DE69533331T2

DE69533331T2 - Liganden zur induktion der antigen-spezifischen apoptose in t-zellen

Info

Publication number: DE69533331T2
Application number: DE69533331T
Authority: DE
Inventors: G. John GRIBBEN; J. Gordon FREEMAN; M. Lee NADLER; Paul Rennert; L. Cindy JELLIS; Edward Greenfield; S. Gary GRAY
Original assignee: Repligen Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Repligen Corp; Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1995-06-02
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2015-06-03
Also published as: EP0764171A1; JPH10505482A; US7592007B2; JP4391558B2; US6719972B1; HK1014720A1; AU710340B2; US20040202650A1; ATE272652T1; CA2191610A1; JP2008074859A; EP0764171B1; WO1995033770A1; DE69533331D1; JP4052524B2; AU2692095A

Description

Die Induktion einer Antigen-spezifischen Antwort von T-Zellen erfordert vielfältige Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren der Zelloberfläche einer T-Zelle und Liganden einer Antigen präsentierenden Zelle. Die primäre Wechselwirkung findet zwischen dem T-Zell-Rezeptor/CD3-Komplex und einem Molekül des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes statt, der dem T-Zell-Rezeptor ein Peptid mit antigener Wirkung präsentiert, wodurch ein Antigen-spezifisches Signal in den T-Zellen ausgelöst wird. Zusätzlich zu diesem Antigen-spezifischen Signal benötigt eine T-Zell-Antwort ein zweites, costimulatorisches Signal. Ein costimulatorisches Signal kann in einer T-Zelle durch Stimulation der T-Zelle durch einen Zelloberflächenrezeptor CD28 erzeugt werden (Harding, F. A. (1992) Nature 356, 607–609). Liganden für CD28 sind auf Antigen präsentierenden Zellen (APCs) identifiziert worden. CD28-Liganden umschließen Mitglieder der B7-Familie von Proteinen wie etwa B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86) (Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260–3267; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714–2722; Freeman, G. J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625–631; Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909–911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76–79; Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185–2192). Zusätzlich ist gezeigt worden, dass B7-1 und B7-2 einen weiteren Oberflächenrezeptor auf T-Zellen, der mit CD28 verwandt ist, binden, genannt CTLA-4 (Linsley, P. S. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569; Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 901–911). Im Gegensatz zu CD28, der konstitutiv auf T-Zellen exprimiert wird, wird CTLA-4 auf T-Zellen durch Aktivierung induziert (Linsley, P. S. et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1595–1604). Obwohl eine funktionale Rolle für CTLA-4 nicht bekannt ist, gibt es einige Hinweise, dass CTLA-4 bei der Aussendung eines costimulatorischen Signals an eine T-Zelle mit CD28 zusammenwirkt (Linsley, P. S. et al. (1992) J. Exp. Med. 176, 1595–1604; Damle, N. K. et al. (1994) J. Immunol. 153, 2686–2697).
Aussendung eines Antigen-spezifischen Signals an eine T-Zelle in Abwesenheit eines costimulatorischen Signals induziert keine T-Zell-Antwort, sondern es stellte sich im Gegenteil heraus, dass ein T-Zell-Status der Reaktionslosigkeit oder Anergie induziert wird (vgl. Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349; Jenkins, M. K. et al. (1988) J. Immunol. 140, 3324). Bei einer Reihe klinischer Situationen ist es wünschenswert, T-Zell-Antworten zu unterbinden (z. B. bei Transplantation oder Autoimmun-Defekten). Daher wurden therapeutische Ansätze vorangetrieben, Antigen-spezifische Reaktionslosigkeit von T-Zellen durch Blockierung eines costimulatorischen Signals in T-Zellen hervorzurufen. Zum Beispiel ist ein CTLA-4-Ig-Fusionsprotein, das sowohl B7-1 als auch B7-2 bindet, verwendet worden, um die Abstoßung von allogenen und xenogenen Transplantaten zu verhindern (vgl. z. B. Turka, L. A. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 11102–11105; Lenschow, D. J. et al. (1992) Science 257, 789–792). In ähnlicher Weise sind Antikörper, die mit B7-1 und/oder B7-2 reagieren, verwendet worden, um T-Zell-Proliferation und IL-2-Produktion in vitro zu verhindern und primäre Immunantworten auf Antigen in vivo zu hemmen (Hathcock K. S. et al. (1993) Science 262, 905–907; Azuma M. et al. (1993) Nature 366, 76–79; Powers, G. D. et al. (1994) Cell. Immunol. 153, 298–311; Chen, C. et al. (1994) J. Immunol. 152, 2105–2114).
Ein alternativer Ansatz zur Induktion von Anergie zur Vermeidung einer unerwünschten T-Zell-Antwort auf ein Antigen ist, auf dem Wege der Clonierung für das Antigen spezifische T-Zellen zu zerstören, wodurch die Antigen-spezifischen T-Zellen aus dem T-Zell-Repertoire entfernt werden. In vivo beinhaltet die T-Zell-Reifung im Thymus clonale Deletion von potentiell autoreaktiven T-Zellen. Zusätzlich gibt es sich mehrende Hinweise, dass zuvor aktivierte T-Zellen selektiv in der Peripherie verringert werden, nachdem clonale Expansion und Effektor-Funktion stattgefunden haben (Webb, S. et al. (1990) Cell 63, 1249–1256; Rocha, B. et al. (1991) Science 251, 1225–1227 und Russell, J. H. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2151–2155). Deletion oder Elimination von vielen Zelltypen, einschließlich T-Zellen, kann durch einen Mechanismus, der Apoptose oder programmierter Zelltod genannt wird, auftreten. Das Auftreten von Apoptose in einer Zelle ist durch Eigenschaften gekennzeichnet, die Zellschrumpfung, Zellkern-Kollaps und DNA-Fragmentierung einschließen (Überblick bei Cohen, J. J. et al. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10, 267–293). Mehrere Moleküle der Zelloberfläche sind identifiziert worden, die bei Bindung Apoptose einer Zelle auslösen können, einschließlich Rezeptoren für Fas- und Tumornekrose-Faktoren (Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169, 1747–1756; Trauth, B. C. et al. (1989) Science 245, 301–305; Itoh, N. et al. (1991) Cell 66, 233–239 und Greenblatt, M. S. et al. (1992) Blood 80, 1339–1344). Jedoch ist keines dieser apoptotischen Moleküle auf die T-Zell-Linie begrenzt, noch induzieren sie Apoptose in einer Antigen-spezifischen Weise. Die Fähigkeit, T-Zellen auf dem Wege der Clonierung in einer Weise zu deletieren, die von antigener Stimulation abhängig ist, würde ein Mittel zur Langzeit-Hemmung von T-Zell-Antworten bei einer Reihe von klinischen Situationen bereitstellen, ohne dass eine chronische generelle Immunsuppression mit den von ihr verursachten zerstörerischen Nebenwirkungen bei einem Lebewesen notwendig wäre.
Diese Erfindung basiert, zumindestens zum Teil, auf der Entdeckung eines in vitro-Verfahrens zur Hemmung von T-Zell-Proliferation oder Interleukin-2(IL-2)-Akkumulation und zur Induktion eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals durch eine aktivierte T-Zelle, das das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, die die aktivierte T-Zelle enthält, mit einem Agens umfasst, das ein Epitop auf einem CTLA-4-Molekül bindet, welches sich von einer B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle auf CTLA-4 unterscheidet, wobei das Epitop die Aminosäuresequenz (Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO. 33) umfasst, worin (Xaa)_n eine beliebige Aminosäure und n = 0–20 ist, wobei dieses Agens ein CTLA-4 assoziiertes Signal in der aktivierten T-Zelle in der Weise stimuliert, dass T-Zell-Proliferation oder IL-2-Akkumulation durch die aktivierte T-Zelle gehemmt und Apoptose in der aktivierten T-Zelle induziert wird.
Darüber hinaus basiert die Erfindung auf der Verwendung eines Agens, das, wie vorstehend genannt, definiert ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulation eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals in einer aktivierten T-Zelle eines Lebewesens in der Weise, dass Apoptose in der aktivierten T-Zelle induziert wird.
Bevorzugt ist das Agens ein Antikörper oder Fragment eines Antikörpers, der das T-Zell-Oberflächenmolekül CTLA-4, besonders menschliches CTLA-4 bindet. Diese anti-CTLA-4-Antikörper binden ein Epitop auf CTLA-4, das sich von dem (den) Epitop(en) unterscheidet, die von den bekannten CTLA-4-Liganden B7-1 und B7-2 erkannt werden, zur Antigen-spezifischen T-Zell-Apoptose. Die Antikörper können polyclonale oder monoclonale Antikörper oder Fragmente hiervon sein. Chimäre und humanisierte monoclonale Antikörper und Fragmente hiervon werden von der Erfindung eingeschlossen. In einer anderen Ausführungsform besteht das Agens aus einer löslichen Form eines natürlichen CTLA-4-Liganden, exprimiert auf einer B-Lymphoblastoid-Zelle, die sich von B7-1 und B7-2 unterscheidet und T-Zell-Apoptose induzieren kann.
Die vorliegende Erfindung verwendet Agenzien, die ein Epitop auf CTLA-4 binden, das sich von einem Epitop unterscheidet, das von den bekannten B7-1- und B7-2-Liganden gebundenen wird, und die Apoptose in einer T-Zelle induzieren. Das CTLA-4-Epitop, das von dem Agens, z. B. einem Antikörper erkannt wird, umschließt eine Aminosäuresequenz:
(Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO.: 33)
worin Xaa eine beliebige Aminosäure und n = 0–20, bevorzugt 0–5, mehr bevorzugt 0–3 ist. Dieses CTLA-4-Epitop wird in menschlichem CTLA-4 an den Aminosäurepositionen 59 bis 64 angetroffen. Daher sind Xaa typischerweise zusätzliche Aminosäurereste, die entweder an der Amino- oder Carboxyseite oder sowohl an den Amino- als auch an den Carboxyseiten des Epitops in der CTLA-4-Aminosäuresequenz des Menschen (SEQ ID NO.: 36) angetroffen werden. Alternativ kann Xaa ein Aminosäurerest sein, der die Löslichkeit des resultierenden Peptids erhöht oder die Immunogenität des resultierenden Peptids bei der Verwendung als ein Immunogen verstärkt. Zum Beispiel kann Xaa eine geladene Aminosäure sein (z. B. Lysin, Arginin), die angefügt werden kann, um die Löslichkeit des Peptids zu erhöhen. Alternativ kann Xaa aus Cysteinmolekülen bestehen, hinzugefügt, um die Dimerisierung des resultierenden Peptids zu erhöhen.
Die vorstehend definierten Agenzien können, wenn sie mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff kombiniert werden, in Zusammensetzungen verwendet werden, die zur pharmazeutischen Verabreichung geeignet sind.
Die vorstehend definierten Agenzien sind hilfreich bei der clonalen Deletion von aktivierten T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise, entweder in vitro oder in vivo, durch Induktion von T-Zell-Apoptose. In einer Ausführungsform wird eine aktivierte T-Zelle in vitro mit einem ersten Agens in Kontakt gebracht, das die T-Zelle durch den TCR/CD3-Komplex stimuliert, und dann mit einem zweiten Agens, dem vorstehend genannten Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft und Apoptose in der T-Zelle induziert. Alternativ wird das zweite Agens einem Lebewesen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff verabreicht, um T-Zell-Apoptose in vivo in dem Lebewesen zu induzieren. Ein bevorzugtes zweites Agens ist ein anti-CTLA-4-Antikörper der Erfindung. Zusätzlich zur Induktion der Apoptose durch einen CTLA-4-vermittelten Weg können einem Lebewesen ein oder mehrere weitere Agenzien verabreicht werden, um die Aussendung von stimulierenden Signalen an eine T-Zelle zu hemmen. Zum Beispiel kann ein Agens, das die Produktion oder Funktion eines oder mehrerer Wachstumsfaktoren von T-Zellen in einem Lebewesen hemmt, wie etwa ein anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper, ein anti-IL-2-Antikörper oder Cyclosporin A, einem Lebewesen ebenfalls verabreicht werden. Alternativ oder zusätzlich kann auch ein anderes Agens, das die Aussendung eines costimulativen Signals an die T-Zelle hemmt, wie etwa ein Molekül (z. B. Antikörper oder lösliches Fusionsprotein), das eine Wechselwirkung zwischen CD28 und B7-1 und/oder B7-2 hemmt, in Verbindung mit einem Agens, das T-Zell-Apoptose induziert, verabreicht werden.
Clonale Deletion von T-Zellen durch Induktion von Apoptose in Übereinstimmung mit den hierin beschriebenen Verfahren ist bei einer Reihe klinischer Situationen anwendbar. Zum Beispiel können alloreaktive T-Zellen eines Transplantatempfängers deletiert werden, um Abstoßung der transplantierten Zellen, Gewebe oder Organe zu verhindern. Zusätzlich können alloreaktive T-Zellen von Knochenmarkspendern vor der Knochenmarktransplantation deletiert werden, um eine Graft-versus-host-Erkrankung in einem Transplantatempfänger zu vermeiden.
Bei anderen Anwendungen werden autoreaktive T-Zellen deletiert, um Autoimmunkrankheiten zu behandeln, und Allergen-spezifische T-Zellen werden deletiert, um Allergien zu behandeln. Virus-infizierte oder maligne T-Zellen, die CTLA-4 an ihrer Oberfläche exprimieren, können mit den Verfahren der Erfindung ebenfalls eliminiert werden.
1A ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten (Proliferation, IL-2-Produktion oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen bei wiederholtem Kontakt mit dem Antigen (t-DR7) und der angezeigten zweiten Signale, wodurch die Induktion von Apoptose durch einen monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörper (mAb) dargestellt wird.
1B ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten (Proliferation, IL-2-Produktion oder Apoptose) von normalen peripheren CD4⁺ T-Zellblasten aus dem Blut auf wiederholten Kontakt mit anti-CD3 und der angezeigten zweiten Signale, wodurch die Induktion von Apoptose durch einen anti-CTLA-4-mAb dargestellt wird.
2A ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten (Proliferation, IL-2-Produktion oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen auf wiederholten Kontakt mit Zellen, die Antigen allein (t-DR7) exprimieren, oder Zellen, die sowohl Antigen als auch entweder B7-1 (tDR7/B7-1) oder B7-2 (tDR7/b7-2) exprimieren, wodurch gezeigt wird, dass weder B7-1 noch B7-2 Antigen-spezifische Apoptose induziert.
2B ist eine grafische Darstellung von T-Zell-Antworten (Proliferation, IL-2-Produktion oder Apoptose) von aktivierten DR7-spezifischen T-Zell-Clonen auf wiederholten Kontakt mit den angezeigten Zellen zusammen mit den angezeigten mAbs oder Fusionsproteinen, wodurch gezeigt wird, dass Antigen-spezifische Apoptose durch einen nicht-B7-1-, nicht B7-2-CTLA-4-Bindungsliganden induziert wird.
Die vorliegende Erfindung basiert, wenigstens zum Teil, auf der Entdeckung, dass Querverknüpfung eines T-Zell-Oberflächenmoleküls wie etwa CTLA-4 auf einer aktivierten T-Zelle zusammen mit der Aussendung eines Signals an die aktivierte T-Zelle durch den TCR/CD3-Komplex Apoptose in der T-Zelle induziert. Wenn ein Antigen verwendet wird, um das Signal durch den TCR/CD3-Komplex zu senden, ist das Ergebnis eine Antigen-spezifische Apoptose. Demzufolge liefert die Erfindung ein Mittel, um aktivierte T-Zellen auf clonalem Weg in einer Antigen-spezifischen Weise zu deletieren.
Ein Aspekt der Erfindung liefert ein in vitro-Verfahren zur Hemmung von T-Zell-Proliferation oder Interleukin-2(IL-2)-Akkumulation durch eine aktivierte T-Zelle, die das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, die die aktivierte T-Zelle enthält, mit einem Agens umfasst, das ein Epitop auf einem CTLA-4-Molekül bindet, das sich von einer B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle auf CTLA-4 unterscheidet, wobei das Epitop die Aminosäuresequenz (Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO.: 33) umfasst, worin Xaa_n eine beliebige Aminosäure und n = 0–20 ist, und wobei dieses Agens ein CTLA-4 assoziiertes Signal in der aktivierten T-Zelle stimuliert, sodass T-Zell-Proliferation oder IL-2-Akkumulation durch die aktivierte T-Zelle gehemmt wird.
Wie hier verwendet, ist „Agens" ein Molekül, das spezifische Reaktivität für ein Zielmolekül aufweist (d. h. dieses spezifisch erkennt und bindet). Das in dieser Erfindung verwendete Agens bindet ein T-Zell-spezifisches Oberflächenmolekül, um ein apoptotisches Signal in der T-Zelle hervorzurufen. Ein Oberflächenmolekül, das „T-Zell-spezifisch" ist, wird im Vergleich zu anderen Zelltypen ausschließlich oder bevorzugt (d. h. überwiegend) auf T-Lymphocyten exprimiert. Ein bevorzugtes T-Zell-Oberflächenmolekül, an das ein in der Erfindung verwendetes Agens bindet, ist CTLA-4. In einer Ausführungsform bezeichnet CTLA-4 ein menschliches Protein, das eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO.: 36 dargestellt, aufweist (vgl. auch Harper, K. et al. (1991) J. Immunol. 147, 1037–1044) und von einer cDNA codiert wird, die eine Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO.: 35 dargestellt, aufweist (vgl. auch Dariavach, F. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18, 1901–1905). In einer anderen Ausführungsform bezeichnet CTLA-4 ein Homolog des menschlichen Proteins von einer anderen Säugerart, wie etwa CTLA-4 der Maus (eine cDNA, die CTLA-4 der Maus codiert, wird von Brunet, J.-F. et al. (1987) Nature 328, 267–270 beschrieben).
Zusätzlich ist die Verwendung von Agenzien in der Erfindung eingeschlossen, die Proteine binden, die eine strukturelle Ähnlichkeit zu CTLA-4 aufweisen (z. B. eine homologe Aminosäuresequenz aufweisen), T-zell-spezifische Expression zeigen und in der Lage sind, Antigen-spezifische Apoptose in T-Zellen auszulösen.
Die in der Erfindung verwendeten Agenzien sind in der Lage, Apoptose oder ein apoptotisches Signal in aktivierten T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu induzieren. Der Ausdruck „Apoptose" soll einen zellulären Prozess des programmierten Zelltods beschreiben, der durch das Auftreten von Zellschrumpfung, Kernkollaps und, besonders typisch, zelluläre DNA-Fragmentierung gekennzeichnet ist. „Antigen-spezifische" Apoptose soll bedeuten, dass Apoptose innerhalb einer Population von T-Zellen nur in jenen T-Zellen auftritt, die Spezifität für ein bestimmtes Antigen wie etwa ein Alloantigen oder ein Autoantigen aufweisen. Antigen-spezifische Apoptose wird durch Stimulierung einer aktivieren T-Zelle sowohl mit einem Antigen als auch mit einem CTLA-4-Liganden der Erfindung erreicht. Alternativ kann eine nicht-Antigen-spezifische (d. h. polyclonale) Apoptose erreicht werden, indem ein nicht-Antigen-spezifisches Signal durch den TCR/CD3-Komplex an die T-Zelle ausgesendet wird, z. B. mit einem anti-CD3-Antikörper zusammen mit einem CTLA-4-Liganden der Erfindung. Apoptose wird in einer „aktivierten" T-Zelle induziert, die CTLA-4 auf ihrer Oberfläche exprimiert. Eine T-Zelle kann aktiviert werden, CTLA-4 in einer Antigen-spezifischen Weise zu exprimieren, z. B. durch Stimulation der T-Zelle mit einem Antigen zusammen mit einem costimulatorischen Signal (z. B. Signalisierung durch den CD28-Weg). Alternativ können T-Zellen polyclonal aktiviert werden, zum Beispiel durch Kultivierung mit einem Mitogen wie etwa Phytohämagglutinin (PHA) oder einen Phorbolester wie etwa Phorbolmyristinacetat (PMA).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein in der Erfindung verwendetes Agens ein Antikörper, der CTLA-4 bindet (hierin auch als ein anti-CTLA-4 Antikörper bezeichnet). Der hierin verwendete Ausdruck „Antikörper" bezeichnet Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile der Immunglobulinmoleküle, d. h. Moleküle, die eine Antigen-Bindungsstelle enthalten, die spezifisch ein Antigen wie etwa CTLA-4 bindet (mit diesem immunreagiert). Strukturell besteht der einfachste natürlich vorkommende Antikörper (z. B. IgG) aus vier Polypeptidketten, zwei schweren (H) Ketten und zwei leichten (L) Ketten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Es ist gezeigt worden, dass die Antigen-Bindungsfunktion eines Antikörpers durch Fragmente eines natürlich vorkommenden Antikörpers ausgeführt werden kann. Daher sollen diese Antigen-Bindungsfragmente ebenfalls in den Ausdruck „Antikörper" eingeschlossen sein. Beispiele, die in den Ausdruck Antikörper eingeschlossen sind, umschließen (i) ein Fab-Fragment, das aus den Domänen VL, VH, CL und CH1 besteht; (ii) ein Fd-Fragment, das aus den Domänen VH und CH1 besteht; (iii) ein Fv-Fragment, das aus den Domänen VL und VH eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht, (iv) ein dAb-Fragment (Ward et al. (1989) Nature 341, 544–546), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) eine isolierte komplementäre Determinierungsregion (CDR) und (vi) ein F(ab')₂-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Gelenkregion verbunden sind. Obwohl die beiden Domänen des Fv-Fragments von zwei getrennten Genen codiert werden, kann darüber hinaus ein synthetischer Linker durch rekombinante Verfahren hergestellt werden, die es ermöglicht, sie als eine einzelne Proteinkette herzustellen (bekannt als Einzelketten-Fv (scFv); Bird et al. (1988) Science 242, 423–426 und Huston et al. (1988) PNAS 85, 5879–5883). Solche Einzelketten-Antikörper sind ebenfalls in dem Ausdruck „Antikörper" eingeschlossen. Bevorzugte Antikörperfragmente zur Induzierung von Apoptose sind jene, die in der Lage sind, ihr Ziel-Antigen querzuverknüpfen, z. B. bivalente Fragmente wie etwa F(ab')₂-Fragmente. Alternativ kann ein Antikörperfragment, das selbst nicht sein Ziel-Antigen querverknüpft (z. B. ein Fab-Fragment), in Verbindung mit einem sekundären Antikörper verwendet werden, der dazu dient, das Antikörperfragment querzuverknüpfen, wodurch das Ziel-Antigen querverknüpft wird. Zusätzlich kann ein nicht querverknüpfendes Antikörperfragment (z. B. ein Fab-Fragment) verwendet werden, um Apoptose zu blockieren oder zu hemmen, wie nachstehend beschrieben. Antikörper können, wie hierin beschrieben, unter Verwendung herkömmlicher Techniken fragmentiert werden, und die Fragmente können in gleicher Weise auf ihre Nützlichkeit durchmustert werden, wie für ganze Antikörper beschrieben. Ein Antikörper der Erfindung soll darüber hinaus bispezifische und chimäre Moleküle, die einen CTLA-4-Bindungsabschnitt haben, einschließen.
Der Ausdruck „eine erwünschte Bindungsspezifität für ein CTLA-4-Epitop", ebenso wie der allgemeinere Ausdruck „eine Antigen-Bindungsstelle, die spezifisch bindet (immunreagiert mit)", betrifft die Fähigkeit von individuellen Antikörpern, spezifisch mit einem Oberflächenmolekül der T-Zelle, z. B. CTLA-4, eine Immunreaktion einzugehen. Das heißt, er betrifft eine nicht zufällige Bindungsreaktion zwischen einem Antikörpermolekül und einer antigenen Determinate von CTLA-4. Die erwünschte Bindungsspezifität wird typischerweise vom Referenzpunkt der Fähigkeit des Antikörpers bestimmt, differentiell ein CTLA-4-Antigen und ein nicht verwandtes Antigen zu binden und damit zwischen zwei unterschiedlichen Antigenen zu unterscheiden, besonders in dem Fall, dass die beiden Antigene einmalige Epitope aufweisen. Ein Antikörper, der spezifisch an ein CTLA-4-Epitop bindet, wird als „spezifischer Antikörper" bezeichnet.
Der hierin verwendete Ausdruck „Antikörper-Kombinationsstelle" bezeichnet den strukturellen Abschnitt eines Antikörpermoleküls, der variable und hypervariable Regionen einer schweren und leichten Kette umfasst und spezifisch Antigen bindet (mit diesem immunreagiert). Der Ausdruck „immunreagieren" oder „ist reaktiv mit" in seinen verschiedenen Formen wird hierin verwendet, um die Bindung zwischen einem antigenen, eine Determinante enthaltenden Molekül und einem Molekül, das eine Antikörper-Kombinationsstelle enthält, wie etwa ein vollständiges Antikörpermolekül oder ein Abschnitt hiervon zu bezeichnen.
Der hierin verwendete Ausdruck „Epitop" bezeichnet den genauen strukturellen Abschnitt des Antigens, der immunologisch durch die Antikörper-Kombinationsstelle gebunden wird. Der Ausdruck wird auch austauschbar mit dem Ausdruck „antigene Determinante" verwendet. Das in der Erfindung verwendete Agens, z. B. ein Antikörper, bindet an ein Epitop von CTLA-4, das von dem(n) Epitop(en), das (die) von B7-1 oder B7-2 gebunden werden, verschieden ist (d. h. sich von diesen unterscheidet). Das heißt, der CTLA-4-Ligand bindet an eine Stelle von CTLA-4, die von der B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle von CTLA-4 verschieden ist. Die Bindung eines CTLA-4-Liganden an ein CTLA-4-Epitop, das von der B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle verschieden ist, wird durch die Unfähigkeit des Liganden angezeigt, die Bindung von B7-1 oder B7-2 an CTLA-4 zu verhindern oder anders herum (d. h. die Unfähigkeit von B7-1 oder B7-2, die Bindung des CTLA-4-Liganden an CTLA-4 zu verhindern). Dies kann zum Beispiel mit Hilfe der Verwendung einer enzymverbundenen Immunadsorptionsuntersuchung (ELISA) und löslichen B7-1-, B7-2- und CTLA-4-Fusionsproteinen, wie in Beispiel 2 beschrieben, untersucht werden. Bevorzugt wird ein Fab-Fragment verwendet, um die Fähigkeit eines Antikörpers zu untersuchen, die Bindung von B7-1 oder B7-2 an CTLA-4 zu hemmen, um nicht spezifische Hemmung aufgrund von sterischen Gründen zu reduzieren.
Das menschliche CTLA-4-Epitop, an das ein in der Erfindung verwendetes CTLA-4-Agens bindet, umschließt eine Aminosäuresequenz:
(Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO.: 33),
worin Xaa eine beliebige Aminosäure und n = 0–20, mehr bevorzugt 0–10, noch mehr bevorzugt 0–5, am meisten bevorzugt 0–3 ist. In natürlichem menschlichen CTLA-4 liegt diese Sequenz in der extrazellulären Domäne in der Komplementarität bestimmenden Region 2(CDR2)-ähnlichen Region an den Aminosäurepositionen 59 bis 64 der SEQ ID NO.: 36. Xaa sind daher typischerweise zusätzliche Aminosäurereste, die entweder an der Amino- oder an der Carboxyseite oder sowohl an der Amino- als auch an der Carboxyseite des Kernepitops im menschlichen CTLA-4 (dessen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO.: 36 in voller Länge dargestellt ist) angetroffen werden. Fachleuten auf dem Gebiet wird klar sein, dass in dem natürlichen Protein zusätzliche nicht benachbarte Aminosäurereste ebenfalls zur Konformation des Epitops, das vom Antikörper erkannt wird, beitragen können. Synthetische Peptide können hergestellt werden, die das Epitop umschließen, das andere Aminosäurereste, als die sechs, die der Kern flankieren, umschließt (d. h. Xaa kann alternativ aus anderen Aminosäureresten als aus jenen bestehen, die im natürlichen CTLA-4-Protein gefunden werden). Diese flankierenden Aminosäuren können bewirken, dass sich die Eigenschaften das resultierenden Peptids verändern, zum Beispiel dass die Löslichkeit ansteigt, die Immunogenität verstärkt wird oder die Dimerisation des resultierenden Peptids unterstützt wird. Wenn das Peptid als ein Immunogen verwendet werden soll, können eine oder mehrere geladene Aminosäuren (z. B. Lysin, Arginin) eingeschlossen werden, um die Löslichkeit des Peptids zu erhöhen und/oder die Immunogenität des Peptids zu verstärken. Alternativ können Cysteinreste eingeschlossen werden, um die Dimerisation des resultierenden Peptids zu erhöhen.
Diese und andere Ausführungsformen der Erfindung werden in weiteren Einzelheiten im den nachstehenden Abschnitten beschrieben:
1. CTLA-4 und anti-CTLA-4-Antikörper
Das CTLA-4-Antigen ist ein Mitglied aus einer Familie von Oberflächenmolekülen von T-Zellen, das costimulatorische Moleküle binden kann, die an der Oberfläche von B-Lymphocyten, professionellen Antigen präsentierenden Zellen (z. B. Monocyten, dendritische Zellen, Langerhans-Zellen) und anderen Zellen (z. B. Keratinocyten, Endothelzellen, Astrocyten, Fibroblasten, Oligodendrocyten) angetroffen werden, die den Immunzellen Antigen präsentieren. Ein anderes Mitglied dieser Familie ist das T-Zell-Oberflächenmolekül CD28, das 31% der gesamten Aminosäureidentität mit CTLA-4 teilt (Harper, K. et al. (1991) J. Immunol. 147, 1037–1044). Die CD28- und CTLA-4-Moleküle binden beide costimulatorische Moleküle wie etwa B7-1 und B7-2. Die Beobachtung jedoch, dass ein anti-CD28 Fab-Fragment T-Zell Antworten auf Costimulation sowohl durch B7-1 als auch durch B7-2 vollständig hemmt, unterstützt die Hypothese, dass Costimulation durch die B7-Familie überwiegend über CD28 vermittelt wird (vgl. Gimmi, C. D. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6575–6579 und Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185–2192). Im Gegensatz dazu ist nun entdeckt worden, dass T-Zell-Apoptose über CTLA-4 durch Wechselwirkung mit einem neuartigen CTLA-4-Liganden vermittelt werden kann.
Das CTLA-4-Molekül wird nicht auf ruhenden T-Zellen exprimiert, wird aber durch Aktivierung induziert. Zum Beispiel wird CTLA-4-mRNA nach Stimulation normaler, ruhender menschlicher T-Zellen mit PHA oder PMA über 24 Stunden in den beiden Untersätzen CD4⁺ und CD8⁺ exprimiert (vgl. Freeman, G. J. et al. (1992) J. Immunol. 149, 3795–3801). Darüber hinaus wurde CTLA-4-Expression bei HTLV-I- und HIV infizierten T-Zelllinien beobachtet (vgl. Freeman, G. J. et al. (1992) J. Immunol. 149, 3795–3801; Haffar, O. K. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11094–11098).
Techniken zur Reinigung von T-Zell-Oberflächenmolekülen wie etwa CTLA-4 sind entwickelt worden, und zusätzlich sind CTLA-4-Gene und cDNA sowohl vom Menschen als auch von der Maus cloniert worden (vgl. zum Beispiel Dariavach, F. et al. (1988) Eur. J. Immunol. 18, 1901–1905 und Brunet, J.-F. et al. (1987) Nature 328, 267–270). Die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen CTLA-4 werden in SEQ ID NO.: 35 beziehungsweise 36 dargestellt. Ein CTLA-4-Protein oder Peptid hieraus kann durch Reinigung des natürlichen Proteins oder durch rekombinante Expression erhalten werden. Eine modifizierte rekombinante Form von CTLA-4 wie etwa eine extrazelluläre CTLA-4-Domäne kann exprimiert werden, indem eine CTLA-4 codierende DNA in einen Expressionsvektor eingefügt und der Vektor in eine Wirtszelle, entweder eine prokaryontische oder eine eukaryontische Zelle, überführt wird. Zum Beispiel kann eine extrazelluläre CTLA-4-Domäne oder ein Peptid hiervon in Bakterienzellen wie etwa E. coli, Insektenzellen (z. B. unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems), Hefe oder Säugerzellen wie etwa Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), COS- oder NS0-Zellen exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen und Expressionsvektoren können bei Goeddel, (1990) vorstehend, nachgeschlagen werden oder sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerivisae umschließen pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6, 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30, 933–943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54, 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Baculovirus-Vektoren, verfügbar zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (SF 9-Zellen), umschließen die pAc-Serien (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3, 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow, V. A. und Summers, M. D. (1989) Virology 170, 31–39). Allgemein werden COS-Zellen (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175–182) in Verbindung mit solchen Vektoren wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329, 840) zur vorübergehenden Ampifikation/Expression in Säugerzellen verwendet, während CHO-(dhfr^– Chinese Hamster Ovary, Ovarien des chinesischen Hamsters)Zellen mit Vektoren wie etwa pMT2PC (Kaufmann et al. (1987) EMBO J. 6, 187–195) zur stabilen Amplifikation/Expression in Säugerzellen verwendet werden. Rekombinante Proteine können in der NS0-Myelom-Zelllinie (erhältlich bei der ECACC; Katalog #85110503) hergestellt werden, wie von Galfre, G. und Milstein, C. (1981) Methods in Enzymology 73 (13), 3–46 und Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures, Academic Press, N. Y., N. Y.) beschrieben.
Alternativ kann ein rekombinanter extrazellulärer Abschnitt von CTLA-4 in Bakterienzellen wie etwa E. coli exprimiert werden. Bevorzugte E. coli-Expressionssysteme umschließen die induzierbaren Expressionsvektoren pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69, 301–315) und den pET 11 (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89; käuflich zu erwerben bei Novagen). In dem pTrc-Vektorsystem wird das inserierte Gen mit einer pelB-Signalsequenz durch Transkription mit RNA-Polymerase des Wirtes von einem trp-lac-Hybrid-Fusionspromotor exprimiert. Nach der Induktion kann rekombinantes CTLA-4 aus der periplasmatischen Fraktion gereinigt werden. In dem pET 11-Vektorsystem wird das Zielgen als nicht-Fusionsprotein durch Transkription von T7 gn10-lac-0-Fusionspromotor, vermittelt durch eine coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1), exprimiert. Diese virale Polymerase wird von den E. coli-Wirtsstämmen BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem innewohnenden λ-Prophagen, der T7 gn1 unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV 5-Promotors beherbergt, bereitgestellt. In diesem System kann rekombinantes CTLA-4 aus Einschlusskörpern in einer denaturierten Form gereinigt werden und, falls erwünscht, durch Stufengradientdialyse renaturiert werden, um denaturierende Substanzen zu entfernen. Die Expression der extrazellulären Domäne von menschlichem CTLA-4 in E. coli wird genauer in Beispiel 6 beschrieben.
Eine rekombinante Zelloberflächenform von CTLA-4 kann durch Modifikation des transmembranen und/oder cytoplasmatischen Abschnittes des Proteins auf einer Säugerzelle exprimiert werden (die natürliche Form des Proteins in voller Länge wird auf der Oberfläche vieler Säugerzellen nicht wirksam exprimiert). Zum Beispiel können die transmembranen und cytoplasmatischen Domänen durch eine alternative Struktur ersetzt werden, um das Molekül an der Zelloberfläche zu befestigen, etwa durch einen Glycophosphatidylinosit-(gpi)Anker (wie in Beispiel 1 beschrieben) oder einen Fettsäureanker. Alternativ kann Expression von CTLA-4 an der Zelloberfläche erreicht werden, indem eine heterologe Transmembran-Domäne verwendet wird oder durch Entfernung der cytoplasmatischen Domäne. CTLA-4 kann in Säugerzellen auch als ein lösliches Fusionsprotein exprimiert werden (z. B. ein Immunglobulin-Fusionsprotein), wie von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569) beschrieben wurde.
Zur Expression in Säugerzellen wird Vektor-DNA mit Hilfe von herkömmlichen Techniken wie etwa der Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Co-Fällung, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektin oder Elektroporation in Säugerzellen eingebracht. Geeignete Verfahren zur Transformation von Wirtszellen können bei Sambrook et al. (Molekular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) und in anderen Laborhandbüchern nachgeschlagen werden. Bei der Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft durch genetisches Material von Viren bereitgestellt. Zum Beispiel stammen gewöhnlich verwendete Promotoren vom Polyoma-, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und am häufigsten vom Affenvirus 40.
CTLA-4-Proteine oder Peptide hiervon, exprimiert in Säugerzellen oder anderswo, können nach Standardverfahren des Fachgebietes, einschließlich der Ammoniumsulfat-Fällung, fraktionierten Säulenchromatographie (z. B. Ionenaustausch, Gelfiltration, Elektrophorese, Affinitätschromatographie etc.) und schließlich der Kristallisation gereinigt werden (vgl. allgemein „Enzyme Purification and Related Techniques" Methods in Enzymology 22, 233–577 (1971)).
Anti-CTLA-4-Antikörper können von Fachleuten auf dem Gebiet mit Hilfe von Standardtechniken hergestellt werden. Zum Beispiel können CTLA-4-Moleküle von einer Reihe von Arten, entweder in löslicher Form oder an Membran gebunden, verwendet werden, um die Bildung von anti-CTLA-4-Antikörpern zu induzieren. Solche Antikörper können entweder polyclonale oder monoclonale Antikörper oder Antigen bindende Fragmente solcher Antikörper sein. Von Bedeutung für die therapeutischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung sind Antikörper, die eine Querverknüpfung mit einem Epitop auf CTLA-4 eingehen, das T-Zell-Apoptose induziert. Die Erfindung umfasst sowohl Antikörper, die an menschliches CTLA-4 binden (z. B. ein menschlicher anti-CTLA-4-mAb, bevorzugt ein menschlicher oder humanisierter mAb) als auch Antikörper, die an CTLA-4-Proteine von anderen Arten binden, z. B. Affen, Rindern, Pferden, Ziegen, Schafen, Hunden, Katzen, Ratten, Mäusen etc., die zu tiermedizinischen Zwecken verwendet werden können. Verfahren zur Herstellung von anti-CTLA-4-Antikörpern werden nachstehend genauer beschrieben:
A. Das Immunogen
Der Ausdruck „Immunogen" wird hierin verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein CTLA-4-Peptid oder Protein als einen aktiven Inhaltstoff enthält, der zur Herstellung von Antikörpern gegen CTLA-4 verwendet wird. Wenn ein CTLA-4-Peptid oder -Protein verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, ist es klar, dass das Peptid allein oder verbunden mit einem Trägerstoff als ein Konjugat oder als ein Peptid-Polymer verwendet werden kann.
Um geeignete anti-CTLA-4-Antikörper zu erzeugen, sollte das Immunogen eine wirksame, immunogene Menge eines CTLA-4-Peptids oder -Proteins enthalten, ggf. als ein Konjugat an einen Trägerstoff gebunden. Die wirksame Menge an Peptid pro Dosierungseinheit hängt, neben anderen Dingen, von der geimpften Tierart, dem Körpergewicht des Tiers und dem gewählten Immunisierungsschema ab, was auf dem Fachgebiet gut bekannt ist. Das Immunogenpräparat wird typischerweise Peptidkonzentrationen von etwa 10 Mikrogramm bis etwa 500 Milligramm pro Immunisierungsdosis enthalten, bevorzugt etwa 50 Mikrogramm bis etwa 50 Milligramm pro Dosis. Eine Immunisierungspräparat kann auch einen Hilfsstoff als Teil der Verdünnungslösung einschließen. Hilfsstoffe wie etwa vollständiges Freudsches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freudsches Adjuvans (IFA) und Alaun sind auf dem Fachgebiet gut bekannte Materialien, und sie sind über mehrere Quellen zu beziehen.
Fachleute auf dem Gebiet werden wissen, dass statt der Verwendung von natürlich vorkommenden Formen von CTLA-4 zur Immunisierung alternativ synthetische Peptide eingesetzt werden können, gegen die Antikörper zur Verwendung in dieser Erfindung erzeugt werden können. Sowohl lösliche als auch an Membran gebundene CTLA-4-Protein- oder -Peptidfragmente sind für die Verwendung als ein Immunogen geeignet und können gleichfalls auch durch Immunaffinitätsreinigung isoliert werden. Eine gereinigte Form des CTLA-4-Proteins, das, wie vorstehend beschrieben, oder auf in dem Fachgebiet bekannte Weise isoliert worden sein kann, kann selbst direkt als ein Immunogen verwendet werden oder kann alternativ mit herkömmlichen Verfahren an ein geeignetes Trägerprotein gebunden sein, einschließlich durch chemische Kopplungsmittel als auch durch Gentechnik, indem ein cloniertes Gen des CTLA-4-Proteins verwendet wird. Das gereinigte CTLA-4-Protein kann auch kovalent oder nicht kovalent mit nicht-Protein-Materialien wie etwa Lipiden oder Kohlenhydraten modifiziert werden, um Immunogenität oder Löslichkeit zu erhöhen. Alternativ kann ein gereinigtes CTLA-4-Protein mit einem viralen Partikel, einem replizierenden Virus oder anderen Mikroorganismen gekoppelt oder in diese inkorporiert werden, um die Immunogenität zu verstärken. Das CTLA-4-Protein kann zum Beispiel chemisch an das virale Partikel oder den Mikroorganismus oder einen immunogenen Abschnitt davon gebunden werden.
In einer erläuternden Ausführungsform wird ein gereinigtes CTLA-4-Protein oder ein Peptidfragment hiervon (z. B. hergestellt durch begrenzte Proteolyse oder rekombinante DNA-Techniken) an einen Trägerstoff gebunden, der in Tieren Immunogen ist. Bevorzugte Trägerstoffe umschließen Proteine wie etwa Albumine, Serumproteine (z. B. Globuline und Lipoproteine) und Polyaminosäuren. Beispiele nützlicher Proteine umschließen Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Thyroglobulin, KLH „keyhole limpet hemocyanin", Ei-Ovalbumin und Rinder-Gammaglobuline. Synthetische Polyaminosäuren wie etwa Polylysin oder Polyarginin sind ebenfalls nützliche Trägerstoffe. Für die kovalente Anbindung des CTLA-4-Proteins oder -Peptidfragments an einen geeigneten immunogenen Trägerstoff gibt es eine Reihe von chemischen querverknüpfenden Agenzien, die Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Bevorzugte querverknüpfende Agenzien sind heterobifunktionale querverknüpfende Substanzen, die verwendet werden können, um Proteine schrittweise zu verbinden. Eine breite Vielfalt von heterobifunktionalen querverknüpfenden Substanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt, einschließlich Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxylat (SMCC), m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS); N-Succinimidyl(4-jodacetyl)aminobenzoat (SIAB), Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat (SMPB), 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC); 4-Succinimidyloxycarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluol (SMPT), N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionat]hexanoat (LC-SPDP).
Es kann auch wünschenswert sein, ein Tier einfach mit ganzen Zellen zu immunisieren, die ein CTLA-4-Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren. Verschiedene Zelllinien können als Immunogene verwendet werden, um monoclonale Antikörper gegen ein CTLA-4-Antigen zu erzeugen, einschließlich, aber nicht hierauf begrenzt, gegen aktivierte T-Zellen. Zum Beispiel können periphere Blutzellen, die einem Lebewesen entnommen wurden, in vitro mit anti-CD3-Antikörpern, PHA oder PMA aktiviert werden. Alternativ kann ein Antigen-spezifischer (z. B. alloreaktiver) T-Zell-Clon aktiviert werden, CTLA-4 zu exprimieren, indem der T-Zelle Antigen zusammen mit einem costimulatorischen Signal präsentiert wird. Ganze Zellen, die als Immunogene verwendet werden können, um CTLA-4-spezifische Antikörper zu erzeugen, umschließen auch rekombinante Transfektanten. Zum Beispiel können COS- und CHO-Zellen durch Transfizierung mit einer CTLA-4-gpi-cDNA verändert werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, um Zellen zu produzieren, die CTLA-4 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Diese transfizierten Zellen können dann als Immunogene verwendet werden, um anti-CTLA-4-Antikörper zu erzeugen. Andere Beispiele von transfizierten Zellen sind bekannt, besonders eukaryontische Zellen sind in der Lage, das CTLA-4-Protein zu glycosylieren, jedes Verfahren jedoch, das in der Lage ist, transfizierte CTLA-4-Gene auf der Zelloberfläche zu exprimieren, könnte verwendet werden, um das ganzzellige Immunogen zu erzeugen.
Alternativ zu einer CTLA-4 exprimierenden Zelle oder einem isolierten CTLA-4-Protein können Peptidfragmente von CTLA-4 als Immunogene verwendet werden, um anti-CTLA-4-Antikörper zu erzeugen. In der vorliegenden Erfindung umfasst das CTLA-4-Epitop, das vom Antikörper gebunden wird, eine Aminosäuresequenz: (Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO.: 33), worin Xaa eine beliebige Aminosäure und n = 0–20, bevorzugt 0–10, mehr bevorzugt 0–5, am meisten bevorzugt 0–3 ist. Daher kann ein Peptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO.: 33 aufweist, als ein Immunogen verwendet werden.
Zur Verwendung als Immunogene können Peptide modifiziert werden, um die Löslichkeit zu erhöhen und/oder die Immunogenität zu verstärken, wie vorstehend beschrieben.
Als eine Alternative zur Verwendung eines Proteins oder Peptids als Immunogen ist es möglich, Nucleinsäure (z. B. DNA), die das Protein oder Peptid codiert, als ein Immunogen für die so genannte genetische Immunisierung zu verwenden. Daher soll der Ausdruck „Immunogen" auch Nucleinsäure einschließen, die ein Protein oder Peptid codiert, gegen das Antikörper erzeugt werden sollen. Um Antikörper durch genetische Immunisierung zu erzeugen, wird eine Konstruktion eines Expressionsvektors, der die Nucleinsäure enthält, die das interessierende Protein (z. B. CTLA-4 oder ein Peptid hiervon) codiert, intrazellulär in die Haut eines Tieres (z. B. Maus) eingebracht, indem Partikel (z. B. Goldpartikel) mit der Konstruktion überzogen werden und diese Partikel in die Haut injiziert werden. Dies führt zur Antigenproduktion in der Haut und Entwicklung einer spezifischen Antikörper-Antwort (vgl. z. B. Tang, D. C. et al. (1992) Nature 356, 152–154; Eisenbraun, M. D. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12, 791–797; Wang, B. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12, 799–805).
B. Polyclonale anti-CTLA-4-Antikörper
Polyclonale Antikörper gegen ein gereinigtes CTLA-4-Protein oder Peptidfragment hiervon können allgemein in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen eines CTLA-4-Immunogens wie etwa der extrazellulären Domäne des CTLA-4-Proteins und eines Hilfsstoffs erzeugt werden. Ein polyclonales anti-CTLA-4-Antiserum kann zum Beispiel erzeugt werden, wie von Lindsten, T. et al. (1993) J. Immunol. 151, 3489– 3499 beschrieben. In einer erläuternden Ausführungsform werden Tiere typischerweise gegen das immunogene CTLA-4-Protein, -Peptid oder -Derivat immunisiert, indem etwa 1 μg bis 1 mg Protein mit vollständigem Freundschen Adjuvans kombiniert werden und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später wird die Impfung der Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Immunogens in vollständigem Freundschen Adjuvans (oder einem anderen geeigneten Adjuvans) durch subkutane Injektion an mehreren Stellen aufgefrischt. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut entnommen, und das Serum wird auf den anti-CTLA-4-Titer untersucht (z. B. durch ELISA). Tiere werden wiederholt geimpft, bis ihr Titer ein Plateau erreicht. Es können auch aggregierende Agenzien wie etwa Alaun verwendet werden, um die Immunantwort zu verstärken.
Solche von Säugern produzierten Populationen von Antikörpermolekülen werden als „polyclonal" bezeichnet, weil die Population Antikörper mit sich unterscheidenden Immunspezifitäten und Affinitäten für CTLA-4 umfasst. Die Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säuger gewonnen (z. B. aus dem Blut) und mit Hilfe gut bekannter Techniken wie etwa Protein A-Chromatographie isoliert, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Um die Spezifität des Antikörpers zu erhöhen, können die Antikörper durch Immunaffinitätschromatographie unter Verwendung eines Festphasen fixierten Immunogens gereinigt werden. Der Antikörper wird über einen Zeitraum mit dem Festphasen fixierten Immunogen in Kontakt gebracht, der ausreichend ist, dass das Immunogen mit den Antikörpermolekülen immunreagieren kann, um einen Festphasen fixierten Immunkomplex zu bilden. Die gebundenen Antikörper werden mit Hilfe von Standardtechniken aus dem Komplex abgetrennt.
C. Monoclonale anti-CTLA-4-Antikörper
Der hierin verwendete Ausdruck "monoclonaler Antikörper" oder "monoclonale Antikörperzusammensetzung" bezeichnet eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Form einer Antigen bindenden Stelle enthalten, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop eines CTLA-4-Antigens eine Immunreaktion einzugehen. Eine monoclonale Antikörperzusammensetzung zeigt daher typischerweise eine alleinige Bindungsaffinität für ein bestimmtes CTLA-4-Protein, mit dem sie eine Immunreaktion eingeht. Bevorzugt ist der monoclonale Antikörper, der in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, darüber hinaus dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem vom Menschen stammenden CTLA-4 eine Immunreaktion eingeht.
Monoclonale Antikörper die für die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung nützlich sind, sind in der Weise auf ein Epitop eines CTLA-4-Antigens auf aktivierten T-Zellen gerichtet, dass Komplexbildung zwischen dem Antikörper und dem CTLA-4-Antigen (hierin auch als Ligation bezeichnet) Apoptose in den aktivierten T-Zellen induziert. Ein monoclonaler Antikörper gegen ein Epitop von CTLA-4 kann unter Verwendung einer Technik hergestellt werden, die zur Produktion von Antikörpermolekülen Kulturen kontinuierlicher Zelllinien verwendet. Diese umschließen, sind aber nicht darauf begrenzt, die Hybridom-Technik, die ursprünglich von Köhler und Milstein (1975, Nature 256, 495–497) beschrieben wurde, und die neuere Hybridom-Technik für menschliche B-Zellen (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4, 72), die EBV-Hybridom-Technik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96) und Triom-Techniken. Andere Verfahren, mit denen man wirksam monoclonale Antikörper erhalten kann, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, umschließen Phagen-Display-Techniken (Marks et al. (1992) J. Biol. Chem. 16007–16010).
In einer Ausführungsform ist die Antikörperherstellung, die in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, ein monoclonaler Antikörper, der durch eine Hybridom-Zelllinie hergestellt wird. Hybridom-Fusionstechniken wurden zuerst von Köhler und Milstein eingeführt (Köhler et al. Nature (1975) 256, 495–97; Brown et al. (1981) J. Immunol. 127, 539–46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255, 4980–83; Yeh et al. (1976) PNAS 76, 2927–31 und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29, 269–75). Daher können die monoclonalen Antikörperzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch das folgende Verfahren hergestellt werden, welches die nachstehenden Schritte umfasst:

(a) Immunisierung eines Tieres mit einem CTLA-4-Protein oder Peptid hiervon. Die Immunisierung wird typischerweise durchgeführt, indem das CTLA-4-Immunogen an einen immunologisch gesunden Säuger in einer immunologisch wirksamen Menge verabreicht wird, d. h. in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Immunantwort hervorzurufen. Bevorzugt ist der Säuger ein Nagetier wie etwa ein Kaninchen, eine Ratte oder Maus. Der Säuger wird dann über einen Zeitraum gehalten, der ausreichend ist, dass der Säuger Zellen produzieren kann, die Antikörpermoleküle sekretieren, die mit dem CTLA-4-Immunogen eine Immunreaktion eingehen. Eine solche Immunreaktion wird nachgewiesen, indem die auf diese Weise produzierten Antikörpermoleküle auf Immunreaktivität mit einem Präparat des Immunogen-Proteins durchmustert werden. Bei Bedarf kann es wünschenswert sein, die Antikörpermoleküle mit einem Präparat des Proteins in der Form zu durchmustern, in der es von den Antikörpermolekülen in einer Untersuchung erkannt werden soll, z. B. einer Membran-gebundenen Form von CTLA-4. Diese Durchmusterungsverfahren sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt, z. B. enzymverbundene Immunabsorptionsuntersuchung (ELISA) und/oder Durchflusscytometrie.
(b) Dann wird eine Suspension von Antikörper produzierenden Zellen hergestellt, die jedem einzelnen immunisierten Säuger entnommen werden und den gewünschten Antikörper sekretieren. Nach einem ausreichenden Zeitraum wird die Maus getötet, und somatische Antikörper produzierende Lymphocyten werden entnommen. Antikörper produzierende Zellen können von den Lymphknoten, der Milz und aus dem peripheren Blut der behandelten Tiere stammen. Milzzellen werden bevorzugt und können in einem physiologisch verträglichen Medium auf mechanischem Weg unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren in individuelle Zellen getrennt werden. Lymphocyten der Maus ergeben einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen mit den nachstehend beschriebenen Maus-Myelomen. Somatische Zellen von Ratte, Kaninchen und Frosch können ebenfalls verwendet werden. Die Milzzell-Chromosomen, die die gewünschten Immunglobuline codieren, werden durch Fusionierung der Milzzellen mit Myelomzellen unsterblich gemacht, gewöhnlich in Anwesenheit eines Fusionsagens wie etwa Polyethylenglycol (PEG). Jede einer Reihe von Myelom-Zelllinien kann als Fusionspartner nach den Standardtechniken verwendet werden; zum Beispiel die Myelom-Linien P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 oder Sp2/O-Ag14. Diese Myelom-Linien können von der American Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. bezogen werden.

Die resultierenden Zellen, die die gewünschten Hybridom-Zellen einschließen, werden dann in einem selektiven Medium wie etwa HAT-Medium gezüchtet, in dem nicht fusionierte elterliche Myelomzellen oder Lymphocyten schließlich absterben. Nur die Hybridom-Zellen überleben und können unter begrenzenden Verdünnungsbedingungen gezüchtet werden, um isolierte Clone zu erhalten. Die Überstände der Hybridome werden auf die Anwesenheit von Antikörpern mit der erwünschten Spezifität durchmustert, z. B. mit Hilfe von Immununtersuchungstechniken, die das Antigen verwenden, das zur Immunisierung verwendet worden ist. Positive Clone können dann unter begrenzenden Verdünnungsbedingungen subcloniert werden, und der produzierte monoclonale Antikörper kann isoliert werden. Zahlreiche herkömmliche Verfahren bestehen zur Isolierung und Reinigung der monoclonalen Antikörper, wie auch um sie von anderen Proteinen und Verunreinigungen zu befreien. Gewöhnlich verwendete Verfahren zur Reinigung monoclonaler Antikörper umschließen Ammoniumsulfat-Fällung, Ionenaustausch-Chromatographie und Affinitätschromatographie (vgl. z. B. Zola et al. in: Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Hurell (Hrsg.) S. 51–52 (CRC Press 1982)). Die nach diesen Verfahren erzeugten Hybridome können in vitro oder in vivo (in Bauchwasser) unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Techniken gezüchtet werden.
Allgemein kann die individuelle Zelllinie in vitro gezüchtet werden, zum Beispiel in Labor-Kulturgefäßen, und das Kulturmedium, das hohe Konzentrationen eines einzelnen, spezifischen monoclonalen Antikörpers enthält, kann durch Abgießen, Filtern oder Zentrifugation geerntet werden. Alternativ kann die Ausbeute an monoclonalem Antikörper erhöht werden, indem einem histokompatiblen Tier des verwendeten Typs eine Probe des Hybridoms injiziert wird, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen. Tumore, die den spezifischen monoclonalen Antikörper sekretieren, der von dem fusionierten Zellhybrid produziert wird, entwickeln sich in dem injizierten Tier. Die Körperflüssigkeiten des Tieres wie etwa Bauchwasser oder Serum liefern monoclonale Antikörper in hohen Konzentrationen. Wenn menschliche Hybridome oder EBV-Hybridome verwendet werden, ist es notwendig, Abstoßung des Transplantates zu verhindern, das in Tiere wie Mäuse injiziert worden ist. Immundefekte oder nackte Mäuse können verwendet werden, oder das Hybridom kann zunächst bestrahlte, nackte Mäuse als ein solider, subkutaner Tumor durchlaufen, in vitro kultiviert werden und dann intraperitoneal in mit Pristan sensibilisierten bestrahlten, nackten Mäusen injiziert werden, die Bauchwasser-Tumore entwickeln, welche große Mengen an spezifischen, menschlichen monoclonalen Antikörpern sekretieren.
Sowohl Medien als auch Tiere, die für die Herstellung dieser Zusammensetzungen nützlich sind, sind in dem Fachgebiet gut bekannt und käuflich zu erwerben und umschließen synthetische Kulturmedien, aus Inzucht hervorgegangene Mäuse und dergleichen. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist minimales essentielles Dulbecco-Medium (DMEM; Dulbecco et al. (1959) Virol. 8, 396), ergänzt mit 4,5 g/l Glucose, 20 mM Glutamin und 20% fötalem Kälberserum. Ein beispielhafter Inzuchtstamm ist die Balb/c-Maus.
Beispiel 1 beschreibt die Herstellung von murinen monoclonalen anti-menschlichen CTLA-4-Antikörpern, die in den vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können. Die Hybridome ER5.4D3, ES5.3D6, ER5.3D8, ES5.4E3 und ER4.7G11, die die entsprechenden Antikörper ER5.4D3 (auch als 4D3 oder CTLA-4.1 bezeichnet), ES5.3D6 (auch als 3D6 oder CTLA-4.2 bezeichnet), ER5.3D8 (auch als 3D8 oder CTLA-4.3 bezeichnet), ES5.4E3 (auch als 4E3 oder CTLA-4.4 bezeichnet) und ER4.7G11 (auch als 7G11 bezeichnet) produzieren, wurden nach den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., am 3. Juni 1994 hinterlegt. Dem ER5.4D3-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11645 zugeteilt. Dem ES5.3D6-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11644 zugeteilt. Dem ER5.3D8-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11641 zugeteilt. Dem ES5.4E3-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer HB 11643 zugeteilt. Dem ER4.7G11-Hybridom wurde die ATCC-Zugangsnummer ___ zugeteilt.
D. Chimäre und humanisierte anti-CTLA-4-Antikörper
Wenn Antikörper, die in nicht menschlichen Lebewesen produziert wurden, therapeutisch beim Menschen eingesetzt werden, werden sie in unterschiedlichen Maßen als körperfremd erkannt, und es kann eine Immunantwort im Patienten hervorgerufen werden. Ein Ansatz zur Minimierung oder Beseitigung dieses Problems, der einer allgemeinen Immunsuppression vorzuziehen ist, besteht darin, chimäre Antikörperderivate zu erzeugen, d. h. Antikörpermoleküle, die eine variable, nicht menschliche, tierische Region und eine konstante menschliche Region miteinander kombinieren. Solche Antikörper sind die Äquivalente zu den monoclonalen und polyclonalen Antikörpern, die vorstehend beschrieben wurden, sollten aber weniger immunogen sein, wenn sie Menschen verabreicht werden, und es ist dadurch wahrscheinlicher, dass sie besser vom Patienten toleriert werden.
Chimäre monoclonale Maus-Mensch-Antikörper (d. h. chimäre Antikörper), die mit CTLA-4 reaktiv sind, können mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden, die in dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel wird ein Gen, das eine konstante Region eines CTLA-4-Antikörpermoleküls einer murinen (oder einer anderen) Art codiert, durch ein Gen ersetzt, das eine menschliche konstante Region codiert (vgl. Robinson. et al. Internationale Patentschrift PCT/US86/02269; Akira et al. Europäische Patentanmeldung Nr. 184187; Taniguchi, M., Europäische Patentanmeldung Nr. 171.496; Morrison et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 173.494; Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 86/01533; Cabilly et al. US-Patent Nr. 4,816,567; Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 12.5.023; Better et al. (1988 Science 240, 1041–1043); Liu et al. (1987) PNAS 84, 3439–3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139, 3521–3526; Sun et al. (1987) PNAS 84, 214–218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47, 999–1005; Wood et al. (1985) Nature 314, 446–449 und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553–1559).
Ein chimärer Antikörper kann weiter "humanisiert" werden, indem Abschnitte der variablen Region, die nicht an der Bindung des Antigens beteiligt sind, durch äquivalente Abschnitte variabler Regionen des Menschen ersetzt werden. Allgemeine Überblicke über „humanisierte" chimäre Antikörper werden von Morrison, S. L. (1985) Science 229, 1202–1207 und von Oi et al. (1986) BioTechniques 4, 214 gegeben. Diese Verfahren umschließen Isolierung, Manipulation und Expression der Nucleinsäuresequenz, die die gesamte oder einen Teil einer variablen Region von mindestens einer der schweren oder leichten Kette eines Immunglobulins codiert. Quellen für solche Nucleinsäuren sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und können zum Beispiel von einem anti-CTLA-4-Antikörper produzierenden Hybridom gewonnen werden. Die cDNA, die den chimären Antikörper oder ein Fragment hiervon codiert, kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor cloniert werden. Geeignete „humanisierte" Antikörper können alternativ durch CDR- oder CEA-Substitution produziert werden (vgl. US.-Patent Nr. 5,225,539 von Winter; Jones et al. (1986) Nature 321, 552–525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239, 1534 und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053–4060).
Als eine Alternative zur Humanisierung eines mAb einer Maus oder einer anderen Art kann ein menschlicher mAb, der gegen ein menschliches Protein gerichtet ist, erzeugt werden. Es wurden transgene, Repertoires menschlicher Antikörper tragende Mäuse erzeugt, die mit menschlichem CTLA-4 immunisiert werden können. Milzzellen dieser immunisierten transgenen Mäuse können dann zur Erzeugung von Hybridomen verwendet werden, die menschliche mAbs sekretieren, die spezifisch reaktiv mit menschlichem CTLA-4 sind. (vgl. z. B. Wood et al., PCT-Offenlegungsschrift WO 91/00906, Kucherlapati et al., PCT-Offenlegungsschrift WO 91/10741; Lonberg et al., PCT-Offenlegungsschrift WO 92/03918; Kay et al. PCT-Offenlegungsschrift 92/03917; Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368, 856–859; Green, L. L. et al. (1994) Nature Genet. 2, 13–21; Morrison, S. L. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855; Bruggeman et al. (1993) Year Immunol. 7, 33–40, Tuaillon et al. (1993) PNAS 90, 3720–3724; Bruggeman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21, 1323–1326).
E. Kombinatorische anti-CTLA-4-Antikörper
Monoclonale Antikörperzusammensetzungen der Erfindung können auch mit Hilfe anderer Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie gut bekannt sind. Ein alternatives Verfahren, als Verfahren des „kombinatorischen Antikörper-Displays" bezeichnet, wurde entwickelt, um Antikörperfragmente zu identifizieren und zu isolieren, die eine besondere Antigen- Spezifität aufweisen, und kann verwendet werden, monoclonale anti-CTLA-4-Antikörper zu erzeugen (für Beschreibungen der kombinatorischen Antikörper-Displays vgl. z. B. Sastry et al. (1989) PNAS 86, 5728; Huse et al. (1989) Science 246, 1275 und Orlandi et al. (1989) PNAS 86, 3833). Nach der Immunisierung eines Tiers mit einem CTLA-4-Immunogen, wie vorstehend beschrieben, wird das Antikörper-Repertoire des resultierenden B-Zellen-Pools cloniert. Verfahren zur direkten Gewinnung der DNA-Sequenz der variablen Regionen einer gemischten Population von Immunglobulin-Molekülen unter Verwendung eines Gemisches von oligomeren Primern und PCR sind allgemein bekannt. Zum Beispiel können sowohl gemischte Oligonucleotid-Primer, die den 5'-Leader-(Signalpeptid)Sequenzen und/oder Gerüst 1-(FR1-)Sequenzen entsprechen, als auch Primer für einen konservierten konstanten 3'-Region-Primer für die PCR-Amplifikation der variablen Regionen der schweren und leichten Kette einer Reihe von murinen Antikörpern verwendet werden (Larrick et al. (1991) Biotechniques 11, 152–156). Eine ähnliche Strategie kann auch verwendet werden, um menschliche variable Regionen der schweren und leichten Kette von menschlichen Antikörpern zu amplifizieren (Larrick et al. (1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2, 106–110).
In einer erläuternden Ausführungsform wird RNA aus aktivierten B-Zellen isoliert, zum Beispiel aus peripheren Blutzellen, Knochenmark oder Milzpräparaten, unter Verwendung von Standardprotokollen (z. B. US.-Patent Nr. 4,683,202; Orlandi, et al. PNAS (1989) 86, 3833–3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86, 5728–5732 und Huse et al. (1989) Science 246, 1275–1281). cDNA des ersten Stranges wird unter Verwendung von Primern synthetisiert, die für die konstante Region der schweren Kette(n) und jede der leichten κ- und λ-Ketten spezifisch sind, als auch von Primern für die Signalsequenz. Mit Verwendung von PCR-Primern für die variablen Regionen werden sowohl die variablen Regionen der schweren als auch die leichten Ketten amplifiziert, jede für sich allein oder zusammen, und in geeignete Vektoren zur weiteren Manipulation zur Erzeugung der Display-Pakete eingefügt. Oligonucleotid-Primer, die für die Amplifizierungsprotokolle nützlich sind, können einmalig oder degeneriert sein oder Inosin an degenerierten Positionen inkorporiert haben. Erkennungssequenzen für Restriktions-EndoNucleasen können ebenso in die Primer integriert sein, um das Clonieren des amplifizierten Fragments in einen Vektor in einen vorbestimmten Leserahmen zur Expression zu ermöglichen.
Die V-Gen-Bibliothek, die aus dem aus der Immunisierung stammenden Antikörper-Repertoire cloniert wurde, kann von einer Population von Display-Paketen, bevorzugt von einem filamentösen Phagen stammend, exprimiert werden, und eine Antikörper-Display-Bibliothek zu bilden. Idealerweise enthält das Display-Paket ein System, das die Auswahl von sehr stark variierenden Antikörper-Display-Bibliotheken, schnelles Aussortieren nach jeder Runde der Affinitätstrennung und einfache Isolation des Antikörpergens aus den gereinigten Display-Paketen gestattet. Zusätzlich zu den käuflich zu beziehenden Kits zur Erzeugung von Phagen-Display-Paketen (z. B. das Recombinant Phage Antibody System von Pharmacia, Katalog Nr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAP^TM-Phagendisplay-Kit, Katalog Nr. 240612) können Beispiele von Verfahren und Reagenzien, die für die Verwendung zur Erzeugung einer breit gefächerten Display-Bibliothek für anti-CTLA-4-Antikörper besonders geeignet sind, in der Literatur gefunden werden, zum Beispiel bei Ladner et al., US.-Patent Nr. 5.223,409; Kang et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 92/18619; Dower et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 91/17271; Winter et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 92/20791; Markland et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 92/15679; Breitling et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 93/01288; McCafferty et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 92/01047; Garrard et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 92/09690; Ladner et al., Internationale Offenlegungsschrift Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9, 1370–1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81–85; Huse et al. (1989) Science 246, 1275–1281; Griffths et al. (1993) EMBO J. 12, 725–734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226, 889–896; Clackson et al. (1991) Nature 352, 624–628; Gram et al. (1992) PNAS 89, 3576–3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9, 1373–1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid. Res. 19, 4133–4137 und Barbas et al. (1991) PNAS 88, 7978–7982.
In bestimmten Ausführungsformen können die Domänen der V-Regionen der schweren und leichten Ketten auf dem gleichen Polypeptid exprimiert werden, um, verbunden durch einen flexiblen Linker, ein Einzelketten-Fv-Fragment zu bilden, und das scFv-Gen kann nachfolgend in den gewünschten Expressionsvektor oder in das gewünschte Phagengenom cloniert werden. Wie allgemein von McCafferty et al., Nature (1990) 348, 552–554 beschrieben, können vollständige V_H- und V_L-Domänen eines Antikörpers, die durch einen flexiblen (Gly₄-Ser)₃ Linker verbunden sind, verwendet werden, um einen Einzelketten-Antikörper zu erzeugen, der das Display-Paket basierend auf Antigen-Affinität auftrennen kann. Isolierte scFv-Antikörper, die mit CTLA-4 immunreaktiv sind, können nachfolgend zur Verwendung in dem vorliegenden Verfahren in einer pharmazeutischen Zubereitung formuliert werden.
Sobald die Antikörper-Bibliothek an der Oberfläche eines Display-Pakets (z. B. eines filamentösen Phagen) gezeigt wird, wird sie mit einem CTLA-4-Protein oder Peptidfragment hiervon durchmustert, um Pakete zu identifizieren und zu isolieren, die einen Antikörper mit Spezifität für CTLA-4 exprimieren. Nucleinsäure, die den ausgewählten Antikörper codiert, kann aus dem Display-Paket gewonnen werden (z. B. aus dem Phagen-Genom) und mit Standardtechniken der DNA-Rekombination in andere Expressionsvektoren subcloniert werden.
F. Hybridome und Verfahren zur Herstellung
Hybridome, die nützlich für die vorliegende Erfindung sind, sind jene, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Fähigkeit haben, einen monoclonalen Antikörper zu erzeugen, der spezifisch mit einem CTLA-4-Antigen eine Immunreaktion eingeht. Wie nachstehend beschrieben, kann die Hybridom-Zelle, die anti-CTLA-4-Antikörper produziert, direkt in das empfangende Tier implantiert werden, um eine konstante Quelle für Antikörper zu haben. Die Verwendung von immunisolatorischen Mitteln zur Einkapselung der Hybridomkultur kann sowohl vor immunogener Reaktion gegen die implantierten Zellen schützen, als auch ungeprüfte Proliferation der Hybridomzelle in einem abwehrgeschwächten Wirt verhindern. Ein bevorzugtes Hybridom der vorliegenden Erfindung ist durch die Produktion von Antikörper-Molekülen gekennzeichnet, die spezifisch mit einem Epitop auf einem CTLA-4-Molekül, das auf den Zelloberflächen von aktivierten menschlichen T-Zellen exprimiert wird, eine Immunreaktion eingehen, wodurch bei Ligation Apoptose in der T-Zelle induziert wird.
Verfahren zur Erzeugung von Hybridomen, die Antikörpermoleküle mit einer gewünschten Immunspezifität produzieren, z. B. sekretieren, d. h. die die Fähigkeit aufweisen, mit einem bestimmten CTLA-4 und/oder einem identifizierbaren Epitop von CTLA-4 eine Immunreaktion einzugehen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Besonders gut anzuwenden ist die Hybridom-Technologie, die von Niman et al. (1983) PNAS 80, 4949–4953 und von Galfre et al. (1981) Meth. Enzymol. 73, 3–46 beschrieben wird.
II. Andere Agenzien, die Apoptose auslösen
Alternativ zu einem anti-CTLA-4-Antikörper oder Fragment hiervon kann Apoptose durch eine isolierte, lösliche Form eines neuartigen natürlichen CTLA-4-Liganden induziert werden. Wie in Beispiel 5 beschrieben, kann T-Zell-Apoptose durch einen neuartigen nicht-B7-1, nicht-B7-2, CTLA-4-bindenden Liganden induziert werden, der auf der Oberfläche einer B-lymphoblastoiden Zelllinie (LBL) anzutreffen ist, der an ein Epitop bindet, das die Aminosäuresequenz (Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID NO.: 33) umfasst, worin Xaa_n eine beliebige Aminosäure und n = 0–20 ist. Eine cDNA, die diesen neuartigen CTLA-4-Liganden codiert, kann durch Expressionsclonierung, wie in Beispiel 5 beschrieben, isoliert werden. Ein auf diese Weise isolierter apoptotischer CTLA-4-Ligand kann mit Hilfe von Standardtechniken rekombinant exprimiert werden, etwa wie vorstehend beschrieben. Genauer wird eine lösliche, rekombinante Form des natürlichen CTLA-4-Liganden exprimiert und isoliert, zum Beispiel durch Expression der extrazellulären Domäne des Proteins allein oder als ein Fusionsprotein (z. B. ein Immunglobulin-Fusionsprotein). Eine isolierte, lösliche Form des natürlichen CTLA-4-Liganden, die in der Lage ist, ein Epitop auf CTLA-4 querzuverknüpfen, was T-Zell-Apoptose induziert, kann verwendet werden, um nach den Verfahren der Erfindung clonal T-Zellen zu deletieren. Zusätzlich kann der neuartige CTLA-4-Ligand auf einer Zelloberfläche exprimiert werden, und die Zelle, die den CTLA-4-Liganden exprimiert, kann verwendet werden, um T-Zell-Apoptose zu induzieren (z. B. kann der Ligand auf allogenen Zellen exprimiert werden, um clonal alloreaktive T-Zellen zu deletieren).
Peptidfragmente bekannter oder neuartiger CTLA-4-Liganden, Peptid-Nachahmer und andere kleine Moleküle (z. B. Arzneistoffe), die an ein Epitop auf CTLA-4 binden und es querverknüpfen, was Apoptose der T-Zelle induziert, befinden sich gleichfalls innerhalb des Rahmens der Erfindung. Ein kleines Molekül als Auslöser der T-Zell-Apoptose kann identifiziert werden, indem Substanzen mit Hilfe eines Systems durchmustert werden, etwa wie es in den Beispielen beschrieben wird, oder durch rationales Arzneistoffdesign, zum Beispiel durch Entwerfen eines Moleküls zur Wechselwirkung mit einem Epitop auf CTLA-4, das T-Zell-Apoptose induziert (d. h. mit dem in SEQ ID NO: 33 dargestellten Epitop).
Ein anderer Typ eines apoptotischen Agens, das von der Erfindung eingeschlossen ist, ist eine Nucleinsäure, die einen apoptotischen CTLA-4-Liganden, wie hierin beschrieben, codiert. Zum Beispiel kann Nucleinsäure (z. B. DNA), die einen anti-CTLA-4-Antikörper (oder ein Fragment hiervon) codiert, der ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was Apoptose induziert, oder Nucleinsäure, die einen neuartigen CTLA-4-Liganden (oder einen Abschnitt hiervon) codiert, der Apoptose induziert, als Gentherapie in vitro in Zellen eingeführt oder in vivo einem Lebewesen verabreicht werden, um clonal aktivierte T-Zellen zu deletieren. Rekombinante Expressionsvektoren zur Expression von Proteinen oder Peptiden in Zellen (z. B. rekombinante virale Vektoren) und Liefermechanismen für Nucleinsäure, die für die Gentherapie in vitro oder in vivo geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Ein Expressionsvektor, der eine lösliche, sekretierte Form eines anti-CTLA-4-Antikörpers oder eines anderen CTLA-4-Liganden codiert, kann verwendet werden, um innerhalb von Zellen einen CTLA-4-apoptotischen Liganden zu produzieren, der dann von den Zellen sekretiert wird und an CTLA-4 auf aktivierten T-Zellen bindet (z. B. in Kultur oder in vivo), um Apoptose zu induzieren.
III. Therapeutische Verwendungen von CTLA-4-Liganden, die T-Zell-Apoptose induzieren
Die CTLA-4 bindenden Agenzien, die in der Erfindung verwendet werden, z. B. querverknüpfende Antikörper, können zu therapeutischen Zwecken verwendet werden, um aktivierte T-Zellen clonal durch Induktion von Apoptose in den T-Zellen zu deletieren und dadurch T-Zell-Antworten zu unterbinden. Apoptotische Liganden können durch ihre Fähigkeit erkannt werden, Apoptose zu induzieren, wenn sie zu einer in vitro-Kultur von aktivierten T-Zellen in Anwesenheit eines TCR/CD3-Stimulus zugegeben werden, wie in den Beispielen beschrieben. Der TCR/CD3-Stimulus kann Antigen-spezifisch sein, wie etwa Antigen, das einem T-Zell-Clon durch Antigen-präsentierende Zellen präsentiert wird, oder er kann nicht spezifisch sein, wie etwa die Querverknüpfung von CD3 durch anti-CD3-Antikörper. Apoptose wird typischerweise durch Messung der zellulären DNA-Fragmentierung untersucht, wie etwa durch Nachweis von DNA-Fragmenten nucleosomaler Länge auf elektrophoretischen Agarose-Gels (vgl. z. B. Quingsheng, T. et al. (1991) Cell 67, 629–639). Andere geeignete Untersuchungsmethoden für Apoptose umschließen Aufnahme des 33342-Farbstoffs von Hoechst (vgl. z. B. Hardin, J. A. et al. (1992) J. Immunol. Methods 154, 99–107), Nachweis von Schädigung der Kern-DNA unter Verwendung des intercalierenden Farbstoffs p-Phenylenediamin (vgl. z. B. Salcedo, T. W. et al. (1992) J. Immunol. Methods 148, 209–216) und Durchflusscytometrie-Untersuchungen, wie bei Darzynkiewicz, Z. et al. (1992) Cytometry 13, 795–808 beschrieben.
Zusätzlich zu der direkten Untersuchung des Auftretens von Apoptose in einer Population von T-Zellen kann die clonale Deletion von T-Zellen innerhalb einer Population von T-Zellen als ein Ergebnis von Apoptose untersucht werden, indem die Population von T-Zellen erneut mit einem antigen wirkenden Stimulus herausgefordert wird, und untersucht wird, ob T-Zell-Antworten wie etwa Proliferation und/oder Produktion von Cytokin auftreten. Zum Beispiel kann Apoptose in alloreaktiven, aktivierten T-Zellen innerhalb einer T-Zell-Population durch Kontakt mit allogenen Zellen und einem CTLA-4-bindenden Agens, wie es in der Erfindung verwendet wird, induziert werden. Nachfolgend kann die clonale Deletion der alloreaktiven T-Zellen durch Herausfordern der T-Zell-Population mit den allogenen Zellen und der Messung von T-Zell-Proliferation und/oder Cytokin-Produktion (z. B. IL-2) untersucht werden. T-Zell-Proliferation wird typischerweise durch Aufnahme von Tritium-Thymidin gemessen, während Cytokin-Produktion durch Nachweis des Cytokins (z. B. IL-2) im Kulturüberstand etwa durch ELISA-Verfahren untersucht werden kann. Clonale Deletion von alloreaktiven T-Zellen wird durch einen Mangel an T-Zell-Antworten auf Restimulierung durch allogene Zellen angezeigt.
Um Apoptose in aktivierten T-Zellen im Einklang mit der Erfindung zu induzieren, wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, mit der T-Zelle in Kontakt gebracht. Dieses Agens wirkt durch Querverknüpfung eines Epitops auf CTLA-4, was Apoptose induziert (d. h., ein Epitop, das die in SEQ ID NO: 33 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst). Ein bevorzugtes querverknüpfendes Agens ist ein anti-CTLA-4-Antikörper, wie vorstehend definiert, wie etwa ein monoclonaler anti-Mensch-CTLA-4-Antikörper. Andere Agenzien (z. B. lösliche natürliche CTLA-4-Liganden, chemische Agenzien etc.), die CTLA-4 querverknüpfen können, um die gewünschten Ergebnisse (d. h. Apoptose) hervorzurufen, können jedoch ebenfalls verwendet werden. Eine aktivierte T-Zelle (d. h eine T-Zelle, die zuvor entweder Antigen-spezifisch oder nicht spezifisch stimuliert worden ist, CTLA-4 auf ihrer Oberfläche zu exprimieren) kann durch den Kontakt mit einem CTLA-4-Liganden der Erfindung oder einem anderen Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was Apoptose induziert, angeregt werden, die Apoptose zu durchlaufen. Um Apoptose zu durchlaufen, benötigt die T-Zelle zusätzlich zur Induktion eines CTLA-4 assoziierten Signals (z. B. durch Querverknüpfung von CTLA-4) auch die Stimulierung durch (ein) andere(s) Oberflächenmolekül(e), besonders durch den TCR/CD3-Komplex, z. B. durch Kontakt mit Antigen oder mit einem nicht spezifischen Stimulus wie etwa einem anti-CD3-Antikörper. Wenn Antigen verwendet wird, um die T-Zelle durch ihren T-Zell-Rezeptor (TCR) zu stimulieren, erfolgt Antigen-spezifische Apoptose. Daher offenbart die Erfindung Verfahren zur Induzierung Antigen-spezifischer Apoptose in aktivierten T-Zellen. Die Fähigkeit von apoptotischen CTLA-4-Liganden, clonal T-Zellen auf Antigen-spezifische Weise zu deletieren, kann verwendet werden, um spezifische antigene T-Zell-Antworten zu verhindern und eine Antigen-spezifische Langzeit-Immunsuppression und/oder Toleranz hervorzurufen. Stimulation von anderen Oberflächenmolekülen der T-Zellen in Verbindung mit Stimulation eines CTLA-4- assoziierten apoptotischen Signals kann ebenfalls T-Zell-Apoptose auf eine nicht Antigen-spezifische Weise induzieren.
T-Zellen können durch Induktion von Apoptose nach den Verfahren der Erfindung entweder in vitro oder in vivo clonal deletiert werden. Um T-Zell-Apoptose in vitro zu induzieren, werden aktivierte T-Zellen sowohl mit einem ersten Agens, das die T-Zellen durch den TCR/CD3-Komplex stimuliert, als auch mit einem zweiten Agens, dem vorstehend beschriebenen Agens, in Kontakt gebracht, welches ein CTLA-4-assoziiertes Signal zur Apoptose stimuliert, wie etwa ein Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was Apoptose in einer T-Zelle induziert (z. B. ein CTLA-4-Ligand oder ein anderes Agens, das CTLA-4 querverknüpft). Das erste Agens kann ein nicht spezifisches Agens sein, wie etwa ein anti-CD3-Antikörper, um polyclonale T-Zell-Apoptose zu induzieren. Mehr bevorzugt wird Antigen-spezifische Apoptose durch Stimulierung der T-Zelle durch den TCR mit Antigen induziert, zum Beispiel Antigen, das von einer Antigen präsentierenden Zelle präsentiert wird oder Alloantigen an der Oberfläche von allogenen Zellen (d. h. das erste Agens ist Antigen, das der T-Zelle in einer Form präsentiert wird, die geeignet ist, ein Signal durch den TCR zu stimulieren). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite Agens ein anti-CTLA-4-Antikörper, bevorzugt ein monoclonaler Antikörper.
Um T-Zell-Apoptose in vivo zu induzieren, wird das vorstehend beschriebene Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal in der T-Zelle stimuliert (z. B. ein Agens, das ein Epitop auf CTLA-4 querverknüpft, was Apoptose in der T-Zelle induziert) einem Lebewesen verabreicht. In diesem Fall erhalten die aktivierten T-Zellen die erforderliche Stimulation durch den TCR/CD3-Komplex durch einen endogenen Stimulus in vivo (z. B. ein Autoantigen oder fremdes Antigen, präsentiert durch Antigen präsentierende Zellen in vivo). Alternativ kann ein antigener Stimulus zusammen mit dem Agens verabreicht werden, das CTLA-4 querverknüpft (z. B. kann, um Apoptose in Allergen-spezifischen T-Zellen zu induzieren, das Allergen zusammen mit dem Agens, das CTLA-4 querverknüpft, verabreicht werden, oder um Apoptose in Autoantigen-spezifischen T-Zellen zu induzieren, kann das Autogen mitverabreicht werden). Ein bevorzugtes CTLA-4 querverknüpfendes Agens zur Verabreichung an ein Lebewesen, um T-Zell-Apoptose zu induzieren, ist ein anti- CTLA-4-Antikörper, wie vorstehend beschrieben, bevorzugt ein monoclonaler anti-CTLA-4-Antikörper.
Wenn T-Zell-Apoptose in vivo durch Verabreichung eines Agens induziert wird, das ein CTLA-4-assoziiertes apoptotisches Signal in einem Lebewesen stimuliert, kann zusätzliche Behandlung des Lebewesens notwendig sein, um stimulatorische Signale, die an T-Zellen in der Mikroumgebung in vivo ausgesandt werden und T-Zell-Proliferation und/oder andere T-Zell-Antworten bewirken, zu hemmen oder zu blockieren. Zum Beispiel kann, wie in Beispiel 4 beschrieben, die Anwesenheit des Lymphokins Interleukin-2 (IL-2) die durch Querverknüpfung von CTLA-4 vermittelte Induktion von Apoptose verhindern. Demzufolge kann es bei den Verfahren zur Induktion von T-Zell-Apoptose vorteilhaft sein, auch die Produktion oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren (z. B. IL-2) im Lebewesen zu hemmen. Daher kann zusätzlich zu einem Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, dem Lebewesen ein anderes Agens verabreicht werden, das Produktion oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren hemmt, um T-Zell-Apoptose zu bewirken. Beispiele für geeignete Agenzien zur Hemmung der Produktion oder Funktion von T-Zell-Wachstumsfaktoren umschließen einen anti-IL-2-Antikörper, einen anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper oder einen immunsuppressiven Arzneistoff, welcher IL-2-Spiegel im Lebewesen senkt, wie etwa Cyclosporin A.
Um Apoptose in einem Lebewesen zu induzieren, kann es zusätzlich oder alternativ vorteilhaft sein, T-Zellen daran zu hindern oder davor zu bewahren, ein costimulatorisches Signal in vivo zu empfangen, wie etwa das costimulatorische Signal, das durch die Wechselwirkung von CD28 entweder mit B7-1 oder B7-2 vermittelt wird. Demzufolge kann zusätzlich zu der Verabreichung eines Agens an ein Lebewesen, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, dem Lebewesen auch ein weiteres Agens verabreicht werden, welches die Erzeugung eines costimulatorischen Signals in T-Zellen verhindert, wie etwa ein blockierendes Molekül, das an CD28, B7-1 oder B7-2 bindet. Beispiele für geeignete blockierende Moleküle umschließen ein anti-CD28 Fab-Fragment, anti-B7-1 oder anti-B7-2 blockierende Antikörper (d. h. Antikörper, die CD28-B7-1/B7-2-Wechselwirkungen blockieren, aber kein costimulatorisches Signal in T-Zellen induzieren) und lösliche Formen von CD28, B7-1 oder B7-2 (z. B. Immunglobulin-Fusionsproteine, die CD28-B7-1/B7-2-Wechselwirkungen blockieren, aber kein costimulatorisches Signal in T-Zellen induzieren). Zusätzlich können Kombinationen von blockierenden Molekülen, z. B. ein anti-B7-1-Antikörper und ein anti-B7-2 Antikörper verwendet werden.
Die Verfahren der Erfindung zur Induktion von T-Zell-Apoptose sind bei einer Reihe von klinischen Situationen anwendbar, bei denen es wünschenswert ist, eine spezifische Population von reaktiven T-Zellen clonal zu deletieren, wie genauer in den nachstehenden Unterabschnitten beschrieben wird.
A. Organtransplantation/GVHD
Clonale Deletion von alloreaktiven T-Zellen durch Induktion einer alloantigen-spezifischen Apoptose in aktivierten T-Zellen ist nützlich in Situationen von Zell-, Gewebe-, Haut- und Organtransplantationen und bei Knochenmarkstransplantationen (z. B. zur Verhinderung von Graft-versus-Host-Erkrankungen (GVHD)). Zum Beispiel kann die Deletion von alloreaktiven T-Zellen reduzierte GewebeDeletion bei Transplantation von Gewebe und Langzeit-Akzeptanz des Transplantats ohne die Notwendigkeit einer allgemeinen Immunsuppression zur Folge haben. Typischerweise wird die Abstoßung des Transplantats bei Gewebetransplantationen durch die Erkennung als körperfremd durch die T-Zellen eingeleitet, gefolgt von einer Immunreaktion, die das Transplantat zerstört. Die Verabreichung eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, wie etwa ein monoclonaler anti-CTLA-4-Antikörper der Erfindung, an einen Transplantatempfänger zusammen mit den transplantierten Zellen kann Apoptose in alloreaktiven T-Zellen des Empfängers induzieren, die durch die transplantierten körperfremden Zellen aktiviert werden. Das Behandlungsprotokoll kann vorherige Sensibilisierung (d. h. Aktivierung) der alloreaktiven T-Zellen des Empfängers auf Spender-Antigene durch Verabreichung einer Probe von Spenderzellen (z. B. hämatopoetische Zellen) an den Empfänger vor der Transplantation beinhalten. Diese Vorbehandlung aktiviert Spender-spezifische alloreaktive T-Zellen im Empfänger dazu, CTLA-4⁺ zu werden, um auf diese Weise zu ermöglichen, bei wiederholter Exposition gegen Spender-Antigene (z. B. des Transplantats) in Anwesenheit eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, clonal deletiert zu werden.
Ein alternatives Behandlungsprotokoll kann beinhalten, T-Zellen des Empfängers in vitro Spenderzellen (z. B. hämatopoetische Zellen des Transplantatspenders) auszusetzen, bevor das Transplantat in den Empfänger übertragen wird, um Alloantigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren (d. h. CTLA-4 auf der Oberfläche der alloreaktiven Zellen zu induzieren) und, sobald sie aktiviert sind, die T-Zellen des Empfängers in vitro sowohl mit den Spenderzellen als auch mit einem Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert (z. B. anti-CTLA-4-mAb), in Kontakt zu bringen, wodurch Apoptose in den aktivierten alloreaktiven Zellen induziert wird. Sobald die alloreaktiven T-Zellen in vitro clonal deletiert worden sind, können die verbleibenden T-Zellen dem Empfänger reinjiziert werden, und die Transplantation kann durchgeführt werden. Zusätzlich kann dem Lebewesen ein CTLA-4-querverknüpfendes Agens verabreicht werden, um Apoptose in all jenen alloreaktiven T-Zellen zu induzieren, die noch in vivo vorhanden sind (d. h. kann der Ansatz einer kombinierten in vitro-Abreicherung, in vivo-Behandlung verwendet werden).
Die vorstehend beschriebenen Ansätze können in ähnlicher Weise auf die Situation der Knochenmarktransplantation angewendet werden, um spezifisch alloreaktive T-Zellen aus Spenderknochenmark abzureichern. Die Entfernung von alloreaktiven T-Zellen aus dem Transplantat bei Bewahrung der Anwesenheit anderer T-Zellen ist vorteilhaft für die Verhinderung des Auftretens der Graft-versus-host-Erkrankung, fördert das Einwachsen des Knochenmarks im Transplantatempfänger und schützt vor der anti-Leukämie-Aktivität (d. h. der Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktion) der Spenderzellen im Transplantat. Um alloreaktive T-Zellen im Transplantat clonal zu deletieren, kann Spenderknochenmark vor der Transplantation in vitro mit Zellen des Empfängers (z. B. hämatopoetischen Zellen) inkubiert werden, um alloreaktive T-Zellen im Knochenmark zu aktivieren. Nach der Aktivierung können alloreaktive T-Zellen durch in vitro-Inkubation sowohl mit Empfängerzellen als auch mit einem Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, clonal aus dem Knochenmark deletiert werden. Zusätzliche Agenzien, die die Erzeugung von stimulatorischen Signalen in T-Zellen hemmen (z. B. anti-B7-1- und/oder anti-B7-2-Antikörper, ein anti-IL-2R-Antikörper etc., wie vorstehend beschrieben), können in die Inkubation eingeschlossen werden. Spezifisch um alloreaktive Zellen abgereichertes Knochenmark kann dann dem Empfänger verabreicht werden, der weiterhin mit dem Agens behandelt werden kann, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotischens Signal in vivo stimuliert, um Apoptose in etwa noch vorhanden gebliebenen alloreaktiven Zellen in vivo zu induzieren. Zusätzliche Behandlungen, die die Erzeugung eines costimulatorischen Signals in T-Zellen im Empfänger hemmen oder die die Produktion oder Funktion eines oder mehrerer T-Zell-Wachstumsfaktoren (z. B. IL-2) im Empfänger hemmen, können ebenso in vivo verabreicht werden, um darüber hinaus die Induktion von T-Zell-Apoptose im Empfänger zu fördern.
Die Wirksamkeit eines bestimmten Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotischens Signal stimuliert (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper), um Abstoßung von Organtransplantaten oder GVHD zu verhindern, kann mit Hilfe von Tiermodellen untersucht werden, von denen Rückschlüsse auf die Wirksamkeit beim Menschen gezogen werden können. Aufgrund der Homologie zwischen CTLA-4-Molekülen der verschiedenen Arten nimmt man an, dass die funktional wichtigen Aspekte von CTLA-4 zwischen den Arten strukturell konserviert sind und auf diese Weise gestatten, dass Tiersysteme als Modelle für die Wirksamkeit in Menschen verwendet werden können. Beispiele für geeignete Systeme, die verwendet werden können, umschließen allogene Herztransplantate bei Ratten und xenogene Transplantate von Inselzellen der Bauchspeicheldrüse bei Mäusen, welche beide verwendet worden sind, um die immunsuppressiven Wirkungen von CTLA-4-Ig-Fusionsproteinen in vivo zu untersuchen, wie von Lenschow et al., (1992) Science 257, 789–792 und Turka et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 11102–11105 beschrieben. Zusätzlich können murine Modelle von GVHD (vgl. Paul (Hrsg.), Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 846–847) verwendet werden, um die Wirkung der Induktion von T-Zell-Apoptose über ein CTLA-4-assoziiertes apoptotisches Signal (durch Behandlung von T-Zellen in vitro und/oder in vivo) auf die Entwicklung dieser Krankheit zu untersuchen.
Als eine erläuternde Ausführungsform kann ein anti-CTLA-4-Antikörper in einem Rattenmodell zur Organtransplantation verwendet werden, um die Fähigkeit des Antikörpers zu ermitteln, alloantigene Reaktionen in vivo zu blockieren. Lewis-Ratten als Empfänger erhalten ein allogenes Herztransplantat eines Brown-Norway-Rattenstamms, das mit Gefäßen im Nacken verbunden wird, wie von Bolling, S. F. et al., Transplant 453, 283–286 (1992) beschrieben. Die Transplantate werden durch Abtasten auf ihre mechanische Funktion und durch Elektrokardiogramm auf ihre elektrophysiologische Funktion überwacht. Man definiert, das Abstoßung des Transplantats am letzten Tag der tastbaren Kontraktionsfunktion eingetreten ist. Als eine erste Untersuchung werden die Tiere über 7 Tage mit täglichen Injektionen von monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörpern oder einem zum Isotyp passenden monoclonalen Kontroll-Antikörper behandelt. Die Antikörper werden in einem Dosierungsbereich von etwa 0,015 mg/Tag bis 0,5 mg/Tag verabreicht. In parallel laufenden Experimenten erhalten empfangende Lewis-Ratten vor der allogenen Herztransplantation eine Probe von Brown-Norway-Zellen (z. B. periphere Blutzellen oder Milzzellen), um alloreaktive T-Zellen in den Empfängern zu aktivieren. Nach diesem Präsensibilisierungsschritt wird das allogene Transplantat zusammen mit der Verabreichung von anti-CTLA-4-Antikörpern transplantiert. Unbehandelte Lewis-Ratten stoßen heterotopische allogene Brown-Norway-Transplantate typischerweise in etwa 7 Tagen ab. Die Abstoßung allogener Transplantate in mit Antikörpern behandelten Tieren wird im Vergleich zu unbehandelten Kontrolltieren untersucht.
Ein unbehandeltes Tier und ein mit Antikörpern behandeltes Tier werden für die histologische Untersuchung getötet. Die allogenen Herztransplantate werden vom unbehandelten Tier und vom mit Antikörpern behandelten Tier vier Tage nach der Transplantation entfernt. Die allogenen Transplantate werden in Formalin fixiert, und Gewebeschnitte werden mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt. Das Herzgewebe der unbehandelten und behandelten Tiere wird histologisch auf schwere akute zelluläre Abstoßungsreaktionen einschließlich eines hervortretenden monoNuclearen interstitiellen Zellinfiltrats mit Ödembildung, Deletion von Myocyten und Infiltration von Arterienwänden untersucht. Die Wirksamkeit der Behandlung mit Antikörpern zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten wird durch das Fehlen einer akuten zellulären Abstoßungsreaktion im Herzgewebe der mit Antikörpern behandelten Tiere gestützt.
Um zu bestimmen, ob Antikörpertherapie eine Langzeit-Akzeptanz des Transplantats begründet, die nach der Antikörperbehandlung weiter besteht, werden Tiere, die über 7 Tage mit täglichen Injektionen von Antikörpern behandelt worden sind, ohne zusätzliche Therapie bis zum Stillstand der Funktion des Transplantats beobachtet. Die Tiere erhalten entweder keine Behandlung, Behandlung mit anti-CTLA-4-Antikörpern oder mit einem dem Isotyp entsprechenden monoclonalen Kontroll-Antikörper. Die Antikörperbehandlung beginnt zum Zeitpunkt der Transplantation und wird über 7 Tage fortgesetzt. Das Überleben des Transplantats wird täglich, wie vorstehend beschrieben, untersucht. Allogene Transplantate von Tieren, in denen das Transplantat seine Funktion eingestellt hat, werden histologisch untersucht, wie vorstehend beschrieben. Induktion von Toleranz des Transplantats durch Antikörperbehandlung wird durch das fortgesetzte Funktionieren des Transplantats nach Beendung der Antikörperbehandlung angezeigt.
Nach verlängerter Transplantat-Akzeptanz kann ein mit Antikörpern behandeltes Tier getötet werden, und die Lymphocyten des Empfängers können auf ihre funktionalen Antwortreaktionen untersucht werden. Diese Antwortreaktionen werden mit denen von Lymphocyten einer Kontroll-Lewis-Ratte (ohne Transplantat) verglichen, und Ergebnisse werden als prozentuale Angaben der Kontroll-Antwortreaktionen normiert. Die proliferative Antwort von T-Zellen auf ConA und auf Zellen einer Brown-Norway-Ratte und einer dritten Art, einer ACI-Ratte, können untersucht werden. Zusätzlich können Thymus und Milz von den unbehandelten und behandelten Tieren in Größe, Anzahl der Zellen und Art der Zellen verglichen werden (z. B. mit Hilfe von Durchflusscytometrie-Untersuchungen von Thymus, Lymphknoten und Milzzellen). Spezifische Nicht-Reaktivität auf Alloantigene in den behandelten Tieren als ein Ergebnis der spezifischen clonalen Deletion alloreaktiver Zellen wird durch die Fähigkeit der T-Zellen angezeigt, auf ConA und Stimulatoren einer dritten Art (z. B. ACI-Zellen von Ratten) zu antworten, nicht aber auf Zellen von Brown-Norway-Ratten.
B. Autoimmun-Erkrankungen
Clonale Deletion von T-Zellen durch Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Apoptose kann auch bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen therapeutisch nutzbringend eingesetzt werden. Viele Autoimmun-Störungen sind das Ergebnis von unangemessener Aktivierung von T-Zellen, die reaktiv gegen Eigengewebe sind (d. h. reaktiv gegen Autoantigene) und welche die Produktion von Cytokinen und Autoantikörpern voran treiben, die an der Pathologie dieser Erkrankungen beteiligt sind. Die Verhinderung der Aktivierung autoreaktiver T-Zellen kann daher die Krankheitssymptome vermindern oder beseitigen. Die Verabreichung eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, wie etwa ein anti-CTLA-4-Antikörper der Erfindung, der an ein Epitop von CTLA-4 bindet, wodurch T-Zell-Apoptose induziert wird, kann verwendet werden, um autoreaktive T-Zellen zu deletieren, wodurch Antworten der T-Zellen gehemmt und die Produktion von Autoantikörpern oder von T-Zellen stammenden Cytokinen, die an dem Verlauf der Krankheit beteiligt sein können, verhindert werden. Zusätzlich kann eine Langzeit-Erholung von dieser Erkrankung erreicht werden, da autoreaktive T-Zellen eleminiert werden können anstatt einfach nur toleriert zu werden.
Um eine Autoimmun-Störung zu behandeln, wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert (d. h. das CTLA-4-bindende, vorstehend beschriebene Agens), einem Lebewesen, das einer Behandlung bedarf, verabreicht. Autoreaktive T-Zellen, die zuvor durch ein Autoantigen in vivo aktiviert wurden, werden durch antigene Stimulation mittels Autoantigen in vivo dazu angeregt, Apoptose zu durchlaufen. Alternativ kann bei Autoimmun-Störungen mit einem bekannten Autoantigen dem Lebewesen das Autoantigen zusammen mit dem apoptotischen Agens verabreicht werden. Da nur aktivierte T-Zellen durch diese Behandlung eliminiert werden, sollten ruhende T-Zellen, die für andere Antigene spezifisch sind, von dieser Behandlung unberührt bleiben.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, um eine Reihe von Autoimmun-Erkrankungen und Störungen zu behandeln, die einen Autoimmun-Anteil aufweisen, einschließlich Diabetis mellitus, Arthritis (einschließlich rheumatoide Arthritis, jugendliche rheumatoide Artritis, Osteoarthritis, psoriatischer Arthritis), multipler Sklerose, Myasthenia gravis, systemischem Lupus erythematodes, autoimmuner Thyroiditis, Dermatitis (einschließlich atopischer Dermatitis und ekzematöser Dermatitis), Psoriasis, Sjögren-Syndrom, einschließlich Keratoconjunctivitis sicca nach Sjögren-Syndrom, Alopecia areata, allergischer Reaktionen auf Arthropodenbiss-Reaktionen, Morbus Crohn, aphthösem Geschwür, Iritis, Conjunctivitis, Keratoconjunctivitis, ulcerativer Colitis, Asthma, allergischem Asthma, cutanösem Lupus erythematodes, Scleroderma, Vaginitis, Proctitis, Arzneistoffdermatitis, lepröser Umkehrreaktionen, Erythema nodosum leprosum, Autoimmun-Uveitis, allergischer Enzephalomyelitis, akuter nekrotischer hämorrhagischer Enzephalopathie, idiopathischem progressivem sensorineuralem Hörverlust, aplastischer Anämie, Anämie der roten Blutkörperchen, idiopathischer Thrombocytopenie, Polychondritis, Wegenersche Granulomatose, chronischer aktiver Hepatitis, Stevens-Johnson-Syndrom, idiopathischer Sprue, Lichen planus, Morbus Crohn, Graves Ophthalmopathie, Sarcoidosis, primärer biliärer Zirrhose, Uveitis posterior und interstitieller Lungenfibrose.
Die Wirksamkeit von CTLA-4 querverknüpfenden Agenzien bei der Verhinderung oder Erleichterung von Autoimmun-Störungen kann bestimmt werden, indem eine Reihe von gut untersuchten Tiermodellen menschlicher Autoimmun-Erkrankungen verwendet wird. Beispiele umschließen murine experimentelle Autoimmun-Enzephalitis, systemischen Lupus erythematodes in MRL/Ipr/Ipr-Mäusen oder NZB-Hybridmäusen, murine Autoimmun-Kollagen-Arthritis, Diabetes mellitus in NOD-Mäusen und BB-Ratten und murine experimentelle Myasthenia gravis (vgl. Paul (Hrsg.), Fundamental Immunology, Raven Press, New York, 1989, S. 840–856).
Experimentelle Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Nager- und Primatenmodell für multiple Sklerose. In einer erläuternden Ausführungsform werden in einem passiven EAE-Modell Spendermäuse mit 0,4 mg Myelin-Basisprotein (MBP) in einer Lösung mit vollständigem Freundschen Adjuvans (CFA), über vier Quadranten verteilt, immunisiert. Die drainierenden Lymphknoten der Achseln und Leisten werden 11 Tage später entfernt. Die Lymphknotenzellen (4 × 10⁶/ml) werden in 2 ml-Kulturen in Anwesenheit von 25 μg/ml MBP auf Platten mit 24 Vertiefungen aufgebracht. Nach 4 Tagen in Kultur werden je 30 × 10⁶ der behandelten Zellen in die Schwanzvenen unbehandelter, syngener Empfängermäuse injiziert.

Die empfangenden Mäuse entwickeln eine vorübergehende, rezidivierende Erkrankung und werden unter Verwendung der folgenden Kriterien bewertet:

0	normal, gesund
1	schlaffer Schwanz, Inkontinenz; gelegentlich ist das erste Anzeichen der Erkrankung ein "Umkippen"
2	Schwäche der Hinterbeine, Schwerfälligkeit
3	milde Paraparese
4	schwere Paraparese
5	Quadriplegie
6	Tod

Mit der Verwendung des passiven EAE-Modells wird die Auswirkung der Behandlung der Spenderzellen mit anti-CTLA-4-Antikörpern auf die resultierende Schwere der Erkrankung in einem empfangenden Tier in Mäusen (z. B. dem Stamm PLSJLF1/J) untersucht. Die Kultivierung von Lymphzellen mit MBP in vitro wird entweder in Anwesenheit oder in Abwesenheit von etwa 30 μg/ml eines anti-CTLA-4-Antikörpers durchgeführt. Die behandelten Zellen werden dann in eine syngene Empfängermaus überführt. Die Auswirkung von Antikörperbehandlung der Spenderzellen auf die Schwere des ersten Abschnitts der Erkrankung beim Empfänger im Vergleich zu Mäusen, die unbehandelte Zellen erhalten haben, kann mit Hilfe der vorstehend genannten Kriterien zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung untersucht werden. Zusätzlich können nachfolgende Rückfälle bei Mäusen, die mit Antikörpern behandelte Zellen erhalten hatten, gegenüber unbehandelten Zellen mit den vorstehend beschriebenen Kriterien untersucht werden.
Darüber hinaus kann die Auswirkung auf die klinische Schwere der Erkrankung des Empfängers untersucht werden, wenn sowohl die Spendermäuse als auch die kultivierten Spenderzellen mit anti-CTLA-4-Antikörpern behandelt worden sind. In diesen Experimenten werden Spendermäusen (z. B. vom Stamm SJL/J), die mit MBP immunisiert worden sind, entweder 100 μg eines anti-CTLA-4-Antikörpers (allein oder in Kombination) oder 100 μg eines vom Isotyp passenden Kontroll-Antikörpers intraperitoneal täglich über 11 Tage verabreicht. Die Zellen werden dann von den Lymphknoten dieser Spender isoliert und mit MBP in vitro in Anwesenheit von entweder 30 μg/ml eines anti-CTLA-4-Antikörpers (allein oder in Kombination) oder eines Kontroll-Antikörpers kultiviert. Die behandelten Zellen werden dann in einen syngenen Empfänger überführt. Die Auswirkung der Antikörperbehandlung auf die Schwere der nachfolgenden Erkrankung im Empfänger wird dann anhand der vorstehend genannten Kriterien untersucht.
Studien, die ein direktes (aktives) Modell für EAE verwenden, können ebenfalls durchgeführt werden. In diesen Experimenten wird ein anti-CTLA-4-Antikörper Mäusen direkt verabreicht, die mit MBP immunisiert und mit Pertussis-Toxin (PT) behandelt worden sind. Mäuse (z. B. der Stamm PLSJLFI/J) werden mit MBP an Tag 0 immunisiert, erhalten PT an den Tagen 0 und 2 intravenös injiziert und erhalten entweder einen anti-CTLA-4-Antikörper oder einen vom Isotyp passenden Kontroll-Antikörper an den Tagen 0 bis 7. Die Auswirkung der direkten Antikörperbehandlung der MBP immunisierten Mäuse auf die Schwere der nachfolgenden Erkrankung wird dann anhand der vorstehend genannten Kriterien untersucht.
C. Allergie
Die IgE-Antikörperreaktion bei atopischer Allergie ist in hohem Maße von T-Zellen abhängig, und daher kann clonale Deletion von Allergen-spezifischen T-Zellen durch Induktion von Apoptose von therapeutischem Nutzen bei der Behandlung von Allergie und allergenen Reaktionen sein. Zum Beispiel kann ein anti-CTLA-4-Antikörper einem allergischen Lebewesen, das einem Allergen ausgesetzt ist, verabreicht werden, um Apoptose in Allergen-spezifischen Zellen zu induzieren, um auf diese Weise allergische Reaktionen im Lebewesen herunterzuregeln. Die Verabreichung eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal bei einem allergischen Lebewesen stimuliert, kann davon begleitet sein, das Lebewesen einer allergenen Umgebung auszusetzen oder gleichzeitig das Allergen zu verabreichen. Allergene Reaktionen können systemischer oder örtlicher Natur sein, abhängig vom Eingangsweg des Allergens und dem Ablagerungsmuster von IgE auf Mastzellen oder basophilen Zellen. Es kann daher notwendig sein, Allergen-spezifische T-Zell-Apoptose durch geeignete Injektion eines Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) stimuliert, lokal oder systemisch zu induzieren. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform einem allergischen Lebewesen ein anti-CTLA-4-Antikörper und ein Allergen gemeinsam subkutan verabreicht.
D. Virus-infizierte oder maligne T-Zellen
Die Verfahren der Induktion von T-Zell-Apoptose durch Querverknüpfung von CTLA-4 können bei jeder T-Zelle angewendet werden, die CTLA-4 an ihrer Oberfläche exprimiert. Zusätzlich zu T-Zellen, die durch Aussetzen gegenüber einem bestimmten Antigen aktiviert werden, exprimieren auch andere Formen von T-Zellen CTLA-4 an ihrer Oberfläche. Zum Beispiel Virus-infizierte T-Zellen wie etwa jene, die mit HTLV-I oder HIV infiziert sind, können CTLA-4⁺ sein (vgl. Freeman, G. J. et al. (1992) J. Immunol. 149, 3795–3801; Haffar, O. K. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11094–11098). Demzufolge können virusinfizierte CTLA-4⁺-T-Zellen durch Induktion von CTLA-4 vermittelter Apoptose in den T-Zellen eliminiert werden. Zum Beispiel können virusinfizierte CTLA-4⁺-T-Zellen, die von einem Lebewesen erhalten wurden, in vitro mit einem anti-CTLA-4-Antikörper der Erfindung zusammen mit anti-CD3-Antikörpern kultiviert werden, um Apoptose zu induzieren. Nach der Abreicherung der virusinfizierten Zellen kann die verbliebene T-Zellpopulation mit Hilfe herkömmlicher Techniken in vitro vermehrt und dem Lebewesen zurück verabreicht werden. Zusätzlich können maligne T-Zellen, die CTLA-4 an ihrer Oberfläche exprimieren, durch Induktion von Apoptose in den T-Zellen, wie hierin beschrieben, entfernt werden.
E. Antigen-spezifische clonale Deletion
Die Verfahren der Erfindung zur Induktion von T-Zell-Apoptose können im Wesentlichen auf jedes Antigen (z. B. Protein) angewendet werden, um T-Zellen, die in einem Lebewesen reaktiv für dieses Antigen sind, clonal zu deletieren. Daher kann ein Lebewesen mit dem Antigen sensibilisiert werden, Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren (d. h. CTLA-4 an der Oberfläche Antigen-spezifischer T-Zellen zu induzieren), und bei wiederholtem Kontakt mit dem Antigen wird ein Agens, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal induziert, zusammen mit dem Antigen verabreicht, um Antigen-spezifische T-Zell-Apoptose zu induzieren. Das Antigen kann in einer löslichen Form oder an einen Trägerstoff oder Hilfsstoff (z. B. eine Perle) gebunden verabreicht werden. Dieser Basisansatz hat ein weitreichendes Anwendungsgebiet als eine Begleitung von Therapien, die ein potentielles immunogenes Molekül für therapeutische Zwecke einsetzen. Zum Beispiel verwendet eine steigende Anzahl von therapeutischen Ansätzen ein proteinartiges Molekül wie etwa einen Antikörper, ein Fusionsprotein oder dergleichen zur Behandlung einer klinischen Störung. Eine Begrenzung für die therapeutische Verwendung solcher Moleküle ist dadurch gegeben, dass sie eine Immunantwort hervorrufen können, die gegen das therapeutische Molekül im behandelten Lebewesen gerichtet ist (z. B. wird die Wirksamkeit muriner monoclonaler Antikörper in menschlichen Patienten durch die Induktion einer Immunantwort gegen die Antikörper im menschlichen Patienten behindert). Das Verfahren der Erfindung zur Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Apoptose kann in diesen therapeutischen Situationen angewendet werden, um Langzeit-Verwendung des therapeutischen Moleküls im Patienten ohne Erregung einer Immunantwort zu ermöglichen. Zum Beispiel wird ein therapeutischer Antikörper (z. B. ein muriner mAb) einem Lebewesen (z. B. einem Menschen) verabreicht, der typischerweise T-Zellen aktiviert, die in dem Lebewesen spezifisch für den Antikörper sind. Um diese aktivierten T-Zellen clonal zu zerstören, wird der therapeutische Antikörper dem Lebewesen erneut, zusammen mit einem Agens verabreicht, das ein CTLA-4 assoziiertes apoptotisches Signal stimuliert, wodurch Antigen-spezifische Apoptose in den T-Zellen induziert wird. Clonale Eliminierung dieser aktivierten T-Zellen sollte dann die fortgesetzte Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers im Patienten ermöglichen.
V. Verabreichung therapeutischer Formen von CTLA-4-Liganden
Die vorstehend beschriebenen CTLA-4 bindenden Agenzien (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) werden Patienten in einer biologisch verträglichen Form verabreicht, die für die pharmazeutische Verabreichung in vivo geeignet ist, T-Zell-Apoptose zu induzieren. Mit „biologisch verträglicher Form, die zur Verabreichung in vivo geeignet ist" ist eine Form des zu verabreichenden Proteins gemeint, bei der mögliche toxische Wirkungen von den therapeutischen Wirkungen des Liganden übertroffen werden. Der Ausdruck Lebewesen soll lebende Organismen einschließen, in denen eine Immunantwort erzeugt werden kann, z. B. Säuger. Beispiele für Lebewesen umschließen Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Mäuse, Ratten und transgene Arten hiervon. Verabreichung des hierin beschriebenen Agens kann in jeder pharmakologischen Form erfolgen, einschließlich einer therapeutisch aktiven Menge des CTLA-4 bindenden Agens allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Molekül (z. B. anti-IL-2-Rezeptor-Antikörper oder CD28-, B7-1 oder B7-2 blockierender Antikörper etc., wie vorstehend beschrieben) und einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge der therapeutischen Zusammensetzungen ist als eine Menge definiert, die in notwendigen Dosierungen und Zeiträumen bewirkt, das das gewünschte Ergebnis erreicht wird. Zum Beispiel kann eine therapeutisch wirksame Menge eines anti-CTLA-4-Antikörpers aufgrund von Faktoren wie Status der Erkrankung, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und der Fähigkeit des Antikörpers, eine gewünschte Reaktion im Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierunsprotokolle können angepasst werden, um die optimale therapeutische Antwort zu bekommen. Zum Beispiel können mehrere unterteilte Dosen pro Tag verabreicht werden, oder die Dosis kann proportional reduziert werden, wie von den Notwendigkeiten der therapeutischen Situation angezeigt.
Der aktive Bestandteil (z. B. Antikörper) kann auf herkömmliche Weise wie etwa Injektion (subkutan, intravenös etc.), orale Verabreichung, Inhalation, transdermale Applikation oder rektale Applikation verabreicht werden. Abhängig von der Art der Verabreichung kann der aktive Bestandteil von einem Material ummantelt werden, um den Bestandteil vor der Aktivität von Enzymen, Säuren und anderen natürlichen Bedingungen, die den Bestandteil inaktivieren können, zu schützen.
Um ein CTLA-4 bindendes Agens auf einem anderen Weg als durch parenterale Verabreichung zu verabreichen, kann es notwendig sein, das Agens mit einem Material zu ummanteln oder zusammen zu verabreichen, das seine Inaktivierung verhindert. Ein CTLA-4 bindendes Agens kann einem Individuum in einem geeigneten Trägerstoff oder einer geeigneten Verdünnungslösung zusammen mit Enzymhemmern oder in einem geeigneten Trägerstoff, wie etwa Liposomen, verabreicht werden. Pharmazeutisch verträgliche Verdünnungslösungen umschließen Kochsalzlösung und wässrige Pufferlösungen. Enzymhemmer umschließen Pankreastrypsin-Hemmer, Diisopropylfluorophosphat (DEP) und Trasylol. Liposomen umschließen Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen ebenso wie herkömmliche Liposomen (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7, 27).
Der aktive Bestandteil kann auch parenteral oder intraperitoneal verabreicht werden. Dispersionen können auch in Glyzerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen hieraus und in Ölen zubereitet werden. Unter normalen Bedingungen von Lagerung und Verwendung können diese Präparate ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Arzneimittel, die für injizierbare Verwendung geeignet sind, umschließen sterile wässrige Lösungen (soweit wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersion direkt vor der Verwendung. In allen Fällen muss die Zusammensetzung steril sein, und sie muss in einem Ausmaß flüssig sein, dass leichte Injizierbarkeit besteht. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss vor der verunreinigenden Aktivität von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen bewahrt werden. Der Trägerstoff kann ein Lösungsmittel oder Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssigen Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische hieraus enthält. Die geeignete Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung einer Ummantelung wie etwa Lecithin, durch die Beibehaltung der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch die Verwendung von grenzflächenaktiven Stoffen erhalten werden. Verhinderung der Tätigkeit von Mikroorganismen kann mit Hilfe verschiedener antibakterieller und fungizider Agenzien, zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und dergleichen erreicht werden. In vielen Fällen wird es vorteilhaft sein, isotonische Agenzien, zum Beispiel Zucker, Polyalkohole wie etwa Mannit, Sorbit, Natriumchlorid in die Zusammensetzung einzuschließen. Verlangsamte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann erreicht werden, indem ein Agens in die Zusammensetzung eingeschlossen wird, das die Absorption verzögert, zum Beispiel Aluminium-Monostearat und Gelatine.
Sterile, injizierbare Lösungen können durch Einschluss des aktiven Bestandteils (z. B. anti-CTLA-4-Antikörper) in erforderlicher Menge in ein geeignetes Lösungsmittel mit einem oder einer Kombination aus den vorstehend aufgezählten Inhaltstoffen je nach Anforderung mit anschließender Filtersterilisation hergestellt werden. Allgemein werden Dispersionen aus dem aktiven Bestandteil, der in ein steriles, ein Basis-Dispersionsmedium enthaltendes Vehikel eingeschlossen wird, und den erforderlichen weiteren der vorstehend aufgezählten Inhaltstoffen hergestellt. In dem Fall steriler Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung, die ein Pulver des aktiven Inhaltstoffs (z. B. Antikörper) ergeben, mit jedem zusätzlich gewünschten Inhaltstoff aus einer zuvor steril gefilterten Lösung hieraus.
Wenn der aktive Bestandteil auf geeignete Art, wie vorstehend beschrieben, geschützt ist, kann der Bestandteil oral verabreicht werden, zum Beispiel mit einer inerten Verdünnungslösung oder einem assimilierbaren, essbaren Trägerstoff. Der hierin verwendete Ausdruck „pharmazeutisch verträglicher Trägerstoff" umschließt jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Ummantelungen, antibakteriellen und fungiziden Agenzien, isotonische und Absorption verzögernde Agenzien und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Soweit ein herkömmliches Medium oder Agens nicht verträglich mit dem aktiven Bestandteil ist, ist seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen eingeschlossen. Ergänzende aktive Bestandteile können ebenfalls in den Zusammensetzungen eingeschlossen sein.
Es ist besonders vorteilhaft, parenterale Zusammensetzungen in Dosierungseinheitsformen zur leichten Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. Der hierin verwendete Begriff Dosierungseinheitsform betrifft physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierung für die zu behandelnden Säugerarten geeignet sind; jede Einheit enthält eine vorbestimmte Menge an aktivem Bestandteil, der so berechnet ist, dass die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Trägerstoff erzielt wird. Die Spezifizierung der Dosierungseinheitsformen der Erfindung wird diktiert und ist direkt abhängig von (a) den einzigartigen Eigenschaften des aktiven Bestandteils und der jeweiligen zu erreichenden therapeutischen Wirkung und (b) den Begrenzungen, die sich auf dem Fachgebiet der Bildung eines solchen aktiven Bestandteils zur Behandlung der Sensitivität von Individuen ergeben.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter erläutert, die nicht als begrenzend betrachtet werden sollen. Die Inhalte aller Referenzen, Patente und offengelegter Patentanmeldungen, die in dieser Anmeldung zitiert werden, sind hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen.
BEISPIEL 1: Herstellung und Durchmusterung von monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörpern
Produktion von monoclonalen Antikörpern für menschliches CTLA-4
Weibliche Balb/c-Mäuse (bezogen von Taconic, Germantown, NY) wurden subkutan und intraperitoneal immunisiert: entweder pro Maus mit 50 μg rekombinantem menschlichem E. coli exprimiertem CTLA-4 (nur extrazelluläre Domäne), emulgiert in vollständigem Freundschen Adjuvans (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) für Mäuse der ER-Serie oder 2 × 10⁶ PMA/Ionomycin aktivierte menschliche T-Zellen (bezogen von Leukopaks) pro Maus für Mäuse der ES-Serie. Die Mäuse erhielten eine Auffrischung mit 20–25 μg menschlichem rekombinantem CTLA-4, emulgiert in unvollständigem Freundschem Adjuvans (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) pro Maus oder 10⁶ PMA/Ionomycin aktivierten menschlichen T-Zellen in 14-tägigen Intervallen nach den Anfangsimmunisierungen. Den Mäusen wurde aus der Schwanzvene Blut entnommen, und die Seren wurden mit Hilfe des ELISA-Verfahrens gegen das immunisierende Protein auf Antikörper untersucht, die reaktiv auf das Immunogen waren. Mäuse, die einen starken serologischen Titer aufwiesen, erhielten intravenös eine Auffrischung mit 50 μg rekombinantem menschlichem CTLA-4 pro Maus, verdünnt in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2 (GIBCO, Grand Island, NY). Drei bis vier Tage nach der Auffrischung wurden die Milzen dieser Mäuse in einem Verhältnis von 5 : 1 mit SP 2/0-Ag 14-Myelomzellen (ATCC, Rockville, MD) mit PEG 1450 (ATCC, Rockville, MD) fusioniert und auf Platten mit 96 Vertiefungen ausgebracht, die bestrahlte MRC-5 Fibroblastzellen (ATCC, Rockville, MD) in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (GIBCO, Grand Island, NY) mit 25% CPSR-3 (Sigma Chemical Company), 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 20 μg/ml Gentamycin, 0,25 μg/ml Fungizon und 10% NCTC-109 (GIBCO, Grand Island, NY) enthielten. Auswahl der Hybridome wurde in Anwesenheit von Hypoxanthineaminopterin-Thymidin (ATCC, Rockville. MD) durchgeführt. Während die Hybridomkolonien in den nächsten 10–21 Tagen hervorwuchsen, wurde der Überstand aus den Vertiefungen auf Flachboden-EIA-Platten mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) durchmustert, die mit rekombinantem menschlichem CTLA-4 als primäres Absuchmaterial überzogen waren. Sekundäre Durchmusterung wurde mittels Durchflusscytometrie auf mit menschlichem CTLA-4 transfizierte CHO-Zellen und mit PMA/Ionomycin aktivierte menschliche T-Zellen durchgeführt. Hybridom-Überstände, bei denen sich herausstellte, dass sie gegen CTLA-4 gerichtete Antikörper enthielten, wurden vermehrt und vor Ascitesproduktion und Reinigung der Antikörper durch Affinitätschromatographie mit Protein A-Sepharose zweimal subcloniert.
Primäre Durchmusterung von mAbs: ELISA-Protokoll
Jede Vertiefung einer Flachboden-EIA-Platte mit 96 Vertiefungen (Costar, Cambridge, MA) wurde pro Vertiefung mit 50 μl einer 1 μg/ml Lösung aus rekombinantem menschlichem CTLA-4, hergestellt in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, über Nacht bei 4°C überzogen. Die CTLA-4-Lösung wurde ausgesaugt, und die Vertiefungen wurden mit 100 μl 1% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, über 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert. Nach dieser Blockierungsinkubation wurden die Vertiefungen 3 × mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen und pro Vertiefung wurden 50 μl Hybridom-Überstand zugegeben und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Vertiefungen 3 × mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen und dann pro Vertiefung mit 50 μl einer 1 : 4000 Verdünnung aus Meerrettich-Peroxidase-konjugierten, affinitätsgereinigten, für anti-Maus-IgG der Ziege (H&L) spezifischen Antikörpern (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) über 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 3 × mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen, worauf eine 30-minütige Inkubation mit 50 μl pro Vertiefung einer Lösung aus 1 mM ABTS (2,2 Azino-bis-3-ethylbenzthiazole-6-sulfonsäure) in 0.1 M Natriumcitrat, pH-Wert 4,2 folgte, der eine 1 : 1000-Verdünnung von 30% Wasserstoffperoxid als ein Substrat für die HPR zugegeben worden war, um gebundene Antikörper nachzuweisen. Die Absorption wurde dann bei 410 nm auf einem Spektralphotometer (Molecular Devices Corp. Menlo Park, CA) gemessen.
Sekundäre Durchmusterung von mAbs: Durchflusscytometrie
Sekundäre Durchmusterung wurde mit Hilfe von Durchflusscytometrie auf mit menschlichem CTLA-4-gpi transfizierten CHO-Zellen und mit PMA/Ionomycin aktivierten menschlichen T-Zellen durchgeführt. CTLA-4 wurde durch Verbinden der extrazellulären Domäne von CTLA-4 mit einem Glycophosphatidylinosit(gpi)-Anker auf CHO- und COS-Zellen exprimiert. DNA, die die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 codiert, wurde aus einer menschlichen CTLA-4-cDNA mittels PCR amplifiziert, wobei als Sense-Primer
CATGAAGCTTCTCGAGCCGCCACCATGGCTTGCCTTGGA (SEQ ID NO: 1) verwendet wurde, der eine Hind III-Stelle, eine starke Translation-Startstelle und die ersten 15 Nucleotide der CTLA-4 codierenden Sequenz enthielt, und als Antisense-Primer
GAGAATTCTAGACTAGCTTAAGTCAGAATCTGGGCACGGT (SEQ ID NO: 2), der die letzten 19 Nucleotide der extrazellulären Domäne von CTLA-4 und eine Afl II-Stelle enthielt. PCR-Bedingungen bestanden aus 94°C, 1 min, 43°C, 1 min, 72°C, 1 min über 35 Zyklen, gefolgt von einem Zyklus mit 72°C über 10 min. Das PCR-Produkt wurde mit Hind III und Afl II gespalten, Gel-gereinigt und in einen mit Hind III und Afl II gespaltenen pCDM8-Vektor ligiert, der den gpi-Anker von menschlichem CD58 enthielt (vgl. J. Immunol. 148, 3271, freundlicherweise überlassen von Dr. Donald Staunton, Center for Blood Research, Boston, MA). Plasmide, die die CTLA-4-gpi-Insertion enthielten, wurden vorübergehend in COS-Zellen transfiziert und exprimierten stark das Zelloberflächen-CTLA-4, wie durch Bindung von B7-Ig-Fusionsprotein abgeschätzt wurde. Das CTLA-4-gpi-Plasmid wurde zusammen mit einem Plasmid, das Resistenz gegen Neomycin codierte, in CHO-Zellen transfiziert, und stabile Transfektanten wurden mit G418 ausgewählt. CHO-Zell-Transfektanten wurden auf der Basis von B7-Ig-Bindung sortiert und cloniert.
Zellen für die Durchflusscytometrie (entweder CHO-CTLA-4- oder aktivierte menschliche T-Zellen) wurden gründlich in 1% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen, dann mit 50 μl Hybridom-Überstand oder Kulturmedium pro 10⁶ Zellen über 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen 3 × mit 1% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen, dann in 50 μl einer 1 : 40-Verdünnungslösung aus Fluorescein gebundenen anti-Maus-IgG(H&L)-Antikörpern der Ziege (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) über 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann 3 × in 1% BSA in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH-Wert 7,2, gewaschen und in 1% Paraformaldehyd-Lösung fixiert. Die Zellproben wurden darauf auf einem FACScan-Durchflusscytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) analysiert.
Primäre und sekundäre Durchmusterung der monoclonalen anti-CTLA-4-Antikörper, wie vorstehend beschrieben, führte zur Isolierung von fünf mAbs zur genaueren Untersuchung: ER4.7G11 (bezeichnet als 7G11), ER5.3D8 (bezeichnet als 3D8) ER5.4D3 (bezeichnet als 4D3), ES5.3D6 (bezeichnet als 3D6) und ES5.4E3 (bezeichnet als 4E3). Die ER-Serie von Antikörpern wurde gegen rekombinantes menschliches CTLA-4 hergestellt, während die ES-Serie von Antikörpern gegen aktivierte menschlichen T-Zellen hergestellt wurde. Aus dieser Gruppe wird ER4.7G11 nicht von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, die Verweise hierauf in den nachstehenden Beispielen sollen jedoch dazu dienen, die Erfindung zu erläutern.
BEISPIEL 2: Charakterisierung von monoclonalen anti-CTLA-4 Antikörpern
Bindungsspezifität
Um die Bindungsspezifität der fünf mAbs 7G11, 4D3, 3D6, 3D8 und 4E3 zu bestimmen, wurde ihre Bindung entweder an CHO-Zellen, die transfiziert waren, CD28 zu exprimieren, oder an CHO-Zellen, die transfiziert waren, CTLA-4 zu exprimieren, mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Das Bindungsmuster der verschiedenen anti-CTLA-4-mAbs (im Vergleich zu dem Kontroll-anti-CD28-mAb 3D10) wird nachstehend in Tabelle 1 zusammengefasst:
TABLLE 1
Es stellte sich heraus, dass der 7G11-Antikörper sowohl an CHO-CD28 als auch an CHO-CTLA-4 band und daher als ein anti-CD28/CTLA-4-mAb bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu stellte sich heraus, dass die mAbs 4D3, 3D6, 3D8 und 4E3 nur an das CHO-CTLA-4 banden und daher CTLA-4-spezifische Antikörper sind. Diese Antikörper werden hierin auch als CTLA-4.1, CTLA-4.2, CTLA-4.3 bzw. CTLA-4.4 bezeichnet.
Epitopkartierung
Um die Epitope zu bestimmen, die von den fünf vorstehend beschriebenen mAbs erkannt werden, wurde Epitopkartierung mit Hilfe einer Durchmusterung einer Phagen-Display Bibliothek (PDL) durchgeführt und unter Verwendung synthetischer Peptide bestätigt. Eine PDL mit 20 zufälligen Aminosäuren wurde durch Clonierung eines degenerierten Oligonucleotids in den fUSE5-Vektor hergestellt (Scott, J. K. und Smith, G. P. (1990) Science 249, 386–390), wie von Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378–6382 beschrieben. Die PDL wurde verwendet, um kurze Peptide mittels eines Mikropanning-Verfahrens, beschrieben von Jellis, C. L. et al. (1993) Gene 137, 63–68, zu identifizieren, die spezifisch die mAbs anti-CD28/CTLA-4 und anti-CTLA-4.1–CTLA-4.4 banden. Individuelle Phagenclone wurden auf Grund ihrer Affinität zu immobilisiertem mAb aus der Bibliothek gereinigt, und das Zufallspeptid wurde durch DNA-Sequenzierung ermittelt.
Sequenzanalyse von 20 Clonen, die durch das Panning-Verfahren mit anti-CD28/CTLA-4 (7G11) ausgewählt worden waren, enthielten die neun einzigartigen nachstehend dargestellten Peptidsequenzen.
Von mAb 7G11 ausgewählte Phagenpeptide
Aus diesen neun Peptiden wurde eine Consensus-Bindungssequenz aus fünf Resten P-P-Y-Y-L/I (SEQ ID NO: 12) identifiziert, innerhalb derer Y häufig durch die aromatischen Reste F und W ersetzt war. Die Sequenz P-P-Y-Y-L (SEQ ID NO: 13) wurde innerhalb der extrazellulären Domäne von hCTLA-4 identifiziert, innerhalb oder sehr dicht an der CDR3-Domäne, von der ein Abschnitt in dem synthetischen CTLA-4-Peptid RP 454 enthalten ist:
RP 454: KVELMYP[PPYYL]GIGNGTGG (SEQ ID NO: 14)
Das Peptid RP454 wurde verwendet, um das Epitop von anti-CD28/CTLA-4 zu bestätigen und könnte mit natürlichem hCTLA-4 um Bindung von anti-CD28/CTLA-4 konkurrieren. Die Sequenzidentität von CD28 und CTLA-4 innerhalb der kartierten Region erklärt die beobachtete Kreuzreaktivität mit diesem mAb auf CHO-CD28 und CHO-CTLA-4.
Die mAbs CTLA-4.1–CTLA-4.4 wurden getrennt dem Panning-Verfahren unterworfen, und es wurde entdeckt, dass Phagen jeder dieser individuellen Panning-Verfahren spezifisch auf jeden der vier mAbs reagieren würde. DNA-Sequenzanalyse von 42 Phagenclonen ergab die 14 nachstehend dargestellten Peptide:
Von mAbs 4D3, 3D6, 3D8 und 4E3 ausgewählte Phagenpeptide
Aus diesen Peptiden wurde das gemeinsame Epitop auf einen Strang von sechs Resten auf hCTLA-4 kartiert, der die Aminosäuresequenz L-T-F-L-D-D (SEQ ID NO: 29) aufweist. Dieses Epitop ist in der CDR2-ähnlichen Region von CTLA-4 gelegen und unterscheidet sich von der Region P-P-Y-Y-L (SEQ ID NO: 13), die vorstehend als das Epitop für den anti-CD28/CTLA-4-mAb beschrieben wurde. Das gemeinsame anti-CTLA-4.1–CTLA-4.4-Epitop ist in dem synthetischen CTLA-4-Peptid RP 365 enthalten:
RP 365: AATYMMGNE[LTFLDD]SIC (SEQ ID NO: 30),
das zur Bestätigung der Ergebnisse der Epitopkartierung verwendet wurde.
Kreuz-Kompetition mit B7-1 und B7-2
Da die fünf anti-CTLA-4-mAbs an zwei verschiedene antigene Regionen des CTLA-4-Moleküls binden, wurde untersucht, ob eine dieser Regionen Teil der Bindungsstelle für Mitglieder dieser Familie war. Die monoclonalen Antikörper 7G11 und 4D3 wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Bindung von B7-1-Ig an CTLA-4-Ig zu blockieren (durchgeführt, wie von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721–730; und Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med 174, 561–569 beschrieben), wobei die nachstehenden experimentellen Rahmen verwendet wurden:
Eine Nunc-Maxisorp-Platte wurde über Nacht bei Zimmertemperatur mit einer Lösung aus 20 μg/ml CTLA-4-Ig in PBS überzogen, dann für 1 Stunde mit PBS/1% BSA blockiert. 10 μg/ml biotinyliertes B7-1-Ig wurde mit steigenden Mengen monoclonaler Antikörper zugegeben, bis zu 100 μg/ml. Kontrollreagenzien („kaltes" B7-1-Ig, CTLA-4-Ig, anti-B7-1-Antikörper 4B2 und 6B10 und anti-HIV-Antikörper 59.1) wurden ebenfalls untersucht. Das biotinylierte B7-1-Ig wurde mit Hilfe von Strepavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) und enzymatischem Substrat sichtbar gemacht. Die Ergebnisse, nachstehend zusammengefasst, zeigen, dass 7G11 und 4D3 unwirksame Kompetitorsubstanzen waren:
TABELLE 2: Standard-Kurve für die Bindung von biotinyliertem B7-1-Ig an CTLA-4-Ig
TABELLE 3: Wirkung von verschiedenen Kompetitorsubstanzen auf die Bindung von 10 μg/ml biotinyliertem B7-1-Ig an immobilisiertes CTLA-4-Ig
Im zweiten Experiment wurde das Format „umgekehrt". Die Platte wurde über Nacht mit 20 μg/ml B7-1-Ig in PBS überzogen, mit PBS/1% BSA blockiert, dann mit biotinyliertem CTLA-4-Ig und verschiedenen Kompetitor- und Kontrollsubstanzen inkubiert, wie für das erste Experiment beschrieben. Das biotinylierte CTLA-4-Ig wurde mit Hilfe von Strepavidin:HRP und enzymatischem Substrat sichtbar gemacht. Die Ergebnisse waren jenen vorstehend gezeigten ähnlich.
TABELLE 5: Wirkung verschiedener Kompetitorsubstanzen auf die Bindung von biotinyliertem CTLA-4-Ig an immobilisiertes B7-1-Ig
Zusammengenommen zeigen diese komplementären Datensätze an, dass die mAbs 7G11 und 4D3 nicht das Vermögen haben, die Bindung von CTLA-4-Ig an B7-1-Ig aufzubrechen. Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten beobachtet, in denen B7-2-Ig verwendet wurde. Das Ergebnis, dass der anti-CD28/CTLA-4-Antikörper (7G11) die Bindung von B7-1-Ig an CTLA-4 (oder anders herum) nicht verhinderte, war überraschend, da zuvor vorgeschlagen worden war, dass die Sequenz M-Y-P-P-P-Y (SEQ ID NO: 31), die sich mit dem für den 7G11-Antikörper kartierten P-P-Y-Y-L(SEQ ID NO: 13)-Epitop überschneidet, Teil der Bindungsstelle sowohl von CD28 als auch von CTLA-4 an B7-1 war (vgl. Harper, K, et al, (1991) J. Immunol, 147: 1037–1044).
BEISPIEL 3: Induktion von Apoptose in T-Zellen durch anti-CTLA-4-Antikörper
In diesem Beispiel wurde Apoptose in zuvor aktivierten T-Zellen durch Bindung von CTLA-4 an der T-Zelloberfläche unter Verwendung eines anti-CTLA-4-mAb induziert. In den ersten Serien der Experimente wurde ein alloreaktiver T-Zell-Clon verwendet. Alloreaktive T-Zell-Clone mit Spezifität für HLA-DR7 wurden aus HLA-DR7-negativen Individuen hergestellt. T-Zell-Clone wurden durch Kultur über 24 h mit einer bestrahlten, homozygoten lymphoblastoiden DR7⁺-Zelllinie (LBL-DR7) aktiviert, die innerhalb von 24 h CTLA-4-Expression an der Oberfläche induziert. Die T-Zellen wurden mit einer Konzentration von 10⁵ Zellen/Vertiefung in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen bei 37°C, 5% CO₂ kultiviert. Aktivierte T-Zell-Clone wurden allein oder zusammen mit anti-CD28- oder anti-CTLA-4-mAbs mit NIH-3T3-Zellen wiederholt herausgefordert, die mit menschlichem DRα und DR7β transfiziert waren (t-DR7; beschrieben von Gimmi, C. D. et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6586–6590), um ein zweites Signal hervorzurufen. Einlagerung von Thymidin als ein Index für mitotische Aktivität wurde durch Standardverfahren untersucht. IL-2- und IL-4-Konzentrationen in Kulturüberständen wurden durch Standard-ELISA-Verfahren untersucht. Apoptose wurde durch die Anwesenheit von DNA-Fragmentierung auf Agarosegel-Elektrophorese untersucht, wie von Quingsheng, T. et al. (1991) Cell 67, 629–639 beschrieben. Kurz beschrieben wurde DNA aus Zellen extrahiert, und die Proben wurden auf ein 1% Agarosegel geladen, das 0,5 μg/ml Ethidiumbromid enthielt. Nach der Elektrophorese wurde die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht und auf die Anwesenheit von Fragmenten mit Nucleosomaler Länge, die kennzeichnend für Apoptose ist, untersucht. Zusätzlich wurde die Apoptose durch Aufnahmen von 33342-Farbstoff von Hoechst untersucht, wie von Hardin, J. A. (1992) J. Immunol. Methods 154, 99–107 beschrieben.
Die Ergebnisse werden grafisch in 1A dargestellt. Aktivierte T-Zell-Clone proliferierten als Antwort auf Herausforderung mit t-DR7 ohne nachweisbare Akkumulation von IL-2. Die Zugabe von anti-CD28- oder anti-CD28/CTLA-4-mAb (z. B. 7G11) führte zu signifikanter Proliferation und IL-2-Akkumulation. Im Gegensatz dazu stimulierte die Zugabe von anti-CTLA-4.1-mAb zur mit t-DR7 stimulierten T-Zellkultur die Proliferation nicht, sondern führte statt dessen zu einer signifikant erniedrigten Proliferation, keiner nachweisbaren IL-2-Akkumulation und induzierte Apoptose, wie durch DNA-Fragmentierung gemessen wurde. Die Zugabe von exogenem IL-2 zu der mit t-DR7 und CTLA-4.1-mAb stimulierten T-Zellkultur führte zu signifikanter T-Zell-Proliferation, die mit jener vergleichbar war, die bei der Zugabe von IL-2 allein zu t-DR7 beobachtet worden war, und verhinderte die Induktion von Apoptose durch t-DR7 und anti-CTLA-4-mAb. Nach der CTLA-4-Bindung mit CTLA-4.1 wurde nicht beobachtet, dass aktivierte T-Zell-Clone in Anwesenheit von exogenem IL-2 proliferierten, was mit der Schlussfolgerung übereinstimmt, dass diese Zellen Antigen-spezifische clonale Deletion durchliefen.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob CTLA-4-Bindung gleichfalls Apoptose in zuvor aktivierten, normalen menschlichen T-Zellen induzieren konnte. CD4-positive T-Zellblasten wurden durch negative Abreicherung nach einer Kultur von PBMC über vier Tage in Medien, die Phytohämagglutinin (PHA) enthielten, um die T-Zellen zu aktivieren, isoliert. Die Zellen wurden ausführlich gewaschen und dann erneut in Anwesenheit verschiedener zweiter Signale mit anti-CD3-mAB herausgefordert.
Die Ergebnisse werden grafisch in 1B dargestellt. Anti-CTLA-4-mAb hatte ohne anti-CD3-Behandlung keine Auswirkung auf T-Zell-Proliferation oder IL-2-Produktion. Anti-CD3 allein induzierte eine geringe Proliferation von PHA-Blasten, begleitet von niedrigen Spiegeln an IL-2-Akkumulation. Die Zugabe von anti-CD28 oder anti-CD28/CTLA-4(z. B. 7G11)-mAbs verstärkte sowohl die Proliferation als auch IL-2-Akkumulation. Ähnlich wie die vorstehend beschriebenen Ergebnisse für den HLA-DR7-spezifischen, alloreaktiven T-Zell-Clon führte anti-CD3-Stimulierung von aktivierten, normalen T-Zellen des peripheren Blutes in Anwesenheit von jedem anti-CTLA-4-mAb (z. B. CTLA-4.1–CTLA-4.4) zu verminderter Proliferation, Abwesenheit von IL-2-Akkumulation und zu Apoptose. Apoptose war schon nach nur 6 h Kultur nachweisbar. Querverknüpfung von CTLA-4 war notwendig, denn anti-CTLA-4.1-Fab hatte keine Wirkung. Wie bei den aktiven Zellclonen beobachtet wurde, schützte die Zugabe von exogenem IL-2 zu anti-CTLA-4.1-mAb vor Apoptose. In ähnlicher Weise schützte auch die Zugabe von anti-CD28 gegen Apoptose. Die Apoptose schien nicht nur ein Ergebnis des Verlustes der Produktion von IL-2 zu sein, denn CD4⁺-PHA-Blasten, die in Medien allein über Zeiträume bis zu 24 Stunden kultiviert wurden, durchliefen keine Apoptose. Die Spezifität der CTLA-4-Querverknüpfung wurde durch den Befund gezeigt, dass anti-CD45-, anti-CD45RA-, anti-CD45RO-, anti-CD4-, anti-CD5- oder anti-CD6-mAb-Querverknüpfung unter identischen Kulturbedingungen in keinem einzigen der 5 durchgeführten Experimente verringerte Proliferation oder Apoptose induzierten. Ähnliche Ausmaße an Apoptose wurden auch bei isolierten nicht fraktionierten T-Zellen, CD28-positiven und CD8-positiven PHA-Blasten beobachtet, die unter identischen Kulturbedingungen untersucht wurden.
BEISPIEL 4: Induktion von Apoptose in T-Zellen durch einen neuartigen CTLA-4-Liganden
Wie in Beispiel 2 beschrieben, induziert die Bindung von CTLA-4 mit einem anti-CTLA-4-Antikörper in Anwesenheit eines primären Aktivierungssignals Apoptose bei zuvor aktivierten, normalen T-Zellen und alloreaktiven T-Zell-Clonen. Als nächstes wurde untersucht, ob einer der bekannten CTLA-4-Liganden B7-1 oder B7-2 diese Funktion ebenfalls vermitteln könnte. Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen identischen Systems zur Aktivierung von T-Zellen wurden aktivierte alloreaktive T-Zell-Clone erneut mit COS-Zellen herausgefordert, die in der Weise transfiziert waren, dass sie HLA-DR7 allein (t-DR7) exprimierten, oder mit COS-Zellen, die in der Weise transfiziert waren, dass sie sowohl HLA-DR7 und entweder B7-1 (tDR7/B7-1) oder B7-2 (tDR7/B7-2) zusammen exprimierten, um Signal 2 auszulösen. Zum Schein transfizierte Kontrollzellen (t-mock) wurden nur mit dem pCDNAI-Plasmid transfiziert. Die Ergebnisse werden grafisch in 2A dargestellt. Wie zuvor beobachtet, wurde bei Kultur von aktivierten T-Zell-Clonen mit t-DR7 in Anwesenheit von anti-CTLA-4.1 Proliferation unterdrückt und Apoptose induziert. Im Gegensatz dazu induzierten sowohl t-DR7/B7-1 als auch t-DR7/B7-2 vermehrte Proliferation und induzierten keine Apoptose. Zugabe von anti-CD28-Fab blockierte die vermehrte Proliferation, die sowohl von B7-1 als auch von B7-2 induziert wurde (d. h. das Ausmaß der Proliferation war im Vergleich zu dem bei t-DR7 allein beobachteten reduziert), wodurch gezeigt wird, dass das von B7-1 oder B7-2 gelieferte proliferative Signal tatsächlich über CD28 vermittelt wurde. Darüber hinaus gab es, im Vergleich zu t-DR7 allein, unter diesen Umständen, unter denen B7-1 oder B7-2 in Abwesenheit von CD28 vermittelter Signalgebung an CTLA-4 bindet, weder eine verminderte Proliferation noch Apoptose. Identische Ergebnisse wurden mit PHA-aktivierten, normalen menschlichen T-Zellen beobachtet. Aus diesen Experimenten kann geschlossen werden, dass keiner der molekular clonierten, natürlichen CTLA-4-Liganden (z. B. B7-1 oder B7-2) Antigen-spezifische clonale Deletion von T-Zellen vermittelt.
Unter Berücksichtigung, dass die beiden molekular clonierten natürlichen CTLA-4-Liganden die Antigen-spezifische clonale Deletion nicht vermittelten, wurde als Nächstes untersucht, ob ein alternativer CTLA-4-Ligand Apoptose vermittelt. Aktivierte alloreaktive T-Zell-Clone wurden mit LBL-DR7 allein oder in Anwesenheit verschiedener mAbs und Ig-Fusionsproteine wiederholt herausgefordert, wie in 2B gezeigt, die die Ergebnisse des Experimentes darstellt. Alle mAbs wurden der Kultur in einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben. Blockierende mAbs, die gegen B7-1, B7-2 und B7-3 gerichtet waren (BB1-mAb), unterdrückten individuell von LBL-DR7 induzierte Proliferation um 25%. Zugabe von CTLA-4-Ig, nicht aber von Kontroll-Ig, unterdrückte die Proliferation um 50% und blockierte die IL-2-Produktion vollständig. Die resultierende Proliferation war mit jener vergleichbar, die mit t-DR7 allein beobachtet wurde. Die kombinierte Zugabe von anti-B7-1- und B7-2-mAbs jedoch unterdrückte die Proliferation bemerkenswert stark und, noch wichtiger, die T-Zellen durchliefen Apoptose. Weitere Zugabe von BB1-mAb oder Kontroll-Ig zu anti-B7-1- und anti-B7-2-mAbs hatte weder auf Proliferation noch auf Apoptose zusätzliche Auswirkungen. Im Gegensatz dazu blockierte die Zugabe von entweder CTLA-4-Ig oder CTLA-4.1-Fab zu anti-B7-1- und anti-B7-2-mAbs die Apoptose vollständig und ließ das Ausmaß der Proliferation auf jenes zurückkehren, das mit t-DR7 allein beobachtet worden war. Diese Daten zeigen, dass der auf LBL-DR7 exprimierte Ligand, der Apoptose induziert, weder B7-1 noch B7-2 ist, sondern dass es ein CTLA-4 bindender Ligand ist, der das Signal durch CTLA-4 sendet. Die Apoptose war Antigen-spezifisch, denn LBL-DR1-Zellen verminderten unter identischen Kulturbedingungen die Proliferation nicht oder induzierten keine Apoptose. Ähnlich wie bei zuvor gemachten, in Beispiel 4 beschriebenen Beobachtungen, unterbrach die Zugabe von IL-2 zu anti-B7-1 und anti-B7-2 die Unterdrückung von Proliferation und Apoptose. Wiederum wurden identische Beobachtungen mit PHA-Blasten gemacht.
Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse, dass der physiologische Ligand für CTLA-4, der Antigen-spezifische T-Zell-Apoptose vermittelt, folgende Eigenschaften hat: 1) von LBL-DR7-Zellen exprimiert wird, 2) weder B7-1 noch B7-2 ist, denn Blockierung von B7-1 und B7-2 verhinderte Apoptose nicht, 3) ein CTLA-4 bindender Ligand ist, denn CTLA-4-Ig blockierte Apoptose und 4) das Signal durch CTLA-4 vermittelt, denn anti-CTLA-4.1 blockiert Apoptose ebenfalls. Darüber hinaus scheint das funktionelle Epitop auf diesem natürlichen Liganden an das identische CTLA-4-Epitop (L-T-F-L-D-D; SEQ ID NO: 29) zu binden, das von allen vier hierin beschriebenen anti-CTLA-4-mAbs erkannt wird, da CTLA-4.1-Fab Apoptose blockieren konnte. Diese Ergebnisse stimmen mit der Hypothese überein, dass CTLA-4 kein redundanter, CD28 ähnlicher costimulatorischer Stoffwechselweg ist, sondern ein eigenständiger Weg der Signalgebung, der in der Lage ist, unter geeigneten Bedingungen zuvor aktivierte T-Zellen clonal zu deletieren, und darüber hinaus, dass ein neuartiger natürlicher CTLA-4-Ligand, der auf LBL-DR7 vorkommt, diese Apoptose vermitteln kann.
Während einer laufenden Immunantwort besteht eine Balance zwischen Signalen, die Aktivierung/Erweiterung, und jenen, die nachfolgend Antigen-spezifische zelluläre Deletion induzieren. Die Querverknüpfung entweder von CD28 oder der gemeinsamen Bindungsregion von CD28/CTLA-4 durch mAbs oder deren natürliche Liganden B7-1 oder B7-2 liefert ein solches positives costimulatorisches Signal, das zur Akkumulation von IL-2 führt. Die hierin beschriebenen Ergebnisse legen nahe, dass Signale, die IL-2-Akkumulation induzieren, dominant sind, denn sie erweitern die Immunantwort und schützen dadurch die laufende Immunantwort vor CTLA-4 vermittelter Apoptose. Da B7-1 und B7-2 Liganden sowohl für CD28 als auch für CTLA-4 sind, sollten sie in den meisten Fällen ein Signal zur Vermehrung statt zur Verminderung von Zellen vermitteln. Während dieses Zeitraums vermittelt die Querverknüpfung von CTLA-4 keine Apoptose, kann aber im Gegensatz dazu ein synergistisches costimulatorisches Signal für CD28 liefern. Nach der T-Zell-Aktivierung senkt die CD28-Einbeziehung durch B7-1 die CD28-Synthese und -Funktion (Linsley, P. S. et al. (1993) J. Immunol. 150, 3161–3169), während die CTLA-4-Expression ansteigt. Unter Bedingungen, unter denen die proliferative Antwort schwächer wird, kann dann die Querverknüpfung von CTLA-4 in Abwesenheit von CD28 vermittelter Costimulation zelluläre Deletion der zuvor aktivierten Zellen induzieren. Diese funktionale Kapazität, abhängig von dem Aktivierungsstatus der T-Zelle, entweder zu costimulieren oder Apoptose zu induzieren, erinnert an das funktionelle Repertoire von Mitgliedern der TNF-Familie von Rezeptoren (vgl. Smith et. al. (1994) Cell 76, 959–962). CTLA-4-Querverknüpfung vermittelt jedoch, anders als bei der von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie induzierten Apoptose, Antigen-spezifische clonale Deletion, da es auch ein Signal durch den TCR benötigt.
Beispiel 5: Clonierung eines CTLA-4-Liganden, der Apoptose in aktivierten T-Zellen induziert
Der natürliche CTLA-4-Ligand, der Apoptose in T-Zellen vermittelt, wird molekular durch Expressionsclonierung, basierend auf seiner Wechselwirkung mit CTLA-4, isoliert. Wie in Beispiel 5 gezeigt, wird der natürliche CTLA-4-Ligand an der Oberfläche einer B-Lymphoblastoid-Zelllinie (LBL) exprimiert. Solche LBL-Zelllinien sind auf dem Fachgebiet bekannt und können mit Hilfe von Standardverfahren hergestellt werden, die für Transformation von B-Lymphomzellen das Epstein-Barr-Virus verwenden. Um den natürlichen CTLA-4-Liganden, der Apoptose in T-Zellen vermittelt, zu isolieren, wird eine cDNA-Expressionsbibliothek aus einer solchen LBL-Zelllinie wie folgt hergestellt:
A. Konstruktion einer cDNA-Expressionsbibliothek
Eine cDNA-Bibliothek wird in einem eukaryontischen Expressionsvektor wie etwa dem pCDM8-Vektor (Seed, (1987) Nature 329, 840) unter Verwendung von Poly(A)⁺-RNA hergestellt, die aus der LBL-Zelllinie, wie beschrieben, isoliert wird (Aruffo et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365). Um die Gesamt-RNA zu gewinnen, werden die LBL-Zellen aus der Kultur geerntet, und das Zellpellet wird in einer Lösung aus 4 M Guanidinthiocyanat, 0,5% Sarkosyl, 25 mM EDTA, pH-Wert 7,5, 0,13% Sigma-Anti-foam A und 0,7% Mercaptoethanol homogenisiert. RNA wird aus dem Homogenisat durch Zentrifugation über 24 Stunden bei 32.000 UpM durch eine Lösung aus 5.7 M CsCl, 10 mM EDTA, 25 mM Na-Acetat, pH-Wert 7, gereinigt. Das RNA-Pellet wird in 5% Sarkosyl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, gelöst und mit zwei Volumina aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert. RNA wird zweimal mit Ethanol ausgefällt. Poly(A)⁺-RNA, die zur Herstellung der cDNA-Bibliothek verwendet wird, wird durch zwei Zyklen von oligo-(dT)-Cellulose-Selektion gereinigt.
Komplementäre DNA wird aus 5,5 μg poly(A)⁺-RNA bei 37°C über 1 h in einem Reaktionsgemisch synthetisiert, das 50 mM Tris, pH-Wert 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM Dithiothreit, 500 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50 μg/ml oligo(dT)12-18, 180 Einheiten/ml RNasin und 10.000 Einheiten/ml reverse Moloney-MLV-Transkriptase in einem Gesamtvolumen von 55 μl enthält. Nach der reversen Transkription wird die cDNA durch Einstellung der Lösung auf 25 mM Tris, pH-Wert 8,3, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, je 250 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 5 mM Dithiothreit, 250 Einheiten/ml DNA-Polymerase I, 8,5 Einheiten/ml Ribonuclease H und Inkubation bei 16°C über 2 h in doppelsträngige DNA umgewandelt. EDTA wird zu 18 mM zugegeben, und die Lösung wird mit einem gleichen Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert. DNA wird mit zwei Volumen Ethanol in Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumacetat und mit 4 Microgramm linearem Polyacrylamid als Trägerstoff ausgefällt. Zusätzlich wird cDNA aus 4 μg poly(A)⁺-RNA in einem Reaktionsgemisch bei 42°C über 0,67 h synthetisiert, das 50 mM Tris, pH-Wert 8,8, 50 μg/ml oligo(dT)12-18, 327 Einheiten/ml RNasin und 952 Einheiten/ml reverse AMV-Transkriptase in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthält. Nach der reversen Transkription wird die reverse Transkriptase durch Erhitzen auf 70°C über 10 min inaktiviert. Die cDNA wird durch Zugabe von 320 μl H₂O und 80 μl einer Lösung aus 0,1 M Tris, pH-Wert 7,5, 25 mM MgCl₂, 0.5 M KCl, 250 μg/ml Rinderserumalbumin und 50 mM Dithiothreit und Einstellung der Lösung auf je 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 50 Einheiten/ml DNA-Polymerase I, 8 Einheiten/ml Ribonuclease H und Inkubation bei 16°C über 2 Stunden in doppelsträngige DNA umgewandelt. EDTA wird zu 18 mM zugegeben, und die Lösung wird mit einem gleichen Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert. DNA wird mit zwei Volumina Ethanol in Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumacetat und mit 4 Microgramm linearem Polyacrylamid als Trägerstoff ausgefällt.
Die DNA aus 4 μg reverser AMV-Transkription und 2.0 μg reverser Moloney-MLV-Transkription werden kombiniert. Nicht selbstkomplementäre BstXI-Adaptoren werden der DNA wie folgt zugegeben: Die doppelsträngige cDNA aus 6 μg poly(A)⁺-RNA wird mit 3,6 μg eines Kinase behandelten Oligonucleotids mit der Sequenz CTTTAGAGCACA (SEQ ID NO: 31) und 2,4 μg eines Kinase behandelten Oligonucleotids mit der Sequenz CTCTAAAG (SEQ ID NO: 32) in einer Lösung bei 15°C über 16 Stunden inkubiert, die 6 mM Tris, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl₂, 5 mM NaCl, 350 μg/ml Rinderserumalbumin, 7 mM Mercaptoethanol, 0.1 mM ATP, 2 mM Dithiothreit, 1 mM Spermidin und 600 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 0,45 ml enthält. EDTA wird zu 34 mM zugegeben, und die Lösung wird mit einem gleichen Volumen aus 50% Phenol, 49% Chloroform, 1% Isoamylalkohol extrahiert. Die DNA wird mit zwei Volumina Ethanol in Anwesenheit von 2,5 M Ammoniumacetat ausgefällt.
DNA, die länger als 600 Bp ist, wird wie folgt ausgewählt: die mit Adaptoren versehene DNA wird in 10 mM Tris, pH-Wert 8, 1 mM EDTA, 600 mM NaCl, 0.1% Sarkosyl wieder gelöst und auf einer Sepharose-CL-4B-Säule in der gleichen Pufferlösung chromatographiert. DNA aus dem Leervolumen der Säule (das DNA enthält, die größer als 600 Bp ist) wird zusammengegeben und mit Ethanol ausgefällt.
Der pCDM8-Vektor für cDNA-Clonierung wird durch Spaltung mit BstXI und Reinigung auf einem Agarosegel hergestellt. Die mit Adaptoren versehene cDNA aus 6 μg poly(A)⁺-RNA wird an 2, 25 μg mit BstXI gespaltenem pCDM8 in einer Lösung, die 6 mM Tris, pH-Wert 7,5, 6 mM MgCl₂, 5 mM NaCl, 350 μg/ml Rinderserum, 7 mM Mercaptoethanol, 0,1 mM ATP, 2 mM Dithiothreit, 1 mM Spermidin und 600 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 1.5 ml enthält, bei 15°C über 24 h ligiert. Das Reaktionsgemisch aus der Ligation wird dann mit Standardverfahren in kompetente E. coli DH10B/P3 transformiert.
Plasmid-DNA wird aus einer 500 ml-Kultur der ursprünglichen Transformation der cDNA-Bibliothek hergestellt. Plasmid-DNA wird durch das alkalische Lyse-Verfahren gereinigt, gefolgt von zweifacher Bindung in CsCl-Gleichgewichtsgradienten (Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laborarory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1987)).
B. Clonierungsverfahren
Im Clonierungsverfahren wird die cDNA-Expressionsbibliothek in eine eukaryontische Zelllinie wie etwa COS-Zellen eingebracht, und die Zellen werden mit CTLA-4-Protein (z. B. einem CTLA-4-Ig-Fusionsprotein) durchmustert, um Transfektanten zu identifizieren, die einen CTLA-4-Liganden an ihrer Oberfläche exprimieren. Weil die cDNA-Bibliothek zusätzlich zu cDNA, die den Apoptose induzierenden CTLA-4-Liganden codiert, vermutlich auch „verunreinigende" B7-1- und B7-2-cDNA enthält, umschließen die zweite und dritte Runde der Durchmusterung der Bibliothek eine Vorbehandlung mit anti-B7-1- und anti-B7-2-Antikörpern, gefolgt von einer Abreicherung mit Hilfe immunmagnetischer Perlen unter Verwendung von anti-Maus-Ig gebundenen magnetischen Perlen, um Clone, die diese Proteine exprimieren, zu entfernen. In der ersten Runde der Durchmusterung werden 30 100 mm-Schalen mit 50% konfluenten COS-Zellen mit 0,05 μg/ml DNA der LBL-Zelllinien-Bibliothek unter Verwendung des DEAE-Dextran-Verfahrens (Seed, B. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,3365) transfiziert. Die Zellen werden trypsinisiert und nach 24 Stunden erneut plattiert. Nach 47 Stunden werden die Zellen durch Inkubation in PBS/0,5 mM EDTA, pH-Wert 7,4/0,02% Na-Azid bei 37°C über 30 min abgelöst.
Die abgelösten Zellen werden mit 10 μg/ml CTLA-4-Ig behandelt (rekombinantes CTLA-4-menschliches Ig-Fusionsprotein wird von Linsley, P. S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 561–569 und Gimmi, C. D. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6586–6590 beschrieben). Die Zellen werden mit dem Fusionsprotein über 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen werden gewaschen und in Panningschalen verteilt, die mit affinitätsgereinigten anti-menschlichem IgG-Antikörper der Ziege ausgekleidet sind und können sich bei Zimmertemperatur anheften. Nach 3 Stunden werden die Platten sanft zweimal mit PBS/0,5 mM EDTA, pH-Wert 7,4/0,02% Na-Azid, 5% FCS und einmal mit 0,15 M NaCl, 0,01 M Hepes, pH-Wert 7,4, 5% FCS gewaschen. Ungebundene Zellen werden auf diese Weise entfernt, und episomale DNA wird von den anhaftenden Zellen des Panning-Verfahrens (z. B. Zellen, die an CTLA-4-Ig binden) mit Hilfe herkömmlicher Verfahren gewonnen.
Episomale DNA wird in E. coli DH10B/P3 transformiert. Die Plasmid-DNA wird in COS-Zellen via Sphäroblastfusion, wie beschrieben, zurückgeführt (Seed, B. et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365) und der Zyklus von Expression und Panning wird zweimal wiederholt. In den zweiten und dritten Runden der Auslese werden nach 47 Stunden die abgelösten COS-Zellen zuerst mit 10 μg/ml murinem anti-B7-1-mAb (z. B. mAb 133, beschreiben von Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260–3267, mAb L307, käuflich zu erwerben bei Becton Dickinson und/oder B1.1 von Repligen Corp.) und anti-B7-2-mAb (z. B. mAb B-70, beschrieben von Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76–79, käuflich zu erwerben bei Pharmingen) über 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Zellen, die B7-1 oder B7-2 exprimieren, werden unter Verwendung von anti-Maus-IgG und IgM überzogenen magnetischen Perlen entfernt. COS-Zellen werden dann mit 10 μg/ml menschlichem CTLA-4-Ig (hCTLA-4-Ig) behandelt. Zellen, die einen neuartigen CTLA-4-Liganden exprimieren, werden durch Panning in Schalen, die mit anti-Mensch-IgG-Antikörper der Ziege überzogen sind, ausgewählt. Nach der dritten Runde der Durchmusterung wird von den einzelnen Kolonien Plasmid-DNA hergestellt und in COS-Zellen mit Hilfe des DEAE-Dextran-Verfahrens transfiziert. Die Expression des CTLA-4-Liganden auf transfizierten COS-Zellen wird durch indirekte Immunfluoreszenz mit CTLA-4-Ig analysiert.
In einem alternativen Ansatz werden die Clone auf Grund ihrer Bindung an den BB1-Antikörper ausgewählt. Ein Kandidat für den neuartigen CTLA-4-Liganden ist B7-3, das durch die Bindung des BB1-mAb definiert ist (Boussiotis, V. A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11059–11063). Obwohl der BB1-mAb unfähig war, CTLA-4 vermittelte Apoptose zu blockieren (vgl. Beispiel 5), ist es möglich, dass B7-3 der CTLA-4-Ligand ist, der Apoptose vermittelt, dass aber der BB1-mAb für diese Funktion kein blockierender Antikörper ist. Demzufolge kann eine cDNA-Expressionsbibliothek, wie vorstehend beschrieben, auf Clone durchmustert werden, die an den BB1-mAb binden (der BB1-mAb wird von Yokochi, T. et al. (1982) J. Immunol. 128, 823–827 beschrieben). Die Clone werden durch Panning auf Platten isoliert, die mit sekundärem anti-Maus-IgM-Antikörper der Ziege überzogen sind. Die LBL-cDNA-Bibliothek kann verwendet werden, oder es kann alternativ eine Bibliothek aus aktivierten menschlichen Keratinocyten, von denen man weiß, dass sie das BB1-Antigen exprimieren, hergestellt und, wie vorstehend beschrieben, durchmustert werden.
Die Fähigkeit eines CTLA-4-Liganden, der, wie vorstehend beschrieben, durch Expressionsclonierung isoliert wurde, Antigen-spezifische Apoptose in aktivierten T-Zellen zu induzieren, kann mit Hilfe des in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Systems untersucht werden. Zum Beispiel kann eine cDNA aus der Durchmusterung der Bibliothek in CHO-Zellen eingeführt werden, um CHO-Transfektanten zu erzeugen, die den CTLA-4-Liganden auf ihrer Oberfläche exprimieren (CHO-CTLA-4-L). Um Apoptose in normalen menschlichen T-Zellen zu untersuchen, werden PHA aktivierte CD4⁺ T-Zellblasten mit anti-CD3 und CHO-CTLA-4-L kultiviert, und DNA-Fragmentierung wird als ein Maß für Apoptose bestimmt. Um Antigen-spezifische Apoptose in alloreaktiven T-Zellen zu untersuchen, wird ein zuvor aktivierter HLA-DR7-spezifischer T-Zell-Clon mit CHO-Zellen kultiviert, die transfiziert sind, um sowohl HLA-DR7 als auch den CTLA-4-Liganden (CHO-DR7/CTLA-4-L) zu exprimieren, und DNA-Fragmentierung und Herunterregelung von T-Zell-Proliferation werden als ein Maß für Apoptose und biologische Funktion untersucht.
Beispiel 6: Expression der menschlichen extrazellulären Domäne von CTLA-4 in E. coli
Clonierung der extrazellulären CTLA-4-Domäne
Die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 wurde nach Clonierung in den Expressionsvektor pETCm11a in E. coli exprimiert. Dieser Vektor wurde durch Clonierung einer Chloramphenicol-Resistenzgen-Kassette in die ScaI-Restriktionsstelle innerhalb des Ampicillin-Resistenzgens aus dem Expressionsvektor pET-11a (Novagen Inc., Madison WI) erhalten. Die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 wurde aus dem Plasmid phCTLA-4 durch PCR-Amplifikation unter Verwendung des Oligonucleotids
5'GCAGAGAGACATATGGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGG-3' (SEQ ID NO: 37) als vorwärts gerichtetem Primer und des Oligonucleotids
5'-GCAGAGAGAGGATCCTCAGTCAGTTAGTCAGAATCTGGGCACGGTTCTGG-3' (SEQ ID NO: 38) als reversem Primer hergestellt. Der vorwärts gerichtete PCR-Primer enthält eine NdeI-Restriktionsstelle, in der der ATG-Sequenz in der NdeI-Restriktionsstelle unmittelbar das Codon für die erste Aminosäure des reifen CTLA-4 folgt. Der reverse PCR-Primer enthält eine BamHI-Restriktionsstelle, der Translations-Stoppcodons in allen drei Leserahmen vorausgehen, denen die letzte Aminosäure direkt vor der CTLA-4-Transmembran-Domäne vorausgeht. PCR-Amplifikation mit diesen Primern ergibt ein Fragment mit 416 Bp, das durch die NdeI- und BamHI-Restriktionsstellen begrenzt ist und DNA-Sequenzen enthält, die die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 codiert, der ein Methionin-Codon vorausgeht. Das PCR-Produkt wurde mit NdeI plus BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pETCm11a ligiert, der mit den gleichen Restriktionsenzymen gespalten wurde. Die ligierte DNA wurde in die E. coli-Stämme BL21, HMS174, RGN714 and RGN715 transfiziert, die den lambda-DE3-Helferphage enthielten. Die Transformanten wurden in L-Agar, der Chloramphenicol enthielt, selektiert. Individuelle Transformanten wurden ausgewählt und nach Induktion durch Behandlung mit 0,5 mM IPTG auf Expression von CTLA-4 getestet. Extrakte ganzer Zellen wurden auf SDS-PAGE-Gel analysiert, worauf Coomassie-Blau-Färbung und Western-Blot-Analyse folgten. Der größte Teil des CTLA-4-Proteins in diesen Zellen wurde in Einschlußkörpern gefunden.
Reinigung von CTLA-4 aus Einschlußkörpern
Rekombinantes CTLA-4 wurde aus Zellpellets durch Behandlung der gewaschenen Zellen in Lysis-Pufferlösung (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 und Lysozyme zu 0,3 mg/ml) gewonnen, worauf Ultraschallbehandlung folgte. Die Einschlußkörperchen wurden durch Zentrifugation bei 20.000 × g gewonnen und durch Behandlung mit Solubilisierungspufferlösung (50 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-Mercaptoethanol (2-ME)) solubilisiert. Die Solubilisierung wurde durch Durchmischung über 2 Stunden bei Zimmertemperatur unterstützt. Die lösliche Fraktion enthielt CTLA-4. Das CTLA-4 wurde durch Chromatographie auf S-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) wie folgt gereinigt. Der CTLA-4 enthaltende Überstand wurde durch die Zugabe von Eisessig auf einen pH-Wert von 3,4 eingestellt und auf eine S-Sepharose-Säule aufgetragen, die mit Säulenpufferlösung äquilibriert war (100 mM Na-Acetat, pH-Wert 6, 5, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-ME und 5 mM EDTA). Die Säule wurde mit Säulenpufferlösung gewaschen, und das gebundene CTLA-4 wurde mit einem linearen, in Säulenpufferlösung hergestellten Salzgradienten (NaCl, 0 bis 1 M) eluiert. Peakfraktionen, die hohe Abs_280nm-Werte zeigten, wurden zusammengegeben und gegen Dialysepufferlösung (100 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 8 M Harnstoff, 50 mM 2-ME, 5 mM EDTA) dialysiert. Noch verbliebene verunreinigende Proteine wurden durch Chromatographie auf einer nach Größe auftrennenden Sephacryl S-100 Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) entfernt. Die resultierende Herstellung ergab mehr als 95% reines CTLA-4, berechnet durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassie-Blau-Färbung und Western-Blot Analyse. Da die geschätzte Größe von monomerem, rekombinanten, in E. coli produzierten CTLA-4 etwa 15 kDa betrug, wurden alle Schritte des Reinigungsprotokolls durch SDS-PAGE auf die Anwesenheit eines 15 kDa großen Proteins überprüft, und die Anwesenheit von CTLA-4 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt.
Gewinnung von sekretiertem CTLA-4 von E.coli
Eine sekretierte Form von CTLA-4 wurde von E. coli wie folgt gewonnen. Die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 wurde mit der pelB(Lei, S.-P. et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 4379–4383)-Signalsequenz mit Hilfe von PCR verbunden, worin Plasmid phCTLA-4 als Matrize und das Oligonucleotid
5'GGCACTAGTCATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCGATGGCCGCAGCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGGG3' (SEQ ID NO: 39) als der vorwärts gerichtete Primer und das Oligonucleotid der SEQ ID NO: 38, vorstehend beschrieben, als der reverse Primer verwendet wurden. Der vorwärts gerichtete PCR-Primer enthält eine einzelne BspHI-Restriktionsstelle, die vollständige pelB-Signalsequenz und das 5'-Ende der extrazellulären Domäne von CTLA-4. Der reverse PCR-Primer enthält eine einmalige BamHI- Restriktionsstelle, der translationale Stoppcodons in allen drei Leserahmen voraus gehen, denen die letzte Aminosäure vor der transmembranen Domäne von CTLA-4 vorausgeht. PCR-Amplifikation mit diesen Primern ergab ein 480 Bp großes Fragment, begrenzt von einmaligen BspHI- und BamHI-Restriktionsstellen, das die pelB-Signalsequenz gebunden an die extrazelluläre Domäne von CTLA-4 codiert. Nach PCR-Amplifikation wurde das DNA-Fragment mit BspHI und BamHI gespalten und in den Expressionsvektor pTrc99A (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), der zuvor mit NcoI und BamHI gespalten worden war, ligiert. Dies ergab ein Plasmid, in dem die Expression des pel-CTLA-4-Proteins vom pTrc-Promotor gesteuert wurde, der im pTrc99A-Expressionsvektor vorhanden war. E. coli-Wirtsstämme, die mit der ligierten DNA transformiert worden waren, wurden auf L-Agar selektiert, der Ampicillin (50 μg/ml) enthielt, und individuelle Clone wurden isoliert. Die Expression von CTLA-4 in diesen Stämmen wurde durch die Behandlung mit exponentiell wachsenden Kulturen mit IPTG (0,5 mM) über Nacht induziert. Extrakte, die nach Konzentration aus dem Kulturmedium oder durch Freisetzung aus dem Periplasma hergestellt wurden (die Zellen wurden in 20% Saccharose, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, für 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, durch Zentrifugation gesammelt und in Wasser bei 4°C resuspendiert und für 10 Minuten auf Eis gehalten), wurden auf die Anwesenheit von CTLA-4 durch SDS-PAGE, Western-Blot-Analyse und kompetitive B7 bindendes ELISA-Verfahren untersucht.
ÄQUIVALENTE
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen oder in der Lage sein, zu überprüfen, dass es bei Verwendung von nicht mehr als Routine-Experimenten viele Äquvalente der spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung gibt. Solche Äquivalente sollen durch die nachfolgenen Ansprüche eingeschlossen sein.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

In-vitro-Verfahren zur Hemmung der T-Zellproliferation oder Interleukin-2(IL-2)-Akkumulation und zur Induktion eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals durch eine aktivierte T-Zelle, umfassend das Inkontaktbringen einer Population von Zellen, umfassend die aktivierte T-Zelle, mit einem Antikörper, der ein Epitop auf einem CTLA-4-Molekül bindet, welches sich von einer B7-1- oder B7-2-Bindungsstelle auf CTLA-4 unterscheidet, wobei das Epitop die Aminosäuresequenz (Xaa)_n-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-(Xaa)_n (SEQ ID Nr.: 33) umfasst, wobei Xaa_n eine beliebige Aminosäure und n = 0–20 ist und wobei der Antikörper ein CTLA-4 assoziiertes Signal in der aktivierten T-Zelle stimuliert, so dass die T-Zellproliferation oder IL-2-Akkumulation durch die aktivierte T-Zelle gehemmt wird und die Apoptose in der aktivierten T-Zelle induziert wird.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper ein monoclonaler anti-CTLA-4-Antikörper oder ein Fragment davon ist.
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ER5.4D3 (ATCC Nr. HB 11645), ES5.3D6 (ATCC Nr. HB 11644), ER5.3D8 (ATCC HB 11641) und ES5.4E3 (ATCC Nr. HB 11643).
In-vitro-Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper eine lösliche Form eines nativen CTLA-4-Liganden ist, der auf einer B-Lymphoblastoidzelle exprimiert wird.
In-vitro-Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei Xaa_n eine beliebige Aminosäure und n = 0–5 oder n = 0–3 ist.
Verwendung eines Antikörpers wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung eines CTLA-4 assoziierten apoptotischen Signals in einer aktivierten T-Zelle eines Individuums, so dass in der aktivierten T-Zelle Apoptose induziert wird.
Verwendung nach Anspruch 6, weiterhin umfassend die Verwendung mindestens eines zweiten Mittels, welches ein co-stimulierendes Signal in der T-Zelle hemmt.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das co-stimulierende Signal in der T-Zelle über einen CD28-Signaltransduktionsweg erfolgt.
Verwendung nach Anspruch 6, weiterhin umfassend mindestens ein zweites Mittel, das die Herstellung oder Funktion von IL-2 in dem Individuum hemmt.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das zweite Mittel ein blockierendes Molekül ist, das an einen Liganden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2 und einem IL-2-Rezeptor bindet.