DE10051396A1 - Verfahren und Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Herstellung von rezeptorbeschichteten Partikeln angegeben, welches die Schritte umfasst: DOLLAR A a) Bereitstellen eines Trägerkörpers, DOLLAR A b) Leiten einer Flüssigkeit mit Partikeln in oder auf den Trägerkörper, DOLLAR A c) Immobilisieren der Partikel auf mindestens einer Oberfläche des Trägerkörpers, DOLLAR A d) Leiten einer Flüssigkeit mit darin enthaltenen Rezeptoren oder Rezeptorbausteinen für die Synthese von polymeren Rezeptoren über die immobilisierten Partikel, DOLLAR A e) orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln der Rezeptoren oder Rezeptorbausteine an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers an die immobilisierten Partikel, DOLLAR A f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (d) und (e), bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers auf den immobilisierten Partikeln synthetisiert worden sind.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger.

Für die Grundlagenforschung in den Biowissenschaften und für die medizinische Diagnostik sowie für einige andere Disziplinen ist die Erfassung biologisch relevanter Informationen in definiertem Untersuchungsmaterial von herausragender Bedeutung. Dabei liegt die genetische Information in Form einer enormen Vielfalt von unterschiedlichen Nukleinsäuresequenzen vor, der DNA (desoxyribonucleic acid). Die Realisation dieser Information führt über die Herstellung von Abschriften der DNA in RNA (ribonucleic acid) meist zur Synthese von Proteinen, die ihrerseits häufig an biochemi­ schen Reaktionen beteiligt sind.

Zum technischen Hintergrund der Erfindung ist auf die Herstellung und Verwendung von Biochips hinzuweisen. Biochips sind normalerweise miniaturisierte, hybride Funktionselemente mit biologischen und technischen Komponenten, z. B. an einer Außenoberfläche oder Innenoberfläche immobilisierte Biomoleküle, die als spezifische Interaktionspartner dienen können. Sie werden für die miniaturisierte, hochparallele Analyse benötigt. Häufig weist die Struktur dieser Funktionselemente Reihen und Spalten auf, man spricht dann von "Arrays". Da Tausende von biologischen bzw. biochemischen Funktionselementen auf einem Biochip angeordnet sein können, müssen diese in der Regel mit mikrotechnischen Methoden angefertigt werden. Konventionelle Biochips haben üblicherweise eine 2D- Geometrie. Davon abweichend kann die Form eines Biochips auch aus der Anordnung von zwei oder mehreren 1D-Strukturen entstehen (z. B. Kapillaren). Eine Weiterführung der Geometrie ist eine 3D-Struktur, bei der die Analyse und ggf. auch Manipulation bzw. Steuerung von Reaktionen in einer 2D-Anordnung erfolgen. Als biologische und biochemische Funktions­ elemente kommen insbesondere in Frage: DNA, RNA, PNA (bei Nukleinsäu­ ren und ihren chemischen Derivaten können z. B. Einzelstränge, Doppel­ stränge, Triplex-Strukturen oder Kombinationen hiervon vorliegen), Saccharide, Peptide, Proteine (z. B. Antikörper, Antigene, Rezeptoren), Derivate der kombinatorischen Chemie (z. B. organische Moleküle), Zellbestandteile (z. B. Organellen), Zellen, Mehrzeller, Zellverbänder etc.

Zum technischen Hintergrund und zum Umfeld der vorliegend vorgestellten Erfindung wird auf folgende Patentanmeldungen bzw. Druckschriften verwiesen, deren Inhalt in vorliegender Anmeldung einbezogen wird:
DE 199 40 750 A; WO 0013018 A,
DE 199 40 751 A,
DE 199 40 752 A; WO 0013017 A,
DE 199 57 116; PCT/EP00/01356,
DE 199 35 433.2; PCT/EP00/07445,
DE 199 40 810.6; WO 0012123 A.

In der WO 0013018 A sind Träger für Analytbestimmungsverfahren und Vorrichtungen sowie Verfahren zur integrierten Synthese und Analytbestim­ mung an solchen Trägern beschrieben. Die Träger dienen als Basis für eine vorzugsweise lichtgesteuerte Synthese einzelner Basen (G, A, C und T) oder ganzer Oligonukleotide (Basensequenzen) zur Bildung einer hochparallelen, -planaren und -dichten Anordnung (Array) dieser Oligonukleotide in einer festen Trägermatrix (Chip). Der Träger enthält eine Struktur aus Mikrokanä­ len in einem zumindest teilweise durchsichtigen, flachen Körper. Die flüssigen Einsatzstoffe werden bei der Rezeptorsynthese oder -immobilisie­ rung durch die Kanäle im Trägerkörper geführt und binden, lokal aktiviert, an den Kanalwänden bzw. an bereits vorher an den Kanalwänden syn­ thetisierten Molekülen. Mit anderen Worten, die Produktion der Chips gemäß der WO 0013018 A bzw. der DE 199 40 750 A umfasst die Herstellung eines vorzugsweise mit Mikrokanälen versehenen Trägerkörpers aus einem geeigneten, lichtdurchlässigen Material sowie den biochemischen Beschichtungsvorgang an den Wänden der einzelnen Mikrokanäle, so dass anschließend die polymeren Rezeptoren, z. B. Oligonukleotide, in den Kanälen synthetisiert werden können. Hierbei werden in den einzelnen Kanälen im Träger mittels Fotoaktivierung durch eine geeignete Lichtquelle einzelne Rezeptorbausteine, oligomere Synthone (z. B. Di-, Tri-, Tetra- oder Pentanukleotide) oder ganze Basensequenzen (Oligos) ortsspezifisch angelagert. Dadurch entsteht in jedem Kanal eine Vielzahl an Rezeptor­ bestückten Bereichen (spezifische Bindungs- bzw. Hybridisierungsstellen), wobei jeder Bereich aufgrund seiner individuellen Rezeptor-Sequenz- Kombination für die Bindung und anschließende Detektion eines spezifischen Analyten, z. B. eines DNA-Fragments, dient. Die Bereiche sind in einer Dimension des planaren Trägers durch die Wände der Kanäle voneinander getrennt, und entlang der einzelnen Kanäle wird zwischen zwei benachbarten Bereichen bei der fotoaktivierten Bindung ein entsprechender Freiraum gelassen. Es entsteht ein hochparalleler, hochintegrierter Array von spezifischen Rezeptoren. Die Synthese der Rezeptoren und spätere Bestimmung von Analyten erfolgt bei dem aus WO 0013018 A bzw. DE 199 40 750 A bekannten System mittels einer Lichtemissions-Detektions­ einrichtung. Diese umfasst eine programmierbare Lichtquellenmatrix, eine Detektormatrix sowie den zwischen Lichtquellen- und Detektormatrix vorzusehenden Träger sowie ferner Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger. Zum Stand der Technik, betreffend den Aufbau von Lichtemissions-Lichtdetektionsein­ richtungen, wird auf die WO 0013017 A verwiesen.

Ausgehend von der vorstehend angesprochenen Technologie liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein weiter verbessertes Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Synthese einer Vielzahl von polymeren Rezeptoren zum Zweck der Bildung eines Rezeptor-Arrays für die Analytbestimmung bereitzustellen.

Zur Lösung der Aufgabe wird unter einem ersten Aspekt ein Verfahren zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger vorgeschla­ gen, welches die Schritte umfasst:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers;
• b) Leiten einer Flüssigkeit mit Partikeln in oder auf den Trägerkörper;
• c) Immobilisieren der Partikel auf mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche des Trägerkörpers;
• d) Leiten einer Flüssigkeit mit darin enthaltenen Rezeptoren oder Bausteinen für die Synthese von polymeren Rezeptoren über die immobilisierten Partikel;
• e) Orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln der Rezeptoren oder Rezep­ torbausteine an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers an die immobilisierten Partikel;
• f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte d) und e), bis die ge­ wünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers auf den immobilisierten Partikeln synthetisiert worden sind;
• g) Inkontaktbringen des Trägers bzw. der synthetisierten Rezeptoren mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe, und
• h) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezepto­ ren, die an die immobilisierten Partikel gekoppelt sind.

Bei den Partikeln handelt es sich vorzugsweise um sogenannte Mikrobeads oder Mikrokügelchen (microspheres), die beispielsweise im Wesentlichen aus Polystyren hergestellt sein können. Solche Mikrobeads sind käuflich erhältlich, z. B. von der Fa. Polyscience, Inc., Warrington, PA 18976, USA.

Allgemein können die Beads unter Standardbedingungen hergestellt werden und erlauben jede Art der Online- bzw. Offline-Oberflächenanalytik für die Qualitätskontrolle.

Mit Hilfe der Partikel (Mikrobeads) sollen betreffende Oberflächenbereiche des Trägerkörpers permanent oder temporär bedeckt werden. Die Anwen­ dung kann z. B. in einer Flusszelle erfolgen. Sie ist aber besonders inte­ ressant für geschlossene Mikrostrukturen, deren Mikrokanaloberflächen sich ansonsten jeder Oberflächenanalytik entziehen, was die Qualitätssicherung bei der Oberflächenfunktionalisierung erschwert.

Bei der permanenten Immobilisierung der Beads können diese z. B. kovalent oder nicht kovalent untereinander und/oder mit der Oberfläche des Trägerkörpers verbunden (z. B. verklebt) sein. In der Produktion hat dieses Verfahren den Vorteil, dass das Erzeugen der Oberfläche des Trägerkörpers sehr schnell in wenigen einfachen Verfahrensschritten erfolgen kann. Die oftmals aufwendige Funktionalisierung der Oberfläche für die biochemischen oder molekularbiologischen Anwendungen kann vorher in einem kon­ tinuierlichen oder Batchprozess an der Oberfläche der Beads erfolgen. Hier herrschen zudem optimale, fluidische Bedingungen für Mischvorgänge etc.

Der Aufbau einer temporären, reaktiven Oberfläche mit Hilfe von Beads in einem Trägerkörper ist besonders interessant. Sie kann im Zusammenhang mit in-situ-Verfahren, wie beispielsweise der in-situ-Synthese und Analyse von DNA/RNA etc. zum Einsatz kommen. Bei der temporären Bead- Oberfläche können Prinzipien wie magnetische Felder, elektrische Felder oder auch eine entsprechende Fluidführung im Trägerkörper als Haltekraft­ ursachen verwendet werden. (Die Beads müssen entsprechend magnetisch oder aber elektrisch geladen sein.) Die Haltekraft muss umso größer sein, je stärker die temporär entstehende Oberfläche aus Bead-Oberflächen später beansprucht wird. Ein großer Vorteil der temporären Immobilisierung liegt in der Kostenreduktion. Von einem Verfahrensdurchgang zum nächsten Verfahrensdurchgang sind lediglich die Beads auszuwechseln und nicht der komplette Trägerkörper. Der Trägerkörper verbleibt beispielsweise als fester Bestandteil im System. Entsprechend komplex kann er gestaltet sein. Dies erlaubt beispielsweise eine Vielzahl an Anschlüssen (z. B. fluidisch, elektrisch, optisch) sowie eine komplexe Fluidführung oder die Integration von Funktionselementen wie Detektions(CCD etc.)- oder Manipulations(Mik­ rofelder, Mikrotemperierung via CMOS-Schaltung im Trägerkörper)- Komponenten. Im Anschluss an die Anwendung der Mikrobeads zur Schaffung einer reversiblen Oberfläche können diese wieder aus dem Trägerkörper herausgelöst bzw. -gespült werden. Anschließend können die Beads mit z. B. herkömmlichen Methoden weiterverwendet werden. So kann z. B. eine Substanzbibliothek, welche auf den Beads entstanden ist, sehr einfach verfügbar gemacht werden.

Die Grundzüge des Lösungsweges der vorliegenden Erfindung betreffend die Immobilisierung der Partikel am Trägerkörper können wie nachstehend zusammengefasst werden:

Der Trägerkörper/das Trägersystem (z. B. eine Flusszelle, eine Kapillare oder eine Mikrokanalstruktur etc.) wird mit einer Mikrobead-Suspension benetzt, bespült, gefüllt oder durchströmt. Suspensionen geeigneter Konzentration im räumlichen Volumen über der bzw. den betreffenden Trägerkörperoberflächen liefern unter Ausnutzung der Gravitation oder elektrischer Felder (bei elektrisch geladenen Beads) bzw. magnetischer Felder (bei magnetischen, insbes. paramagnetischen Beads) oder durch eine entsprechende Fluidführung im Trägerkörper (bei gleichzeitiger Verwendung spezieller fluidischer Systeme) Strukturen, die im Idealfall einem Monolayer, also einer Einzellage, entsprechen und sich an einer oder mehreren Trägerkörperoberflächen, Membranen, Filtern etc. anlagern.

Diese neue vergrößerte Oberfläche wird von den Beads gebildet, die entsprechend ihrer Anwendung beschichtet bzw. funktionalisiert wurden.

Entsprechend ihrer Eigenschaften lassen sich für die mono- bis polyfunktio­ nalen Mikrobeads verschiedene Varianten für die Oberflächenfixierung (Immobilisierung der Beads) unterscheiden. Entscheidend für alle Varianten ist die Ortsgebundenheit während des gesamten Prozesses. Es kann zwischen temporären und permanenten "Beadoberflächen" unterschieden werden.

Permanente "Beadoberflächen"

Die Fixierung der präorganisierten Strukturen (Partikel) kann sowohl kovalent als auch nicht kovalent durch Ausnutzung adhäsiver Kräfte erfolgen. Im Falle des letzteren werden die Beads mit einem lösungsmittel­ beständigen Kleber aus der Schmelz-, Kontakt-, Dispersions-, Reaktions-, Polykondensations-, Polymerisations- oder Polyadditionsklebstoffklasse (z. B. einigen Epoxidklebern) auf der betreffenden Oberfläche bzw. den Ober­ flächen des Trägerkörpers irreversibel fixiert. Das Kleben beruht auf Adhäsion und setzt sich aus drei Komponenten zusammen: der mechani­ schen (Verankerung und Verzahnungseffekte), der physikalischen (hierzu gehören die klassischen nicht kovalenten Wechselwirkungen, wie z. B. van der Waals-, Dipol-Dipol- und andere elektrostatische Kräfte) und der chemischen Adhäsion (hierzu gehören neben Chemisorption auch kovalente Bindungen zwischen Klebstoff und Trägerkörperoberfläche und/oder Beads).

Die verbleibende bzw. verbleibenden Funktionalitäten, die sich selektiv, zum Teil unter Ausnutzung eines orthogonalen Schutzgruppenkonzeptes, adressieren lassen, dienen dem Ankoppeln von Molekülen bzw. Molekülver­ bänden. Auf diese Weise lassen sich auf Syntheseplätzen im Biochip (Trägerkörper mit immobilisierten Beads) verschiedene Biopolymere, z. B. Peptide und Oligonukleotide oder Biopolymere mit unterschiedlichen Sequenzen synthetisieren.

Temporäre "Beadoberflächen"/permanent - kovalent

Bei kovalenter Fixierung der präorganisierten Strukturen (Partikel) werden wiederum zwei Fixierungsvarianten unterschieden: eine vertikale Ver­ knüpfung mit der Trägerkörperoberfläche und eine laterale Verknüpfung zwischen den Mikrobeads.

Für die vertikale Verankerung auf den betreffenden Trägeroberflächen kommen u. a. die klassischen Kopplungsprinzipien der Biopolymersynthese (z. B. Peptid- bzw. Phosphoamiditchemie) in Betracht.

Wählt man für die laterale Verknüpfung ein reversibles Bindungsmotiv, z. B. die redoxpotentialabhängige Bildung eines Disulfides, so gelangt man zu temporären Oberflächen, die sich nach Beendigung des Gesamtprozesses aus dem Trägerkörpersystem rückstandslos entfernen lassen.

Bei mehrfach funktionalen Beadoberflächen dienen die verbleibenden Funktionalitäten dem Ankoppeln von Molekülen bzw. Molekülverbänden. Durch eine geeignete Auswahl oder/und durch Ausnutzung eines or­ thogonalen Schutzgruppenkonzepts lassen sich die verschiedenen Funktio­ nalitäten selektiv adressieren und auf einem Syntheseplatz im Biochip verschiedene Biopolymere-Beadkonjugate, z. B. Peptid und Oligonukleotid oder Biopolymere mit unterschiedlichen Sequenzen synthetisieren.

Temporäre "Beadoberflächen"/nicht kovalent

Eine weitere Variante stellt die Fixierung der präorganisierten Strukturen (Bead-Partikel) durch reine Haltekräfte, wie Graviationskräfte oder aber elektrische Felder (bei elektrisch geladenen Beads) oder magnetische Felder (bei magnetischen, insbesondere paramagnetischen Beads) oder durch eine entsprechende Fluidführung im Trägerkörper dar.

An die so temporär immobilisierten Beads lassen sich nun wiederum Moleküle bzw. Molekülverbände ankoppeln. Durch eine geeignete Auswahl oder/und durch Ausnutzung eines orthogonalen Schutzgruppenkonzepts lassen sich die verschiedenen Funktionalitäten selektiv adressieren und auf einem Syntheseplatz im Biochip verschiedene Biopolymere-Beadkonjugate, z. B. Peptid und Oligonucleotid oder Biopolymere mit unterschiedlichen Sequenzen synthetisieren.

Nach Beendigung des jeweiligen Verfahrensdurchlaufs kann die temporäre Mikrobeadoberfläche wieder aufgelöst und z. B. durch Spülen fluidisch entfernt werden. Das Auflösen kann z. B. durch Umkehrung oder auch schnellen Wechsel der magnetischen oder elektrischen Haltefelder oder durch eine Umkehrung der fluidischen Halteströmung erfolgen.

Mögliche in-situ-Verfahren sind:

• - die in-situ-DNA/RNA/LNA/PNA, Peptid- oder Proteinsynthese und Analyse (nasschemisch und/oder fotochemisch),
• - farbige Beads (magnetisch oder elektrisch angelagert), z. B. mit Limineszenzanwendung,
• - hochparallele ECL-Anwendungen (ECL-Array),
• - vorsynthetisierte Beads, also Beads mitvorsynthetisierten Molekülen, die verlängert werden,
• - magnetische Beads mit E-Feld für Hybridisierungsoptimierung (flächig oder pro Kanal oder punktuell/ortsaufgelöst durch integrierten Schaltungsbaustein),
• - magnetische Beads mit E-Feld und/oder Temperaturfeld für Hybridi­ sierungsoptimierung,
• - Bead-Bead-Interaktionen.

In einer abgewandelten Ausführungsform mit zunächst permanent immobilisierten Partikeln kann es vorgesehen sein, die Partikel auf chemi­ schem Wege von den Trägerwänden zu lösen und schließlich vom Träger durch Spülen etc. zu entfernen.

Wie bereits angedeutet, können bei der besonders bevorzugten "temporären Beadoberfläche" magnetische Felder, elektrische Felder oder auch eine entsprechende Fluidführung im Trägerkörper zur Erzeugung einer ent­ sprechenden Haltekraft für die Bead-Partikel Anwendung finden. Ent­ sprechend dem verwendeten Halteprinzip müssen die Bead-Partikel magnetisch oder/und elektrisch geladen bzw. polarisiert sein. Magnetisch präparierte Beads können beispielsweise einen Eisenoxidkern haben, der eine Silanbeschichtung aufweist. Solche Mikrobeads werden z. B. als superparamagnetische Partikel mit Abmessungen in der Größenordnung von 1 µm von der Firma Polyscience, Inc., angeboten. Bevorzugt ist die Verwendung von Beads mit mittlerem Durchmesser von 0,2 bis 10 µm, besonders bevorzugt von 0,4 bis 5 µm.

Die mit permanent immobilisierten Beads und die mit temporär immobilisier­ ten Beads präparierten Träger können auf all den Gebieten verwendet werden, die z. B. in der WO 0013018 A bzw. DE 199 40 750 A für Träger mit unmittelbar an den Trägerkörperwänden zu synthetisierenden Rezepto­ ren beschrieben sind.

Im Rahmen der Erfindung kann es ferner vorgesehen sein, dass die Bead- Partikel mehrfachfunktionalisiert, z. B. bifunktionalisiert, werden, etwa indem in separaten Syntheseschritten an den immobilisierten Bead- Partikeln ein Rezeptoraufbau und das Koppeln bzw. der Aufbau einer rezeptorspezifischen Markierungsgruppe erfolgt.

Ferner kann es im Rahmen der Erfindung vorgesehen sein, dass die Bead- Partikel untereinander wechselwirken (Bead-Bead-Interaktionen).

Allgemein ergibt sich als Anwendungsgebiet die flexible und kostengünstige Darstellung und Auswertung einer großen Zahl von individuellen und spezifischen Messplätzen in miniaturisiertem Format, z. B. durch miniaturi­ sierte, ortsaufgelöste Fotochemie und direkt anschließende Analyse.

Dadurch kann in Screening-, Analyse- und Herstellungsverfahren eine großen Messdatenmenge sowie eine Produktvielfalt erzeugt werden als Voraussetzung für die Bewältigung und ggf. Reproduktion der Informations­ fülle biologischer Systeme.

Die Anwendungsfelder sind entsprechend vielfältig und umfassen:

• - prinzipiell alle Anwendungen von Biochips, insbesondere DNA, RNA und Protein-Arrays,
• - Substanzentwicklung und Austesten von entsprechenden Substanzen (u. a. Pharmaforschung, Pharmacogenomics etc.),
• - Herstellung bzw. Synthese von biochemischen und molekularbiologi­ schen Substanzen,
• - molekulare Diagnostik, in-vitro-Diagnostik (IVD),
• - DNA-, RNA- und Protein-Analyse (Genom, Transkriptom, Physiom),
• - Screening nach molekularen Interaktionen (Immunologie, Pharmaka, Funktional Genomics),
• - Zytologie (u. a. 2D-Zellanalyse analog zu FACS-Technik),
• - Molekularbiologie,
• - Histologie,
• - Forensik.

Die erfindungsgemäße Nutzung von kleinen, immobilisierten Trägerpartikeln (Beads) als Basis für die Synthese von Rezeptoren bringt folgende Verbes­ serungen und Vorteile gegenüber dem Stand der Technik mit sich:

• - minimale Kosten für die Festphase (disposable Mikrobeads) und den Trägerkörper, da dieser wiederverwendbar ist;
• - einfache und kostengünstige Derivatisierung der Partikeloberfläche im Batch- oder einem kontinuierlichen Verfahren, da die chemischen Modifizierungen vorab außerhalb des Gesamtsystems durchgeführt werden können;
• - hohe Funktionsintegration bei niedrigen Verbrauchskosten;
• - einfache Qualitätskontrolle, da Standardanalysemethoden verwendet werden können;
• - erstmalige Kombination verschiedener Verfahren in einem System (so lässt sich z. B. durch die feste Integration des Mikrofluidmoduls (Trägerkörpers) auch eine aufwendigere Elektronik z. B. zur Temperie­ rung, zur Erzeugung von elektrischen und/oder magnetischen Feldern oder zur Messung bzw. Detektion optischer bzw. elektrischer Signale etc. mit der Mikrofluidik kombinieren). Die Verbrauchsmaterialskosten bleiben dennoch vergleichsweise gering.
• - Es wird eine systematische Kontrolle und Qualitätssicherung der reaktiven Oberflächen (Bead-Oberflächen) in der Produktion und ferner die Verwendung von Mikrofluidik in geschlossenen Mikrostruk­ turen bei den Synthese- und Analyseschritten möglich,
• - über eine Messung z. B. der Eigenfluoreszenz der Beads oder aber angelagerter Fluoreszenzmarker oder ggf. anderer Label kann die Dichte der Beads vor dem Verfahren festgestellt werden. Diese Label können gemäß einer Verfahrensvariante bei Bedarf im Vorfeld des eigentlichen Verfahrens auch wieder entfernt werden.

Weiterbildungen des Verfahrens zur integrierten Synthese und Analytbestim­ mung nach Anspruch 1 sind in den Ansprüchen 2 - 15 angegeben.

Gegenstand der Erfindung ist gemäß Anspruch 16 auch ein Verfahren zur Herstellung von rezeptorbeschichteten Partikeln für die Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers,
• b) Leiten einer Flüssigkeit mit Partikeln in oder auf den Trägerkörper,
• c) Immobilisieren der Partikel auf mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche des Trägerkörpers,
• d) Leiten einer Flüssigkeit mit darin enthaltenen Rezeptoren oder Bausteinen für die Synthese von polymeren Rezeptoren über die immobilisierten Partikel,
• e) orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln der Rezeptoren oder Rezep­ torbausteine an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers an die immobilisierten Partikel,
• f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte d) und e), bis die gewünsch­ ten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers auf den immobilisierten Partikeln synthetisiert worden sind.

Die mit Rezeptoren versehenen Partikel können beispielsweise aus dem Trägerkörper ausgebracht und später an anderer Stelle, beispielsweise in einem anderen Trägerkörper, für die Bestimmung von Analyten he­ rangezogen werden.

Gegenstand der Erfindung ist gemäß Anspruch 17 auch ein Verfahren zum Bestimmen eines oder mehrerer Analyten auf einem Träger, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers mit mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche, wobei Partikel mit daran gekoppelten Rezeptoren an jeweils vorbestimmten Positionen der Oberfläche immobilisiert sind, wobei Partikel in unterschiedlichen Bereichen unterschiedliche Rezeptoren tragen,
• b) Inkontaktbringen des Trägerkörpers mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe und
• c) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezepto­ ren, die an die immobilisierten Partikel gekoppelt sind.

Gegenstand der Erfindung ist gemäß Anspruch 18 auch ein Verfahren zum Bestimmen eines oder mehrerer Analyten auf einem Träger, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers mit mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche,
  wobei Partikel mit daran gekoppelten Rezeptoren an der Oberfläche immobilisiert sind,
  wobei mehrere kodierte Partikelspezies mit jeweils unterschiedlichen Rezeptoren verwendet werden und
  die Immobilisierung eine magnetische oder/und elektrische Wechselwirkung umfasst,
• b) Inkontaktbringen des Trägerkörpers bzw. der Rezeptoren mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe und
• c) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezepto­ ren, die an die immobilisierten Partikel gekoppelt sind.

Die Codierung der Partikelspezies kann z. B. eine Farbcodierung, eine Größencodierung oder/und eine Codierung in Form einer rezeptorspezifi­ schen Markierungsgruppe an der Partikeloberfläche sein.

Gegenstand der Erfindung ist gemäß Anspruch 19 auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-15 oder zur Durchführung wenigstens eines der Verfahren nach den Ansprüchen 16, 17 oder 18, mit einem Trägerkörper, welcher wenigstens einen inneren oder/und einen äußeren Oberflächenbereich zur Anlagerung von an ihrer Oberfläche funktionalisierten Partikeln, insbesondere Mikrobeads, aufweist, Mitteln zur Zufuhr der Partikel zu dem wenigstens einen Oberflächenbereich des Trägerkörpers, einer Einrichtung zur Immobilisierung der Partikel an den wenigstens einen Oberflächenbereich des Trägerkörpers, Mitteln zur Zuführung von Rezeptoren oder Rezeptorbausteinen A, B zu auf dem wenigstens einen Oberflächenbereich immobilisierten Partikeln und Mitteln zur Steuerung des orts- und/oder zeitspezifischen Koppelns der Rezeptoren oder Rezeptorbausteine A, B an die immobilisierten Partikel an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers.

Weiterbildungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den An­ sprüchen 20-30 angegeben.

In einer erweiterten Darstellung können Aspekte der Erfindung wie folgt umschrieben werden: Sie betrifft ein Verfahren zur in-situ-Herstellung von permanenten oder temporären Oberflächen, bestehend aus einer Vielzahl in Abhängigkeit zur geplanten Anwendung derivatisierten Partikeln (Beads) geeigneter Dimension (Durchmesser im Bereich von µm oder nm).

In Ausgestaltung des Verfahrens kommt als Trägersystem z. B. eine Flusszelle, eine Kapillare oder eine Mikrokanalstruktur, etwa aus Gläsern, Platten aus unterschiedlichen Materialien, wie Si, Ge oder aber Kunst­ stoffen, in Frage. Ferner können als Trägersysteme Membranen, Filter etc. in Frage kommen. Die Beads werden auf dem Trägersystem präorganisiert.

Die Präorganisation kann z. B. durch Gravitation erfolgen, wobei es zur Ausbildung von Strukturen kommt, die vorzugsweise einem Monolayer oder einem geordneten Multilayer entsprechen.

Einerseits kann die Präorganisation durch elektrische Felder (bei elektrisch geladenen Beads) erfolgen, wobei es zur Ausbildung von Strukturen kommt, die vorzugsweise einem Monolayer oder einem geordneten Multilayer entsprechen.

Andererseits kann die Präorganisation durch magnetische Felder (bei paramagnetischen Beads) erfolgen, wobei es zur Ausbildung von Strukturen kommt, die vorzugsweise einem Monolayer oder einem geordneten Multilayer entsprechen.

Andererseits kann die Präorganisation durch eine entsprechende Fluidfüh­ rung im Trägerkörper (bei gleichzeitiger Verwendung spezieller, fluidischer Systeme) erfolgen, wodurch es zur Ausbildung von Strukturen kommt, die vorzugsweise einem Monolayer oder einem geordneten Multilayer ent­ sprechen.

Zweckmäßigerweise werden die Beads aus einer Suspension geeigneter Konzentration im räumlichen Volumen über der bzw. den Oberflächenberei­ chen des Trägerkörpers an einem oder mehreren Oberflächenbereichen angelagert.

Die temporäre Oberfläche der präorganisierten Beads wird durch Haltekräfte, wie Gravitationskräfte oder aber elektrische Felder (bei elektrisch geladenen Beads) oder magnetische Felder (bei magnetischen Beads) oder durch eine entsprechende Fluidführung im Trägerkörper fixiert und der geplanten Anwendung zugänglich gemacht.

In anderer Ausgestaltung können die präorganisierten Beads lateral kovalent miteinander verwendet werden und so im Träger fixiert werden, dass sie der geplanten Anwendung zugänglich gemacht werden.

In Abhängigkeit des Bindungsmotivs erhält man eine temporäre oder permanente Oberfläche.

Durch Verwendung eines reversiblen Bindungsmotivs (z. B. die redoxaktive Thiolchemie) erhält man eine temporär fixierte Oberfläche.

In weiterer Ausgestaltung werden die präorganisierten Beads vertikal kovalent mit der Trägerkörperoberfläche verknüpft und so im Trägerkörper fixiert, dass sie der geplanten Anwendung zugänglich gemacht werden.

Für die vertikale Verankerung auf den Trägerkörperoberflächen kommen u. a. die klassischen Kopplungsprinzipien der Biopolymersynthese (z. B. Peptid- bzw. Phosphoamiditchemie) in Betracht.

In anderer Ausgestaltung werden die präorganisierten Beads durch Adhäsion auf den Trägerkörperoberflächen verklebt und so im Trägerkörper fixiert, dass sie der geplanten Anwendung zugänglich gemacht werden.

Zum Verkleben kommen folgende Klebstoffklassen in Betracht: Schmelz-, Kontakt-, Dispersions-, Reaktions-, Polykondensations-, Polymerisations- oder Polyadditionsklebstoffe. Insbesondere eignet sich zum Verkleben Polyadditionsklebstoff auf lösungsmittelstabiler Epoxidbasis.

Die verbleibenden Funktionalitäten dienen für das Ankoppeln der in Betracht kommenden Moleküle bzw. Molekülverbände.

Die multifunktionalen Beadoberflächen dienen vorzugsweise zum Ankoppeln verschiedener Spezies, so dass auf einem Syntheseplatz im Biochip (Trägerkörper mit immobilisierten Beads) verschiedene Biopolymere- Beadkonjugate z. B. Peptid oder Oligonucleotid oder Biopolymere mit unterschiedlichen Sequenzen synthetisieren kann. Dies kann durch Ausnutzung eines orthogonalen Schutzgruppenkonzepts, mit dem sich die verschiedenen Funktionalitäten selektiv adressieren, erfolgen.

Die Erfindung ist zu Herstellung bzw. Analyse von Substanzbibliotheken geeignet. Durch Leiten einer Probe über den Träger mit den immobilisierten Beads können Bestandteile der Probe über spezifische Bindungsereignisse extrahiert werden. Dabei können insbesondere Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen, wie Proteinen oder Peptiden und den Beads untersucht werden, so dass die Erfindung auch für das Feld der Proteomanalyse (Proteomics) geeignet ist.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert.

Fig. 1 zeigt in einer Blockschaltbild-Darstellung eine Vorrichtung nach der Erfindung.

Fig. 2a und 2b zeigen ausschnittsweise Längsschnittdarstellungen eines Mikrokanals mit darin befindlichen Bead-Partikeln im nicht­ immobilisierten Zustand (Fig. 2a) und im immobilisierten Zustand (Fig. 2b).

Fig. 3a-3c zeigen in ausschnittsweisen Längsschnittdarstellungen entsprechend der Perspektive in den Fig. 2a und 2b einen Fluidkanal des Trägerkörpers während dreier, verschiedener Schritte bei der Durchführung eines Syntheseverfahrens.

Fig. 4a zeigt in einer Draufsicht einen Schnitt durch einen Fluidkanal des Trägerkörpers, wobei ein auf den Querschnitt projiziertes Belichtungsmuster einer Belichtungsmatrix mit eingezeichnet worden ist.

Fig. 4b zeigt einen vergrößerten Ausschnitt aus Fig. 4a.

Fig. 5 zeigt in einer Blockschaltbild-Darstellung eine Variante der Vorrichtung nach der Erfindung.

Fig. 6 zeigt in einer Blockschaltbild-Darstellung eine weitere Variante der Vorrichtung nach der Erfindung.

Fig. 7 zeigt ein Helmholtz-Spulenpaar aus Fig. 6 in der in Fig. 6 mit dem Pfeil VII angedeuteten Blickrichtung.

Fig. 8 zeigt in einer ausschnittsweisen Längsschnittdarstellung einen Fluidkanal des Trägers mit einer Porenwand zur Immobilisie­ rung von Bead-Partikeln.

Fig. 9 zeigt ausschnittsweise eine Draufsicht auf die Porenwand aus Fig. 8.

Fig. 10 zeigt eine ausschnittsweise Draufsicht auf eine Porenwand mit einer dichteren Porenverteilung als in Fig. 9, wobei die Poren in Fig. 10 mehr oder weniger ungeordnet verteilt sind.

Fig. 11 zeigt ein weiteres Beispiel einer mit Poren versehenen Wand.

Fig. 12 zeigt eine ausschnittsweise Längsschnittdarstellung eines Fluidkanals des Trägerkörpers mit einer porösen Zwischen­ wand, welche ein Array aus Säulen und Vertiefungen bildet.

Fig. 13 zeigt eine ausschnittsweise Draufsicht auf die Zwischenwand aus Fig. 12.

Fig. 14 zeigt in einer ausschnittsweisen Längsschnittdarstellung eine Variante einer bereichsweise porösen Zwischenwand der in Fig. 12 gezeigten Art.

Die Fig. 15-17 zeigen in stark vergrößerten Ausschnitten und in Draufsichts­ darstellungen Formen und Verläufe verschiedener Varianten von Mikrokanälen in einem Trägerkörper.

Fig. 1 zeigt eine schematische Blockdarstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung für ein lichtgestütztes, integriertes Synthese- und ggf. Analyseverfahren. Die Vorrichtung umfasst einen Trägerkörper 2, der von in Fig. 1 nicht erkennbaren Kanälen für den Fluidtransport durchsetzt ist. Der Trägerkörper 2 kann in einer Weise ausgebildet sein, wie es z. B. in der WO 0013018A oder in der deutschen Patentanmeldung DE 199 35 433.2 und der korrespondierenden, internationalen Patentanmeldung PCT/EP00/07445 beschrieben ist. Deren Offenbarungsgehalt wird insoweit in die vorliegende Anmeldung einbezogen.

Der Trägerkörper 2 befindet sich zwischen einer zur Erzeugung bestimmter Belichtungsmuster programmierbar steuerbaren Belichtungsmatrix 4 und einer Lichtdetektormatrix 6. Für Licht der Belichtungsmatrix 6 ist der Trägerkörper 2 transparent.

Bei der Belichtungsmatrix kann es sich z. B. um eine Lichtquellenmatrix handeln, die ein zweidimensionales Array aus Leuchtdioden, insbesondere UV-Dioden, oder Laserelementen, insbesondere UV-Laserelementen, umfasst. Als Belichtungsmatrix kommt auch eine Matrix aus steuerbaren Reflexionselementen in Frage, wobei dann eine zusätzliche Lichtquelle erforderlich ist. Als Belichtungsmatrix kommt ferner eine Lichtventilmatrix, etwa eine LCD-Matrix, in Frage. Die auch im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugten Möglichkeiten der Realisierung einer Belichtungsmatrix sind in der WO 0013017 und in der DE 199 40 752 A näher beschrieben.

Die Programmierbarkeit der Belichtungsmatrix 4 ist in die Systemkom­ ponente 8 integriert, welche einen Steuerrechner umfasst, der entspre­ chende Steuersignale an die Belichtungsmatrix 4 abgibt. Die Belichtungs­ matrix 4 belichtet den transparenten Träger 2 nach Maßgabe des jeweiligen vom Steuerrechner 8 im aktuellen Belichtungsschritt vorgegebenen Belichtungsmusters. Über ein fluidisches Anschlusssystem 10 werden die vom Fluidikmodul 12 bereitgestellten Fluide in den Trägerkörper 2 trans­ portiert und in dessen in der Zeichnung nicht dargestellten Mikrokanal­ struktur an die Reaktionsbereiche für die Rezeptorsynthese weitergeleitet.

Das in den Trägerkörper 2 eintretende Licht kann ggf. für Absorptions­ messungen, für die Aktivierung von Fotoreaktionen oder/und für das Anregen von Fluoreszenz genutzt werden. Das aus dem Trägerkörper 2 austretende Licht kann beispielsweise das im Durchlicht den Trägerkörper 2 passierende Licht der Belichtungsmatrix 4 sein. Es kann sich dabei jedoch auch um Lichtsignale handeln, die in den einzelnen Reaktionsbereichen in dem Trägerkörper 2 durch beispielsweise Fluoreszenz oder Lumineszenz erzeugt werden. Die Detektormatrix 6, die zum Beispiel aus einem CCD-Chip mit oder ohne zwischengeschalteten, optischen Elementen besteht, ist in Fig. 1 so gegenüber der Belichtungsmatrix 4 mit dem dazwischen liegenden Trägerkörper 2 angeordnet, dass dadurch eine dreifache Matrixanordnung aus Belichtungs-, Träger- und Detektormatrix entsteht. Das Fluidmodul 12 dient der Versorgung von Reaktionsbereichen im Trägerkörper 2 zum Beispiel mit Einsatzstoffen, Schutzgasen, Chemikalien, wie Lösemitteln, etc. und Probenmaterial. Das Fluidmodul 12 besteht aus Tanks 14, die durch Pumpen 16 und Ventile 18 in geeigneter Weise entleert werden. Die Tanks 14 können einzeln oder im Cluster ausgewechselt oder neu gefüllt werden. Permanent benötigte Fluide, wie beispielsweise Schutzgas, können auch mittels Leitungen von außen liegenden Reservoirs zugeführt werden. Der fluidische Abfall der verschiedenen Verfahrensschritte kann in einem Abfallsystem 20 aufgefangen werden.

Die Vorrichtung umfasst ferner Mittel 22 zur Zuführung von oberflächen­ funktionalisierten Partikeln, vorzugsweise Mikrobeads, zu dem Trägerkörper 2. Die Mittel 22 umfassen ein Reservoir 24 für die Bereitstellung einer Partikelsuspension (Mikrobead-Suspension) sowie eine Pumpe 26 zur Förderung der Suspension aus dem Reservoir 24 in das Kanalsystem des Trägerkörpers 2. Der Trägerkörper 2 ist über eine Leitung 28 mit der Pumpe 26 verbunden. Die Mittel 22 zur Zuführung oberflächenfunktionalisierter Partikel zum Trägerkörper 2 können alternativ in das Fluidmodul 12 integriert sein.

Nur allgemein schematisch ist in Fig. 1 bei 30 eine Einrichtung zur temporären Immobilisierung der aus dem Reservoir 24 zugeführten Partikel an Oberflächen der Fluidkanäle des Trägerkörpers 2 angedeutet.

Mit 32 ist in Fig. 1 ein Auffangsystem für Partikel mit an der Oberfläche ansynthetisierten Rezeptoren bezeichnet, Der Steuerrechner 8 übernimmt die Steuerung bzw. Regelung des Systems. Hierunter fallen auf der Basis der Berechnung der Sonden- bzw. Rezeptorse­ quenzen für die einzelnen Reaktionsbereiche die Steuerung der Belichtungs­ matrix 4 sowie des Fluidmoduls 12. Hierunter fallen ferner die Steuerung der Einrichtung 30 zur temporären Immobilisierung der Partikel (Mikrobeads) an den Fluidkanaloberflächen im Trägerkörper 2. Ferner erfasst der Steuer­ rechner 8 die Daten der Detektormatrix 6, um diese auszuwerten oder ggf. zur Auswertung über eine Schnittstelle 34 an daran anzuschließende System weiterzugeben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an dem Träger 2 wird in einem ersten Schritt die Pumpe 26 aktiviert, damit sie aus dem Reservoir 24 die Mikrobead-Suspension in das Kanalsystem des Trägerkörpers 2 fördert. Der Steuerrechner 8 aktiviert die Einrichtung 30, woraufhin sich Mikrobeads aus der Suspension an Fluidkanalflächen des Trägerkörpers 2 absetzen und dort verbleiben. Der Vorgang kann mittels der Detektormatrix 6 optisch überwacht werden.

Nach Immobilisierung einer Lage von Mikrobeads im Trägerkörper 2 und nach Ausspülen der für das weitere Verfahren nicht mehr benötigten Restsuspension können die Rezeptorsyntheseschritte erfolgen. Hierzu steuert der Steuerrechner 8 jeweils die Belichtungsmatrix 4 nach einem Programm zur Erzeugung der betreffenden Belichtungsmuster an. An den belichteten Stellen kommt es zur Abtrennung fotolabiler Schutzgruppen von den Mikrobeads. An diesen entschützten Stellen können dann Rezeptorbau­ steine ankoppeln, die mit einem Fluid aus dem Fluidmodul 12 zugeführt werden und ihrerseits fotolabile Schutzgruppen tragen, die bei einem nächsten oder späteren Syntheseverfahrensschritt durch Belichtung abgetrennt werden können, um einen nächsten Synthesebaustein an die betreffenden entschützten Stellen ankoppeln zu können. Die lichtgesteuerte Synthese von Rezeptoren (allerdings unmittelbar auf Flächen des Trägerkör­ pers) ist insoweit in der WO 0013018 A und der DE 199 40 750 A beschrieben.

Nachdem die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers 2 auf den immobilisierten Mikrobeads synthetisiert worden sind, kann der Schritt der Analytbestimmung erfolgen, wobei die Rezeptoren mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht werden, wobei dann das Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezeptoren, d. h. über den Nachweis der Bindung an bestimmte Rezeptoren erfolgt.

Vorzugsweise umfasst die Einrichtung 30 zur Immobilisierung der Mikro­ beads Mittel zur Erzeugung eines Magnetfeldes (B-Feldes) quer zur Strömungsrichtung in den Fluidkanälen des Trägerkörpers 2. Die Mikrobeads sind in diesem Fall magnetisch präpariert. Damit lässt sich dann die anhand der Fig. 2a und 2b zu erläuternde Situation der Immobilisierung der Mikrobeads 46 herbeiführen. Fig. 2a zeigt in einer Ausschnittsdarstellung einen Längsschnitt eines Fluidkanals (Mikrokanals) 40 eines Trägerkörpers 2 mit einer transparenten Deckschicht 42 und einem vorzugsweise ebenfalls transparenten Boden 44. Der Kanal 40 wird in der Darstellung gemäß Fig. 2a von einer Mikrobead-Suspension mit magnetischen Mikrobeads 46 durchströmt.

Nach Einschalten des B-Feldes kommt es zur Situation gemäß Fig. 2b, in der die Beads 46 aufgrund ihrer magnetischen Wechselwirkung mit dem B-Feld an der inneren Oberfläche des Mikrokanals 40 festgehalten und somit immobilisiert worden sind. Zur Erzeugung des B-Feldes können Permanent­ magneten oder/und elektrische Magnetspulen herangezogen werden.

Die Situation gemäß Fig. 2b kann auch herbeigeführt werden, wenn elektrisch geladene bzw. elektrisch polarisierte Mikrobeads verwendet werden und zu deren Immobilisierung in den Fluidkanälen 40 des betreffen­ den Trägerkörpers 2 ein elektrisches Feld quer zur Strömungsrichtung erzeugt wird. Dabei kann es vorgesehen sein, dass ein ausgedehntes elektrisches Feld über die Fläche des Trägerkörpers hinweg erzeugt wird. Andererseits kann es auch vorgesehen sein, dass punktuell und orts­ aufgelöst in Bezug auf bestimmte Reaktionsbereiche elektrische Felder erzeugt werden, z. B. mittels in den Trägerkörper integrierten, elektronischen Elementen, wie etwa CMOS-Transistoren oder ggf. transparente Elektroden, wie sie bei Flüssigkristallanzeigen verwendet werden.

Fig. 3a zeigt in einer der Fig. 2a entsprechenden Darstellung den Mikrokanal 40, der von magnetischen Mikrobeads mit fotolabilen Schutzgruppen x in einer betreffenden Suspension durchströmt wird.

Fig. 3b illustriert einen Syntheseschritt, nachdem durch Einschalten des B- Feldes magnetische Mikrobeads 46 in einer im Beispielsfall planar angeord­ neten 1-Layerschicht immobilisiert worden sind und nachdem in einem vorausgegangenen Syntheseschritt einige Mikrobeads bereits einen kovalent angekoppelten Synthesebaustein A mit fotolabiler Schutzgruppe x aufweisen. 4 kennzeichnet in Fig. 3b die Belichtungsmatrix, wobei sie in dem betrachteten, aktuellen Belichtungsschritt unterhalb der Stelle H den Trägerkörper 2 durch dessen transparente Deckschicht 42 hindurch belichtet, wohingegen von den Stellen D der Belichtungsmatrix 4 momentan kein Licht zum Trägerkörper 2 hin emittiert oder ggf. reflektiert wird, so dass unterhalb von D ein "Dunkelfeld" vorliegt. Die Strahlung des "Hell­ feldes" H führt in dem belichteten Bereich zur Abspaltung der fotolabilen Schutzgruppen x, so dass an den so entschützten Mikrobeads 46 bzw. Synthesebausteinen A weitere Synthesebausteine B mit fotolabilen Schutzgruppen x ankoppeln können, wie dies in Fig. 3c angedeutet ist. Die Belichtungsschritte mit programmiert gesteuerter Auswahl des jeweiligen Belichtungsmusters und die fluidische Zufuhr betreffender Synthesebau­ steine mit fotolabilen Schutzgruppen wird wiederholt, bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers 2 auf den immobilisierten Partikeln 46 synthetisiert worden sind.

Fig. 4a zeigt in einer ausschnittsweisen Draufsicht auf einen Schnitt durch den Trägerkörper 2 einen Fluidkanal (Mikrokanal) 40 und einen Ausschnitt aus einem Schachbrettmuster-artigen Hell-Dunkel-Lichtfeld, wie es von der Belichtungsmatrix 4 erzeugt werden kann.

Fig. 4b zeigt einen vergrößerten Ausschnitt aus Fig. 4a, nämlich einen Bereich des Fluidkanalbodens mit dem darauf projizierten Hell-Dunkel- Lichtfeld. Darin ist zu sehen, dass in einem jeweiligen Belichtungsfeld­ element eine größere Anzahl an immobilisierten Mikrobeads 46 vorgesehen sein kann. Die Dichte der Belegung kann z. B. durch die Konzentration der Mikrobeads 46 in der ursprünglichen Mikrobead-Suspension oder durch entsprechende Wahl der Zeit, in der die Fluidkanäle 40 bei eingeschaltetem Magnetfeld (oder ggf. E-Feld) von der Mikrobead-Suspension durchströmt werden. Wie bereits erwähnt, kann die Belegung der Kanäle 40 mit immobilisierten Beads 46 großflächig, z. B. durch ein entsprechendes B-Feld oder ggf. E-Feld, erfolgen. Alternativ könnte die Belegung auch orts­ aufgelöst, z. B. durch ortsaufgelöste lokale E-Felder, B-Felder oder ggf. auch durch optische Lichtfallen (analog einer sogenannten Laserpinzette) erfolgen.

In Bezug auf die Fig. 4a und 4b ist darauf hinzuweisen, dass für einen folgenden Belichtungsschritt ein anderes Belichtungsmuster als das gezeigte Schachbrett-Muster erzeugt werden kann.

In Fig. 5 ist ein Blockschaltbild einer erfindungsgemäßen Vorrichtung für Auflichtbeobachtung gezeigt. Entsprechend den Bezugszeichen in Fig. 1 umfasst die Vorrichtung einen Steuerrechner 8, eine Belichtungsmatrix 4, eine Detektionsmatrix 6, ein Fluid-Handlingsystem (Fluidmodul) 12 für die Zufuhr der Beadsuspension zum Trägerkörper 2 und für die Zufuhr der für die Rezeptorsynthese erforderlichen Chemikalien. Als Einrichtung 30 zur Immobilisierung der Mikrobeads am Trägerkörper 2 ist eine ggf. wahlweise aus der dargestellten Position entfernbare Magnetvorrichtung an der der Belichtungsmatrix 4 abgewandten Seite des Trägerkörpers 2 vorgesehen. Die Einrichtung 30 kann Magnetspulen oder/und Permanentmagneten enthalten. Mit 7 ist ein optischer Strahlteiler in Fig. 5 gekennzeichnet, der Licht der Belichtungsmatrix 4 zum Trägerkörper 2 hin durchlässt. Vom Trägerkörper 2 kommendes Licht reflektiert der Strahlteiler 7 zur Detektions­ matrix 6. Bedarfsweise kann der Strahlteiler 7 aus dem Strahlengang zwischen Belichtungsmatrix 4 und Trägerkörper 2 herausbewegt werden.

Bei der in Fig. 6 schematisch dargestellten Variante der Vorrichtung aus Fig. 5 weist die Einrichtung zur Immobilisierung der Beads ein Helmholtz- Spulenpaar 30 zur Erzeugung eines B-Feldes auf. Eine Spule des Helmholtz- Spulenpaares befindet sich unterhalb des Trägerkörpers 2, wohingegen die andere Helmholtz-Spule oberhalb des Trägers 2 positioniert ist.

Fig. 7 zeigt eine Draufsicht auf den Trägerkörper 2 und die Helmholtz- Spulen 30, wobei zu erkennen ist, dass die Helmholtz-Spulen 30 den Trägerkörper 2 im Belichtungsstrahlengang nicht abschatten. Dies bedeutet auch, dass mittels der Detektionsmatrix 6a eine Durchlichtbeobachtung des Trägerkörpers 2 und der darin bzw. daran vorgesehenen Partikel durch­ geführt werden kann.

Bei den bisherigen Ausführungsbeispielen erfolgte die Immobilisierung der Mikrobeads mittels magnetischer, elektrischer bzw. elektromagnetischer Felder. Fig. 8 illustriert eine andere Möglichkeit der Immobilisierung von Mikrobeads in einem Mikrokanal 40 des Trägerkörpers 2. Fig. 8 zeigt ausschnittsweise einen Längsschnitt durch einen Fluidkanal 40, der von einer Zwischenwand 52 in einen Hauptströmungskanal 40a und einen Unterdruckkanal 40b unterteilt ist. Die Zwischenwand 52 weist eine Vielzahl von Mikroporen 54 auf, welche den Hauptströmungskanal 40a mit dem Unterdruckkanal 40b verbinden. Der Unterdruckkanal 40b ist an einer einen Unterdruck gegenüber dem Druck im Hauptströmungskanal 40a erzeugenden Pumpe angeschlossen. Die Mikrobeads 46 im Hauptströmungskanal 40a werden bei der Anordnung gemäß Fig. 8 an der Zwischenwand 52 aufgrund der eingestellten Druckverhältnisse immobilisiert. Der Durchmesser der Mikroporen 54 kann sehr viel kleiner sein, als der Durchmesser der Mikrobeads, wie es in Fig. 8 angedeutet ist.

Fig. 9 zeigt eine schematische Draufsicht auf einen Bereich der Zwischen­ wand 52 in Fig. 8. In Fig. 9 ist zu erkennen, dass die Poren 54 geordnet in einem Raster vorgesehen sind, so dass eine entsprechende Rasteranordnung der immobilisierten Beads 46 erfolgen kann.

Alternativ könnte eine statistische bzw. zufällige Verteilung der Poren mit großer Porendichte in einer Zwischenwand 52 vorgesehen sein, wie dies in einer der Perspektive gemäß Fig. 9 entsprechenden Ansicht in Fig. 10 angedeutet ist. In diesem Sinne könnte die Zwischenwand 52 aus einem in sich porösen Material bestehen.

Aus der Detaildarstellung einer Zwischenwand in Fig. 1 l ist zu erkennen, dass eine Variante möglich ist, bei der der Durchmesser der Poren 54 nur geringfügig kleiner ist, als der Durchmesser der Mikrobeads 46.

Fig. 12 zeigt eine weitere Möglichkeit der Immobilisierung von Mikrobeads 46 an einem Trägerkörper 2 auf. Fig. 12 zeigt ausschnittsweise einen Längsschnitt durch einen Fluidkanal 40 des nun betrachteten Trägerkörpers 2. In dem Fluidkanal 40 ist eine Zwischenwand 52a vorgesehen, welche den Fluidkanal in einen oberen Hauptströmungskanal 40a und einen unteren Unterdruckkanal 40b unterteilt. Im Unterdruckkanal 40b herrscht geringerer Druck als im Hauptströmungskanal 40a.

Die Zwischenwand 52a weist zwischen Mikrosäulen 56 aus Silizium, Foturan oder Kunststoff etc. Vertiefungen 58 auf, deren Böden 60 Mikroporen enthalten oder aus in sich porösem Material bestehen. Die Mikroporen in den Böden 60 erlauben Fluidströmung vom Hauptströmungs­ kanal 40a zum Unterdruckkanal 40b mit entsprechendem Druckabfall. Dabei kommt es zur Anlagerung von in einer Suspension zugeführten Mikrobeads 46 in den Vertiefungen 58.

Wie die ausschnittsweise Draufsicht auf die Zwischenwand 52a gemäß Fig. 13 erkennen lässt, sind die Vertiefungen 58 und Säulen 56 im Beispielsfall nach Art eines Schachbrett-Musters angeordnet.

In Fig. 14 ist illustriert, dass die Vertiefungen 58 alternativ so gestaltet sein können, dass lediglich eine Lage an Mikrobeads 46 jeweils aufgenommen werden kann.

Es sei darauf hingewiesen, dass bei den Ausführungsformen nach den Fig. 8-14 unterstützend ein B-Feld oder/und ein E-Feld bei ent­ sprechend magnetisch bzw. elektrisch präparierten Mikrobeads zu deren Immobilisierung verwendet werden kann.

Es sei ferner darauf hingewiesen, dass Mittel zur ganzheitlichen oder lokalen Temperierung des Trägers durch optischen oder elektrischen Energieeintrag vorgesehen sein können. Denkbar sind mikrotechnisch in den Trägerkörper integrierte Widerstandsheizelemente, die ortsspezifische Temperierung ermöglichen.

Weiterhin ist allgemein darauf hinzuweisen, dass bei Ausführungsformen mit elektrischer Immobilisierung der Beads ein den betreffenden Trägerkörper 2 ganzheitlich durchsetzendes E-Feld oder ortsspezifisch lokale, elektrische Felder Anwendung finden können, wobei letztere z. B. durch individuell angesteuerte Elektroden auf einer CMOS-Schaltung und/oder mittels transparenter LCD-Elektroden erzeugt werden können.

Auch bei den Ausführungsformen mit magnetischer Immobilisierung der Beads kann es vorgesehen sein, dass ein den Trägerkörper ganzheitlich durchsetztes Magnetfeld erzeugt wird oder dass alternativ dazu orts­ aufgelöst lokale Magnetfelder durch Spulen oder Permanentmagnete erzeugt werden. Denkbar sind in den Trägerkörper integrierte Mikrospulen zur Erzeugung lokaler Magnetfelder.

Die Beads können ggf. transparent oder zumindest teiltransparent sein.

Die Fig. 15-17 zeigen ausschnittsweise in Vergrößerung Draufsichten auf verschiedene Varianten der Mikrofluidkanalgestaltung. Die Begrenzungs­ flächen der Mikrokanäle weisen vorzugsweise inerte Oberflächen auf.

Claims (30)

1. Verfahren zur integrierten Synthese und Analytbestimmung an einem Träger, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers (2),
• b) Leiten einer Flüssigkeit mit Partikeln (46) in oder auf den Trägerkörper (2),
• c) Immobilisieren der Partikel (46) auf mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche (45) des Trägerkörpers (2),
• d) Leiten einer Flüssigkeit mit darin enthaltenen Rezeptoren oder Bausteinen (A, B) für die Synthese von polymeren Rezeptoren über die immobilisierten Partikel (46),
• e) orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln der Rezeptoren oder Rezeptorbausteine (A, B) an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers (2) an die immobilisierten Partikel (46),
• f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte d) und e), bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers auf den immobilisierten Partikeln (46) synthetisiert worden sind,
• g) Inkontaktbringen der Rezeptoren mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe und
• h) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezeptoren, die an die immobilisierten Partikel (46) gekoppelt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) ein permanentes Immobilisieren umfasst.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das permanente Immobilisieren eine kovalente, chemische Bindung umfasst.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) ein nicht-permanentes Immobilisieren umfasst.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht- permanente Immobilisieren eine magnetische, elektrische oder/und mechanische Wechselwirkung umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, weiterhin umfassend
das Ablösen der immobilisierten Partikel (46) von der Trägeroberfläche (45) und
das Leiten der Partikel (46) aus dem Trägerkörper (2).

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese und Analytbestimmung in einer integrierten Vorrichtung durchgeführt wird, wobei der Synthese- oder/und der Analytbestimmungsprozess in einer beliebigen Anzahl von Positionen auf dem Träger überwacht und geregelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine integrierte Vorrichtung verwendet, umfassend eine programmierbare Lichtquellenmatrix (4), eine Detektormatrix (6), einen vorzugsweise zwischen Lichtquellen- und Detektormatrix angeordneten, zumindest bereichsweise transparenten Trägerkörper (2) sowie Mittel zur Zufuhr von Fluids in den Trägerkörper und zur Ableitung von Fluids aus dem Trägerkörper.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Bestimmung der Analyt wieder vom Trägerkörper entfernt wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Synthese/Analytbestimmungszyklen durchgeführt werden, wobei die Rezeptoren für einen nachfolgenden Zyklus auf Basis der Informationen aus einem vorhergehenden Zyklus synthetisiert werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass für den nachfolgenden Zyklus eine Verlängerung der Rezeptoren aus dem vorhergehenden Zyklus erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass für den nachfolgenden Zyklus ein neuer Trägerkörper mit gegenüber dem vorhergehenden Zyklus modifizierten Rezeptoren synthetisiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifizierung der Rezeptoren eine Änderung der Sequenz oder/und einen Ausschluss negativer Rezeptoren des vorhergehenden Zyklus umfasst.

14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Trägerkörper (2) mit einer Vielzahl von Kanälen (40) verwendet.

15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für einen Synthese/Analytbestimmungszyklus mehrere Trägerkörper (2) verwendet werden.

16. Verfahren zur Herstellung von rezeptorbeschichteten Partikeln für die Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers (2),
• b) Leiten einer Flüssigkeit mit Partikeln (46) in oder auf den Trägerkörper (2),
• c) Immobilisieren der Partikel (46) auf mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche (45) des Trägerkörpers (2),
• d) Leiten einer Flüssigkeit mit darin enthaltenen Rezeptoren oder Bausteinen (A, B) für die Synthese von polymeren Rezeptoren über die immobilisierten Partikel (46),
• e) orts- oder/und zeitspezifisches Koppeln der Rezeptoren oder Rezeptorbausteine (A, B) an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers (2) an die immobilisierten Partikel (46),
• f) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte d) und e), bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers auf den immobilisierten Partikeln (46) synthetisiert worden sind.

17. Verfahren zum Bestimmen eines oder mehrerer Analyten auf einem Träger, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers (2) mit mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche (45),
  wobei die Partikel (46) mit daran gekoppelten Rezeptoren an jeweils vorbestimmten Positionen der Oberfläche immobilisiert sind,
  wobei die Partikel (46) in unterschiedlichen Bereichen unterschiedliche Rezepto­ ren tragen,
• b) Inkontaktbringen des Trägerkörpers (2) mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe und
• c) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezeptoren, die an die immobilisierten Partikel (46) gekoppelt sind.

18. Verfahren zum Bestimmen eines oder mehrerer Analyten auf einem Träger, umfassend die Schritte:

• a) Bereitstellen eines Trägerkörpers (2) mit mindestens einer inneren oder/und äußeren Oberfläche (45),
  wobei die Partikel (46) mit daran gekoppelten Rezeptoren an der Oberfläche (45) immobilisiert sind,
  wobei mehrere kodierte Partikelspezies mit jeweils unterschiedlichen Rezeptoren verwendet werden und
  die Immobilisierung eine magnetische oder/und elektrische Wechselwirkung umfasst,
• b) Inkontaktbringen des Trägerkörpers bzw. der Rezeptoren mit einer den oder die zu bestimmenden Analyten enthaltenden Probe und
• c) Bestimmen des oder der Analyten über eine Bindung an die Rezeptoren, die an die immobilisierten Partikel (46) gekoppelt sind.

19. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-15 oder zur Durchführung wenigstens eines der Verfahren nach den Ansprüchen 16, 17 oder 18, umfassend:
einen Trägerkörper (2), welcher wenigstens einen inneren oder/und einen äußeren Oberflächenbereich (45) zur Anlagerung von an ihrer Oberfläche funktionalisierten Partikeln (46), insbesondere Mikrobeads, aufweist,
Mittel zur Zuführung der Partikel (46) zu dem wenigstens einen Oberflächenbereich (45) des Trägerkörpers (2),
eine Einrichtung (30) zur Immobilisierung der Partikel (46) an den wenigstens einen Oberflächenbereich (45) des Trägerkörpers (2),
Mittel zur Zuführung von Rezeptoren oder Rezeptorbausteinen (A, B) zu auf dem wenigstens einen Oberflächenbereich (45) immobili­ sierten Partikeln (46) und
Mittel (4, 6, 8) zur Steuerung des orts- und/oder zeitspezifi­ schen Koppelns der Rezeptoren oder Rezeptorbausteine (A, B) an die immobilisierten Partikel (46) an jeweils vorbestimmten Positionen des Trägerkörpers (2).

20. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei der Trägerkörper (2) innere oder/und äußere Kanäle, insbesondere Mikrokanäle (40) hat, welche Oberflächenbereiche (45) für die Immobilisierung der Partikel (46) aufweisen.

21. Vorrichtung nach Anspruch 19 oder 20,
wobei die Partikel (46) magnetisch sind und
wobei die Einrichtung (30) zur Immobilisierung der Partikel (46) Mittel zur Erzeugung eines den Trägerkörper (2) durchsetzenden, magnetischen Feldes (B) aufweisen.

22. Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei die Magnetfelderzeugungs­ mittel (30) elektromagnetische Spulen, insbesondere wenigstens ein Helmholtz-Spulenpaar, oder/und wenigstens einen Permanentmagne­ ten umfassen.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19-22, wobei die Partikel (46) elektrisch geladen bzw. elektrisch polarisiert sind und wobei die Einrichtung (30) zur Immobilisierung der Partikel (46) Mittel zur Erzeugung eines den Trägerkörper (2) durchsetzenden, elektrischen Feldes (E) umfassen.

24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19-23, wobei die Ein­ richtung (30) zur Immobilisierung der Partikel (46) Porenöffnungen in dem wenigstens einen Trägerkörper-Oberflächenbereich (45) für die Immobilisierung der Partikel (46) und Mittel zur Erzeugung einer die betreffenden Partikel (46) an dem Oberflächenbereich (45') haltenden Saugwirkung an den Porenöffnungen (47) umfasst.

25. Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei die mit Porenöffnungen (47) versehenen Oberflächenbereiche in Vertiefungen (58) von Mikrofluid­ kanälen (40a) angeordnet sind.

26. Vorrichtung nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Porenöffnungs­ durchmesser kleiner als 90% des kleinsten Partikeldurchmessers, vorzugsweise kleiner als 30% des kleinsten Partikeldurchmessers sind.

27. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19-26, wobei die Ein­ richtung (30) zur Immobilisierung der Partikel (46) dazu eingerichtet ist, gesteuert ortsspezifisch und ortsaufgelöst Haltekräfte in wahl­ weise unterschiedlichen Abschnitten der Oberflächenbereiche (46) des Trägerkörpers (2) auf betreffende Partikel auszuüben.

28. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19-27,
wobei die Mittel zur Steuerung der orts- oder/und zeitspezifischen Kopplung der Rezepto­ ren oder Rezeptorbausteine (A, B) an die immobilisierten Partikel (46) eine Belichtungsmatrix (4) zur Erzeugung programmierbar steuerbarer Belichtungsmuster aufweist und
wobei der Trägerkörper (2) wenig­ stens einseitig an der Seite der Belichtungsmatrix (4) zu dem wenigstens einen Oberflächenbereich (45) hin für Licht der Belich­ tungsmatrix (4) transparent ist.

29. Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei sie ferner eine Lichtdetektions­ matrix (6) zur optischen Überwachung der Partikelimmobilisierung oder/und der Synthesevorgänge oder/und von Analytbestimmungs­ vorgängen im Trägerkörper (2) aufweist.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 19-29,
wobei die Partikel (46) im Wesentlichen gleich große Durchmesser aufweisen und
wobei der Partikeldurchmesser kleiner als 50 µm, insbesondere kleiner als 10 µm, ist.