit einer mikrofluidischen Vorrichtung für eine ausreichende Zeitdauer und unter Bedingungen, die für die Bakterien ausreichend sind, um Nanocellulose mit einer gewünschten Geschwindigkeit herzustellen; Fortsetzen der Verabreichung der Medien, bis eine dreidimensionale Zielstruktur mit einer Zieldicke und Zielstärke gebildet wird, die eine Morphologie aufweist, die durch ein Netzwerk mehrerer Schichten aus miteinander verbundenen biosynthetischen Cellulosen definiert ist.
CN 2018 09342 U bezieht sich auf eine Vorrichtung zum dynamischen Herstellen eines bakteriellen Cellulosematerials mit profiliertem Hohlraum. Die Vorrichtung umfasst u.a. eine Drehwelle, eine Form, einen Fermentationstank, einen Motor, und eine Wasserbadvorrichtung, wobei ein Ende der Drehwelle fest mit einer Ausgangswelle des Motors verbunden ist und sich das andere Ende der Drehwelle durch die Mittelposition einer Endfläche des Fermentationsbehälters in den Fermentationsbehälter erstreckt. In dem Gebrauchsmuster dreht sich die Form um die Mitte der rotierenden Welle, sodass die Form Bakterienzellulose in einer Fermentationsflüssigkeit aufwickelt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine verbesserte Vorrichtung anzugeben, womit Hohlkörper mit hoher Festigkeit und hoher Bioverträglichkeit aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, hergestellt werden können. Wenn möglich sollte die Fertigung in hoher Stückzahl mit möglichst wenig Aufwand durchführbar sein. Die Kultivierungszeiten sollen möglichst kurz, vorzugsweise bis zu maximal 7 Kultivierungstagen, liegen. Die Hohlkörper sollen weiterhin in beliebiger Form herstellbar sein.
Eine oder mehrere dieser Aufgaben werden gelöst mit einer Vorrichtung nach Anspruch 1, oder mit vorteilhaften Ausgestaltungen der Erfindung, wie in den Unteransprüchen angegeben.
Angegeben wird eine Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, aufweisend

- ein Template, das die Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist,
- ein erstes Reservoir, das mit einem Gemisch, welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst, befüllbar ist,
- eine Benetzungseinrichtung zur Benetzung des Templates mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch, wobei mit der Benetzungseinrichtung ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates erzeugbar ist,
- ein Gehäuse, welches zumindest das Template und das Reservoir so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung verhinderbar ist,
- eine Bewegungseinrichtung, womit das Template um mehrere Raumachsen rotierbar ist.

Der Begriff „mikrobielles Polymer“ bezeichnet ein Polymer, das durch einen Mikroorganismus produziert wird. Beispielhafte Mikroorganismen sind Pilze, Bakterien und Algen.
Der Begriff Polymer bezeichnet eine chemische Verbindung aus Ketten- oder verzweigten Molekülen (Makromolekülen), die wiederum aus gleichen oder gleichartigen Einheiten bestehen, oder mit anderen Worten ein großes Molekül (Makromolekül), das aus sich wiederholenden gleichen oder gleichartigen Struktureinheiten besteht, die als unverzweigte, verzweigte oder vernetzten Molekülketten angeordnet sind.
Ein bevorzugtes mikrobielles Polymer ist mikrobielle Cellulose. Eine Reihe von Mikroorganismen ist in der Lage, Cellulose herzustellen. Dazu zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Algen wie Valonia und Boergesenia, Pilze wie Dictyostelium discoideum und Bakterien wie Gluconacetobacter, Enterobacter, Agrobacterium, Pseudomonas, Rhizobium und Zoogloea. Ein besonders geeigneter Mikroorganismus ist Gluconacetobacter, insbedondere Gluconacetobacter xylinus. Mikrobielle Cellulose wird herkömmlich durch Mikroorganismen an der Grenzfläche zwischen Luft und einem z.B. D-Glucose-haltigen Nährmedium in Form eines Biofilms (Vlies) hergestellt. Die Bakterien stoßen die Cellulose als Fibrillen aus. Diese lagern sich zu Fasern zusammen. Durch die Verflechtung der Fasern entsteht ein dreidimensionales, hoch wasserhaltiges Nanofaser-Netzwerk, das aus ca. 99% Wasser und 1% Cellulose besteht (Jonas R, Farah LF: Production and application of microbial cellulose. Polym. Degrad. Stab (1998), 59(1-3), 101-106; Hirai A, Horii F: Cellulose assemblies produced by Acetobacter xylinum. ICR Annual Report (1999) 6, 28-29; Klemm D, Heublein B, Fink H-P, Bohn A: Cellulose: fascinating biopolymer as sustainable raw material. Angew. Chem. Int. Ed. (2005) 44, 3358-3393).
Das Kulturmedium, auch bezeichnet als „Nährlösung“ oder „Nährmedium“ enthält Glucose, Pepton, Hefeextrakt, Natriumhydrogenphosphat und Citronensäure in wässriger Lösung (Hestrin-Schramm-Medium).
Mikrobielle Cellulose wird, sofern sie von Bakterien hergestellt wird, auch mit den Begriffen „bakterielle Cellulose“ und „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) bezeichnet. Der Begriff „bakterielle Nanocellulose“ (BNC) ist daraus hergeleitet, dass bakteriell produzierte Cellulose wie oben erwähnt ein Nanofasernetzwerk bildet.
Nachfolgend wird die Erfindung bisweilen anhand des speziellen Falls der mikrobiellen Cellulose dargestellt. Dennoch ist die Erfindung auch auf andere mikrobielle Polymere anwendbar.
Nachteile von vorstehend beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen des Standes der Technik wurden insbesondere durch die folgende Maßnahmen überwunden:
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer Anwendung in einem Herstellungsverfahren für Hohlkörper aus mikrobiellem Polymer ist kein äußerer Formkörper vonnöten wie z.B. bei Verfahren der statischen Kultivierung, wo mikrobielle Cellulose durch Kultivierung eines Cellulose-bildenden Mikroorganismus in einem Raum zwischen zwei Wandungen gebildet wird.
Weiterhin werden bei der Durchführung des Verfahrens in der erfindungsgemäßen Vorrichtung alle Prozesse vermieden, bei welchen Stoffe durch eine bereits gebildete Celluloseschicht hindurchtreten müssen, was zu Störungen im Aufbau dieser Schichten führen kann, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist.
Es wird mit der Vorrichtung und in dem Verfahren die Innenkontur des Hohlkörpers durch ein geeignet geformtes Template vorgegeben auf dessen Oberfläche sich bei Durchführung des Verfahrens ein Flüssigkeitsfilm befindet, in oder auf welchem die Biosynthese des Polymers abläuft. Somit bildet das direkt auf der Templateoberfläche erzeugte Polymer später die innere Oberfläche des Hohlkörpers. Auf diesem auf der Templateoberfläche erzeugten Polymer kann durch das Verfahren weiteres Polymer erzeugt werden.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem damit durchführbaren Verfahren wird die Herstellung von Cellulosehohlkörpern mit verschiedenen Mikro- und Nanostrukturen ermöglicht. Es ist möglich, Mikro- und Nanostrukturen gezielt aufzubauen. Es können biomimetische Hohlkörper erzeugt werden. Der Begriff „biomimetisch“ bedeutet, dass ein menschliches oder tierisches Hohlorgan, beispielsweise ein Blutgefäß, durch den hergestellten Hohlkörper strukturell und/oder funktionell nachgebildet wird, wobei die strukturellen/funktionellen Eigenschaften der natürlichen Vorlage nicht notwendigerweise exakt erfüllt sein müssen. Der Begriff „biomimetische Struktur“ bezeichnet insbesondere eine dem natürlichen Blutgefäß möglichst nahekommende Struktur.
Die mit der Vorrichtung und dem damit durchgeführten Verfahren hergestellten BNC-Implantate sind durch verbesserte mechanische Eigenschaften und bioaktive Oberflächen gekennzeichnet.
Unter einem Hohlkörper ist ein Körper zu verstehen, der eine Wand aufweist, die einen Hohlraum umgibt. Die Wand kann eine oder mehrere Öffnungen haben, durch welche der Hohlraum zugänglich ist.
Grundsätzlich kann der Hohlkörper beliebig geformt sein. Die Form wird dem späteren Einsatzzweck angepasst. Für medizinische Verwendungen als Implantat kann der Hohlkörper z.B. die Form eines Blutgefäßes, einer Speiseröhre, eines Teils des Verdauungstrakts, einer Luftröhre, einer Harnröhre, eines Gallengangs, eines Harnleiters, eines Lymphgefäßes oder einer Manschette (cuff) haben. Diese natürlichen Formen können exakt oder annähernd erreicht sein.
Der Hohlkörper kann die Form einer Röhre oder eines Hohlzylinders haben. Länge und Innendurchmesser sind variabel und variabel miteinander kombinierbar. Beispielhafte Innendurchmesser sind 1-30 mm, vorzugsweise 2 bis 8 mm, und beispielhafte Längen sind 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Das Längen-Durchmesser-Verhältnis ist vorzugsweise größer 1. Der Innendurchmesser kann auch innerhalb eines Hohlkörpers variieren.
In einer speziellen Ausführungsform ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer oder mehreren Verzweigungen bzw. Verästelungen. Beispielsweise kann der Hohlkörper eine Y-Form haben.
Der Hohlkörper, insbesondere sein Hohlraum, kann statt eines runden auch einen anders geformten Querschnitt, beispielsweise einen quadratischen, rechteckigen, dreieckigen, oder sternförmigen Querschnitt aufweisen.
Das Template, oder auch „Templat“, ist wie bereits erwähnt die Negativform des Hohlraums des Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums. Der Begriff „Negativform“ bezeichnet das Hilfsmittel, die Positivform ist das gewünschte Ergebnis, in diesem Fall der/die Hohlkörper/Hohlraum/Hohlraumwand. Das Template ist komplementär zur Form des gewünschten herzustellenden Hohlraums geformt und wird entsprechend vorgegeben. Entsprechend ist über die Form der oben angegebenen Hohlkörper auch die Form des Templates definiert. Das Template gibt die Innengeometrie des Hohlkörpers vor. Beispielsweise ist das Template zylinderförmig, mit einem Durchmesser von 1-30 mm, vorzugsweise 2-8 mm, und einer Länge von 5-500 mm, vorzugsweise 100-200 mm. Wie der Hohlkörper oder Hohlraum kann das Template aber einen beliebigen Querschnitt besitzen, wie rund, eckig, insbesondere quadratisch, rechteckig, dreieckig, oder stern- oder schneeflockenförmig. Ebenso wie der Hohlkörper kann das Template Verzweigungen aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform hat das Template eine 2-dimensionale oder 3-dimensionale gitterartige Struktur.
Die Vorrichtung zur Herstellung eines Hohlkörpers besitzt außer dem Template, welches die innere Form definiert, keinerlei Einbauten, die die äußere Form des Hohlkörpers definieren.
In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist. Die Strukturen sind beispielsweise Ehebungen oder Vertiefungen oder beides. Die Strukturen können verschiedene Geometrien aufweisen. Über eine Templateoberfläche können gleichartige oder verschiedene Strukturen regelmäßig oder unregelmäßig verteilt sein.
Die Templateoberfläche kann so ausgeführt sein, dass die bei dem Hohlkörper erzeugte innere Oberflächenstruktur, d.h. die Struktur der Oberfläche, die an den Hohlraum angrenzt, der späteren Funktion des Hohlkörpers angepasst ist. Sollen z.B. Hohlkörper als Blutgefäßersatz synthetisiert werden, so kann die Oberfläche des Templates so strukturiert sein, dass die innere Oberfläche des synthetisierten Hohlkörpers später eine gute Endothelisierung ermöglicht.
Das Material, woraus die Oberfläche des Templates gefertigt ist, ist prinzipiell nicht beschränkt. In einer Ausführungsform hat das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, wie Aluminium, Edelstahl oder Titan, Kunststoff, Keramik, synthetischen Polymeren wie Polypropylen, Polyestern, Polyamiden oder Teflon, Papier Textilgewebe oder Glas. Es kann auch das gesamte Template aus einem der genannten Stoffe bestehen. Das Template selbst kann ein Hohlkörper oder massiv (Vollkörper) sein.
Die Oberfläche des Templates kann unbehandelt sein oder vorbehandelt sein. Beispielsweise kann die Vorbehandlung eine Veränderung der Oberflächenmorphologie sein, z.B. durch ätzen, polieren, aufrauen. Die Oberfläche kann beschichtet oder mit chemischen Verbindungen vorgehandelt oder überzogen sein
Das Template ist so beschaffen, dass zum einen optimale Bedingungen für die Bindung und Versorgung des Mikroorganismus an seiner Oberfläche und eine Haftung des Polymers erreicht werden. Zum anderen wird das Template so gewählt, dass das Polymerprodukt auf einfache Weise vom Template gelöst werden kann, um den Hohlkörper zu erhalten. Die Oberfläche des Templates ist so beschaffen, dass die Oberflächenqualität der bei Implantation in Kontakt mit Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, tretenden Oberfläche des Hohlkörpers reproduzierbar ist.
In einer speziellen Ausführungsform weist die Vorrichtung eine Anordnung aus mehreren Templates auf, auch bezeichnet als Template-Matrix. Diese kann mehrere Templates mit gleicher oder unterschiedlicher Geometrie, insbesondere unterschiedlicher Querschnitte, und/oder aus gleichem oder unterschiedlichem Material aufweisen. Dadurch können bei dem mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren Verfahren mehrere gleiche oder unterschiedliche Hohlkörper erhalten werden. Ein Beispiel für eine Anordnung aus mehreren Templates ist eine Anordnung aus mehreren zylinderförmigen Templates zur Herstellung mehrerer hohlzylinderförmiger bzw. röhrenförmiger Hohlkörper. Mehrere Templates gleicher oder unterschiedlicher Geometrie können in einer Einspannvorrichtung fixiert sein (Template-Matrix), welche mit einer Benetzungseinrichtung und/oder Bewegungseinrichtung verbunden ist.
Wie vorangehend erwähnt, weist die Vorrichtung ein Gehäuse auf, welches zumindest das Template und das Reservoir so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung verhinderbar ist. Sowohl in dem Reservoir als auch auf der Oberfläche des Templates befindet sich während des Verfahrens zur Herstellung des Hohlkörpers ein Gemisch, welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst. Zweck des Gehäuses ist es, eine Kontamination des Kulturmediums mit unerwünschten Substanzen oder Organismen zu verhindern. Das Gehäuse kann auch die Benetzungseinrichtung oder Teile davon umschließen. Das Gehäuse ist insbesondere flüssigkeits- und gasdicht, wobei der Begriff „gasdicht“ vorzugsweise auf eine umgebende Atmosphäre unter Normaldruck bezogen ist.
Das erste Reservoir kann eigener Teil der Vorrichtung sein oder ein Bereich des Gehäuses kann das Reservoir bilden, wobei flüssiges Gemisch in das Gehäuse selbst gegeben wird. Gleiches gilt für ein nachfolgend beschriebenes zweites Reservoir.
In einer Ausführungsform weist das Gehäuse eine verschließbare Öffnung auf, durch welche ein Stoffaustausch mit der Umgebung erfolgen kann. Ein Stoffaustauch kann beispielsweise derart sein, dass beim Wachstumsprozess der Mikroorganismen benötigte Medien, wie z.B. Nährlösung, Impflösung, Sauerstoff etc., nachgeliefert, konstant gehalten oder verändert werden. Es kann auch durch die Öffnung ein Mikroorganismus in das Kulturmedium gegeben werden, das sich bereits im Inneren des Gehäuses im Reservoir befindet. Vorzugsweise erfolgt ein Stoffaustausch mit der Umgebung unter sterilen Bedingungen, um eine Kontamination des Kulturmediums zu verhindern. Die verschließbare Öffnung kann als Medienanschluss ausgestaltet sein, beispielsweise Ventile, Schnellkupplungen, Hähne, Flanschen, etc.
In einer Variante der Vorrichtung ist das Gehäuse insgesamt oder teilweise durchsichtig. Vorzugsweise weist das Gehäuse wenigstens eine durchsichtige Fläche auf, beispielsweise ein Fenster, insbesondere aus wärmebeständigem Glas, durch welche eine optische Kontrolle des Formgebungsprozesses des Hohlkörpers möglich ist.
In noch einer Ausführungsform ist die Vorrichtung sterilisierbar, insbesondere durch Hitze, Dampf, Strahlung oder Chemikalien. Die Vorrichtung kann beispielsweise aus einem Material gefertigt sein, das eine Sterilisation mit den genannten Methoden ohne Schädigung der Vorrichtung erlaubt und/oder die die Vorrichtung kann so dimensioniert sein, dass sie in ein Sterilisationseinrichtung, beispielsweise einen Dampfsterilisator eingebracht werden kann.
Die Vorrichtung weist eine Bewegungseinrichtung auf, womit das Template um mehrere Raumachsen rotierbar ist. Wie nachfolgend anhand des mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbaren Verfahrens noch genauer beschrieben, wird auf der Oberfläche des Templates ein Flüssigkeitsfilm gebildet, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst. In und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm wird mikrobielles Polymer gebildet. Mittels der Bewegungseinrichtung kann dieser Flüssigkeitsfilm auf dem Template verteilt werden, indem das Template um mehrere Raumachsen rotiert wird. Durch eine vorgegebene Bewegung des Templates wird eine noch bessere Verteilung der Flüssigkeit auf der Oberfläche des Templates erreicht. Die Verteilung der Flüssigkeit kann durch die Art der vorgegebenen Rotationsbewegung des Templates beeinflusst werden, wobei die Rotationsbewegung auch unterbrochen werden kann. Die äußere Geometrie des Hohlkörpers wird somit durch eine definierte Verteilung eines Flüssigkeitsfilmes und durch eine definierte Bewegung unter dem Einfluss der Schwerkraft bestimmt.
Vorzugsweise hat das Template eine Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1. Beispielsweise hat das Template eine stab-, Kegel oder zylinderförmige Geometrie mit einem Längen-Durchmesser-Verhältnis von größer 1, zur Herstellung eines röhren- oder hohlzylinderförmigen Hohlkörpers, wobei Verzweigungen vorgesehen sein können. Bei dieser Geometrie weist das Template eine Längsachse auf. Die Bewegungseinrichtung ist dann vorzugsweise so ausgeführt, dass das Template um mehrere Raumachse rotierbar ist, die quer, vorzugsweise senkrecht zur Längsachse des Templates ist/sind.
Wie bereits erwähnt, weist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Benetzungseinrichtung zur Benetzung des Templates mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch auf. Bei der Benetzung wird der oben erwähnte Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates gebildet und der Zweck der Benetzungseinrichtung ist die Bildung des Flüssigkeitsfilms. Der Flüssigkeitsfilm wird dadurch gebildet, dass das Template und das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, relativ zueinander bewegt und dabei in Kontakt gebracht werden. Grundsätzlich kann die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet sein, dass damit das Template, oder das Gemisch, welches Kulturmedium und Mikroorganismus aufweist, oder das Template und das Gemisch bewegt werden können.
In einer Variante ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Template in das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht werden kann. Beispielsweise kann die Einrichtung einen Stab mit einem Antrieb, womit der Stab in Richtung seiner Längsachse auf- und abwärts bewegt werden kann, aufweisen. Das Template, oder eine Anordnung von Templates, kann an dem Stab befestigt sein und das Reservoir mit darin befindlichem Gemisch kann unterhalb des Templates angeordnet sein. Durch eine Abwärts- und Aufwärtsbewegung des Stabes kann das Template in das Gemisch ein- und ausgetaucht werden.
Die zuvor beschriebene Bewegungseinrichtung kann mit der Benetzungseinrichtung gekoppelt sein oder die Benetzungseinrichtung kann ein Teil der Bewegungseinrichtung sein. Es wird auch eine Einrichtung offenbart, die sowohl die Funktion der Benetzungseinrichtung als auch die Funktion der Bewegungseinrichtung aufweist. Eine Bewegung des Templates um mehrere Raumachsen kann einer Ein- und Austauchbewegung des Templates, die in der vorangehenden Variante einer Benetzungseinrichtung erwähnt wurde, überlagert sein.
In einer weiteren Variante ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem ersten Reservoir über das Template gegossen werden kann. Beispielsweise kann das erste Reservoir durch die Benetzungseinrichtung bewegbar sein und in dem Reservoir befindliches Gemisch kann mit der Benetzungseinrichtung über das Template gegossen werden. Vorzugsweise ist ein zweites Reservoir vorhanden, wobei nach dem Gießen des Gemisches über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch in dem zweiten Reservoir auffangbar ist. In einer speziellen Variante ist auch die Umkehrung dieses Prozesses mit der Benetzungseinrichtung möglich: Die Benetzungseinrichtung ist so ausgestaltet, dass damit das Gemisch, welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem zweiten Reservoir über das Template gegossen werden kann und nach dem Gießen des Gemisches über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch in dem ersten Reservoir aufgefangen werden kann.
In noch einer Ausführungsform ist die Benetzungseinrichtung so ausgestaltet, dass damit das Gemisch aus Kulturmedium und Mikroorganismus aus dem ersten Reservoir auf das Template gesprüht werden kann.
Die Erfindung offenbart ein mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchführbares Verfahren zur Herstellung eines Hohlkörpers aus einem mikrobiellen Polymer oder zur Beschichtung eines Gegenstands mit einem mikrobiellen Polymer, wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

a) das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Gegenstands, mit einem Gemischvorrat, der ein flüssiges Kulturmedium und einen mikrobielles Polymer bildenden Mikroorganismus umfasst,
b) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem Gegenstand und dem Gemischvorrat, wobei auf der Oberfläche des Gegenstands ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst,
c) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobiellen Polymers in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, und optional, die Trennung des Gegenstands von dem gebildeten Polymer, wobei ein Hohlkörper aus mikrobiellem Polymer erhalten wird.

Das Verfahren kann mit der vorangehend beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Es wird auf alle vorangehend beschriebenen Merkmale einer erfindungsgemäßen Vorrichtung und die gesamte vorangehende Offenbarung Bezug genommen. Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung eingesetzt wird, so entspricht das Template der Vorrichtung dem Gegenstand des obigen Verfahrens. Der Gemischvorrat des obigen Verfahrens wird in dem Reservoir/ den Reservoirs der Vorrichtung bereitgestellt.
Der Gegenstand wird periodisch, vorzugsweise kurzzeitig, mit dem Gemisch, das die Kulturlösung und den Mikroorganismus umfasst, benetzt. Hierbei bildet sich ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Gegenstands. Die Form dieses Flüssigkeitsfilmes wird durch die Lage des Templates im Raum bestimmt, da die Schwerkraft auf diesen Film einwirkt.
Der Begriff „Unterbrechung des Kontakts“ bedeutet, dass der Kontakt zwischen Gegenstand und Gemischvorrat so unterbrochen wird, dass kein Teil der Oberfläche des Gegenstands während der Unterbrechung Kontakt zum Gemischvorrat hat.
Das in Kontakt bringen der Oberfläche eines Gegenstands, mit dem Gemischvorrat und die Unterbrechung des Kontakts erfolgen mit der zuvor beschriebenen Benetzungseinrichtung, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens eingesetzt wird.
Die sauerstoffhaltige Atmosphäre ist vorzugsweise Luft oder reiner Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gasgemisch. Ein bevorzugtes mikrobielles Polymer des Verfahrens ist mikrobielle Cellulose, die in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm gebildet wird, wenn dieser mit Sauerstoff in Kontakt kommt.
Der Kontakt zwischen dem Gegenstand und dem Gemischvorrat wird bei dem Verfahren unterbrochen und die Synthese des mikrobiellen Polymers erfolgt nur in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm, der von dem Gemischvorrat getrennt wurde. Dadurch spielen etwaige Diffussionsprozesse von Kulturlösung und Sauerstoff eine untergeordnete oder gar keine Rolle. Überraschenderweise wurde gefunden, dass keinerlei Polymer-Bildung innerhalb bzw. auf der Flüssigkeitsoberfläche des Gemischvorrats stattfindet.
Wird der Gegenstand nach Herstellung des Polymers nicht von dem Polymer getrennt, so stellt das Verfahren ein Beschichtungsverfahren dar, bei dem der Gegenstand mit einer Polymerschicht versehen wird. Wird der Gegenstand von dem Polymer getrennt, so kann ein Hohlhörper erhalten werden. In letzterem Fall wird der Gegenstand auch als Template bezeichnet. Die Trennung erfolgt vorzugsweise dadurch, dass das gebildete Polymer von dem Template abgezogen wird. Beispielsweise wird eine Polymer von einem zylinderförmigen Template abgestreift und ein Hohlzylinder aus Polymer erhalten. Je nach verwendetem Material kann das Template nach Oberflächen-schonender Reinigung wieder verwendet werden.
Der Gegenstand wird während Schritt c) um mehrere Raumachsen rotiert. Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung für das Verfahren eingesetzt wird, kann diese Rotation mit der bereits beschriebenen Bewegungseinrichtung erfolgen. Dabei wird die Form des Flüssigkeitsfilms auf der Oberfläche des Gegenstands beeinflusst. Anders ausgedrückt wird das Template mit einem definierten Flüssigkeitsfilm überzogen, was wiederum zu einer definierten Form des sich bildenden Produktes führt. Die Rotation kann auch bereits während Schritt a) und b) erfolgen. Wenn beispielsweise das Template zur Benetzung relativ zu dem Gemischvorrat bewegt und mit diesem in Kontakt gebracht wird, dann kann zusätzlich eine der Bewegung des Templates überlagerte Relativbewegung um mehrere Raumachsen erfolgen.
In einer Variante des Verfahrens werden zusätzlich die folgenden Schritte durchgeführt:

d) das in Kontakt bringen des in Schritt c) gebildeten mikrobiellen Polymers mit dem Gemischvorrat,
e) die Unterbrechung des Kontakts zwischen dem mikrobiellen Polymer und dem Gemischvorrat wobei auf der Oberfläche des Polymers ein Flüssigkeitsfilm zurückbleibt, der das flüssige Kulturmedium und den Mikroorganismus enthält,
f) das in Kontakt bringen des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre und die Bildung mikrobiellen Polymers in und/oder auf dem Flüssigkeitsfilm,

Diese Folge der Schritte d)-f) kann ein- oder mehrmals wiederholt werden, bis eine gewünschte Menge Polymer auf der Oberfläche des Gegenstands erzeugt ist und das Polymer eine gewünschte Gesamtschichtdicke erreicht hat. Die sogenannte Gesamtschicht kann aus mehreren Einzelschichten bzw.-Lagen zusammengesetzt sein. Bei dieser Verfahrensvariante erfolgt eine Synthese weiteren mikrobiellen Polymers auf bereits gebildetem Polymer.
Die Vorteile des mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführten Verfahrens gegenüber der Biosynthese von bakterieller Cellulose an der Oberfläche einer sauerstoffdurchlässigen Membran nach dem Stand der Technik sind unter anderem folgende:

I. Wird die Cellulose an der inneren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die innere Formkörperwandung ohne Begrenzung aber in ständigem Kontakt zur Kulturlösung „frei“ im Raum entwickelt und stellt die ursprünglich erste (älteste) und lockerere Cellulosegelschicht dar. Im Verlauf der Kultivierung steht der an der inneren Hohlträgeroberfläche gebildeten Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt, immer weniger Platz zur Verfügung. Die Ausbildung von Störstellen (Faltungen, Verdichtungen) innerhalb des Schichtsystems und am Lumen ist die Folge. Weitere wesentliche Nachteile dieser Methoden bestehen demnach darin, dass die auf diese Weise hergestellten Hohlzylinder keine hinreichend glatte, homogene innere Oberfläche aufweisen. Da neben der Ausbildung von gravierenden Oberflächeninhomogenitäten durch Falten- oder Muldenbildung auch die Gefahr der Ablösung von Teilen der Cellulose gegeben ist, bergen diese Hohlzylinder ein sehr großes Thromboserisiko. Die Qualität des inneren Lumens kann den Anforderungen an einen Blutgefäßersatz nicht entsprechen.
II. Wird die Cellulose an der äußeren Seite eines permeablen Hohlträgers synthetisiert, wird die jüngste Celloluloseschicht immer zwischen bereits gebildeten Celluloseschichten und der äußeren Oberfläche des Hohlträgers gebildet. Daher entspricht das Lumen des BNC-Hohlkörpers, wenn der Hohlträgers entfernt wurde, der aktuell synthetisierten jüngsten, festeren Celluloseschicht, die eine hohe Bakterienzahl enthält (Bäckdahl H, Risberg B, Gatenholm P: Observations on bacterial cellulose tube formation for application as vascular graft. Materials Science and Engineering (2011) 31, 14-21). Im Verlauf der Kultivierung muss die an der äußeren Hohlträgeroberfläche gebildete Celluloseschicht, die sich in die Nährlösung hineinbewegt und damit nach außen ortsverlagert wird, eine immer größere Fläche abdecken. Morphologische Veränderungen können die Folge sein. Bodin et al. (Bodin A, Bäckdahl H, Fink H, Gustafsson L, Risberg B, Gatenholm P: Influence of cultivation conditions on mechanical and morphological properties of bacterial cellulose tubes. Biotech Bioeng (2007) 97, 425-434) berichten von einem, die Gefäßwand aufbauendem Schichtensystem aus sehr vielen, nicht fest miteinander verbundenen Einzelschichten ähnlicher Morphologie, so dass die Gefahr des Ablösens bzw. Verschiebens einzelner Schichten gegeben ist.
III. Außerdem kann davon ausgegangen werden, dass die Oberflächentopgraphie (Rauhigkeit) des inneren Lumens sehr stark von der Oberflächenstruktur des eingesetzten gas-permeablen Materials (Poren, Spalten, Kanäle und andere Unregelmäßigkeieten) bestimmt wird. Poröses Material erlaubt nur die Passage von Mikrosauerstoffblasen, die die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen nicht gleichmäßig über die gesamte Wachstumsebene gewährleisten und somit die Cellulosebildung stören und zu Defekten/Inhomogenitäten in der gesamten aufgebauten hohlen Cellulose, insbesondere aber auch im Lumen der hohlen Cellulose führen können.
IV. Nicht-poröses Material soll die gleichmäßige Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen gewährleisten und die Gasblasenbildung unterbinden. Als mögliche Folge kann eine zu starke Haftung der BNC am Trägermaterial angenommen werden. Die Isolierung des Cellulosetubes führt zu Verletzungen der inneren Oberfläche.
V. Durch die Erhöhung des angelegten partiellen Sauerstoffdrucks an der äußeren Wandung eines gaspermeablen, nicht-porösen Hohlträgers wie in WO 2008/040729 A2 beschrieben, wird ein Gasüberdruck an der inneren Wandung des gebildeten Cellulosehohlkörpers initiiert. Dieser Gasüberdruck wirkt zum einen der Diffusion der Kulturlösung durch die gebildete Cellulose entgegen, zum anderen können auch Ablöseprozesse der sich bildenden Cellulose vom Träger während der Kultivierung nicht ausgeschlossen werden. Das Einschließen von Gasblasen führt zu Fehlstellen/Inhomogenitäten innerhalb der Cellulose sowie an der inneren Oberfläche.
VI. Die hohe Konzentration an Cellulose-synthetisierenden Bakterien über die gesamte innere Oberfläche der Cellulosehohlkörper stellt hohe Anforderungen an eine sich an Produktion und Isolierung anschließende Reinigung, da bei Verwendung der so hergestellten Cellulosehohlkörper als Blutgefäßersatz diese innere Oberfläche der Kontaktfläche mit dem Blut entspricht. Trotz intensiver Reinigung können Reaktionen des Immunsystems auf Verunreinigungen nicht ausgeschlossen werden.
VII. Wird BNC an der Oberfläche von sauerstoffdurchlässigen Membranen kultiviert, ist von verminderter Biokompatibilität, -stabilität sowie fehlender Bioaktivität des Materials auszugehen. Außerdem ist das Kultivierungsverfahren an sich nur sehr eingeschränkt steuerbar. Lediglich die Sauerstoffzufuhr und der Durchmesser der Hohlkörper-Membranen bieten die Möglichkeit, auf die Morphologie des BNC-Hohlkörpers und damit auf mechanische Eigenschaften Einfluss zu nehmen.

In dem Verfahren erfolgt die Kultivierung nicht rein statisch sondern in „bewegt-statischer“ Form, wobei der Gegenstand/das Template oder das Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus, oder beides, gesteuert so bewegt werden, dass die Oberfläche des Templates/Gegenstands benetzt wird. Ein dauerhafter Kontakt des Gegenstands/Templates mit dem Gemischvorrat wird jedoch ausgeschlossen. Das Template/der Gegenstand und der Gemischvorrat, der das Kulturmedium und den Mikroorganismus aufweist, werden relativ zueinander bewegt und dabei zeitweise, aber nicht ständig, in Kontakt gebracht.
Kennzeichen des Verfahrens sind ein periodisch aber nicht dauerhaft mit Kulturlösung und Mikroorganismus in Kontakt gebrachtes Template/Gegenstand, die Ausbildung eines Films, der Kulturmedium und Mikroorganismus enthält, auf dem Template/Gegenstand und die Biosynthese des Polymers auf dem Template/Gegenstand ausschließlich in und/oder auf dem Film - außerhalb des Gemischvorrats.
Durch periodischen, aber vorzugsweise kurzzeitigen Kontakt mit dem Kulturmedium wird eine Versorgung der Mikroorganismen mit Nährstoffen etc. sichergestellt. Die äußere Formung des Hohlkörpers erfolgt erfindungsgemäß berührungsfrei, ausschließlich durch den Einfluss der Schwerkraft. Nach dem Benetzungsvorgang befindet sich der benetzte Gegenstand/das benetzte Template frei in der umgebenden Sauerstoff-haltigen Atmosphäre und der Polymerbildungsprozess, insbesondere ein Cellulosebildungsprozess, erfolgt in und/oder auf dem Film. Die äußere Formgebung des Hohlkörpers wird ausschließlich durch die Wahl der Kultivierungsbedingungen definiert. Zu den Kultivierungsbedingungen zählen beispielsweise die Richtung der Schwerkrafteinwirkung, die Häufigkeit und der Abstand einzelner Drehungen, das Zeitintervall zwischen den Benetzungen, die Benetzungszeit, die Verweilzeit, wie nachfolgend noch erläutert, die Temperatur, und die Kultivierungsdauer. Während des Verfahrens ist ein Kulturlösungs- und Sauerstoffaustausch zwischen der aufwachsenden Schicht des Hohlkörpers und dem Kultivierungsmillieu gegeben, so dass eine optimale Versorgung mit Nährmedium, Luft und Mikroorganismen gewährleistet ist.
Es erfolgen eine kurzzeitige Benetzung und damit die erforderliche Zufuhr der Kulturlösung an den Ort der Biosynthese. Damit ist die Zufuhr der Kulturlösung im Gegensatz zu den genannten und diskutierten Publikationen nicht mehr diffusionsbestimmt. Bei der Benetzung werden alle für die Biosynthese notwendigen Nährstoffe übertragen.
Bei der BNC-Herstellung unter Verwendung von Reaktoren mit rotierenden Scheiben wird zwar die Diffusionsbarriere überwunden, was durch eine ständige rotierende Bewegung des Templates in der Kulturlösung erreicht wird. Der dauerhafte Kontakt der Mikroorganismen mit der Kulturlösung führt aber zu BNC-Produkten mit strukturellen Nachteilen, wie bei der Würdigung des Standes der Technik genannt. Durch die gesteuerte Zufuhr der Kulturlösung wird die Cellulosebildungsgeschwindigkeit so geregelt, dass optimale Verdichtungs- und Verfestigungsprozesse ohne Störungen im Kristallisationsprozess ermöglicht werden.
Überraschend bietet das Verfahren optimale Bedingungen für die Anlagerung von Bakterien an ein Template oder einen Gegenstand und deren gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen und Sauerstoff. Gleichzeitig wird die BNC mit in der Kulturlösung freibeweglichen Bakterienzellen beladen.
Der Ort der Biosynthese und damit der Ort der höchsten Bakterienkonzentration befinden sich in der äußeren Grenzschicht des Hohlkörpers und damit nicht auf der Seite des Hohlraums, der bei einem künstlichen Blutgefäß das perspektivisch mit Blut in Kontakt stehende Lumen bildet.
Mit dem Verfahren lassen sich Hohlkörper herstellen, die eine Wand mit phasenweisem Aufbau besitzen. Der Begriff „Phase“ bezeichnet eine schichtartige Struktur, wobei die Phase aus mehreren Schichten aufgebaut sein kann.
Insbesondere ist der Hohlkörper ein Hohlzylinder mit einer Mittelachse, die mittig und längs der Zylinderausdehnung durch den Hohlraum verläuft. Insbesondere ist der Hohlkörper aus mindestens zwei, rotationssymmetrisch um die Hauptachse angeordneten, parallel zueinander verlaufenden, miteinander verbundenen, störungsfreien BNC-Phasen gekennzeichnet. Auf diese Weise kann ein biomimetischer Aufbau der Wand des Hohlkörpers erzeugt werden. Im Gegensatz zu WO 2008/040729 wurde gefunden, dass die Phasen fest miteinander verbunden sind. Desweiteren besitzen die Phasen vorzugsweise einen homogenen Aufbau, ohne Störstellen und Strukturgradienten.
Überraschender Weise wurde gefunden, dass dieser Aufbau dem Hohlkörper über die gesamte Länge Formstabilität und gleichmäßig hohe mechanische Reiß- und Druckfestigkeit sowie ausreichende Elastizität unabhängig vom inneren Durchmesser des Hohlkörpers verleiht. Die Phasen sind charakterisiert durch ein gleichmäßiges (isotropes), gut verzweigtes Fasernetzwerk. Anzahl und Stärke der Phasen sind kontrolliert einstellbar. Grundlegend sind die Wände aller natürlichen Arterien und Venen durch einen 3-Schichten-Aufbau aus der Tunica intima, der Tunica media und der Tunica externa (Adventicia) gekennzeichnet. Die Phasen sind so angeordnet, dass sie der einem natürlichen Gefäß nahe kommenden Struktur insbesondere der Media entsprechen (biomimetische Struktur) und den Aufbau körpereigener Strukturen (Adventitia und Intima) sowie den Stoffaustausch vergleichbar mit dem natürlicher Austauschprozesse (bioaktives Material) anregen.
Das Verfahren, kann wie bereits erwähnt in der eingangs beschriebenen Vorrichtung durchgeführt werden. Es wird vorzugsweise in einer zuvor sterilisierten Vorrichtung durchgeführt und mit sterilem Kulturmedium. In einer Variante können das Kulturmedium und die Vorrichtung getrennt voneinander sterilisiert werden. Zur Durchführung des Verfahrens wird anschließend das sterilisierte Kulturmedium in das Reservoir innerhalb des Gehäuses der Vorrichtung, welche ebenfalls bereits steril sind, eingebracht, beispielsweise durch eine oben bereits beschriebene Öffnung im Gehäuse, die nach Einbringen des sterilen Kulturmediums und Impfung des Kulturmediums mit dem Mikroorganismus verschlossen wird. In einer anderen Variante wird die Kulturlösung vor dem Sterilisieren der Vorrichtung in dieselbe eingebracht, und die Sterilisation von Vorrichtung und Kulturmedium erfolgt gleichzeitig. Anschließend kann das Kulturmedium mit dem Mikroorganismus beimpft werden, wobei der Mikroorganismus durch eine oben bereits beschriebene Öffnung im Gehäuse eingeschleust werden kann. In beiden Varianten ist das Template vorzugsweise bereits in die Vorrichtung eingesetzt, wenn diese sterilisiert wird. Ansonsten müsste das Template ebenfalls getrennt sterilisiert und anschließend in die sterilisierte Vorrichtung eingesetzt werden.
Die Zeiten des in Kontakt Bringens der Oberfläche eines Gegenstands (Schritt a) mit einem Gemischvorrat und des in Kontakt Bringens des in Schritt c) erzeugten mikrobiellen Polymers mit dem Gemischvorrat (Schritt d) werden als „Benetzungszeiten“ bezeichnet. Die Zeiten des in Kontakt Bringens des Flüssigkeitsfilms mit einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre (Schritte c und f)) werden als „Verweilzeiten“ bezeichnet. Benetzungszeiten und Verweilzeiten können von einander unabhängig gesteuert werden.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird der Gegenstand zumindest während Schritt c), vorzugsweise auch während Schritt a) und b) um eine oder mehrere Raumachsen rotiert. Wenn die optionalen Schritte d), e) und f) einmal oder mehrmals ausgeführt werden, dann wird in einer weiteren Ausführungsform der Gegenstand zumindest während dem Schritt f), oder einem oder mehreren der Schritte f), wenn der Schritt f) mehrmals durchgeführt wird, um eine oder mehrere Raumachsen rotiert. Der Gegenstand kann auch während Schritt d) und e), um eine oder mehrere Raumachsen rotiert werden, wenn eine Rotation während des Schrittes f) erfolgt.
Die Gesamtkultivierungszeit beträgt vorzugsweise 1-7 Tage. Die Gesamtkultivierungszeit entspricht der gesamten Prozesszeit, innerhalb welcher alle Schritte des Verfahrens, wie Dreh-, Benetzungs- und sonstige Schritte ablaufen. Die Dauer des Verfahrens bestimmt die Dicke des auf dem Template gebildeten Polymers, die der Wandstärke des isolierten Hohlkörpers entspricht.
Das Verfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C durchgeführt.
Die mit dem Verfahren erhaltenen Hohlkörper können ohne Trocknung nach einem Reinigungsprozess als feuchte Implantate eingesetzt werden. Die Hohlkörper können gereinigt werden, um Reste und Bestandteile des Kulturmediums und Mikroorganismen zu entfernen. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mit Wasser, wässriger saurer oder alkalischer Lösung, oder einem organischen Lösungsmittel, oder einer Kombination davon.
Andererseits können die Hohlkörper zur Lagerung, beispielsweise durch Gefriertrocknung oder Kritischpunkttrocknung, schonend getrocknet werden, wobei die Struktur und die Wiederquellbarkeit von Nanocellulose erhalten bleiben. Vor einer chirurgischen Anwendung kann das Implantat beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung oder auch patienteneigenem oder allogenem (pharma-grade) Serum wieder gequollen werden.
Mit der vorliegenden Vorrichtung und dem Verfahren hergestellte Hohlkörper können in medizinischen Anwendungen als innere Hohlstrukturen und -gefäße, wie Blutgefäße, Speiseröhre, Verdauungstrakt, Luftröhre, Harnröhre, Gallengang, Harnleiter, Lymphgefäße oder als Manschette (cuff) zur Umhüllung von körpereigenen Strukturen wie Hohlorganen oder Nervenfasern, oder als Interponat eingesetzt werden, wobei die Hohklkörper direkt oder nach Adaption an die Organspezifik eingesetzt werden können. Weitere Verwendungen sind die Verwendung als medizinisches Übungsmaterial, insbesondere für das realitätsnahe Training chirurgischer Techniken, in der cardiovaskulären Medizin und der Viszeralchirurgie, wozu die Hohlkörper auch mechanisch bearbeitet werden kann.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen in einer vereinfachten Ansicht

1 eine erste Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dynamischer Anordnung des Templates und eine statische Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht
2 eine zweite Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dynamischer Anordnung des Templates und dynamischer Anordnung des Gemisches, in einer Schnittansicht

Beispiel 1: Aufbau und Funktionsweise von Vorrichtungen
In der Ausführungsform der 1 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 als Bioreaktor ausgeführt, mit einem Gehäuse 15, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Das Gefäß 9 ist mit der Abdeckung 8 verschließbar und hier im geschlossenen Zustand gezeigt. Das Gefäß 9 und die Abdeckung 8 können aus Edelstahl sein. In dem Bioreaktor befindet sich ein separates Reservoir 2 für das Gemisch 10, bestehend aus einer Kulturlösung und einem Mikroorganismus. Das Reservoir 2 und das Gemisch 10 können durch die Öffnung 17 des Gefäßes 9 eingebracht werden, wenn die Abdeckung 8 vom Gefäßes 9 entnommen wird.
Eine weitere verschließbare Öffnung 19 ist in der Abdeckung 8 vorgesehen und mit einem Verschluß 20 verschlossen. Alternativ ist es daher auch möglich, das Reservoir 2 in das Gefäß 9 einzusetzen, die Abdeckung 8 zu schließen und die Kulturlösung bzw. das Gemisch durch die Öffnung 19 zuzugeben.
Mehrere Templates 3, hier Zylinder aus Metall oder Holz, sind zwischen zwei Einspannvorrichtungen 4 eingespannt und bilden eine Anordnung aus mehreren Templates (Template-Matrix).
Die Templates 3 sind über eine Kupplung 6, hier stabförmig, mit einem Motor 7 verbunden. Der Motor 7 kann den Stab 6 und die Templates 3 absenken und in das Gemisch 10 in dem Reservoir 2 eintauchen. In einer Gegenbewegung können die Templates wieder angehoben und ausgetaucht werden. Beim Austauchen verbleibt ein Film aus dem Gemisch 10 auf den Templates 3. Der Motor 7 und die Kupplung 6 bilden eine Benetzungseinrichtung. In der hier gezeigten schematischen und nicht maßstäblichen Darstellung ist die Kupplung 6 nur verkürzt gezeichnet. Sie ist so lang ausgeführt, dass die Eintauch- und Austauchbewegung möglich ist. Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist durch eine dynamische Anordnung der Templates 3 und eine statische Anordnung des Gemisches 10 aus Kulturlösung und Mikroorganismus gekennzeichnet: Das Gemisch 10 wird nicht bewegt, während zur Benetzung die Template 3 durch eine Ab- und Aufwärtsbewegung in das Gemisch 10 ein- und ausgetaucht werden. Die Ein- und Austauchbewegung erfolgt translatorisch entlang der dargestellten Z-Achse.
Die Kupplung 6 ist durch die Öffnung in der Abdeckung 8 geführt. Der Spalt zwischen dem Rand der Öffnung und dem Stab ist durch die Dichtung 16 verschlossen, sodass der Innenraum 14 gegen die Umgebung 18 dicht verschlossen ist.
Durch eine schematisch dargestellte Bewegungseinrichtung 5 wird eine Bewegung der Template 3 innerhalb des Innenraums 14 realisiert. Der Antrieb der Bewegungseinrichtung erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 wird um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind. Die Bewegungseinrichtung kann so ausgestaltet sein, dass der Zusammenbau statt um die X-Achse, oder zusätzlich dazu, um die eingezeichnete Y-Achse, oder um weitere Achsen, rotierbar ist. Denkbar ist beispielsweise eine kardanische Aufhängung des Zusammenbaus.
In einer weiteren vorliegenden Ausführungsform der 2 ist die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 als Bioreaktor ausgeführt, mit einem Gehäuse 15, welches aus einem Gefäß 9 und einer Abdeckung 8 besteht und den Innenraum 14 umschließt. Im Innenraum 14 befinden sich der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, ein erstes Reservoir 2 und ein zweites Reservoir 2' für das Gemisch 10. Das erste Reservoir 2 und das zweite Reservoir 2' sind gegenüber liegend, beidseitig des Zusammenbaus aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3 angeordnet. Die Reservoire 2, 2' können in Richtung der Templates geöffnet werden. Mit Verschlusseinrichtungen 13, 13' können die Öffnungen der Reservoire 2, 2' wahlweise geöffnet oder geschlossen werden. Die Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind kein zwingendes Merkmal der erfindungsgemäßen Vorrichtung, aber vorteilhaft um ein ungewolltes Austreten von Gemisch 10, 10' aus den Reservoiren 2, 2' zu verhindern. Die schematisch dargestellten Verschlusseinrichtungen 13, 13' können beispielsweise mechanisch oder elektromagnetisch gesteuerte Ventile sein.
Der Zusammenbau aus Einspannvorrichtungen 4 und Templates 3, das erste Reservoir 2, das zweite Reservoir 2' und die Verschlusseinrichtungen 13, 13' sind von einer Umhüllung 12 umgeben und relativ zu dieser und relativ zueinander fixiert. Die Bewegungseinrichtung 5 greift an der Umhüllung 12 an.
Der Antrieb der Bewegungseinrichtung 5 erfolgt mit dem Motor 7 über die Kupplung 6. In der gezeigten Ausführungsform wird die Kupplung 6 um ihre Längsachse rotiert und hat dadurch die Funktion einer Welle. Die Welle ist mit einem (nicht dargestellten) Getriebe verbunden, welches ein Teil der Bewegungseinrichtung 5 ist und der Zusammenbau aus Hülle 12, Einspannvorrichtungen 4, Templates 3, Reservoirs 10, 10' im Uhrzeigersinn dreht, dargestellt durch einen Pfeil. Die Einspannvorrichtung 4 mit den Templates 3 werden um eine Raumachse gedreht, die senkrecht zur Zeichnungsebene steht (X Achse). Die X-Achse steht senkrecht zu den Längsachsen der Templates 3, die längs in Richtung der eingezeichneten Z-Achse ausgerichtet sind.
Im dargestellten Zustand der Vorrichtung ist das erste Reservoir 2 mit Gemisch 10 gefüllt. Bei einer Drehung im Uhrzeigersinn um 180° um die X-Achse wird das erste Reservoir 2 mitsamt Gemisch 10 in die obere Stellung bewegt, wo sich in dieser Darstellung noch das Reservoir 2' befindet. Dabei wird die Verschlusseinrichtung 13 geöffnet und das Gemisch 10 ergießt sich über die Templates 3. Nicht an der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch ergießt sich in das in die untere Stellung bewegte zweite Reservoir 2', dessen Verschlusseinrichtung 13' ebenfalls geöffnet wurde, und wird darin als Gemisch 10' aufgefangen (in der Darstellung der 2 bezeichnet 10' noch den Raum in den das Gemisch 10' fließt, noch nicht das Gemisch selbst). An der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch bildet dort einen Film aus. Der beschriebene Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden und findet bei der nächsten Drehung um die X-Achse um 180° in umgekehrter Richtung statt: das Gemisch 10', wird aus dem zweiten Reservoir 2' über die Templates 3 gegossen und nicht an der Oberfläche der Templates 3 verbleibendes Gemisch wird in dem ersten Reservoir 2 aufgefangen.
Die Benetzungseinrichtung 6, 7 und die Bewegungseinrichtung 5, welche die Templates 3 dreht, sind in der Ausführungsform der 2 zusammen gefasst: Die Bewegungseinrichtung 5 dreht die Reservoirs 2, 2' und die Templates 3 wie oben angegeben, wodurch wie erläutert eine Benetzung erfolgt. Zusätzlich zu der erwähnten Drehung um die X-Achse können die Templates 3 und die Reservoirs 2, 2' auch um weitere Raumachsen gedreht werden, beispielsweise um die Y-Achse. In den Zeiträumen zwischen den Benetzungsvorgängen werden die Reservoirs 2, 2' mittels der Verschlusseinrichtungen 13, 13' verschlossen und die Templates 3 können mit der Bewegungseinrichtung 5 gedreht werden, ohne dass sich Gemisch 10 über die Templates ergießt. In dieser Zeit wird in und/oder auf dem Film auf der Oberfläche der Templates 3 Polymer gebildet.
Die Ausführungsform der 2 ist durch eine dynamische Anordnung des Templates und eine dynamische Anordnung der Kulturlösung gekennzeichnet. Die Vorrichtung ermöglicht ein Verfahren zum Aufbau von BNC-Implantaten bei dem gleichzeitig die Templates 3 und das Gemisch 10 periodisch bewegt werden.
Beispiel 2: Verfahren - Herstellung eines Hohlkörpers aus mikrobieller Cellulose:
Zur Herstellung der Produkte werden Templates 3 zwischen Einspannvorrichtungen 4 angeordnet und in die Bewegungseinrichtung 5 eingesetzt. Der Reaktor wird daraufhin mit der Abdeckung 8 verschlossen und sterilisiert. Nach erfolgter Sterilisation des gesamten Reaktors wird/werden das Reservoir 2 oder die Reservoire 2, 2' unter sterilen Bedingungen mit einem Gemisch 10 aus Cellulose bildende Mikroorganismen und getrennt sterilisierter Kulturlösung 10 befüllt.
Mikroorganismus: 247,5 ml einer Vorkultur eines Bakteriums der Gattung Gluconacetobacter.
Kulturlösung: 4950 ml Nährlösung, die pro Liter deionisiertem Wasser 20,00 g Glucose wasserfrei, 5,00 g Bactopepton, 5,00 g Hefeextrakt, 3,40 g di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat und 1,15g Citronensäure-Monohydrat enthält sowie einen pH-Wert zwischen 6,0 und 6,3 aufweist (Hestrin-Schramm-Medium, dampfsterilisiert bei 121 °C für 20min im Autoklaven).
Es ist auch möglich, das Reservoir 2 / die Reservoire 2, 2' vor dem Sterilisationsvorgang mit Kulturlösung zu befüllen und zusammen mit allen anderen Einbauten im Bioreaktor zu sterilisieren und anschließend Mikroorganismen zuzugeben, beispielsweise durch eine verschließbare Öffnung im Gehäuse unter sterilen Bedingungen.
Die Bedingungen im Reaktorinnenraum Temperatur, Druck, Atmosphärenzusammensetzung werden entsprechend den Kultivierungsbedingungen eingestellt. Durch das Gehäuse 15 ist jeglicher unkontrollierter Stoffaustausch mit der Umgebung unmöglich, wodurch die Sterilität über den gesamten Kultivierungsprozess sichergestellt wird.
Daraufhin wird der Motor 7 gestartet, und dadurch die Bewegungseinrichtung 5 und die Benetzungseinrichtung 6, 7 in Bewegung gesetzt und die Template-Matrix 3, 4 entsprechend den vorgegebenen Kultivierungsbedingungen bewegt. Die Bewegungsarten der verschiedenen Ausführungsformen einer Vorrichtung wurden in Beispiel 1 erläutert. Die Bewegung erfolgt vorzugsweise diskontinuierlich mit Frequenzen vorzugsweise kleiner 0,01 Hz dahingehend, dass die Templates auf definierte Weise mit Kulturmedium 10 benetzt werden. Daraufhin oder gleichzeitig sorgt die Bewegungseinrichtung 5 durch gezielt überlagerte Bewegungen für eine definierte Verteilung des Flüssigkeitsfilmes. Während dieser Bewegung erfolgt die Kultivierung der bakteriellen Nanocellulose auf dem Template 3 an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeitsfilm und sauerstoffhaltiger Atmosphäre im Innenraum 14. Dieser Vorgang wird so lange wiederholt, bis das Produkt die gewünschte Form angenommen hat.
Sodann kann der Reaktor geöffnet, die Templates 3 mit den darauf gebildeten Hohlkörpern aus bakterieller Nanocellulose entnommen und der Aufarbeitung zugeführt werden. Die Hohlkörper werden von den Templates abgestreift, gereinigt und feucht gelagert oder getrocknet, wie im allgemeinen Beschreibungsteil beschrieben.
Mit einer abgewandelten Vorrichtung ist es auch möglich die Sterilisation und Aufarbeitung der synthetisierten Hohlkörper im Reaktor derart vorzunehmen, dass beim Öffnen des Reaktors das fertige Produkt entnommen werden kann. Durch eine nicht gezeigte Einrichtung könnte durch eine weitere Öffnung das Kulturmedium 10 durch entsprechende Reinigungs- bzw. Spülflüssigkeiten ersetzt werden.
Bezugszeichenliste

1: Vorrichtung
2: Reservoir für Kulturlösung/Gemisch
3: Template/Gegenstand
4: Einspannvorrichtungen
5: Bewegungseinrichtung
6: Kupplung
7: Motor
8: Abdeckung
9: Gefäß
10: Gemisch, enthaltend Kulturlösung und Mikroorganismus
11: Drehachsen
12: Umhüllung
13 14 15 16 17 18 19 20: Verschlusseinrichtung Innenraum (mit sauerstoffhaltiger Atmosphäre) Gehäuse Dichtung Öffnung Umgebung Öffnung Verschluss

Claims

Vorrichtung (1) zur Herstellung von Hohlkörpern aus einem mikrobiellen Polymer, insbesondere mikrobieller Cellulose, aufweisend - ein Template (3), das die Negativform des Hohlraums des herzustellenden Hohlkörpers und der inneren Wände des Hohlraums ist, - ein erstes Reservoir (2), das mit einem Gemisch (10), welches ein flüssiges Kulturmedium und einen Polymer-bildenden Mikroorganismus umfasst, befüllbar ist, - eine Benetzungseinrichtung (6, 7) zur Benetzung des Templates (3) mit dem in das Reservoir eingebrachten Gemisch (10), wobei mit der Benetzungseinrichtung ein Flüssigkeitsfilm auf der Oberfläche des Templates erzeugbar ist, - ein Gehäuse (15), welches zumindest das Template (3) und das Reservoir (2) so umschließt, dass ein Stoffaustausch mit der Umgebung (18) des Gehäuses verhinderbar ist, gekennzeichnet durch - eine Bewegungseinrichtung, womit das Template (3) um mehrere Raumachsen rotierbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Gehäuse (15) eine verschließbare Öffnung (19) aufweist, durch welche ein Stoffaustausch mit der Umgebung (18) erfolgen kann.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gehäuse (15) insgesamt oder teilweise durchsichtig ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bewegungseinrichtung (5) so ausgestaltet ist, dass damit das Template um eine oder mehrere Raumachsen rotierbar ist, die quer zu einer Längsachse des Templates stehen.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche hat, die Strukturen im Millimeter-, Mikrometer- und/oder Nanometerbereich aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Template eine Oberfläche aus Holz, Metall, Kunststoff, Keramik, synthetischem Polymer, Papier Textilgewebe oder Glas hat.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, aufweisend eine Anordnung aus mehreren Templates (3).
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die sterilisierbar ist, insbesondere durch Hitze, Dampf, Strahlung und/oder Chemikalien.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Template (3) in das Gemisch (10), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, ein- und ausgetaucht werden kann.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-8, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Gemisch (10), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem ersten Reservoir (2) über das Template (3) gegossen werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 10, die ein zweites Reservoir (2') aufweist, wobei nach dem Gießen des Gemisches (10), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch (10') in dem zweiten Reservoir (2') auffangbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Benetzungseinrichtung (6, 7) so ausgestaltet ist, dass damit das Gemisch (10'), welches das Kulturmedium und den Mikroorganismus umfasst, aus dem zweiten Reservoir (2') über das Template (3) gegossen werden kann und wobei nach dem Gießen des Gemisches (10') über das Template nicht an der Oberfläche des Templates verbleibendes Gemisch (10) in dem ersten Reservoir (2) aufgefangen werden kann.