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Die Erfindung betrifft ein Abtastmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Aussenden eines Beleuchtungslichtstrahls, einem Objektiv zum Erzeugen eines länglichen Beleuchtungsfokus in einem abzubildenden Objekt und eine Abtastvorrichtung zum Bewegen des Beleuchtungsfokus über einen zu beleuchtenden Zielbereich des Objektes durch Ändern der Einfallsrichtung, in der der Beleuchtungslichtstrahl in eine Eintrittspupille des Objektivs fällt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes.
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Aus dem Stand der Technik sind Abtast- oder Scanmikroskope bekannt, die beispielsweise in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden, um mit Laserlicht Farbstoffe zur Emission von Fluoreszenzstrahlung anzuregen, die dann zur Abbildung des zu untersuchenden Objektes von einem Detektor erfasst wird. Auf diesem Gebiet der Mikroskopie kommen insbesondere konfokale Abtastmikroskope zum Einsatz, die im Unterschied zu konventionellen Lichtmikroskopen zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht das gesamte Objekt beleuchten, sondern einen in der Regel beugungsbegrenzten Lichtfleck erzeugen, mit dem das Objekt Punkt für Punkt abgetastet wird. Die von dem Detektor in den einzelnen Objektpunkten erfassten Lichtsignale werden dann zu einem Gesamtbild des Objektes zusammengesetzt.
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Ein solches Konfokalmikroskop weist üblicherweise einen so genannten Punktscanner als Abtastvorrichtung auf, der den von der Beleuchtungseinheit abgegebenen Beleuchtungslichtstrahl in die Eintrittspupille des Mikroskopobjektivs lenkt. Das Mikroskopobjektiv formt den in ihre Eintrittspupille einfallenden Beleuchtungslichtstrahl in eine fokussierte Lichtverteilung um, die im Folgenden als Beleuchtungsfokus bezeichnet wird. Form und Größe des Beleuchtungsfokus hängen von den optischen Eigenschaften, insbesondere der numerischen Apertur des Objektivs ab. Fällt der Beleuchtungslichtstrahl mittig und senkrecht, d. h. längs der optischen Achse in die Eintrittspupille des Objektivs, so erzeugt das Objektiv einen länglichen Beleuchtungsfokus, dessen Ausdehnung quer zur optischen Achse kleiner als längs der optischen Achse ist. Der Beleuchtungsfokus wird dann zum Abtasten des Objektes quer zur optischen Achse bewegt, indem der Punktscanner beispielsweise über eine bewegliche Spiegelanordnung den Einfallswinkel ändert, unter dem der Beleuchtungslichtstrahl in die Eintrittspupille des Objektivs fällt.
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Um mittels eines Konfokalmikroskops eine dreidimensionale Abbildung vorzunehmen, muss also das Objekt in oben beschriebener Weise punktweise abgetastet werden. Da dies vergleichsweise aufwändig ist, wurde in jüngerer Vergangenheit ein in der Literatur als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichnetes Mikroskopierverfahren vorgeschlagen. Dieses Verfahren arbeitet mit einem Beleuchtungsobjektiv und einem Detektionsobjektiv, die unter einem Winkel von 90 Grad zueinander angeordnet sind. Das Beleuchtungsobjektiv erzeugt im Zusammenwirken mit einer ihm vorgeordneten Zylinderlinse eine näherungsweise ebene Beleuchtungslichtverteilung, die das Objekt längs der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs durchsetzt. Eine solche Lichtverteilung wird häufig auch als Lichtblatt oder Lichtscheibe bezeichnet. Der durch dieses Lichtblatt beleuchtete Zielbereich des Objektes wird durch das Detektionsobjektiv, dessen optische Achse senkrecht zu dem Lichtblatt verläuft, auf eine Detektionsfläche, z. B. ein CCD, abgebildet. Wird nun das beleuchtende Lichtblatt innerhalb des abzubildenden Objektes bewegt, so können mit dieser Anordnung Schichtbilder des Objektes aufgenommen werden.
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Um ein möglichst dünnes Lichtblatt zu erzeugen, muss das Beleuchtungsobjektiv eine entsprechend hohe numerische Apertur aufweisen, wobei der freie Arbeitsabstand des Beleuchtungsobjektivs entsprechend groß sein muss, um eine Kollision mit dem Detektionsobjektiv zu vermeiden. Die numerische Apertur des Beleuchtungsobjektivs definiert demnach die Dicke des Lichtblattes und damit die optische Auflösung längs der optischen Achse des Detektionsobjektivs.
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Bei einem in der
WO 2010/012980 A1 beschriebenen abgewandelten SPIM-Verfahren erfolgen Beleuchtung und Detektion mit ein und demselben Objektiv. Hierzu wird die Eintrittspupille des Objektivs dezentral unterleuchtet, d. h. der Beleuchtungslichtstrahl tritt durch einen Teil der Eintrittspupille, der quer zur optischen Achse versetzt ist. Eine vor dem Objektiv angeordnete Zylinderlinse erzeugt in dem Objekt ein beleuchtendes Lichtblatt, das zur optischen Achse des Objektivs schräggestellt ist. Der durch dieses Lichtblatt beleuchtete Zielbereich des Objektes wird dann wiederum durch das Objektiv abgebildet.
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Die vorstehend beschriebenen Einrichtungen arbeiten jeweils mit einer Zylinderlinse, um die gewünschte Schrägbeleuchtung des Objektes zu erzielen. Die Verwendung einer solchen Zylinderlinse hat jedoch Nachteile. So sind diese Einrichtungen ausschließlich auf eine Schrägbeleuchtung mittels eines Lichtblattes ausgelegt und ermöglichen keine davon abweichende Anwendung, z. B. eine punktweise konfokale Abtastung. Auch wäre es wünschenswert, die räumliche Verteilung der Lichtintensität des zur Schrägbeleuchtung erzeugten Lichtblattes variieren zu können. Dies ist mit einer Zylinderlinse nicht möglich.
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Aus der
DE 10 2005 007 756 A1 ist ein Abtastmikroskop bekannt, bei dem der Beleuchtungslichtstrahl zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille des Objektivs gerichtet wird.
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In der
DE 10 2007 045 897 A1 ist ein Mikroskop offenbart, bei dem das Lichtblatt mittels eines Scanners erzeugt wird.
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Zur weiterführenden Literatur wird ferner verwiesen auf A. H. Voie et al.: „Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens”, Journal of Microscopy 170, 229–236 (1993); J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbold, E. H. K. Stelzer: „Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy”, Science 305, 1007 (2004); F. Fahrbach, A. Rohrbach: ”Microscopy with non diffracting beams”, FOM 2009, Krakau; C. Dunsby: ”Optically sectioned imaging by oblique plane mirror microscopy”, Optics Express Vol. 16, 25 (2008);
DE 10 2005 027 077 A1 ;
DE 44 16 558 C2 ;
US 5 952 668 ;
WO 2006/127692 A2 ;
DE 10 2006 021 317 B3 ;
WO 2007/128434 A1 ;
US 2009/0135432 A1 ;
DE 10 2008 024 568 A1 ;
US 2008/0032414 A1 .
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Beleuchtungslichtstrahl zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus relativ zur optischen Achse des Objektivs auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille richtet und zum Bewegen des Beleuchtungsfokus über den zu beleuchtenden Zielbereich die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb dieses Teilbereichs ändert.
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Die Erfindung sieht zum einen vor, die Eintrittspupille des Objektivs mit dem Beleuchtungslichtstrahl dezentral zu unterleuchten, indem der Beleuchtungslichtstrahl auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille geleitet wird. Die Unterleuchtung der Eintrittspupille, d. h. die Maßnahme, den Beleuchtungslichtstrahl nicht die gesamte Fläche der Eintrittspupille durchsetzen zu lassen und damit nicht die volle Apertur zu nutzen, bewirkt eine Aufweitung des (von vorneherein länglichen) Beleuchtungsfokus sowohl in Längs- als auch in Querrichtung. Da der Beleuchtungslichtstrahl zudem außermittig auf die Eintrittspupille fällt, wird der Beleuchtungsfokus relativ zur optischen Achse des Objektivs schräg gestellt.
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Der in dieser Weise aufgeweitete und schräg gestellte Beleuchtungsfokus kann nun dazu genutzt werden, sequenziell ein den Zielbereich beleuchtendes Lichtblatt aufzubauen. Hierzu dient die Abtastvorrichtung, die für eine entsprechende Abtastbewegung des Beleuchtungslichtstrahls in der Eintrittspupille des Objektivs sorgt. Diese Abtastbewegung entspricht einem Verkippen des Beleuchtungslichtstrahls um einen Kipppunkt, der im Bereich der Eintrittspupille liegt. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl, der selbstredend kein Strahl im mathematischen Sinne, sondern vielmehr ein Bündel von Lichtstrahlen darstellt, im Bereich der Eintrittspupille (zumindest näherungsweise) ortsfest bleibt, während er in einem Abstand von der Eintrittspupille (in Richtung der Abtastvorrichtung) gleichsam eine Schwenkbewegung relativ zu einer parallel zur optischen Achse liegenden Referenzrichtung ausführt. Diese Kipp- oder Schwenkbewegung des Beleuchtungslichtstrahls setzt das Objektiv in eine entsprechende Bewegung des schräg gestellten Beleuchtungsfokus quer zur optischen Achse um. Die tatsächliche Größe der Bewegung des Beleuchtungsfokus in dem Objekt hängt vom konkreten Aufbau des Objektivs ab. Wesentlich ist jedoch, dass die durch die Abtastvorrichtung bewirkte Verkippung des Beleuchtungslichtstrahls erfindungsgemäß dazu genutzt wird, den Beleuchtungsfokus innerhalb des Zielbereichs des Objektes zu bewegen und damit gleichsam ein Lichtblatt aufzubauen, das den Zielbereich beleuchtet.
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Im Unterschied zu den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen, die zur Erzeugung eines Lichtblattes mit einer Zylinderlinse arbeiten, wird bei dem erfindungsgemäßen Abtastmikroskop das Lichtblatt mittels der Abtastvorrichtung sequenziell aufgebaut, indem der Beleuchtungsfokus innerhalb einer Abtastperiode über den Zielbereich bewegt wird. Damit macht sich das erfindungsgemäße Abtastmikroskop zur Erzeugung des Lichtblattes den Umstand zunutze, dass die Abtastperioden, mit denen heutzutage Abtastvorrichtungen betrieben werden können, so kurz sind, dass sie die Detektionszyklen üblicherweise eingesetzter Lichtdetektoren deutlich unterschreiten. Da im Falle der Lichtblatterzeugung nur eine Linie (in X- oder Y-Richtung) erzeugt wird, ist die Gesamtdauer der Beleuchtung für das komplette Lichtblatt abhängig von der Scanrate des Beleuchtungsscanners, d. h. der Abtastvorrichtung. Je nach Scannertyp kann diese im Bereich von 1 Hz bis mehreren 10 KHz liegen. Der Lichtdetektor (vornehmlich ein Flächendetektor; CCD; CMOS, APD Array...) „sieht” demnach den bewegten Beleuchtungsfokus zeitlich und damit räumlich nicht aufgelöst. Vielmehr sieht er eine zusammenhängende Lichtverteilung in Form des Lichtblattes. Beispielhafte Werte für die Abtastperiode liegen in einem Bereich von einigen Hundertstel Millisekunden bis 1 Sekunde, während die Detektionszeit für die ganze Lichtblattebene (abhängig von der Detektorauflösung, z. B. 512×512 Pixel) z. B. zwischen einigen Millisekunden und Sekunden beträgt, sofern sichergestellt ist, dass die Abtastperiode kleiner als die Detektionszeit ist.
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Da in einem herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskop ohnehin eine den Beleuchtungslichtstrahl bewegende Abtastvorrichtung vorgesehen ist, ermöglicht die Erfindung eine besonders effiziente Erzeugung des beleuchtenden Lichtblattes. Insbesondere ist es möglich, im Wesentlichen ein und denselben Mikroskopaufbau für unterschiedliche Applikationen vorzusehen. So ist es zur Realisierung der erfindungsgemäßen Applikation, bei der eine Schrägbeleuchtung des Objektes mittels eines Lichtblattes vorgenommen wird, lediglich erforderlich, in einem an sich standardmäßig aufgebauten konfokalen Abtastmikroskop für eine dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs zu sorgen. Dies kann beispielsweise mittels eines optischen Elementes erfolgen, das in den Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls eingebracht wird. Soll das Abtastmikroskop anschließend wieder mit einer punktweisen Beleuchtung arbeiten, so muss das optische Element lediglich wieder aus dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls entfernt werden.
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Das erfindungsgemäße Abtastmikroskop ermöglicht es, hochaufgelöste Schnittbilder des Objektes aufzunehmen. Hierzu wird das Objekt schrittweise mit dem Lichtblatt abgetastet. Diese Abtastung erfolgt dadurch, dass das Objektiv und das Objekt längs der optischen Achse relativ zueinander bewegt werden.
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Vorzugsweise ändert die Abtastvorrichtung die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls zur Erzeugung eines durch den bewegten Beleuchtungsfokus gebildeten Lichtblattes innerhalb einer Einfallsebene, die zur optischen Achse des Objektivs parallel versetzt ist. Unter der Annahme, dass die Eintrittspupille kreisrund ausgeführt ist, bildet die vorstehend genannte Einfallsebene in der Draufsicht auf die Eintrittspupille eine Gerade, die den durch den Pupillenrand definierten Kreis nach Art einer Sekante in zwei voneinander verschiedenen Punkten schneidet, ohne den Mittelpunkt dieses Kreises zu kreuzen. In der vorstehend definierten Draufsicht führt dann der Beleuchtungslichtstrahl eine Kippbewegung längs dieser Sekante aus. Das Objektiv setzt diese Kippbewegung in eine entsprechende Bewegung des Beleuchtungsfokus längs einer Geraden um, die parallel zu der vorstehend genannten Sekante verläuft [geprüft]. Auf diese Weise kann in einfacher Weise das gewünschte Lichtblatt zur Beleuchtung des Zielbereichs erzeugt werden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Abtastvorrichtung ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zwischen der Beleuchtungseinheit und dem Objektiv angeordnetes optisches Versatzelement auf, durch das die Einfallsebene des Beleuchtungslichtstrahls parallel zur optischen Achse des Objektivs versetzt ist. Dieses Versatzelement kann beispielsweise ein Glaskeil, eine planparallele Platte, ein optischer oder photonischer Kristall, ein räumlicher Lichtmodulator, kurz SLM, ein Mikrospiegelaktor, kurz DMD, etc. sein. Alternativ ist es auch möglich, die Abtastvorrichtung relativ zur Eintrittspupille des Objektivs so anzuordnen, dass der Beleuchtungslichtstrahl in der gewünschten Weise dezentral in die Eintrittspupille fällt. Ebenso ist es möglich, den Beleuchtungslichtstrahl in seinem Lichtweg vor der Abtastvorrichtung beispielsweise durch eine Blende von einer Seite so zu beschneiden, dass die gewünschte dezentrale Beleuchtung der Eintrittspupille erzielt wird. In einer weiteren alternativen Ausführungsform können optische Elemente, die in dem Abtastmikroskop ohnehin schon vorhanden sind, zur Erzeugung des gewünschten Strahlversatzes genutzt werden. Beispielsweise kann ein in einem Abtastmikroskop üblicherweise vorhandener Auskoppelstrahlteiler, der den Beleuchtungslichtstrahl in Richtung des Objektivs durchlässt, während er das von dem Objekt stammende Detektionslicht in Richtung des Lichtdetektors reflektiert, aus einem (z. B. entsprechend beschichteten) Glassubstrat gebildet sein, dessen Dicke so bemessen ist, dass der gewünschte Strahlversatz, der üblicherweise in einem Bereich von einigen Millimeter liegt, bewirkt wird.
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Vorzugsweise weist die Abtastvorrichtung ein Stellelement zum Einbringen und Entfernen des optischen Versatzelementes in den bzw. aus dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls auf. Mittels eines solchen Stellelementes kann das Versatzelement nach Wunsch in den Beleuchtungslichtstrahlengang eingebracht und aus diesem entfernt werden, um so beispielsweise zwischen einer üblichen konfokalen Beleuchtung und der erfindungsgemäßen Schrägbeleuchtung mittels eines Lichtblattes umzuschalten. Darüber hinaus ist es mit einem solchen Stellelement möglich, das beispielsweise keilförmig ausgebildete Versatzelement inkrementell in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zu verschieben, um so eine beliebige Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls gegenüber dem Objektiv zu bewirken.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Abtastvorrichtung ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zwischen der Beleuchtungseinheit und dem Objektiv angeordnetes optisches Strahleinstellelement zum Verändern des Strahldurchmessers des von der Beleuchtungseinheit ausgesendeten Beleuchtungslichtstrahls auf. Das Strahleinstellelement ermöglicht es, den Strahldurchmesser des Beleuchtungslichtstrahls und damit die Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs nach Bedarf einzustellen, um die gewünschte Ausdehnung des Beleuchtungsfokus zu erzielen. Es sind jedoch auch alternative Ausführungsformen denkbar. So weist ein konfokales Abtastmikroskop häufig eine Strahlaufweitoptik auf, um den von der Beleuchtungseinheit abgegebenen Beleuchtungslichtstrahl so aufzuweiten, dass die Eintrittspupille des Objektivs voll ausgeleuchtet und damit die volle Apertur genutzt wird. Ist eine solche Optik in dem Abtastmikroskop ohnehin vorhanden, so kann sie auch dazu genutzt werden, den Strahldurchmesser entsprechend zu verringern, um die erfindungsgemäße Unterleuchtung der Eintrittspupille zu bewirken. Selbstverständlich sind die vorstehend genannten Ausführungsformen rein beispielhaft zu verstehen. So können auch Blenden oder andere optische Elemente zur Einstellung des gewünschten Strahldurchmessers verwendet werden.
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In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der Beleuchtungslichtstrahl aus einem Anregungslichtstrahl und einem Abregungslicht zusammengesetzt, die vor Eintritt in die Abtastvorrichtung einander überlagert sind. Entsprechend erzeugt das Objektiv aus dem Anregungslichtstrahl einen Anregungsfokus und aus dem Abregungslichtstrahl einen Abregungsfokus, die einander zu dem Beleuchtungsfokus überlagert sind. Auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie kann ein solcher Abregungslichtstrahl beispielsweise nach dem so genannten STED-Verfahren dazu genutzt werden, die räumliche Auflösung über die Beugungsgrenze hinaus zu steigern. Bei dem STED-Verfahren werden durch den Abregungslichtstrahl Fluoreszenzfarbstoffe, die zum Markieren einzelner Bereiche des Objektes eingesetzt werden, in an sich bekannter Weise gezielt abgeregt und damit gleichsam ausgeschaltet, um das Auflösungsvermögen zu steigern. In dem erfindungsgemäßen Abtastmikroskop kann durch Anwendung des STED-Verfahrens die Wirksamkeit des Beleuchtungsfokus dadurch, dass dem Anregungslichtstrahl der Abregungslichtstrahl überlagert wird, zur Auflösungssteigerung eingeengt und damit das resultierende Lichtblatt dünner geformt werden. Indem der Abregungslichtstrahl dem Anregungslichtstrahl schon vor Erreichen der Abtastvorrichtung überlagert wird, werden die beiden einander überlagerten Lichtstrahlen durch die Abtastvorrichtung gemeinsam in der Eintrittspupille des Objektivs verkippt.
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Vorzugsweise hat der Abregungsfokus eine räumliche Lichtintensitätsverteilung, die in einer Ebene, in welcher der aus dem Anregungsfokus und dem Abregungsfokus zusammengesetzte Beleuchtungsfokus zur Erzeugung eines Lichtblattes bewegt wird, ein Minimum und beiderseits dieser Ebene jeweils ein Maximum aufweist. Während bei der herkömmlichen Anwendung des STED-Verfahrens der Abregungsfokus im Querschnitt eine Ringform aufweist, sieht die vorstehend genannte Ausführungsform einen Abregungsfokus vor, der im Querschnitt (oberhalb und unterhalb der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus zur Erzeugung des Lichtblattes bewegt wird) zwei Intensitätsmaxima und zwischen diesen Maxima ein Minimum hat. Dabei ist dieses Intensitätsquerschnittsprofil vorzugsweise symmetrisch mit zwei gleich großen Maxima und einer dazwischen liegenden Nullstelle als Minimum ausgebildet.
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Diese vorteilhafte Ausgestaltung macht sich den Umstand zunutze, dass eine STED-Abregung in der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus zur Erzeugung des Lichtblattes bewegt wird, nicht erforderlich, ja sogar unerwünscht ist. So soll bei der erfindungsgemäßen Lösung ein möglichst großflächiges und zugleich möglichst dünnes Lichtblatt erzeugt werden, um räumlich hochaufgelöste optische Schnittbilder aufnehmen zu können. Dabei ist die Fläche des Lichtblattes durch die Länge des bewegten Beleuchtungsfokus definiert, während die Blattdicke durch die Ausdehnung des Beleuchtungsfokus quer zu der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus bewegt wird, festgelegt ist. Der vorstehend beschriebene Abregungsfokus ist nun gerade so geformt, dass er die Anregungswirksamkeit des Anregungsfokus lediglich in Richtung der Fokusquerausdehnung, nicht jedoch in Richtung der Fokuslängsausdehnung herabsetzt.
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Zur Erzeugung des dem Anregungsfokus überlagerten Abregungsfokus ist in dem Lichtweg des Abregungslichtstrahls beispielsweise eine Phasenplatte angeordnet, welche die räumliche Intensitätsverteilung des Abregungslichtstrahls entsprechend der gewünschten Form des Abregungsfokus einstellt. Diese gewünschte Form des Abregungsfokus ist mit einem geringeren technischen Aufwand in Form einer einfachen Phasenplatte erzeugbar, als dies in der üblichen Anwendung des STED-Verfahrens der Fall ist, in der der Abregungsfokus ringförmig ausgebildet werden muss. Die Phasenplatte ist in dem Lichtweg des Abregungslichtstrahls vorzugsweise vor der Abtastvorrichtung angeordnet. Sie kann jedoch auch unmittelbar vor der Eintrittspupille des Objektivs, z. B. an einem vor dem Objektiv angeordneten Auskoppelstrahlteiler ausgebildet sein. Ebenso ist möglich, die Phasenplatte direkt in dem Objektiv anzuordnen.
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Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Abtastmikroskop ein Element zum Variieren der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb einer Abtastperiode, während der der Beleuchtungsfokus über den Zielbereich bewegt wird. Diese Ausgestaltung nutzt den Umstand, dass das den Zielbereich beleuchtende Lichtblatt sequenziell durch den bewegten Beleuchtungsfokus aufgespannt wird. Dadurch ist es möglich, eine modulierte bzw. strukturierte Beleuchtung des Zielbereichs zu realisieren. Hierzu wird innerhalb der Abtastperiode, in der der Beleuchtungsfokus den Zielbereich abtastet, die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls variiert. So kann die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls zu jedem beliebigen Zeitpunkt innerhalb der Abtastperiode und damit an jeder beliebigen Stelle des Zielbereichs nach Wunsch eingestellt werden. Als Element, das die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb der Abtastperiode variiert, kann beispielsweise ein akusto-optisch abstimmbarer Filter (AOTF), ein akusto-optischer Modulator (AOM) oder ein elektro-optischer Modulator (EOM) verwendet werden.
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In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Abtastmikroskop eine Detektionsoptik mit einer ersten Teiloptik zur Zwischenabbildung eines schräg zur optischen Achse der ersten Teiloptik angeordneten, von dem Objektiv erzeugten Bildes des mit dem schräg gestellten Beleuchtungsfokus beleuchteten Zielbereichs, und einer zweiten Teiloptik zur Abbildung des von der ersten Teiloptik erzeugten Zwischenbildes auf eine Detektionsfläche, die parallel zu dem Zwischenbild angeordnet ist. Die beiden Teiloptiken sorgen für eine Aufrichtung des unter der Schrägbeleuchtung durch das Objektiv abgebildeten Zielbereichs. Eine solche Bildaufrichtung ist jedoch auch in anderer Weise möglich, beispielsweise durch eine so genannte Scheimpflug-Anordnung. Als Detektionsfläche, auf der schließlich das aufgerichtete Bild des Zielbereichs erzeugt wird, kann beispielsweise ein CCD, ein sCMOS oder andere flächige Detektoren wie ein APD-Array verwendet werden.
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Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes mit den Merkmalen des Anspruchs 14 vorgesehen.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb einer Abtastperiode variiert, während der der Beleuchtungsfokus über den Zielbereich bewegt wird.
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Insbesondere ist es möglich, durch alternierende Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls und/oder des Abregungslichtstrahls unterschiedliche Beobachtungsvolumina aufzunehmen. Erfolgt die Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls und/oder des Abregungslichtstrahls im Mikrosekundenbetrieb, so können durch geeignete Synchronisation mit dem Lichtdetektor z. B. spaltenweise unterschiedliche Volumenelemente detektiert werden (sofern angenommen wird, dass die Detektionsfläche des Lichtdetektor aus Zeilen und Spalten zusammengesetzt ist).
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft in der Lokalisationsmikroskopie eingesetzt werden. Als Fluoreszenzfarbstoffe eignen sich schaltbare fluoreszierende Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe wie ATTO, Alexa, Rhodamin-Derivate, Fluoreszein-Derivate, Nanokristalle etc. Über die Schrägbeleuchtung können entweder die fluoreszierenden Komponenten aktiviert oder in die Saturierung getrieben werden. Über eine dosierte Beleuchtung wird sichergestellt, dass eine Einzelmolekül-Detektion möglich ist. Über eine Schwerpunktbestimmung der detektierten Photonen können dann die Orte der Fluoreszenzfarbstoffe bestimmt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann besonders gewinnbringend in der Kleintierbildgebung, z. B. der Fluoreszenzbildgebung an Fischen, eingesetzt werden, da die hier verwendeten Objekte gut zugänglich sind.
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Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
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1 ein konfokales Abtastmikroskop als erstes Ausführungsbeispiel;
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2 eine gegenüber dem Abtastmikroskop nach 1 abgewandelte Ausführungsform als zweites Ausführungsbeispiel;
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3 eine gegenüber dem Abtastmikroskop nach 2 abgewandelte Ausführungsform als drittes Ausführungsbeispiel;
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4 eine schematische Darstellung, die die in der herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskopie angewandte vollständige Ausleuchtung der Eintrittspupille eines Objektivs mit dem Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht;
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5 eine schematische Darstellung, die die in der herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskopie angewandte Abtastung mit dem Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht;
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6 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße Unterleuchtung der Eintrittspupille mit dem Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht;
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7 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße Abtastung durch Verkippen des die Eintrittspupille unterleuchtenden Beleuchtungslichtstrahls veranschaulicht; und
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8 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße Überlagerung des Beleuchtungsfokus mit dem Anregungsfokus veranschaulicht.
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1 zeigt ein konfokales Abtastmikroskop 10 als erstes Ausführungsbeispiel in einer schematischen Darstellung. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Darstellung nach 1 Komponenten des Abtastmikroskops 10 weggelassen sind, die zur Verständnis des Erfindungsgegenstandes nicht wesentlich sind.
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Das Abtastmikroskop 10 bildet ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, das darauf ausgelegt ist, unter Anwendung des an sich bekannten STED-Verfahrens eine über die Beugungsgrenze hinausgehende räumliche Auflösung zu erzielen. Dementsprechend umfasst das Abtastmikroskop 10 eine erste Laserlichtquelle 12, im Folgenden als Anregungslichtquelle bezeichnet, sowie eine zweite Laserlichtquelle 15, im Folgenden als Abregungslichtquelle bezeichnet. Die Anregungslichtquelle 12 sendet einen Anregungslichtstrahl 14 aus, dessen Wellenlänge so gewählt ist, dass die in dem angewandten Mikroskopierverfahren verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur Abgabe von Fluoreszenzabstrahlung angeregt. Dagegen sendet die Abregungslichtquelle 15 einen Anregungslichtstrahl 16 aus, der dem Anregungslichtstrahl 14 in weiter unten beschriebener Weise überlagert wird und dessen Wellenlänge so gewählt ist, dass die durch den Anregungslichtstrahl beleuchteten Fluoreszenzfarbstoffe durch stimulierte Emission abgeregt und damit gleichsam ausgeschaltet werden. Der von der Abregungslichtquelle 15 emittierte Abregungslichtstrahl 16 tritt durch eine Phasenplatte 18, die dazu dient, ein gewünschtes Intensitätsprofil des Abregungslichtstrahls 16 einzustellen.
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Der Anregungslichtstrahl 14 fällt auf einen Spiegel 20 und wird an diesem in Richtung eines Strahlteilers 22 reflektiert. Der Strahlteiler 22 ist so ausgebildet, dass er den Anregungslichtstrahl 14 durchlässt, während er den auf ihn fallenden Anregungslichtstrahl 16 reflektiert. Auf diese Weise werden der Anregungslichtstrahl 14 und der in seinem Intensitätsprofil durch die Phasenplatte 18 beeinflusste Abregungslichtstrahl 16 einander überlagert. Der aus den beiden einander überlagerten Lichtstrahlen 14 und 16 gebildete Strahl wird im Folgenden als Beleuchtungslichtstrahl 24 bezeichnet.
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Der Beleuchtungslichtstrahl 24 trifft auf eine in 1 rein schematisch dargestellte Galvanospiegelanordnung 26, die dazu dient, den Beleuchtungslichtstrahl so umzulenken, dass dieser eine weiter unten näher beschriebene Abtastbewegung ausführt. Anschließend tritt der Beleuchtungslichtstrahl 24 durch eine Abtastlinse 28, eine Tubuslinse 30 sowie einen Strahlteiler 32 und trifft schließlich auf ein Objektiv 34.
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Wie der in 1 schematisch dargestellte Beleuchtungslichtstrahlengang zeigt, leuchtet der in das Objektiv 34 eintretende Beleuchtungslichtstrahl 24 eine in 1 mit 36 bezeichnete Eintrittspupille des Objektivs 34 nicht vollständig aus. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl 24 nur einen Teilbereich der Eintrittspupille 36 durchsetzt und somit nicht die volle Apertur des Objektivs 34 nutzt. Zudem ist der in das Objektiv 34 eintretende Beleuchtungslichtstrahl 24 gegenüber der in 1 mit O bezeichneten optischen Achse versetzt. Der Beleuchtungslichtstrahl 24 ist demnach so auf das Objektiv 34 gerichtet, dass er dessen Eintrittspupille 36 dezentral unterleuchtet.
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Diese dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille 36 mit dem Beleuchtungslichtstrahl 24 wird im vorliegenden Ausführungsbeispiel dadurch erreicht, dass der von der Galvanospiegelanordnung 26 reflektierte Beleuchtungslichtstrahl 24 mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O auf einen Randbereich der Abtastlinse 28 fällt. Dieser Parallelversatz führt dazu, dass der aus der Abtastlinse 28 austretende Beleuchtungslichtstrahl 24 zunächst die optische Achse O kreuzt und anschließend wiederum auf einen Randbereich der Tubuslinse 30 fällt, wobei sich dieser Randbereich auf der anderen Seite der optischen Achse O als der lichtdurchsetzte Randbereich der Abtastlinse 28 befindet. Aus der Tubuslinse 30 tritt dann der Beleuchtungslichtstrahl 24 gegenüber der optischen Achse O parallel versetzt in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 ein. Die Tubuslinse 30 lenkt den Beleuchtungslichtstrahl 24 so um, dass dieser mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 fällt.
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In dem in 1 gezeigten Ausführungsbeispiel sorgen schon der Spiegel 20 und der Strahlteiler 22 dafür, dass der aus dem Anregungslichtstrahl 14 und dem Abregungslichtstrahl 16 zusammengesetzte Beleuchtungslichtstrahl 24 mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O auf die Galvanospiegelanordnung 26 fällt. Dieser Parallelversatz kann mittels eines Stellelementes 38 eingestellt werden. Hierzu verschiebt das Stellelement 38 den Spiegel 20 und den Strahlteiler 22 als Einheit quer zur optischen Achse O.
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Die vorstehend erläuterten Komponenten 20, 22, 26, 28, 30 und 38 bilden eine Abtastvorrichtung, die dazu dient, den Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 zu verkippen, wie weiter unten in Detail beschrieben wird. Das Objektiv 34 formt den in ihrer Eintrittspupille 36 eintretenden Beleuchtungslichtstrahl 24 zu einem in 1 nicht gezeigten Beleuchtungsfokus um, der durch die Kippbewegung des Beleuchtungslichtstrahles 24 innerhalb einer Abtastperiode der Abtastvorrichtung über einen Zielbereich eines abzubildenden Objektes 40 bewegt wird. Durch die Bewegung des Beleuchtungsfokus wird ein Lichtblatt erzeugt, das durch den dezentralen Eintritt des Beleuchtungslichtstrahls 24 in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 gegenüber der optischen Achse O schräg gestellt ist. Dieses Lichtblatt ist in der schematischen Darstellung nach 1 mit 42 bezeichnet.
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Die aus dem mit dem Lichtblatt 42 beleuchteten Zielbereich des Objektes 40 stammende Fluoreszenzstrahlung wird wiederum von dem Objektiv 34 erfasst. Die Fluoreszenzstrahlung wird an dem Strahlteiler 32 in Richtung einer in 1 allgemein mit 44 bezeichneten Detektionsoptik reflektiert. Die Detektionsoptik 44 umfasst ein erstes Detektionsobjektiv 46, das einem Tubuslinsensystem 47 nachgeordnet ist, das aus zwei Tubuslinsen 49, 51 besteht. Die Tubuslinse 49 ist dem Objektiv 34 zugeordnet, während die Tubuslinse 51 dem ersten Detektionsobjektiv 46 zugeordnet ist. Die Tubuslinse 49 erzeugt im Zusammenwirken mit dem Objektiv 34 ein erstes Zwischenbild 53. Die in 1 mit O' bezeichnete optische Achse des ersten Detektionsobjektivs 46 steht senkrecht zur optischen O des Objektivs 34. Da der mit dem Lichtblatt 42 beleuchtete Zielbereich schräg zur optischen Achse O des Objektivs 34 angeordnet ist, liegt auch das erste Zwischenbild 53 schräg zur optischen Achse O' des ersten Detektionsobjektivs 46. Das erste Detektionsobjektiv 46 bildet im Zusammenwirken mit der Tubuslinse 51 das erste Zwischenbild 53 in ein zweites Zwischenbild 48 ab, das ebenfalls schräg zur optischen Achse O' angeordnet ist.
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Die Detektionsoptik 44 umfasst ferner ein zweites Detektionsobjektiv 50, welches das zweite Zwischenbild 48 über eine Tubuslinse 52 auf eine Detektionsfläche 54 eines Lichtdetektors 55 abbildet. Die mit O'' bezeichnete optische Achse des zweiten Detektionsobjektivs 50 steht senkrecht auf dem zweiten Zwischenbild 48 und senkrecht auf der Detektionsfläche 54. Durch das Zusammenwirken der beiden Detektionsobjektive 46 und 50 kann so auf der Detektionsfläche 54 weitgehend abbildungsfehlerfrei ein geradegestelltes Bild des mit dem Lichtblatt 42 beleuchteten, schräg gestellten Zielbereichs des Objektes 40 erzeugt werden.
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Um eine Reihe hochaufgelöster Schnittbilder des Objektes 40 aufzunehmen, wird in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ein Objektträger 56, auf dem das Objekt 40 angeordnet ist, sukzessive längs oder quer der optischen Achse O bewegt. Auf diese Weise kann eine hochaufgelöste, dreidimensionale Abbildung des Objektes 40 vorgenommen werden.
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2 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform als zweites Ausführungsbeispiel. In diesem zweiten Ausführungsbeispiel wird der Parallelversatz des Beleuchtungslichtstrahls 24 gegenüber der optischen Achse O des Objektivs 34 vor Eintritt in die Eintrittspupille 36 in anderer Weise als in dem ersten Ausführungsbeispiel bewirkt. So breitet sich der Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Ausführungsform nach 2 bis zu einem Strahlteiler 58 auf der optischen Achse O aus. Der Strahlteiler 58 ist im Unterschied zu dem Strahlteiler 32 nach 1 aus einem vergleichsweise dicken, planparallelen Substrat gebildet, das beim Durchgang des Beleuchtungslichtstrahls 24 für den gewünschten Parallelversatz gegenüber der optischen Achse O sorgt. Über ein Stellelement 60 kann der Strahlteiler 59 quer zur optischen Achse O verstellt werden, um den Parallelversatz zu variieren.
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In 3 ist ein drittes Ausführungsbeispiel gezeigt. Das dritte Ausführungsbeispiel unterscheidet sich von der in 2 gezeigten Ausführungsform dadurch, dass der aus einem planparallelen Substrat gebildete Strahlteiler 58 durch einen keilförmigen Strahlteiler 59 ersetzt ist. Auch in diesem Ausführungsbeispiel ist der Strahlteiler 59 mittels des Stellelementes 60 verschiebbar, um den gewünschten Parallelversatz des Beleuchtungslichtstrahls 24 zu bewirken.
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Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die 4 bis 8 die erfindungsgemäße Erzeugung des Lichtblattes 42 im Einzelnen erläutert. Dabei ist darauf hinzuweisen, dass die 4 bis 8 rein schematische Darstellungen sind, die das Verständnis der Erfindung erleichtern sollen. Ferner soll für die in den 4 bis 7 gezeigten Fälle zur Erleichterung des Verständnisses zunächst angenommen werden, dass der Beleuchtungslichtstrahl 24 allein aus dem Anregungslichtstrahl 14 gebildet ist, d. h. noch keine Überlagerung mit dem Abregungslichtstrahl 16 erfolgt.
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In 4 ist zunächst der für eine herkömmliche konfokale, punktweise Abtastung typische Fall veranschaulicht, bei der das durch den Beleuchtungslichtstrahl 24 gebildete Strahlenbündel die volle Objektivapertur nutzt, d. h. die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 durchsetzt. In 4 ist der Beleuchtungslichtstrahl 24 parallel zur optischen Achse O ausgerichtet. In diesem Fall erzeugt das Objektiv 36 eine fokussierte Lichterverteilung, deren Ausdehnung längs der optischen Achse O größer als quer zur optischen Achse O ist. Diese in der vorliegenden Anmeldung als Beleuchtungsfokus bezeichnete Lichtverteilung ist in 4 mit 62 bezeichnet.
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Für die nachstehenden Erläuterungen wird jeweils auf ein Koordinatensystem Bezug genommen, dessen x-Achse in der Zeichenebene horizontal und dessen z-Achse in der Zeichenebene vertikal ausgerichtet ist, während die y-Achse aus der Zeichenebene heraus weist. Bei dieser Festlegung ist die Eintrittspupille 36 parallel zur x-y-Ebene angeordnet, während die optische Achse O parallel zur z-Achse verläuft. In 4 ist ferner unter A eine Draufsicht auf den Beleuchtungsfokus 62 in Richtung der z-Achse dargestellt. In dieser konventionellen Anordnung ist der Beleuchtungsfokus 62 in der Draufsicht kreisförmig.
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5 zeigt nun, wie sich die Lage des Beleuchtungsfokus 62 ändert, wenn der Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 durch die weiter oben beschriebene Abtastvorrichtung verkippt wird. Dabei wird für den in 5 gezeigten Fall angenommen, dass der Hauptstrahl des durch den Beleuchtungslichtstrahl 24 gebildeten Strahlenbündels in einer Einfallsebene verkippt wird, die parallel zur x-z-Ebene liegt. Ferner soll der Beleuchtungslichtstrahl 24 immer noch die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 durchsetzen, d. h. die Eintrittspupille 36 vollständig ausleuchten.
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Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird in der Einfallsebene so verkippt, dass er seine Einfallsrichtung relativ zur optischen Achse O ändert. Diese Änderung der Einfallsrichtung wird durch das Objektiv 34 in eine Verschiebung des Beleuchtungsfokus 62 quer zur optischen Achse O umgesetzt. In dem in 5 gezeigten Fall findet sich diese Bewegung längs der x-Achse statt. Da der Beleuchtungslichtstrahl 24 immer noch die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 durchsetzt, bleibt der Beleuchtungsfokus 62 mit seiner Längserstreckung parallel zur optischen Achse O ausgerichtet. Dies zeigt sich auch in den in 5 unter B dargestellten Draufsichten, in denen der Beleuchtungsfokus 62 immer noch kreisrund ist.
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In 6 ist die erfindungsgemäße Unterleuchtung der Eintrittspupille 36 dargestellt. Wie in 6 zu erkennen, durchsetzt der Beleuchtungslichtstrahl 24 lediglich einen Teilbereich der Eintrittspupille 36, wobei dieser Teilbereich dezentral angeordnet, d. h. quer zur optischen Achse O aus der Pupillenmitte versetzt ist. Diese Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls 24 in der Eintrittspupille 36 führt dazu, dass der Beleuchtungsfokus 62 relativ zur optischen Achse O schräg gestellt wird. Dies ist auch in der unter C gezeigten Draufsicht zu erkennen, in der der Beleuchtungsfokus 62 nicht mehr kreisrund, sondern in Richtung der x-Achse langer als in Richtung der y-Achse ist. Durch die Unterleuchtung des Beleuchtungslichtstrahls 24 wird zudem eine Aufweitung des Beleuchtungsfokus 62 bewirkt, d. h. der Beleuchtungsfokus 62 ist insgesamt größer als bei vollständiger Ausleuchtung der Eintrittspupille 36.
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In 7 ist nun der Fall gezeigt, in dem der die Eintrittspupille 36 dezentral unterleuchtende Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 verkippt wird. Dabei soll für den in 7 gezeigten Fall angenommen werden, dass der Hauptstrahl des den Beleuchtungslichtstrahl 24 bildenden Strahlenbündels in einer zur optischen Achse O parallelen Einfallsebene verkippt wird, die parallel zur y-z-Ebene liegt. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl 24 in 7 aus der Zeichenebene heraus und diese hinein verkippt wird.
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Diese Verkippung des Beleuchtungslichtstrahls 24 wird durch das Objektiv 34 in eine entsprechende Verschiebung des schräg gestellten Beleuchtungsfokus 62 längs der y-Achse umgesetzt. Demnach wird der Beleuchtungsfokus 62 in 7 aus der Zeichenebene heraus und in diese hinein verschoben. Dies ist in 7 unter D nochmals veranschaulicht.
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Die in 7 unter D gezeigte Bewegungssequenz des Beleuchtungsfokus 62 macht deutlich, wie durch Bewegen des Beleuchtungsfokus 62 innerhalb einer Abtastperiode das Lichtblatt 42 aufgebaut wird. Voraussetzung ist hierfür, dass die Abtastperiode, in der der Beleuchtungsfokus 62 über den gesamten Zielbereich bewegt wird, kürzer ist als die Detektionszeit, mit dem Lichtdetektor 54 zur Bilderzeugung arbeitet. Dadurch erfasst der Lichtdetektor 54 den bewegten Beleuchtungsfokus 62 zeitlich und damit räumlich nicht aufgelöst. Vielmehr erfasst er eine zusammenhängende oder kontinuierliche Lichtverteilung in Form des Lichtblattes 42.
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In 8 ist nun der Fall gezeigt, in dem der Beleuchtungslichtstrahl 24 aus einer Überlagerung des Anregungslichtstrahls 14 und des Abregungslichtstrahls 16 gebildet ist. Dementsprechend erzeugt das Objektiv 34 einen Anregungsfokus 64 sowie einen Abregungsfokus 66, die in ihrer Überlagerung den Beleuchtungsfokus 62 ergeben. Der Anregungsfokus 64 entspricht in seiner Form dem in den 5 und 6 gezeigten Beleuchtungsfokus 62.
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Der Abregungsfokus 66 ist in 8 unter E nochmals in einem Schnitt parallel zur x-z-Ebene dargestellt. Wie insbesondere aus dieser Darstellung deutlich wird, hat der Abregungsfokus 66 eine räumliche Lichtintensitätsverteilung, bei der die Lichtintensität in der Ebene, in welcher der aus dem Anregungsfokus 64 und dem Abregungsfokus 66 zusammengesetzte Beleuchtungsfokus 62 bewegt wird, gleich Null ist, während sie beiderseits dieser Ebene jeweils ein Maximum aufweist. Die vorstehend genannte Bewegungsebene ist in 7 mit 68 bezeichnet. Sie liegt parallel zu einer Ebene, welche die y-Achse enthält und deren Schnittgerade mit der x-z-Ebene mit der x-Achse einen Winkel bildet. Dieser Winkel ist abhängig von dem maximalen Öffnungswinkel des verwendeten Objektivs 34 und der Aufweitung sowie der Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls 24.
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Indem der Anregungsfokus 64 oberhalb und unterhalb dieser Bewegungsebene 68 von dem Abregungsfokus 66 überlagert ist, wird die Anregungswirksamkeit des Anregungsfokus 62 von oberhalb und unterhalb der Bewegungsebene 68 her herabgesetzt. Der anregungswirksame Teil des Anregungsfokus ist in 8 unter E schraffiert angedeutet.
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In 8 ist die Richtung, in der der Anregungsfokus 62 gleichsam eingeengt wird, durch eine Linie 70 angedeutet. Diese Einengungsrichtung 70 steht senkrecht auf der Bewegungsebene 68. Die Überlagerung des Anregungsfokus 64 und des Anregungsfokus 66 bewirkt, dass das anregungswirksame Lichtblatt 42 gleichsam dünner wird, wodurch die räumliche Auflösung erhöht wird.
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Die vorstehende beschriebene Erzeugung des Lichtblattes 42 bietet die Möglichkeit, eine modulierte bzw. strukturierte Beleuchtung des Zielbereichs des Objektes 40 vorzunehmen. So ist es möglich, die Lichtintensität des Anregungslichtstrahls 14 und/oder des Abregungslichtstrahls 16 innerhalb einer Abtastperiode beispielsweise mittels eines in den Figuren nicht gezeigten AOTFs nach Wunsch zu variieren. Durch alternierende Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls 14 und/oder Abregungslichtstrahls 16 können unterschiedliche Beobachtungsvolumina aufgenommen werden. Erfolgt die Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls 14 und/oder Abregungslichtstrahls 16 im Mikrosekundenbereich können durch geeignete Synchronisation mit dem Lichtdetektor 55 z. B. spaltenweise unterschiedliche Volumenelemente detektiert werden (sofern angenommen wird, dass sich die Detektionsfläche 55 des Lichtdetektors 54 aus Zeilen und Spalten zusammensetzt).
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Abtastmikroskop
- 12
- Anregungslichtquelle
- 14
- Anregungslichtstrahl
- 15
- Abregungslichtquelle
- 16
- Abregungslichtstrahl
- 18
- Phasenplatte
- 20
- Spiegel
- 22
- Strahlteiler
- 24
- Beleuchtungslichtstrahl
- 26
- Galvanospiegelanordnung
- 28
- Abtastlinse
- 30
- Tubuslinse
- 32
- Strahlteiler
- 34
- Objektiv
- 36
- Eintrittspupille
- 38
- Stellelement
- 40
- Objekt
- 42
- Lichtblatt
- 44
- Detektionsoptik
- 46
- erstes Detektionsobjektiv
- 47
- Tubuslinsensystem
- 48
- Zwischenbild
- 49
- Tubuslinse
- 50
- zweites Detektionsobjektiv
- 51
- Tubuslinse
- 52
- Tubuslinse
- 53
- Zwischenbild
- 54
- Detektionsfläche
- 55
- Lichtdetektor
- 56
- Objektträger
- 58
- Strahlteiler
- 60
- Stellelement
- 62
- Beleuchtungsfokus
- 64
- Anregungsfokus
- 66
- Abregungsfokus
- 68
- Bewegungsebene
- 70
- Einengungsrichtung
- O, O', O2'
- optische Achsen
