DE69735424T2

DE69735424T2 - Verfahren und mittel zur modifikation der komplementaktivierungskaskade

Info

Publication number: DE69735424T2
Application number: DE69735424T
Authority: DE
Inventors: Antonius Rene VAN LIER; Jörg HAMANN
Original assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Current assignee: Stichting Sanquin Bloedvoorziening
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-11
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2017-08-12
Also published as: ES2260797T3; WO1998006838A1; US6328968B1; NO990581D0; AU733249B2; EP0920502B1; EP0920502A1; AU3869897A; JP2001503248A; CA2263219A1; NO990581L; NO324766B1; DE69735424D1; PT920502E; ATE319824T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie, insbesondere der molekularen Immunologie und Verwendungen davon in der modernen Medizin. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und Mittel, die auf dem Gebiet der Modifikation der Komplementaktivierungskaskade Anwendung finden und betrifft Methoden und Mittel zur Wechselwirkung mit Immunreaktionen durch Manipulation der CD97-CD55-Wechselwirkung.
Die Erfindung betrifft Mittel und Methoden zur (Herab-)Regulierung des Komplementaktivierungswegs und anderer Wechselwirkungen des Immunsystems. Dies ist auf dem Gebiet der Transplantationen von Organen und/oder Geweben und/oder Zellen von Spendern auf Empfänger von besonderem Interesse. Um immunologische Antworten von dem Wirt gegen das transplantierte Material (das Transplantat) zu vermeiden, ist ein sorgfältiges Abgleichen des immunologischen Profils sowohl des Wirts als auch des Empfängers erforderlich. Dieses Erfordernis macht die Verfügbarkeit von transplantierten Teilen oder Transplantaten zu einem limitierenden Faktor in der Transplantationsmedizin. Es wäre daher ein größerer Schritt vorwärts, wenn dieses Erfordernis vermieden werden könnte, so dass viel mehr Spender für Transplantationszwecke verfügbar wären. Bei der Arbeit in Bezug auf eine geeignete Quelle für transplantierbare Organe und Gewebe wurde Schweinematerial in Betracht gezogen. Die Transplantation von Schweinematerial in Menschen würde normalerweise zu einer immunogenen Reaktion, üblicherweise einer hyperaktiven Abstoßung des Transplantats, führen. Aus diesem Grund wurden transgene Schweine entwickelt, die den CD55 Decay-acceleration-Faktor auf der Oberfläche ihrer Zellen exprimieren. CD55 spielt eine wichtige Rolle bei der Komplementinaktivierung, wie nachstehend erklärt. In Kürze, CD55 hemmt zwei wichtige Convertasen im Komplementaktivierungsstoffwechselweg.
So wurde angenommen, dass durch Bereitstellung eines Schweinetransplantats mit CD55 die Komplementaktivierung gehemmt werden könnte. Es wurde nun gefunden, dass die Lösung zur Vermeidung der Hyperimmunabstoßung wegen der Rolle des CD97-Proteins nicht so einfach sein könnte. Die vorliegende Erfindung identifiziert dieses Problem und löst es.
Die Erfindung betrifft auch Mittel und Methoden zur Regulierung der frühen und späten Wechselwirkungen, die eine Rolle bei (Auto-)Immunerkrankungen spielen. Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, SLE, Diabetes und andere, sind Erkrankungen, deren pathogene Mechanismen im Allgemeinen nicht gut verstanden sind, aber wobei ein Komplex von Immunreaktionen, die so verschieden sind wie Zytokinaktivierung, aktivierte Zellen des Immunsystems, Antikörperbildung und Komplementaktivierung, allein und in Kombination gegen "Selbst"-Komponenten eines Körpers eines Patienten gesteuert werden. Eine solche Kaskade von Immunreaktionen kann zu einer Störung des immunologischen Gleichgewichts des Patienten führen, die, wenn sie nicht ausreichend durch das körpereigene System der Immunregulierung gelindert wird, zu ernsthaften und lebensbedrohlichen Erkrankungen führt. Ebenso können erworbene Immunschwächen oder normale immunologische Reaktionen auf infektiöse Erreger und dergleichen zu einer ähnlichen Immunreaktion führen, die in sich selbst für einen Patienten schädlich ist. CD97 ist ein Antigen, das während der Aktivierung auf den meisten Leukozyten sofort hochreguliert wird (1). Jüngst wurde CD97 als 7-TM-Molekül identifiziert, dessen Membran-spannende Region zu der Sekretinrezeptor-Superfamilie homolog ist (2). CD97 unterscheidet sich von dieser Gruppe von Säuger- und Insektenpeptidhormonrezeptoren (3) dahingehend, dass er eine ausgedehnte extrazelluläre Region mit drei bis fünf EGF-Domänen am N-Terminus besitzt. Die Auffindung einer hoch ähnlichen Architektur in EMR1 (4), das sechs EGF-Domänen besitzt, und dessen möglichen Maushomologen F4/80 (5), zeigt die Existenz einer neuen Gruppe von 7-TM-Rezeptoren an, die durch mehrere N-terminale EGF-Domänen gekennzeichnet sind. Es wurde gezeigt, dass dieser neue Typ von 7-TM-Molekül jüngst durch Exon-Shuffling an die stromaufwärtige Region eines Ursprungsgens aus der Sekretinrezeptor-Superfamilie (6) hervorgegangen ist. Alle EGF-Domänen in CD97 und EMR1, ausgenommen die meisten N-terminalen, besitzen eine Calciumbindungsstelle. Die Ca²⁺-Ionen in dieser Untergruppe der EGF-Domänen stabilisieren die Konformation der Domäne und können den Kontakt an andere Proteine (7) vermitteln. Der ziemlich jüngst erfolgte Erwerb der EGF-Domänen ergab die Möglichkeit, dass CD97 parallel mit seiner molekularen Evolution die Fähigkeit erworben hat, zelluläre Liganden zu binden. Um dies zu erforschen, wurden mit CD97-cDNA transfizierte COS-Zellen mit verschiedenen Zellen hämatopoetischen Ursprungs inkubiert. Wie in 1 gezeigt, wurde die Adhäsion von peripheren Blutlymphozyten (PBL) und Erythrozyten an COS-Zellen, die CD97 exprimieren, beobachtet, was durch CD97-mAbs CLB-CD97/1 (siehe experimenteller Teil) oder BL-Ac/F2 (1) vollständig aufgehoben wurde. Sobald die Bindungsstudien anzeigten, dass ein Ligand für CD97 auf den Erythrozyten exprimiert wird, wurde die Immunisierung von Mäusen mit menschlichen Erythrozyten verwendet, um einen Ligandenspezifischen mAb zu erzeugen. Ein mAb (CLB-CD97L/1) wurde identifiziert, der die Adhäsion sowohl von Erythrozyten als auch PBL an CD97-transfizierte COS-Zellen blockierte. Dieser mAb erkennt ein 70-kD-Protein (2A). Unter den Antigenen dieser Größe, die im Fifth International Leucocyte Typing Workshop studiert wurden, wurde eine kleine Anzahl gefunden, die sowohl von Erythrozyten als auch Lymphozyten exprimiert wird (8). Bei Testung der Fähigkeit von mAbs gegen diese Antigene, die Bindung von Erythrozyten an CD97-Transfektanten zu blockieren, zeigte sich, dass IA10 ein mAb, der CD55 erkennt (9), hemmend ist. Ein direkter Vergleich von CLB-CD97L/1 mit IA10 zeigte, dass beide mAbs nicht nur das gleiche Hauptprotein von 70 kD, das das CD55-Antigen kennzeichnet (10), immunpräzipitieren, sondern auch eine kleine Bande bei 140 kD, die dimeres CD55 darstellt (11) (2A). Ferner blockiert IA10 vollständig die Bindung von biotinyliertem CLB-CD97L/1 an PBL (2B), was anzeigt, dass der gegen den Liganden von CD97 erzeugte mAb das gleiche Epitop wie IA10 erkennt, das zuvor gegen das erste (von vier) SCR von CD55 kartiert wurde (12). CD55 oder Decay-acceleration-Faktor (DAF) ist ein GPI-verankertes Molekül, das von allen Blutzellen und Zellen in Kontakt mit Blut und Gewebeflüssigkeit exprimiert wird, das vor Komplement-vermitteltem Schaden schützt, indem C3/C5-Convertasen gehemmt werden (10). Um die Spezifität der Interaktion zwischen CD97 und CD55 zu erforschen, wurde eine größere Gruppe von CD55-mAbs, die gegen verschiedene SCR-Domänen in dem Molekül gerichtet sind, in dem vorstehend beschriebenen Adhäsionsassay getestet. Wie in 3 gezeigt, wurde eine Hemmung der Erythrozytenadhäsion an CD97-transfizierte COS-Zellen zwischen 23 und 92 % beobachtet. Die Entdeckung, dass auch mAbs, die zu dem zweiten (BRIC110) und dritten (BRIC216) SCR von CD55 passen, blockieren können, legt nahe, dass diese Domänen zusätzlich zu dem ersten SCR an der Ligierung von CD97 beteiligt sind. Die Fähigkeit, den Zusammenbau der C3/C5-Convertasen sowohl in dem klassischen als auch in dem alternativen Stoffwechselweg der Komplementkaskade zu dissoziieren und zu verhindern, wurde jüngst den SCR-Domänen zwei, drei und vier (12, 13) zugeschrieben. Es wurde gezeigt, dass SCR1 für die DAF-Funktion nicht benötigt wird, aber dass SCR2, SCR3 und SCR4 jeweils für DAF notwendig sind, um dessen Schutzwirkung bezüglich der Komplementaktivierung auszuüben. Die Entfernung von SCR1 wurde mit einer kleinen Erhöhung der inhibitorischen Aktivität in Zusammenhang gebracht. Die Entdeckung, dass das erste SCR von CD55 an der Adhäsion an CD97 beteiligt ist, ist der erste Nachweis einer molekularen Funktion für diese Domäne.
Weiterer Nachweis, dass CD97 spezifisch mit CD55 wechselwirkt, kam von Beobachtungen, dass Erythrozyten, denen CD55-Expression fehlt, nicht an CD97-Transfektanten anheften können. Erstens ist die paroxysomale nächtliche Hämoglobinurie (PNH) ein erworbener somatischer Defekt in der Synthese des GPI-Ankers, der zur Abwesenheit der GPI-verankerten Moleküle führt (14). Infolge des klonalen Charakters dieser Störung der hämatopoetischen Stammzellen, verbleiben CD55-positive Erythrozyten, die sich an CD97-Transfektanten heften können. Jedoch wurde nach Entleerung der nicht befallenen CD55-exprimierenden Erythrozyten eine vollständige Beseitigung der Adhäsion beobachtet (4A). Zweitens stellt der Inab-Phänotyp einen ererbten Defekt der CD55-Expression infolge von verkürzten Mutationen in dem CD55-Gen dar (15). Erythrozyten mit diesem Phänotyp waren nicht in der Lage, an COS-Zellen, die CD97 exprimieren, zu binden (4B). Eine weitere Untersuchung im Hinblick auf die Spezifität der Wechselwirkung zwischen CD97 und CD55 zeigte die spezifische Beziehung zwischen diesen Molekülen. Ein alternatives Spleißen der EGF-Domänen, die von dem CD97-Gen codiert werden, führt zu Isoformen, die entweder drei (EGF1,2,5), vier (EGF1,2,3,5) oder fünf EGF-Domänen (EGF1,2,3,4,5) besitzen. Die anfängliche Beobachtung, dass CD55 ein zellulärer Ligand des CD97 ist, beruhte auf Experimenten mit der Isoform CD97 (EGF1,2,5), die drei EGF-Domänen enthält. Um die adhäsive Kapazität der größeren Isoformen zu analysieren, wurden die jeweiligen cDNAs kloniert und in COS-Zellen exprimiert. Die spezifische Adhäsion der Erythrozyten an die Transfektanten zeigte, dass alle drei CD97-Isoformen in der Lage sind, CD55 zu binden (5). Jedoch führte die Expression von CD97 (EGF1,2,3,5) und CD97 (EGF1,2,3,4,5) zu weniger und kleineren Rosetten, verglichen mit CD97 (EGF1,2,5). Identische Ergebnisse wurden in Bindungsstudien mit PBL erhalten (Daten nicht gezeigt). Die quantitative Bestimmung der Erythrozytenbindung an COS-Zellen, die ähnliche Mengen der verschiedenen CD97-Isoformen exprimieren, bestätigte eine signifikant niedrigere Bindungskapazität der größeren Isoformen, die vier und fünf EGF-Domänen exprimieren. Bezüglich der unterschiedlichen Bindungskapazität der CD97-Isoformen sind Assays von Wert, die eine Unterscheidung zwischen diesen Isoformen erlauben. Dafür können verschiedene Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise Domänen-spezifische mAbs oder eine RT-PCR-Strategie. Um die Bindungsstelle der CD97-mAbs zu kartieren, wurden mutierte cDNAs erzeugt, die CD97 mit Verkürzungen für bestimmte EGF-Domänen codieren. Da die EGF-Domänen von einzelnen Exons codiert werden, führte eine systematische Deletion der jeweiligen Exons durch SOE-PCR zu Rekombinanten, die als CD97-DEGF1, CD97-DEGF2 und CD97-DEGF5 bezeichnet wurden. Um die verkürzten CD97-Formen zu exprimieren, wurden COS-Zellen vorübergehend mit den mutierten cDNAs transfiziert. Eine Testung der Reaktivität einer Gruppe von sieben CD97-mAbs mittels Durchflusszytometrie zeigte, dass BL-Ac/F2, VIM3, VIM3b, VIM3c und CLB-CD97/1 gegen die erste EGF-Domäne gerichtet sind, wohingegen CLB-CD97/2 und MEM-180 nicht an eine der EGF-Domänen binden (6). Domänen-spezifische mAbs wurden durch Standard-Hybridoma-Technologie aus mit den verschiedenen CD97-Isoformen immunisierten Mäusen erzeugt. Wie vorstehend erwähnt, werden alternativ zu mAbs Techniken auf Nucleinsäurebasis, wie RT-PCR, verwendet, um CD97-Isoformen nachzuweisen. Für die RT-PCR werden spezifische Primer entwickelt, die den alternativ gespleißten Teil der EGF-Domänenregion amplifizieren. Der 5'-Primer sollte innerhalb oder stromaufwärts der zweiten EGF-Domäne angebracht sein, der 3'-Primer innerhalb oder stromabwärts der fünften EGF-Domäne. CD97 wird auf aktivierten Leukozyten exprimiert und besitzt eine Neigung, an das autologe CD55-Protein zu binden, was eine Anziehung von Leukozyten (und anderen Entzündungserregern) in autologes Gewebe mit sich bringt, und damit eine Beteiligung an einer (Auto-)Immunerkrankung als Folge einer gestörten humoralen (u.a. Komplement und Antikörper) und/oder zellulären immunologischen Homöostase. Dies wurde untersucht, indem die Expression von CD97 und CD55 bei rheumatoider Arthritis bestimmt wurde. Rheumatoide Arthritis ist eine chronische entzündliche Erkrankung, die die Gelenkflüssigkeit in vielen Gelenken befällt. Die verdickte Gelenkauskleidungsschicht, die die rheumatoide Arthritis charakterisiert, besteht hauptsächlich aus Typ A-Makrophagen-artigen Synoviozyten und Typ B-Fibroblasten-artigen Synoviozyten. Da CD55 ein Molekül ist, dass Fibroblastenartige Synoviozyten identifiziert, wurde die Expression von CD97 in der Auskleidungsschicht untersucht. Eine signifikante Expression von CD97 wurde auf Makrophagen-artigen Synoviozyten (Mittelwert ± SD: 99 ± 1,3 %) gefunden. Die Expression von CD97 auf Makrophagen-artigen Synoviozyten und von CD55 auf Fibroblasten-artigen Synoviozyten erklärt die spezifische Bauweise der Gelenkauskleidungsschicht, die die Gelenksentzündung unterhält und verstärkt. Die Wechselwirkung zwischen dem Aktivierungs-regulierten CD97-Antigen und CD55 impliziert die Existenz eines neuen Adhäsionsstoffwechselwegs (16), der in erster Linie von geprimten aber nicht ruhenden Leukozyten verwendet wird. Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren, um diese immunologische Wechselwirkung zwischen CD55 und CD97 zu modifizieren, herauf- oder herabzuregulieren, indem die Bindung der zwei Moleküle, CD97 und CD55, blockiert oder damit eine Wechselwirkung erzeugt wird. Ein Beispiel für ein solches Verfahren und Mittel, das bzw. die erfindungsgemäß bereitgestellt wird bzw. werden, sind Antikörper und ihre Verwendung spezifisch gerichtet gegen die jeweilige Bindungsstelle eines der beiden Moleküle, wie Antikörper entsprechend dem CLB-CD97L/1 mAb (hinterlegt am 07. August 1997 bei CNCM, Paris. unter der Hinterlegungsnummer I-1908). Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind humanisierte Antikörper, die von Antikörpern, wie Antikörpern entsprechend CLB-CD97L/1, abgeleitet sind. Die Humanisierung von Antikörpern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und dient der Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung in Menschen, wobei den Antikörpern, die "Nicht-Selbst"-Antigene fehlen, während sie die Spezifizität der Bindungsstelle beibehalten haben. Ebenso werden (humanisierte) Idiotyp- und Anti-Idiotyp-Antikörper entsprechend Antikörpern mit einer Spezifität gegen die jeweilige Bindungsstelle eines der zwei Moleküle, wie Antikörper entsprechend dem CLB-CD97L/1 mAb und/oder davon abgeleitete Antikörper, erfindungsgemäß bereitgestellt. Zusätzlich sind synthetische Peptide oder blockierende Substanzen, die die Bindung der zwei Moleküle, CD97 und CD55, Wechsel wirken oder damit antagonisieren, von Aminosäuresequenzen, ausgewählt aus Sequenzen, umfassend CD97- und/oder CD55-Moleküle, beispielsweise von Aminosäuresequenzen, umfasst von den jeweiligen Bindungsstellen, abgeleitet. Ein Beispiel ist die EGF1-Domäne von CD97 oder die SCR1-Domäne von CD55, worin gefunden wurde, dass ein Teil der Wechselwirkung zwischen den zwei Molekülen stattfindet. Solche Peptide oder andere blockierende Substanzen (seien sie von den vorstehenden Antikörpern oder von CD97(-EGF1)- und/oder CD55(-SCR1)-spezifischen Aminosäuresequenzen abgeleitet), werden durch verschiedene Verfahren, wie synthetische Peptidchemie und synthetische Peptid-ELISA (PEPSCAN) erhalten, wobei die vorstehenden Antikörper oder Bindungsassays, die die spezifische CD97/CD55-Wechselwirkung testen, verwendet werden. Solche Peptide werden auch unter Verwendung einer kombinatorischen Phagendisplaybank, die auf Phagen, die die gewünschte Affinität an ihrer Oberfläche zeigen. testet, abgeleitet.
In einem solchen Peptid sind die Aminosäurereste konventionell ersetzt, z.B. kann Valin durch Alanin ersetzt sein (in synthetischen Peptiden sind alle Aminosäurereste Kandidaten für einen herkömmlichen Austausch mit anderen Resten, seien sie D- oder L-Reste). Auch eine ersetzende Aminosäure wird durch Replacement-Net-Scanning oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Methoden ausgewählt. Beachtlicherweise ist unter den hunderten von bekannten 7-TM-Rezeptoren CD97 das erste Molekül, das einen zellulären Liganden besitzt (17). Es muss erforscht werden, ob dies ein gemeinsames Merkmal der neuen Gruppe von 7-TM-Rezeptoren mit den N-terminalen EGF-Domänen, zu denen CD97 gehört, ist. Obwohl weitere physiologische Konsequenzen der Wechselwirkung zwischen CD97 und CD55 bestimmt werden müssen, zeigen die vorliegenden Befunde an, dass die Komplementregulierung wahrscheinlich nicht die ausschließliche Funktion von CD55 ist. Die Wechselwirkung zwischen CD97 und CD55 spielt auch eine bestimmende Rolle bei der Regulierung der immunologischen Wechselwirkung oder Homöostase. Die Erfindung betrifft Mittel (Peptide, Fragmente oder Derivate), die verwendet werden können, um diese Homöostase herauf- oder herabzuregulieren, wodurch therapeutische Werkzeuge oder Mittel bereitgestellt werden, die die spezifische Regulation der immunologischen Wechselwirkungen in (Auto-)Immunerkrankungen erlauben. Als ein spezifisches Beispiel für eine solche gestörte Homöostase wird die CD97/CD55-Wechselwirkung bei rheumatoider Arthritis angegeben, wobei Mittel zur Herabregulierung der entzündlichen Reaktion dem Patienten eine große Erleichterung geben. Beachtlicherweise wird transgenes CD55 gegenwärtig verwendet, um die Komplementaktivierung durch Xeno-Transplantate herabzumodulieren (18). Die vorliegenden Daten ergeben, dass, obwohl die Wirkung auf die Komplementaktivierung nützlich für das Überleben des Transplantats sein könnte, die Anziehung aktivierter Leukozyten zu dem Transplantat ein unerwünschter (und bis jetzt nicht bezeichneter) Nebeneffekt dieser Variante sein würde. Die Erfindung betrifft eine Lösung für dieses Problem dahingehend, dass sie ein modifiziertes CD55-Protein bereitstellt, wobei die Modifikation die funktionelle Deletion des ersten N-terminalen short consensus repeat umfasst. Bevorzugt sollte dieses modifizierte Protein auf einer so modifizierten Zelle vorhanden sein. Ein überaus bequemer Weg, solche Zellen zu erzeugen, ist, diesen mit einem Vektor zu versehen, der ein erfindungsgemäßes modifiziertes CD55-Protein codiert, was zu einer rekombinanten Zelle, die einen solchen Vektor umfasst, führt. Die Expression eines solchen modifizierten CD55-Proteins auf Zellen von Xeno-Transplantaten vermeidet eine unerwünschte Aktivierung des Immunsystems über CD97, wohingegen die Komplementregulierende Aktivität von CD55 beibehalten wird.
Eine funktionelle Deletion des ersten short consensus repeat in dem CD55-Protein in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass es seine Bindungsaffinität für CD97 verliert und so nicht länger aktivierte Leukozyten anzieht. Ferner ist es natürlich wichtig, dass CD55 seine Anti-Komplementaktivierungsaktivität beibehält. Ein modifiziertes CD55-Protein mit diesen zwei Eigenschaften gilt als Teil der Erfindung. Die Zielzellen, die mit dem modifizierten CD55 versehen werden sollen, sind natürlich Zellen, die transplantiert werden sollen. Diese umfassen spezifisch Zellen hämatopoetischen Ursprungs und Zellen, die in ihrem natürlichen Zustand in Kontakt mit Blut oder Lymphflüssigkeit sind. Besonders werden nicht-menschliche, transplantierbare Säugerzellen, beispielsweise aus dem Schwein, in Betracht gezogen.
Wenn auf rekombinante Zellen, die einen Vektor umfassen, Bezug genommen ist, kann ein solcher Vektor in das Genom der Zelle integriert sein. Dies ist sogar bevorzugt. Der Vektor kann andere Elemente, wie Marker, Regulatorelemente etc., umfassen. Abgesehen von der Modifikation des einen Teils des Bindungspaars ist es natürlich auch möglich, die andere Seite, das ist CD97, zu modifizieren. Dies ist ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Im Grunde betrifft die Erfindung, dass jede Art der Unterdrückung der Bindung und somit des Zusammenbringens von transplantierten Zellen und aktivierten Leukozyten zu einer besseren Suppression der Komplementaktivierung führt. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Unterdrückung der Komplementaktivierung und/oder der Regulation der immunologischen Wechselwirkung oder Homöostase durch Hemmen bzw. Inhibieren der Bindung zwischen dem CD55-Protein und dem CD97-Protein.
Wie vorstehend ausgeführt, kann dies durch funktionelle Deletion der Bindungsdomäne von CD55 oder beides/n erzielt werden, aber dies kann auch erzielt werden, indem die Bindungsstelle entweder von CD97 oder von CD55 oder von beiden blockiert wird. Diese Blockierung kann beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern oder Fragmenten davon oder damit verwandten Fragmenten erzielt werden, wie Bindungspeptide oder synthetische Peptide, die die CD55/CD97-Wechselwirkung blockieren. Solche blockierenden Substanzen und Derivate davon können auch in einem Verfahren zur Hemmung bzw. Inhibierung der Bindung der zwei Moleküle zur Behandlung von (Auto-)Immunerkrankungen verwendet werden.
Andererseits, wenn die Komplementaktivierung erwünscht ist, kann dies auch dadurch erzielt werden, was zu einem Verfahren zur Verstärkung der Komplementaktivierung führt, wobei (aktivierte) Leukozyten mit CD55-Bindungsstellen, die von CD97 abgeleitet sind, versehen werden.
EXPERIMENTELLER TEIL
Monoklonale Antikörper
CLB-CD97/1 (IgG2a) ist ein neuer CD97-spezifischer mAb, der durch Fusion von Maus-Myeloma SP2/0 mit Milzzellen aus einer BALB/c-Maus, die mit NIH-3T3-Zellen immunisiert wurde, die stabil CD97 exprimieren, erzeugt wurde. CLB-CD97/1 hemmt die Bindung von biotinyliertem BL-Ac/F2, was anzeigt, dass beide mAbs gegen das gleiche CD97-Epitop gerichtet sind.
Der mAb CLB-CD97L/1 (IgG1) wurde durch Fusionieren von Mausmyeloma SP2/0 mit Milzzellen aus einer BALB/c-Maus, die mit menschlichen Erythrozyten immunisiert worden war, erzeugt. Die Hybridoma-Überstände wurden auf die Fähigkeit, die Adhäsion von Erythrozyten an mit CD97 transfizierte COS-Zellen (siehe nachstehend) zu blockieren, durchgemustert und auf Kulturplatten mit 96 Kavitäten ausplattiert.
Immunpräzipitation und Blockierungsstudien
Mit ¹²⁵I markierte K562-Zellen wurden in 1 % NP-40-Puffer lysiert, mit normalem Maus-Ig vorgeklärt und mit CLB-CD97L/1 und IA10, einem CD55-mAb, abgeleitet von dem Fifth International Leucocyte Typing Workshop (12), inkubiert. Immunkomplexe wurden an Protein A-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) adsorbiert, unter reduzierenden Bedingungen eluiert, elektrophoretisch durch 5 bis 15 % SDS-PAGE getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Blockierung von CLB-CD97L/1 durch CD55 mAbs wurde durch Inkubation von PBL mit IA10, 20 min lang vor der Anfärbung mit biotinyliertem CLB-CD97L/1, gefolgt von PE-Streptavidin, getestet. Die durchflusszytometrische Analyse wurde auf einem FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) durchgeführt.
Adhäsionsassays
Bindungsassays wurden mit COS-Zellen drei Tage nach vorübergehender Infektion mit CD97 cDNA (2) unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) durchgeführt. Typischerweise exprimierien 30 % der COS-Zellen CD97, wie durch Immunperoxidase-Färbung mit CD97-mAbs bestimmt wurde. Am Tag eins wurden COS-Zellen in Kulturplatten mit sechs Kavitäten replattiert. Eine Mock-Transfektion wurde nach dem gleichen Verfahren durchgeführt, außer dass keine cDNA zugesetzt wurde.
Um die Bindung zu analysieren, wurden 10 × 10⁶ PBL, erhalten aus menschlichem venösen Blut durch Isolation, auf einem Percoll-Dichtegradienten, gefolgt von einer zentrifugalen Gegenstromelution bzw. -auswaschung, oder 100 × 10⁶ Erythrozyten in 1 ml DMEM suspendiert und 30 min bei 20°C auf die COS-Zellen überschichtet. Nicht-adhärierende Zellen wurden durch sanftes Waschen mit PBS vor der mikroskopischen Untersuchung entfernt.
Für die Blockierungsexperimente wurden Erythrozyten mit ⁵¹Cr gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Amersham Co., Buckinghamshire, UK) markiert. Die Bindungsassays wurden in Kulturplatten mit 12 Kavitäten in Gegenwart von 5 μg/ml mAbs durchgeführt. Nach Entfernen nicht-adhärierender Zellen wurde die γ-Emission des Inhalts der Kavitäten, lysiert mit 1 % Triton X-100, bestimmt.
Bindung von CD55-defekten Erythrozyten an CD97
Die Bindung von Erythrozyten an mit CD97-transfizierte COS-Zellen wurde, wie beschrieben (siehe vorstehend), analysiert. Um CD55-positive Zellen aus Erythrozyten eines PNH-Patienten zu depletieren, wurden die Zellen mit CLB-CD97L/1 vor der Zugabe sättigender Mengen von Magnetkügelchen mit Anti-Maus-IgG (Dynal, Oslo, Norwegen) und immunmagnetischer Selektion inkubiert. Die Expression von CD55 auf den Erythrozytenpopulationen wurde durchflusszytometrisch mit CLB-CD97L oder einer Unterklasse als Kontroll-mAb bestimmt. Die Erythrozyten mit Inab-Phänotyp, die bei dieser Studie untersucht wurden, stammen aus einem neuen nicht-veröffentlichten Fall dieser extrem seltenen Störung (Dr. G. Daniels, persönliche Mitteilung).
Epitop-Kartierung von CD97-mAbs
CD97-cDNAs, die bezüglich einzelner EGF-Domänen gekürzt waren, wurden unter Verwendung der Spleiß-Overlap-Extensionspolymerasekettenreaktion (SOE-PCR) [Horton 89] erzeugt. Da die EGF-Domänen von einzelnen Exons codiert werden, wurden die Sequenzen dieser Exons getrennt oder in Kombination deletiert, was zu mutierten cDNAs führte, die die folgenden Rekombinanten codierten: CD97-DEGF1, CD97-DEGF2 und CD97-DEGF5. COS-Zellen wurden vorübergehend mit gleichen Mengen an CD97-cDNA in voller Länge oder in mutierter Form unter Verwendung von Lipofectamin (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) transfiziert. Drei Tage nach der Transfektion wurde die Bindung von sieben CD97-mAbs mittels durchflusszytometrischer Analyse auf einem FACScan (Becton-Dickinson, Mountain View, CA) getestet. Keiner der mAbs färbte die Mock-transfizierten COS-Zellen.
1 Adhäsion von menschlichen PBL (A) und Erythrozyten (B) an COS-Zellen, die CD97 (siehe vorstehend) exprimieren. Sowohl die B- als auch die T-Lymphozyten adhärieren an CD97-transfizierte COS-Zellen, wie aus Experimenten mit gereinigten Zellen hervorgeht (Daten nicht gezeigt). Keine Bindung ist in Gegenwart von CD97-mAbs CLB-CD97/1 (gezeigt) oder BL-Ac/F2 (C) oder bei Überschichtung der Zellen auf Mock-transfizierten COS-Zellen (D) nachweisbar.
2 CLB-CD97L/1. ein mAb, der gegen den zellulären Liganden von CD97 erzeugt wurde (siehe vorstehend), ist spezifisch für CD55.

A, CLB-CD97L/1 und der CD55-mAb IA10 immunpräzipitieren das gleiche Hauptprotein mit 70 kD von der erythromyeloiden Zelllinie K562 (siehe vorstehend). Bemerkenswerterweise ist auch eine kleinere Bande bei 140 kD, die das dimere CD55 darstellt (11) in dem Präzipitat aus CLB-CD97L/1 nachweisbar. Die Position der molekularen Größenmarker in Kilodalton ist auf der linken Seite angegeben.
B, Die Bindung von biotinyliertem CLB-CD97L/1 an PBL (gestrichelte Linie) wird vollständig durch den CD55-mAb IA10 (durchgezogene Linie) blockiert (siehe vorstehend).

3 CD55 mAbs hemmen die Bindung von Erythrozyten an CD97-transfizierie COS-Zellen (vergleiche den experimentellen Teil). Die Adhäsion von ⁵¹Cr-markierten Erythrozyten an CD97-transfizierte COS-Zellen wurde in Gegenwart von 5 μg/ml mAbs, spezifisch für CD97 (CLB-CD97/1), CD55 (CLB-CD97L/1, IA10, BRIC 220, 230, 110, 216), oder eines Maus-IgG1 als Kontroll-mAb, bewertet. Die verwendeten CD55-mAbs sind gegen die erste (IA10_; BRIC220, BRIC230), zweite (BRIC110) oder dritte (BRIC216) SCR-Domäne gerichtet (12). Die Daten sind als mittlerer Prozentsatz der Zellbindung (± s.e.m.) aus doppelten Kavitäten drei unabhängiger Experimente ausgedrückt.
4 CD55-defekte Erythrozyten können nicht an CD97-transfizierte COS-Zellen adhärieren (vgl. experimenteller Teil).

A, Erythrozyten aus einem PNH-Patienten binden an CD97-transfizierte COS-Zellen (obere rechte Anordnung) infolge der Anwesenheit von nicht befallenen Zellen bei dieser klonalen Erkrankung (14) (linke obere Gruppe). Nach Entfernen der CD55-positiven Erythrozyten durch immunmagnetische Sortierung (linke untere Gruppe) war die Adhäsion vollständig beseitigt (untere rechte Gruppe). Ein repräsentatives Experiment aus vier ist gezeigt.
B, Die vollständige Abwesenheit der CD55-Expression in dem Inab-Phänotyp (15) (linke Gruppe) verhindert die Bindung von Erythrozyten an CD97-transfizierte COS-Zellen (rechte Gruppe).

5 Die drei CD97-Isoformen haben unterschiedliche Bindungskapazitäten für CD55.

A, Schematische Struktur der CD97-Isoformen, die drei (EGF1,2,5), vier (EGF1,2,3,5) oder fünf EGF-Domänen (EGF1,2,3,4,5) besitzen.
B, Immunfluoreszenzanalyse mit einer Gruppe von CD97-mAbs bestätigt die Expression der CD97-Isoformen auf transfizierten COS-Zellen. Gezeigt ist die Anfärbung mit dem CLB-CD97/1 mAb.
C, Adhäsion von Erythrozyten an COS-Zellen, die die drei CD97-Isoformen exprimieren. Die Expression von CD97 (EGF1,2,3,5) und CD97 (EGF1,2,3,4,5) führt zu weniger und kleineren Rosetten. Die Mock-Transfektion oder die Anwesenheit von mAbs gegen entweder CD97 (CLB-CD97/1 oder BL-Ac/F2) oder CD55 (CLB-CD97L/1) verhinderte die Adhäsion vollständig (Daten nicht gezeigt).
D, Erythrozyten binden mit unterschiedlicher Affinität an COS-Zellen, die gleiche Mengen der drei CD97-Isoformen exprimieren. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Erythrozytenbindung ausgedrückt, bezogen auf CD97 (EGF1,2,5). Die gezeigten Daten sind Mittelwerte ± SD von doppelten Bestimmungen in drei unabhängigen Experimenten.

6 Epitopkartierung von CD97 mAbs.

A, Schematische Struktur der CD97-DEGF-Rekombinanten. Systematische Deletion der EGF-Domänen wurde durch Deletion, der codierenden Exons, durch SOE-PCR durchgeführt.
B, Immunfluoreszenzanalyse mit einer Gruppe von CD97-mAbs bestätigt die Expression der CD97-DEGF-Rekombinanten in transfizierten COS-Zellen. Das Anfärbungsmuster korreliert mit der Bindung der mAbs an entweder die erste EGF-Domäne oder außerhalb der EGF-Domänen.

LITERATUR

1. W. Eichler, G. Aust, D. Hamann, Scand. J. Immunol. 39, 111 (1994).
2. J. Hamann et al., J. Immunol. 155, 1942 (1995).
3. T. Ishihara et al., EMBO J. 10, 1635 (1991); G.V. Segre und S.R. Goldring, Trends Endocrinol. Metab. 4, 309 (1993).
4. V. Baud et al., Genomics 26, 334 (1995).
5. A.J. McKnight et al., J. Biol. Chem. 271, 486 (1996).
6. J. Hamann, E. Hartmann, R.A.W. van Lier, Genomics 32, 144 (1996).
7. Z. Rao et al., Cell 82, 131 (1995).
8. S.F. Schlossman et al., Hrsg., Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford, 1995).
9. T. Kinoshita, M.E. Medof, R. Silber, V. Nussenzweig, J. Exp. Med. 162, 75 (1985).
10. D.M. Lublin und J.P. Atkinson, Ann. Rev. Immunol. 7, 35 (1989).
11. M.W. Nickells, J.I. Alvarez, D.M. Lublin, J.P. Atkinson, J. Immunol. 152, 676 (1994).
12. K.E. Coyne et al., J. Immunol. 149, 2906 (1992).
13. W.G. Brodbeck, D. Liu, J. Sperry, C. Mold, M.E. Medof, J. Immunol. 156, 2528 (1996).
14. T. Kinoshita, N. Inoue, J. Takeda, Adv. Immunol. 60, 57 (1995); L. Luzzatto, M. Bessler, Curr. Opin. Hematol. 3, 101 (1996).
15. D.M. Lublin et al., Blood 84, 1276 (1994); G. Daniels, Human Blood Groups (Blackwell Science, Oxford, 1995).
16. T.A. Springer, Cell 76, 301 (1994).
17. J.M. Baldwin, EMBO J. 12, 1693 (1993); S. Watson und S. Arkinstall, The G-Protein Linked Receptor FactsBook (Academic Press, London, 1994); T.P. Iismaa, T.J. Biden, J. Shine, G Protein-Coupled Receptors (R.G. Landes Co., Austin, 1995).
18. K.R. McCurry et al., Nature Med. 1, 423 (1995).
19. J.Gray et al., J. Immunol. 157, 5438 (1996).

Claims

Verwendung eines modifizierten CD55 (Decay-accelerationfactor)-Proteins bei der Herstellung eines Medikaments zur Störung der Wechselwirkung zwischen CD55 und CD97, wobei die Modifikation die funktionelle Deletion der ersten N-terminalen short consensus repeat für die Behandlung von Autoimmunkrankheit, mit Transplantation in Verbindung stehender Krankheit und/oder mit Komplementaktivierung in Verbindung stehender Krankheit.
Verwendung einer Zelle, die ein modifiziertes CD55-Protein exprimiert, für eine in vitro-Störung der Wechselwirkung von CD55 und CD97, wobei die Modifikation die funktionelle Deletion der ersten N-terminalen short consensus repeat umfasst.
Verwendung einer Zelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle hämatopoetischer Herkunft ist.
Verwendung einer Zelle nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Zelle in ihrem natürlichen Zustand in Kontakt mit Blut oder Lymphflüssigkeit ist.
Modifiziertes CD97-Protein, wobei die Modifikation die funktionelle Deletion der CD55-Bindungsregionen umfasst.
Modifiziertes CD97 nach Anspruch 5, wobei die Deletion in wenigstens einer der N-terminalen EGF-Domänen ist.
Isolierte Zelle, die ein modifiziertes CD97-Protein nach Anspruch 5 oder 6 umfasst.
Vektor der für ein modifiziertes CD97-Protein nach Anspruch 5 oder 6 codiert.
Isolierte rekombinante Zelle, die einen Vektor nach Anspruch 8 umfasst.
Zelle nach Anspruch 9, die nicht-humanen Säugerursprungs ist.
Zelle nach einem der Ansprüche 9 oder 10 zur Verwendung als Transplantat.
Verwendung eines modifizierten CD55-Proteins, eines modifizierten CD97-Proteins, eines Antikörpers oder eines Peptids, das/der die Wechselwirkung zwischen CD55 und CD97 blockiert und inhibiert, wobei das Peptid von einer Aminosäuresequenz abgeleitet ist, die eine CD55- und/oder CD97-Sequenz umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der immunologischen Wechselwirkung durch Inhibierung der Bindung zwischen CD55-Protein und CD97-Protein, wobei die immunologische Wechselwirkung zwischen aktivierten Leukocyten und Zellen, die CD55-Protein tragen, ist, zur Behandlung von Autoimmunkrankheit, mit Transplantation in Verbindung stehender Krankheit und/oder mit Komplementaktivierung in Verbindung stehender Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Blockierung durch Verwendung eines Peptids erreicht wird, das von einem Antikörper ableitet ist, der CLB-CD97/1, hinterlegt am 7. August 1997 bei der CNCM, Paris, unter der Eingangs-Nr. I-1908, entspricht.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Peptid von einer Aminosäuresequenz abgeleitet ist, die eine CD55-SCR1-Sequenz umfasst, und/oder von einer Aminosäuresequenz abgeleitet ist, die eine CD97-EGF1-Sequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Inhibierungsschritt durch funktionelle Deletion der Bindungsdomäne, die wenigstens die erste N-Terminale short consensus repeat von CD55 umfasst, erreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 12 oder 15, wobei der Inhibierungsschritt durch Blockierung der Bindungsstelle von entweder CD97 oder CD55 oder beiden erreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Blockierung unter Verwendung eines Antikörpers erreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Blockierung durch einen Antikörper erreicht wird, der CLB-CD97/1, hinterlegt am 7. August 1997 bei der CNCM, Paris, unter der Eingangs-Nr. I-1908, entspricht.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei der Antikörper humanisiert ist.
Verwendung einer Zelle, die ein modifiziertes CD55-Protein exprimiert, für die Herstellung eines Medikaments zur Störung der Wechselwirkung von CD55 und CD97, wobei die Modifikation die funktionelle Deletion der ersten N-terminalen short consensus repeat umfasst, für die Behandlung von Autoimmunkrankheit, mit Transplantation in Verbindung stehender Krankheit und/oder mit Komplementaktivierung in Verbindung stehender Krankheit.