DE102011055367A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe - Google Patents
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Abstract
Zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (2) in einer Probe (3) wird der Partikel (2) mit Licht (4) zur Emission von Photonen veranlasst, und von dem Partikel (2) emittierte Photonen werden registriert. Dabei wird das Licht (4) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19) aufweisenden Intensitätsverteilung (18) auf die Probe (3) gerichtet; und das Minimum (19) wird dem sich in der Probe (3) bewegenden Partikel (2) nachgeführt, indem die Intensitätsverteilung (18) so gegenüber der Probe (3) verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel (2) emittierten Photonen minimal bleibt.
Description
- TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe, wobei der Partikel mit Licht zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel emittierten Photonen registriert werden. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf eine Vorrichtung zur Durchführung eines solchen Verfahrens mit einer Lichtquelle für das Licht und mit einem Detektor, um die Photonen zu registrieren.
- Der Partikel dessen Bewegung in der Probe verfolgt wird, kann ein einzelnes Molekül, eine sich gemeinsam bewegende Gruppe von Molekülen, ein Komplex, ein Quantum-Dot, ein reflektierender Goldpartikel oder dergleichen sein. Der Prozess, aufgrund dessen der Partikel durch das Licht zur Emission von Potonen gebracht wird, wird häufig Fluoreszenz sein. Grundsätzlich sind aber auch andere Prozesse, einschließlich Streuung des Lichts, als Grundlage der Emission der Photonen nutzbar. Dabei kann der jeweilige Prozess, der zu der Emission der Photonen führt, unmittelbar mit dem zu verfolgenden Partikel oder mit einem Marker, insbesondere einem Farbstoff, verknüpft sein, mit dem der Partikel markiert ist.
- STAND DER TECHNIK
- Zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls in einer Probe ist es bekannt, das Molekül mit Licht zur Emission von Photonen anzuregen und die von dem Molekül emittierten Photonen mit einem die Probe abbildenden zweidimensionalen Detektor zu registrieren, um die momentane Position des Moleküls aus der räumlichen Verteilung abzuleiten, in der die Photonen von dem Detektor registriert werden. Dabei kann bei geeigneter Abstimmung der Pixeldichte des Detektors aus der räumlichen Verteilung der Photonen mit höherer räumlicher Auflösung als der Beugungsgrenze auf die aktuelle Position des Moleküls geschlossen werden.
- Weitere Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass für jede Position des Moleküls eine größere Anzahl von Photonen registriert werden kann, weil aus einer Mehrzahl von registrierten Photonen nur dann mit einer verbesserten räumlichen Auflösung auf den Ort des Moleküls geschlossen werden kann, wenn dieser über die Registrierung der Photonen hinweg unverändert geblieben ist. Die räumliche Auflösung ausgedrückt als der Radius Δr, innerhalb dessen sich die wahre Position eines Moleküls um die nach dem Schwerpunkt des Beugungsmusters des Moleküls auf dem Detektor bestimmte Position befindet, hängt dabei gemäß
Δr = FWHM/N1/2 (1) - Da das bekannte Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls also eine große Anzahl N von Photonen für jede zu erfassende Position des Moleküls in der Probe benötigt, wird das Molekül bei diesem Verfahren erheblich beansprucht, woraus eine hohe Gefahr des Bleichens des Moleküls resultiert. Beim Bleichen verändert sich das Molekül aus einem angeregten Zustand heraus chemisch, so dass keine Photonen von ihm mehr erhalten werden können. Neben diesem photochemischen Bleichen kann ein Molekül, das häufig zur Emission von Photonen angeregt wird, auch in einen metastabilen Dunkelzustand gelangen, aus dem es zwar nach längerer Zeit wieder zurückkehrt, in dem es jedoch zwischenzeitlich keine Photonen mehr emittiert, mit deren Hilfe seine Position erfasst werden kann.
- Aus den voranstehenden Gründen sind nur wenige Moleküle, d. h. nur wenige sogenannte Fluoreszenzfarbstoffe, zur Verwendung bei dem bekannten Verfahren geeignet. Viele Fluoreszenzfarbstoffe bleichen zu schnell, um ihre Bewegung oder die Bewegung eines mit ihnen markierten Moleküls über einen längeren Zeitraum oder Weg in der Probe verfolgen zu können.
- Während bei den voranstehend geschilderten Verfahren die Position des Moleküls aus der Verteilung der Positionen, an denen die von dem Molekül emittierten Photonen von einem zweidimensionalen Detektor registriert werden, abgeleitet wird, wobei dieses Vorgehen als Lokalisation bezeichnet wird, wird bei der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie der räumliche Bereich, in dem Moleküle in einer Probe effektiv zur Emission von Photonen angeregt werden, bis unter die Beugungsgrenze hinab eingegrenzt. So können aus der Probe heraus emittierte Photonen unabhängig von dem Ort ihrer Registrierung und ihrer Anzahl diesem räumlichen Bereich zugeordnet werden. Konkret erfolgt die Eingrenzung des Bereichs der effektiven Anregung zur Emission von Photonen dadurch, dass ein fokussierter Anregungslichtstrahl mit einem Interferenzmuster aus kohärenten Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen überlagert wird, das am Fokuspunkt des Anregungslichtstrahls eine Nullstelle aufweist. Bei hoher absoluter Intensität der Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen steigt die Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts im Randbereich der Nullstelle sofort auf einen Sättigungsgrenzwert IS an, ab dem die Emission von Photonen durch Moleküle in der Probe im Wesentlichen vollständig verhindert wird. Dabei gilt für die erzielbare Ortsauflösung
Δr = λ/(n sinα(1 + I/IS)1/2) (2), - Die Fluoreszenzverhinderung erfolgt bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie durch stimulierte Emission. Bei der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie erfolgt sie durch vorübergehendes Umschalten der Moleküle in einen nichtfluoreszenzfähigen Konformationszustand. Die Gefahr des Bleichens verwendeter Farbstoffe ist bei der STED-Fluoreszenzlichtmikroskopie durch die notwendigerweise hohe absolute Intensität des Fluoreszenzverhinderungslichts relativ groß. Bei der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie werden zwar keine besonders hohen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts benötigt, hier sind jedoch spezielle, ein Umschalten in den nichtfluoreszenzfähigen Konformationszustand erlaubende Fluoreszenzfarbstoffe erforderlich.
- Grundsätzlich wäre es zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe denkbar, diesem mit einem räumlich reduzierten Bereich der effektiven Anregung zur Emission von Fluoreszenzlicht nachzufahren, wie er sich bei der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie ergibt. Dabei wäre zu jedem Zeitpunkt die Rate der Photonen, die von dem verfolgten Partikel emittiert werden, zu maximieren, um die Schlussfolgerung treffen zu können, dass sich der Partikel in dem räumlich reduzierten Bereich der effektiven Anregung zur Emission von Fluoreszenzlicht befindet. Zwar müsste dabei nicht jeweils eine so große Anzahl von Photonen wie bei der Lokalisation von dem Partikel registriert werden. Dennoch ließe sich die Anzahl der verwendbaren Partikel und Marker gegenüber dem zuvor beschriebenen bekannten Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines einzelnen Moleküls über längere Strecken nicht wesentlich erhöhen. Zudem wären wie bei der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie unterschiedliche und sowohl räumlich als auch bezüglich ihrer Wellenlänge aufeinander abgestimmte Anregungs- und Fluoreszenzverhinderungslichtstrahlen einzusetzen.
- AUFGABE DER ERFINDUNG
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe aufzuzeigen, bei denen die Gefahr des Bleichens des Partikels oder seines Markers auch bei der Verfolgung seiner Bewegung über einen längeren Zeitraum und längere Strecken gering bleibt, indem sie mit einer minimalen Anzahl von emittierten Photonen auskommen.
- LÖSUNG
- Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 und durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 10 gelöst. Die abhängigen Patentansprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
- BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels in einer Probe, wobei das Partikel mit Licht zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel emittierten Photonen registriert werden, wird das Licht mit einer ein räumlich begrenztes Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet und das Minimum wird dem sich in der Probe bewegenden Partikel nachgeführt, indem die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel emittierten Photonen minimal bleibt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren macht von einer Intensitätsverteilung Gebrauch, die ein räumlich begrenztes Minimum aufweist. Wie bei dem Fluoreszenzverhinderungslicht in der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird diese Intensitätsverteilung vorzugsweise als Interferenzmuster kohärenter Lichtstrahlen ausgebildet, wobei das räumlich begrenzte Minimum eine Nullstelle des Interferenzmusters ist. Die räumlichen Abmessungen des Minimums können so besonders klein gehalten werden, insbesondere kleiner als die Beugungsgrenze. Anders als bei der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie wird das Licht mit dieser speziellen Intensitätsverteilung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren aber nicht zur Verhinderung von Fluoreszenz genutzt, sondern um den zu verfolgenden Partikel in der Probe zur Emission von Photonen zu veranlassen. Zudem wird die Probe nicht mit dem Minimum der Intensitätsverteilung abgescannt, sondern die Intensitätsverteilung wird gegenüber der Probe fortlaufend so verschoben, dass die Rate der von dem Partikel emittierten und registrierten Photonen minimiert wird. Dies weist jeweils darauf hin, dass sich der Partikel weiter am Ort des Minimums der Intensitätsverteilung befindet. Bei außerhalb des Minimums steil ansteigender Intensität des Lichts und hierauf basierend schneller Nachführung der Intensitätsverteilung bezüglich der aktuellen Position des Partikels in der Probe kann mit dem neuen Verfahren die Bewegung des Partikels mit einer räumlichen Auflösung deutlich unterhalb der Beugungsgrenze verfolgt werden, ohne dass der Partikel hierfür viele Photonen zu emittieren braucht. Entsprechend ist die Gefahr eines Bleichens des Partikels stark reduziert. In der Konsequenz können auch gegenüber Bleichen empfindliche Partikel über längere Zeiträume bzw. längere Strecken in der Probe problemlos verfolgt werden. Gegenüber Methoden der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie kommt hinzu, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nur die das Minimum aufweisende Intensitätsverteilung auf die Probe gerichtet wird und so weder räumlich noch bezüglich ihrer Wellenlänge mit einem weiteren Lichtstrahl abgestimmt werden muss. Hieraus resultiert auch ein optischer Aufbau der deutlich weniger komplex ist, als derjenige eines STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskops. Noch ein wesentlicher Unterschied des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber der STED- und auch der RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie ist es, dass die absolute Intensität des Lichts mit der das Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung vergleichsweise gering ausfallen kann, wenn sie bereits bei geringen Intensitäten außerhalb ihrer Nullstelle zur Emission von Photonen führt. Eine Sättigung der Anregung zur Emission außerhalb der Nullstelle muss in jedem Fall auch für eine räumliche Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze nicht angestrebt werden. Vielmehr ist häufig ein erkennbarer Anstieg dieser Anregung von der Nullstelle weg günstig. Letztlich gehört es bereits zu den kennzeichnenden Merkmalen der Erfindung, dass die Anzahl der von dem verfolgten Partikel emittierten Photonen und so zugleich die Gefahr seinen Bleichens minimiert wird.
- Das Verschieben der Intensitätsverteilung gegenüber der Probe zur fortlaufenden Minimierung der Rate der von dem Detektor registrierten Photonen kann auf einem Trial- and Error-Verfahren basieren. Das heißt, die Intensitätsverteilung wird probeweise in kleinen Schritten verschoben. Wenn sich durch die Verschiebung eine Reduktion der Rate der registrierten Photonen ergibt, die ein Maß für die Rate der emittierten Photonen ist, wird die Verschiebung in derselben Richtung fortgesetzt. Im anderen Fall wird die Verschiebung einer anderen Richtung, zum Beispiel der Gegenrichtung, probiert. Dem Fachmann sind hierzu unter den Schlagworten "Tracking-Verfahren" und "Fuzzy-Logik" verschiedene Detailausgestaltungsmöglichkeiten bekannt.
- Von der STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie kann der Fachmann aber alle Maßnahmen übernehmen, die dort zur Formung einer ein Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung von Fluoreszenzverhinderungslicht bekannt sind. Hierzu zählen Phasenplatten, Spatial Light Modulatoren, 4 Pi-Anordnungen und dergleichen.
- Auch für die Verlagerung der Intensitätsverteilung mit dem Minimum gegenüber der Probe kann auf Scanner zurückgegriffen werden, wie sie aus der STED- und RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskopie bekannt sind. Hierzu zählen zum Beispiel akusto-optische oder elektro-optische Reflektoren, Drehspiegel oder an dem jeweiligen Objektiv angreifende Piezosteller, die die Lichtstrahlen gegenüber der Probe ausrichten, oder Piezosteller, die die Probe gegenüber den Lichtstrahlen ausrichten.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Minimum der Intensitätsverteilung ein-, zwei- oder dreidimensional begrenzt sein, d. h. es kann eine Ebene, eine Linie oder einen Punkt beschreiben. Beim Verfolgen der Bewegung des Partikels wird die Intensitätsverteilung dann in all den Richtungen der Dimensionen gegenüber der Probe verschoben, in denen das Minimum begrenzt ist. Eine Verschiebung in einer Richtung, in der das Minimum nicht begrenzt ist, kann zu keiner Veränderung der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen führen und ist daher nicht sinnvoll. Dies ist gleichbedeutend damit, dass in dieser Richtung die Bewegung des Partikels auch nicht verfolgt werden kann. Diese Richtung ist also vorzugsweise so auszurichten, dass in ihr keine Bewegung des Partikels zu erwarten ist. Vielfach sind Bewegungen von Partikeln in einer Probe sowieso auf solche längs einer bestimmten Struktur beschränkt. Bei einer zweidimensionalen Probe entfällt bereits grundsätzlich die Bewegung der Partikels in der dritten Dimension.
- Es ist aber auch möglich, die Phasenbeziehung der Lichtstrahlen, aus denen die Intensitätsverteilung durch Interferenz generiert wird, zu modulieren, um das Minimum aus unterschiedlichen Richtungen ein- oder zweidimensional zu begrenzen. So kann bei der einen Phasenbeziehung das Minimum in einer x-y-Ebene ringförmig begrenzt sein, während es bei der anderen Phasenbeziehung in z-Richtung begrenzt ist. Alternativ können verschiedene aufeinander folgende Phasenbeziehungen zu in unterschiedlichen Richtungen ausgerichteten linien- oder flächenförmigen Minima führen, die als rotierende Streifen bezeichnet werden können und die einen Punkt oder eine Linie als räumliche Schnittmenge aufweisen. Wenn zwischen solchen verschiedenen Phasenbeziehungen schnell umgeschaltet wird und für jede Phasenbeziehung einzeln oder auch über die gesamte Variation der Phasenbeziehungen das Minimum der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen aufgesucht wird, kann die Bewegung des Partikels in der Probe in allen drei Dimensionen verfolgt werden.
- Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die Photonen, die von dem Partikel emittiert werden, ausschließlich mit einem Punktdetektor registriert werden, weil es primär auf die Rate dieser Photonen ankommt. Der aktuelle Ort des Partikels in der Probe kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren allein daraus bestimmt werden, welche Lage die Intensitätsverteilung mit dem Minimum aktuell gegenüber der Probe hat. Diese Lage ist aus der Stellung der Einrichtungen, mit denen die Intensitätsverteilung gegenüber der Probe verschoben wird, ableitbar, zum Beispiel aus den momentanen Stellungen der zum Verlagern der Intensitätsverteilung verwendeten Scanner. Die Lage der Intensitätsverteilung gegenüber der Probe kann aber auch direkt erfasst werden, indem beispielsweise ihr Bild auf einer die Probe abbildenden Kamera ausgewertet wird. Auch hierbei kann eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze erreicht werden.
- Eine die Probe abbildende Kamera kann auch dazu genutzt werden, eine Ausgangslage des Partikels bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung der Probe mit dem zur Emission von Photonen veranlassenden Licht zu erfassen. Wenn dabei mehrer Photonen emittierende Partikel erkannt werden, die nicht getrennt verfolgbar sind, können die überzähligen mit den hohen Intensitäten der Intensitätsverteilung des Lichts in den an ihr Minimum angrenzenden Maxima photochemisch weggebleicht werden. Ein solches Wegbleichen störender Partikel kann auch erfolgen, wenn zum Beispiel mit der Kamera durch eine große Anzahl von emittierten Photonen weiter außerhalb des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts erkannt wird, dass sich nicht der verfolgte Partikel weiter weg bewegt hat, sondern ein anderer, gleichartiger Partikel seinen Weg kreuzt.
- Eine die Probe abbildende Kamera kann weiterhin dazu genutzt werden, eine Richtung der Bewegung des Partikels aus den Orten abzuleiten, an denen die von dem Partikel emittierten Photonen mit der Kamera registriert werden. Dazu kann auch eine Lokalisation des Partikels aufgrund der Photonen durchgeführt werden, die er nach dem Verlassen des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts emittiert. Diese Lokalisation muss aber nicht mit besonders hoher Genauigkeit durchgeführt werden und erfordert entsprechend nicht sehr viele Photonen von dem Partikel, weil sie nur der Bestimmung einer Richtung dient, in der das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts dem Partikel nachgeführt werden muss, während die Ortsauflösung durch die anschließende Minimierung der Rate der Photonen von dem Partikel und damit durch die Ausgestaltung des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts erreicht wird.
- Da das erfindungsgemäße Verfahren auf eine Minimierung der Rate der von dem Partikel emittierten Photonen abstellt, gewinnt der Photonenuntergrund an Bedeutung, der zum Beispiel auf dem die Emission der Photonen veranlassenden Licht selbst oder auf Autofluoreszenz des Partikels beruhen kann. Zur Minimierung des Einflusses des Photonenuntergrunds beim Registrieren der von dem Partikel emittierten Photonen kann das Licht zur Veranlassung der Emission in Pulsen auf die Probe gerichtet werden und können von dem Partikel emittierte Photonen in einem begrenzten Zeitfenster nach jedem Puls des Lichts registriert werden. Das Zeitfenster oder Gate kann so gesetzt werden, dass sich ein maximales Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ergibt.
- Der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verfolgte Partikel kann auch ein schaltbarer Partikel, wie beispielsweise ein schaltbares Molekül sein, der mit dem zur Emission veranlassenden Licht zunächst aus einen Zustand, aus dem heraus er nicht zur Emission von Photonen veranlassbar ist, in einen fluoreszenzfähigen Zustand aktiviert wird, aus dem heraus er zur Emission von Photonen veranlassbar ist. Ein hierfür geeignetes Molekül ist unter dem Namen PADRON bekannt, bei dem es sich um eine Mutante des GFP handelt. In diesem Fall ist es zwar nicht zwingend, aber unter Umständen bevorzugt, wenn der Partikel möglichst schnell in seinen nicht fluoreszenzfähigen Dunkelzustand zurückkehrt, weil dadurch der die Rate der emittierten Photonen minimierende Effekt des Minimums der Intensitätsverteilung des zur Emission veranlassenden Lichts gefördert wird. Die Rückkehr in den Dunkelzustand kann spontan oder mit Unterstützung durch irgendein physikalisches oder chemisches Signal erfolgen, das nicht räumlich strukturiert zu sein braucht und daher vorzugsweise auch nicht räumlich strukturiert ist. Mit einer anderen Wellenlänge als derjenigen des zur Emission veranlassenden Lichts können ebenfalls genutzt werden, um beispielsweise eine geringe Konzentration der aktivierten und damit zur Emission von Photonen veranlassbaren Partikel in der Probe einzustellen, wie sie für jede Verfolgung einzelner Partikel Voraussetzung ist. Hierfür sind zum Beispiel ein als DRONPA bekanntes Molekül verwendbar, das eine andere Mutanten des GFP mit gegenüber PADRON umgekehrten Aktivierungsverhalten bei seiner Anregungswellenlänge ist.
- Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln verfolgt werden. Dazu wird Licht zweier unterschiedlicher Wellenlängen eingesetzt; und es werden Photonen mit einer für den jeweiligen Partikel charakteristischer Wellenlänge registriert. Diese Verfolgungen können mit bis auf ein gemeinsames Objektiv getrennten Einrichtungen erfolgen oder mit bis auf die jeweilige Lichtquelle gemeinsamen Einrichtungen, die schnell alternierend für beide Partikel genutzt, d. h. zwischen diesen umgeschaltet werden.
- Eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Lichtquelle für das Licht Veranlassung des Partikels zur Emission von Photonen und einem Detektor, um die von dem Partikel emittierten Photonen zu registrieren, weist Strahlformungsmittel in der Lichtquelle auf, um das Licht mit einer ein räumlich begrenztes Minimum aufweisenden Intensitätsverteilung auf die Probe zu richten. Weiterhin sind in Anhängigkeit von dem Signal des Detektors angesteuerte Strahlverlagerungsmittel vorgesehen, die das Minimum der Intensitätsverteilung dem sich bewegenden Partikel nachführen, indem sie die Intensitätsverteilung so gegenüber der Probe verschieben, dass eine Rate der von dem Detektor registrierten Photonen minimal bleibt.
- Die Lichtquelle der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann kohärente Lichtstrahlen zu einem Interferenzmuster mit einer Nullstelle am Ort des Minimums überlagern. Zur Modulation der Phasenbeziehung der Lichtstrahlen kann die Lichtquelle einen dynamisch ansteuerbaren Spatial Light Modulator aufweisen. Eine die Probe abbildende Kamera, die zum Beispiel genutzt werden kann, um bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung mit Licht zu schauen, wo sich ein zu verfolgender Partikel überhaupt innerhalb der Probe befindet, kann auch verwendet werden, um die Lage der Intensitätsverteilung bei der Verfolgung des Partikels in der Probe zu erfassen oder um die Richtung zu bestimmen, in der die Intensitätsverteilung dem Partikel nachzuführen ist. Zwei Lichtquellen für Licht unterschiedlicher Wellenlängen können vorgesehen sein, um Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln zu verfolgen. Für eine gleichzeitige Verfolgung können den beiden Lichtquellen jeweils eigene Strahlformungsmittel und Strahlauslenkungsmittel zugeordnet sein. Alternativ können gemeinsame Mittel von beiden Lichtquellen alternierend verwendet werden. Es versteht sich, dass auch noch mehr als zwei Lichtquellen zur gleichzeitigen oder schnell alternierenden Verfolgung von mehr als zwei Partikeln vorgesehen sein können.
- Die Lichtquelle ist insbesondere eine gepulste Lichtquelle, wie beispielsweise ein Pulslaser, und richtet das Licht in Pulsen auf die Probe. Der Detektor ist darauf abgestimmt vorzugsweise mit einem Gate versehen oder gegated und so mit der gepulsten Lichtquelle synchronisiert, dass nach jedem Puls des Lichts die von dem Partikel emittierten Photonen mit maximalem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis in einem begrenzten Zeitfenster registriert werden.
- Obwohl eine erfindungsgemäße Vorrichtung durch die Verwendung von Licht nur zur Veranlassung von Emission grundsätzlich einen einfacheren Aufbau aufweisen kann, kann sie auch auf Basis eines vorhandenen STED- oder RESOLFT-Fluoreszenzlichtmikroskops realisiert werden. Bei diesem werden dann die sonst für die Fluoreszenzverhinderungsstrahlen verwendeten Strahlformungsmittel für das Licht verwendet, mit dem erfindungsgemäß eine Veranlassung zur Emission erfolgt. Zudem sind die Strahlverlagerungsmittel von einem Abscannen der Probe auf eine Verfolgung des Partikels durch Minimierung der von ihm registrierten Photonen umzustellen.
- Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibungseinleitung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beigefügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprünglichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rückbeziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Ausführungsformen der Erfindung entfallen.
- KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
- Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert und beschrieben.
-
1 illustriert einen möglichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. -
2 illustriert einen weiteren möglichen Aufbau einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. -
3 illustriert einen Partikel im Bereich eines Minimums einer Intensitätsverteilung zur Veranlassung des Partikels zur Emission von Photonen. -
4 ist eine Auftragung der Intensität über dem Ort bei einem Schnitt durch die Intensitätsverteilung gemäß3 ; weiterhin ist die resultierende Rate von Photonen dargestellt, die von dem Partikel gemäß3 emittiert werden. -
5 zeigt die Situation nach einer Bewegung des Partikels aus seiner Position gemäß3 ; und -
6 zeigt die Situation, nachdem mit der Intensitätsverteilung die Bewegung des Partikels nachvollzogen wurde. - FIGURENBESCHREIBUNG
- Die Vorrichtung
1 gemäß1 dient zur Verfolgung der Bewegung eines Partikels2 in einer Probe3 . Der Partikel2 ist zum Beispiel selbst ein Fluoreszenzfarbstoff oder mit einem solchen markiert. Der Fluoreszenzfarbstoff wird mit Licht4 von einer Lichtquelle5 zur Emission von Photonen veranlasst, aber im Wesentlichen nur außerhalb eines Minimums einer Intensitätsverteilung des Lichts4 in der Probe3 . Diese Intensitätsverteilung wird im Zusammenhang mit den3 bis6 näher beschrieben werden. Die Lichtquelle5 umfasst einen Laser6 , Strahlformungsmittel7 , um die gewünschte Intensitätsverteilung im Fokus eines Objektivs8 einzustellen, sowie Strahlverlagerungsmittel9 ,10 und11 , um die Lage des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts4 in der Probe3 einzustellen. Die Strahlverlagerungsmittel9 und10 wirken unmittelbar auf das Licht4 ein und verlagern das Minimum in x- und y-Richtung, d. h. seitlich zum Strahlengang, während die Strahlverlagerungsmittel11 unmittelbar an der Probe3 angreifen und das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts4 gegenüber der Probe3 in z-Richtung verschieben. Zum selektiven Registrieren von Licht, das von dem2 emittiert wird, ist ein Punktdetektor12 hinter einem dichroitischen Strahlteiler13 vorgesehen, wobei der Strahlteiler13 im Strahlengang zwischen dem Laser6 und der Probe3 angeordnet ist, und zwar vom Laser6 aus vor den Strahlverlagerungsmitteln9 und10 . Ein weiterer Strahlteiler14 ist zwischen den Strahlverlagerungsmitteln9 und10 und dem Objektiv8 angeordnet. Über den Strahlteiler14 beobachtet eine Kamera15 mit einem zweidimensionalen Detektor die Probe3 . Wenn mit Hilfe der Kamera15 der Partikel2 aufgrund der von ihm emittierten Photonen erstmalig lokalisiert ist, wozu die Probe3 großflächig mit dem Licht4 beaufschlagt werden kann, wird die Intensitätsverteilung des Lichts4 so gegenüber dem Partikel2 ausgerichtet, dass sich dieser am Ort des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts4 befindet. Dass dies der Fall ist, wird anschleißend durch probeweise Verschiebungen der Intensitätsverteilung des Lichts4 gegenüber der Probe3 überprüft. Bei diesen Verschiebungen sollte die Rate der von dem Partikel2 emittierten Photonen, die mit dem Punktdetektor12 detektiert werden, ansteigen. Wenn die Rate hingegen abfällt, ist dies ein Indiz dafür, dass die Intensitätsverteilung des Lichts4 mit ihrem Minimum dem Partikel2 nachgeführt werden muss, weil sich dieses bewegt hat. Auch ein Anstieg der Rate der Photonen ohne Verlagerung der Intensitätsverteilung des Lichts4 bedeutet, dass sich de Partikel2 in der Probe3 bewegt hat und die Intensitätsverteilung des Lichts4 mit seinem Minimum dem Partikel2 nachgeführt werden muss, bis die Rate der Photonen wieder ihr Minimum erreicht. Bei diesem Tracking-Verfahren werden die Strahlverlagerungsmittel9 bis11 in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors12 von einer Steuerung16 angesteuert. Die dabei erfasste Lage bzw. Bewegung des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts4 zeichnet die Bewegung des Partikels2 in der Probe3 nach. Das beschriebene Tracking-Verfahren kann dadurch unterstützt werden, dass eine Richtung der Bewegung des Partikels2 aus den Orten abgeleitet wird, an denen die von dem Partikel2 emittierten Photonen mit der Kamera15 registriert werden. - In
1 ist angedeutet, dass die Steuerung16 auch die Strahlformungsmittel7 ansteuert. Konkret kann es sich bei diesen um einen Spatial Light Modulator handeln, mit dem verschiedene Intensitätsverteilungen des Lichts4 in der Probe3 eingestellt werden können, deren jeweilige Minima, die nur ein- oder zweidimensional begrenzt sind, einen übereinstimmenden Schnittpunkt aufweisen, mit dem der Partikel2 in der Probe3 verfolgt werden kann, um es bezüglich seiner Bewegung in der Probe3 mit maximaler Ortsauflösung in allen drei Raumrichtungen zu verfolgen. - Die in
2 dargestellte Ausführungsform der Vorrichtung1 weist statt des zusätzlichen Punktdetektors12 nur die Kamera15 als Detektor für das Licht auf, das von dem Partikel2 in der Probe3 emittiert wird. Die Probe3 ist dabei eine rein zweidimensionale Probe. Die Intensitätsverteilung des Lichts4 weist ein von einem ringförmigen Maximum umschlossenes zentrales Minimum auf, mit dem der Partikel2 verfolgt wird. Diese donutförmige Intensitätsverteilung des Lichts4 wird mit statischen Strahlformungsmitteln7 eingestellt. In der Ebene der zweidimensionalen Probe3 wird das Minimum der Intensitätsverteilung des Lichts4 mit den Strahlverlagerungsmitteln9 und10 eingestellt, die direkt auf das Licht4 einwirken. Die Kamera15 ist hinter einem weiteren Objektiv17 angeordnet, das dem Objektiv8 über die Probe3 hinweg gegenüberliegt. Sie dient hier auch dazu, die Lage der Intensitätsverteilung des Lichts4 in der Probe3 zu erfassen, um hieraus neben der aktuellen Stellung der Strahlverlagerungsmittel9 und10 zusätzlich auf die Lage des Minimums der Intensitätsverteilung des Lichts4 in der Probe3 zu schließen. Auch dies kann mit einer Genauigkeit jenseits der Brechungsgrenze erfolgen. -
3 skizziert die Intensitätsverteilung des Lichts4 in der Probe3 , wobei sich der Partikel2 in dem zentralen Minimum19 der Intensitätsverteilung18 befindet.4 ist eine Auftragung der Intensität I der Intensitätsverteilung18 (mit durchgezogener Linie) über einem Schnitt durch die Probe3 gemäß3 (in vergrößertem Maßstab). Neben der in Bezug auf das Minimum19 symmetrischen und um das Minimum19 herum im wesentlichen sinusförmigen Intensitätsverteilung18 ist die resultierende Rate R der von dem Partikel2 gemäß3 emittierten Photonen (mit gestrichelter Linie) dargestellt, wenn der Partikel2 mit den entsprechenden Intensitäten I des Lichts4 beaufschlagt wird. Am Ort des Minimums19 erreicht auch die Rate R ihr Minimum Rmin. Sobald der Partikel2 dieses Minimum19 verlässt, steigt die Rate R schnell auf ihren Maximalwert Rmax an. Dieser Effekt wird beim Verfolgen des Partikels2 in der Probe3 mit dem Minimum19 der Intensitätsverteilung18 ausgenutzt. - Wenn sich der Partikel
2 wie in5 dargestellt gegenüber der Intensitätsverteilung18 verlagert hat und dabei aus dem Minimum19 herausbewegt, wird eine erhöhte Rate R der von dem Partikel2 emittierten Photonen registriert. Durch probeweises Verschieben der Intensitätsverteilung18 in der Probe3 wird die Rate wieder vermindert bzw. minimal gehalten. Dadurch wird festgestellt, in welche Richtung sich der Partikel2 bewegt hat und über welche Strecke, weil das Minimum der Rate genau dann wieder erreicht wird, wenn wie in6 auch die Intensitätsverteilung18 mit dem Minimum19 in derselben Richtung über dieselbe Strecke gegenüber der Probe3 bewegt wurde. Die Richtung, in der die Intensitätsverteilung18 mit dem Minimum19 dem Partikel2 nachzuführen ist kann auch aus den Orten bestimmt werden, an denen die von dem Partikel2 emittierten Photonen mit einer Kamera registriert werden. - Bezugszeichenliste
-
- 1
- Vorrichtung
- 2
- Partikel
- 3
- Probe
- 4
- Licht
- 5
- Lichtquelle
- 6
- Laser
- 7
- Strahlformungsmittel
- 8
- Objektiv
- 9
- Strahlverlagerungsmittel
- 10
- Strahlverlagerungsmittel
- 11
- Strahlverlagerungsmittel
- 12
- Punktdetektor
- 13
- Strahlteiler
- 14
- Strahlteiler
- 15
- Kamera
- 16
- Steuerung
- 17
- Objektiv
- 18
- Intensitätsverteilung
- 19
- Minimum
- I
- Intensität
- R
- Rate
Claims (18)
- Verfahren zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (
2 ) in einer Probe (3 ), wobei der Partikel (2 ) mit Licht (4 ) zur Emission von Photonen veranlasst wird und wobei von dem Partikel (2 ) emittierten Photonen registriert werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (4 ) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19 ) aufweisenden Intensitätsverteilung (18 ) auf die Probe (3 ) gerichtet wird und dass das Minimum (18 ) dem sich in der Probe (3 ) bewegenden Partikel (2 ) nachgeführt wird, indem die Intensitätsverteilung (18 ) so gegenüber der Probe (3 ) verschoben wird, dass eine Rate der von dem Partikel (2 ) emittierten Photonen minimal bleibt. - Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Minimum (
19 ) ein-, zwei- oder dreidimensional begrenzt ist und dass die Intensitätsverteilung (18 ) in den Richtungen der Dimensionen gegenüber der Probe (2 ) verschoben wird, in denen das Minimum (19 ) begrenzt ist. - Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensitätsverteilung (
18 ) als ein Interferenzmuster kohärenter Lichtstrahlen ausgebildet wird und dass als Minimum (19 ) eine Nullstelle des Interferenzmusters verwendet wird.. - Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Phasenbeziehung der Lichtstahlen moduliert wird, um das Minimum (
19 ) aus unterschiedlichen Richtungen ein- oder zweidimensional zu begrenzen. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Photonen mit einem Punktdetektor (
12 ) registriert werden. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (
3 ) mit einer Kamera (15 ) abgebildet wird. - Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Ausgangslage des Partikels (
2 ) bei nicht räumlich strukturierter Beleuchtung der Probe mit dem Licht (4 ) mit der Kamera (15 ) erfasst wird. - Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Lage der Intensitätsverteilung (
18 ) gegenüber der Probe (3 ) mit der Kamera (15 ) verfolgt wird. - Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Richtung der Bewegung des Partikels (
2 ) aus den Orten abgeleitet wird, an denen die von dem Partikel (2 ) emittierten Photonen mit der Kamera (15 ) registriert werden. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht (
4 ) in Pulsen auf die Probe gerichtet wird und dass von dem Partikel emittierte Photonen in einem begrenzten Zeitfenster nach jedem Puls registriert werden. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Partikel mit dem Licht (
4 ) zunächst aus einen nicht Zustand, aus dem heraus er nicht zur Emission von Photonen veranlassbar ist, in einen Zustand aktiviert wird, aus dem heraus er zur Emission von Photonen veranlassbar ist. - Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln (
2 ) gleichzeitig oder schnell alternierend mit Licht (4 ) zweier unterschiedlicher Wellenlängen verfolgt werden. - Vorrichtung (
1 ) zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels (2 ) in einer Probe (3 ) mit einer Lichtquelle (5 ), um den Partikel (2 ) mit Licht (4 ) zur Emission von Photonen zu veranlassen, und mit einem Detektor (12 ,15 ), um von dem Partikel (2 ) emittierten Photonen zu registrieren, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5 ) Strahlformungsmittel (7 ) aufweist, um das Licht (4 ) mit einer ein räumlich begrenztes Minimum (19 ) aufweisenden Intensitätsverteilung (18 ) auf die Probe (3 ) zu richten, und dass in Abhängigkeit von dem Signal des Detektors (12 ,15 ) angesteuerte Strahlverlagerungsmittel (9 bis11 ) vorgesehen sind, die das Minimum (19 ) dem sich bewegenden Partikel (2 ) nachführen, indem sie die Intensitätsverteilung (18 ) so gegenüber der Probe (3 ) verschieben, dass eine Rate der von dem Detektor (12 ,15 ) registrierten Photonen minimal bleibt. - Vorrichtung (
1 ) nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5 ) kohärente Lichtstrahlen zu einem Interferenzmuster mit einer Nullstelle am Ort des Minimums (19 ) überlagert. - Vorrichtung (
1 ) nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5 ) einen zur Modulation der Phasenbeziehung der Lichtstrahlen ansteuerbaren Spatial Light Modulator aufweist. - Vorrichtung (
1 ) nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine die Probe (3 ) abbildende Kamera (15 ) vorgesehen ist. - Vorrichtung (
1 ) nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (5 ) eine gepulste Lichtquelle ist, die das Licht (4 ) in Pulsen auf die Probe richtet, und dass der Detektor (12 ) ein mit der gepulsten Lichtquelle synchronisiertes Gate aufweist, um nach jedem Puls die von dem Partikel emittierten Photonen in einem begrenzten Zeitfenster zu registrieren. - Vorrichtung (
1 ) nach einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Lichtquellen für Licht unterschiedlicher Wellenlängen vorgesehen sind, um Bewegungen von zwei verschiedenen Partikeln gleichzeitig oder schnell alternierend zu verfolgen.
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