DE102007062154A1 - Verfahren zur Herstellung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen - Google Patents

Verfahren zur Herstellung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten Herstellung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen. Die Herstellung und Testung großer Serien von Substanzen, typischerweise von Wirkstoffkandidaten, ist mit einem großen Präparationsaufwand verbunden. Bisher werden die Testsubstanzen separat in einem biokompatiblen Medium gelöst und in einzelne, speziell adressierte Probenkammern dosiert. Zudem ergibt sich aufgrund der geringen Mengen und der Geometrie der Probenkammern ein vor allem für zellbiologische Tests ungünstiges Oberflächen-Volumen-Verhältnis. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die mit speziell auf das Verfahren abgestimmten Molekülbausteinen ausgestatteten Testsubstanzen an Trägerharz-Beads gebunden und in einer zufällig verteilten Anordnung auf einer Trägerplatte immobilisiert. Von dieser Vorlage können die Testsubstanzen ortsgenau auf eine oder mehrere Assay-Platten übertragen werden, auf deren Oberfläche die Substanztests durchgeführt werden. Der Arbeitsaufwand ist unabhängig von der Zahl der Testsubstanzen. Die Zuordnung der einzelnen Substanz-Spots zu den Originalen auf der Trägerplatte wird durch intelligente Mustererkennungsverfahren realisiert. Das Verfahren eignet sich insbesondere für umfangreiche Testreihen zur medizinisch-biologischen Aktivität von Substanzen, aber auch für die Untersuchung zellbiologischer Proben und für Antikörpertests.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur effizienten Erzeugung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen.
  • Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein Array zufällig verteilter Substanzen, die von einem zufällig verteilten Array aus polymeren Trägerharzen stammen, unter Beibehaltung der räumlichen Anordnung spiegelbildlich auf eine Testoberfläche übertragen wird. Das Verfahren ist zudem dadurch gekennzeichnet, dass auf diese Weise die Anzahl der Arbeitsschritte zur Vorbereitung der Arrays für die vorzugsweise medizinisch-biologischen und diagnostischen Tests unabhängig von der Zahl der Substanzen ist, die auf ihre biologische Aktivität getestet werden sollen.
  • Das Protokoll zum Nachweis der chemischen Struktur der im Assay als biologisch aktiv erkannten Substanzen wurde an die Erfordernisse der stochastisch angeordneten Arrays angepasst. Die Zuordnung der einzelnen Substanz-Spots im Testarray zu den Trägerharz-Partikeln und damit die Identifizierung der Testverbindungen erfolgt mittels intelligenter Mustererkennungsverfahren.
  • Stand der Technik
  • Seit ihrer Erfindung Anfang der 90er Jahre,, haben die Mikroarrays, speziell die Biochips, die Prozesse der medizinisch-biologischen Forschung wesentlich vereinfacht. Dabei werden die Testsubstanzen, meistens Nukleinsäuren, Proteine oder Peptide, die mit medizinisch-biologisch relevanten Molekülen, Zellen oder Mikroorganismen Wechselwirken, in einer hochdichten Anordnung in spezifisch adressierbaren Kompartimenten einer Testfläche aufgebracht. Diese Anordnung ermöglicht die parallele Untersuchung einer Probe mit einer großen Anzahl verschiedener Reaktanden.
  • Jedoch ist die Herstellung von Arrays ortsaufgelöst angeordneter Testsubstanzen, insbesondere die systematische Herstellung und Anordnung einer sehr großen Zahl von Wirkstoffkandidaten, mit den gegenwärtigen Technologien immer noch sehr zeit- und materialaufwändig.
  • Die momentan am weitesten verbreiteten Techniken zur Herstellung von Mikroarrays sind neben der Synthese der Testsubstanzen direkt auf den Testoberflächen ( US 5,591,646 ), die Fixierung der Testsubstanzen durch photolithographische Verfahren ( US 5,412,087 , US 5,489,678 , WO 03/089900 ) und das Auftragen der Testsubstanzen durch Drucktechniken ( US 6,079,283 , US 6,083,762 , US 6,094,966 ). Einen Überblick über den aktuellen Stand der Wissenschaft auf diesem Gebiet geben die Arbeiten von Ng/Ilag, Jain und Müller/Röder.
  • Die Verfahren der Kombinatorischen Festphasensynthese erlauben durch geeignete Reaktionsführung die Synthese von Millionen Verbindungen innerhalb weniger Tage. Diese Verbindungen können mit sehr hohem apparativen und zeitlichen Aufwand aus den Synthese-Beads freigesetzt und dann in einzelnen Gefäßen getestet werden.
  • Dies geschieht meist durch Pipettieren von Stammlösungen der Testsubstanzen in einzelne Probenkammern von Testplatten. Dafür stehen z. B. automatisierte xyz-Pipettiervorrichtungen, die die Kompartimente adressieren, in denen der Assay durchgeführt werden soll, zur Verfügung.
  • Zur rationellen Durchführung einer großen Zahl von medizinisch-biologischen und diagnostischen Tests werden zunehmend miniaturisierte Verfahren eingesetzt. So stehen für die biologische Testung von Substanzen z. B. Mikrotiterplatten mit 1536 Probenkammern zur Verfügung. Aufgrund der kleinen Volumina, die in diese Probenkammern pipettiert werden und aufgrund des ungünstigen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen, ist insbesondere die Durchführung von zellbiologischen Tests in diesen Mikrotiterplatten nur eingeschränkt möglich.
  • Es wurden auch schon Untersuchungen durchgeführt, bei denen die synthetisierten Verbindungen auf den Synthese-Beads belassen und direkt mit den Zielmolekülen (andere kleine Moleküle, Proteine, DNA oder andere Biopolymere) in Kontakt gebracht wurden. Jedoch besteht hier die Gefahr, dass die Testergebnisse durch die Trägerharze beeinflusst werden.
  • Zur Reduzierung des Aufwandes können Kollektionen von mit verschiedenen Substanzen beladenen Trägerharz-Beads gemeinsam untersucht werden. Die erhaltenen Testergebnisse für die Substanzgemische stellen Mittelwerte dar, sind dann jedoch schwer zu interpretieren und von eingeschränktem Nutzen für die Wirkstoffentwicklung.
  • Ein alternativer Ansatz zu der ortsaufgelösten Adressierung ist die Durchführung der Assays in flüssigen Suspensionen. Hierbei sind die Testsubstanzen an durch Farbe, Form, Größe oder chemisch-physikalische Parameter codierte Trägerpartikel gebunden. Die Codierung erfolgt in den meisten Varianten durch einen oder mehrere Fluoreszenz-Farbstoffe ( US 2005/0106711 , US 2005/0106712 ), die in die Trägerpartikel eingebunden sind. In einer anderen Variante werden die an die Testsubstanzen gebundenen Moleküle durch Fluoreszenz-Farbstoffe markiert, in einer weiteren Variante durch eine Kombinationen aus beidem ( US 7,011,945 ). Jedoch ist die Anzahl der möglichen Codierungen und damit der Anzahl gleichzeitig zu erfassender Testsubstanzen begrenzt. Die Identifizierung der Testsubstanzen erfolgt dann durch Methoden der Durchflusszytometrie ( US 5,981,180 ) oder die Erfassung auf Lichtleiter-Bündeln ( US 6,023,540 , US 6,266,459 ). Ein neuerer Ansatz ist die Identifizierung der Testsubstanzen aufgrund von in die Trägerpartikel eingeschlossenen Nanokristallen.
  • Alle diese Technologien sind instrumentell sehr aufwändig. Deshalb wurden einige Methoden zur Herstellung und Anwendung von stochastischen Arrays entwickelt. Hierbei werden die Testsubstanzen ebenfalls an Trägerpartikel gebunden und aus der flüssigen Phase durch spezielle Gelatine-Beschichtungen ( WO 2005/016516 ), elektromagnetische Felder ( US 2007/0231825 ), chemische Bindung oder mechanische Methoden ( US 2002/0051971 ) in einer zufälligen Anordnung an einer Trägeroberfläche immobilisiert. Die Identifizierung der Testsubstanzen erfolgt, ähnlich wie bei den oben genannten Verfahren, durch Analyse der Farbcodierungen der Trägerpartikel und/oder der Fluoreszenz-Marker gebundener Moleküle, mit Hilfe von mit CCD-Kameras ( US 2003/0143542 ) oder Spektrometern ( US 7,034,941 ) gekoppelten mikroskopischen Verfahren. Angewandt werden auch chemische Methoden oder die DNA-Sequenzierung ( WO 2007/044245 ). Dabei wird die Identifizierung direkt auf der Trägeroberfläche, wahlweise vor und/oder nach den Assays durchgeführt.
  • Außer für Nukleinsäuren ( WO 2007/044245 ) sind bisher keine Methoden zur Erzeugung stochastischer Arrays von Trägerpartikel-unabhängigen Testsubstanzen bekannt. Ebenso wird die Herstellung von ortsaufgelösten Kopien stochastisch angeordneter Arrays von Testsubstanzen bisher nur für Nukleinsäuren beschrieben ( US 2003/0124594 ). Ähnliche Methoden für Proteine, Peptide oder andere organische Moleküle sind bisher nicht bekannt. Ferner sind uns keine Methoden bekannt, die die Testsubstanzen durch Zuordnung zu Ihrem ursprünglichen Trägerpartikel und nicht direkt auf der Assay-Oberfläche identifizieren.
  • Obwohl der Ansatz der spektral adressierbaren Träger-Partikel einen wesentlichen Fortschritt gegenüber den bisher üblichen ortsaufgelöst adressierten Mikroarrays darstellt, besteht weiterhin ein erheblicher Bedarf bei der Vereinfachung des Produktionsprozesses und der Senkung der Kosten für medizinisch-biologische Mikroarrays.
  • Aufgabenstellung
  • Die Erfindung stellt sich daher zur Aufgabe, ein effizientes Verfahren zur ortsaufgelösten Herstellung von Arrays der durch Kombinatorische Festphasensynthese hergestellten Testsubstanzen bereitzustellen, das eine Übertragung der Testsubstanzen von einer Trägerplatte auf eine oder mehrere Testplatten ermöglicht und bei dem die Präparations- und Übertragungszeit unabhängig von der Zahl der zu testenden Verbindungen ist. Zudem soll das erfindungsgemäße Verfahren die Durchführung der medizinisch-biologischen und diagnostischen Tests direkt auf den Testoberflächen, vorzugsweise in einer Testebene, mit einer breiten Palette von Medien und unabhängig von einer Stammlösung, ermöglichen.
  • Die Aufgabenstellung umfasst daher sowohl die Lösung des Problems der enormen Zunahme der erforderlichen Pipettierschritte mit der Zunahme der zu testenden Substanzen, als auch die Lösung des Problems des ungünstigen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen, das bei der Miniaturisierung medizinisch-biologischer Tests entsteht.
  • Die Aufgabe wird gelöst durch ein erstmals beschriebenes Verfahren zur Herstellung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen, wie es im Anspruch 1 dargestellt ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 35 beansprucht. Die Ansprüche 36 und 38 betreffen die Anwendung des Verfahrens bei der Durchführung von Wirkstoff-Screenings, medizinisch-biologischen Tests und in der medizinischen Diagnostik. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren besteht in seinen wesentlichen Merkmalen aus der Synthese von an ein Trägerharz gebundenen und in ihren Eigenschaften spezifisch an das Verfahren angepassten Testsubstanzen, einer immobilisierten Trägerharz-Bead-Monolager auf einer Trägerplatte als Quelle für die Testsubstanzen, einer Oberflächen-modifizierten Testplatte zur Aufnahme des stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen, einer Routine zur Zuordnung der einzelnen Substanz-Spots zu ihrer Quelle sowie einem analytischen Protokoll zum Nachweis der chemischen Struktur der Testsubstanzen auf der Trägerplatte.
  • Nach der Lehre der Erfindung werden die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigten Testverbindungen so hergestellt, dass sie an ein Trägerharz gebunden vorliegen und in ihren Eigenschaften spezifisch an das Verfahren angepasst sind. Sie enthalten einen orthogonal zu den Syntheseschritten spaltbaren Linker (Prinzip 1), ein Übertragungsprinzip (Prinzip 2) und einen biokompatiblen Spacer (Prinzip 3), wobei diese Prinzipien auch einzeln oder in beliebigen Kombinationen auftreten können. Die Prinzipien 1 bis 3 können sowohl vor, während, als auch nach der Synthese, vorzugsweise während der Festphasensynthese, in die Testverbindungsmoleküle eingeführt werden.
  • Bei der bevorzugten Herstellung der Testsubstanzen mit den bekannten Verfahren der Kombinatorischen Festphasensynthese werden die Startmoleküle an ein vorbehandeltes, funktionalisiertes Trägerharz angebunden und anschließend die Zielsubstanzen in aufeinanderfolgenden Syntheseschritten systematisch aufgebaut. Besonders bevorzugt wird als Startmolekül der Linker gemäß Prinzip 1 verwendet. Mit Hilfe dieses Verfahrens und durch geeignete Reaktionsführung können komplexe Verbindungs-Bibliotheken innerhalb weniger Tage hergestellt werden.
  • Nach dem Abschluss der Synthesen können Trägerharze aus mehreren Synthesen gemischt werden. Somit liegt ein stochastisch verteiltes Pulver aus vorzugsweise vereinzelten Synthese-Beads, die mit verschiedenen Testsubstanzen beladen sind, vor.
  • Die gemischten Synthese-Beads mit den die Prinzipien 1 bis 3 tragenden Testverbindungen werden auf einer vorzugsweise planaren Unterlage (Trägerplatte) durch einen für den Biotest verträglichen, nicht toxischen Klebstoff in zufälliger Anordnung, vorzugsweise in einer Monolayer, fixiert. Bevorzugt erfolgt dies durch Pulver-, Tauch- oder Zentrifugalbeschichtung und nachfolgendes Kämmen. Auf der Trägerplatte entsteht ein stochastisch angeordnetes Array von mit verschiedenen Testsubstanzen beladenen Synthese-Beads.
  • Zur Erleichterung der Deconvolution von positiv getesteten Verbindungen, vorzugsweise in der massenspektroskopischen Analyse, können aber auch Kompartimentierungen auf der Trägerplatte vorgenommen werden. Dazu werden spezifische Mischungen oder auch sortenreine Beads, die aufgrund des Syntheseverfahrens nach bestimmten Kriterien vorsortiert wurden, in Probenkammern, vorzugsweise die Kavitäten von Mikrotiterplatten eingefüllt. Die Synthese-Beads werden in der vorgegebenen Anordnung, vorzugsweise durch Tauch- oder Zentrifugalbeschichtung und nachfolgendes Kämmen, auf der Klebstoffschicht der Trägerplatte in einer Monolayer fixiert. Auf der Trägerplatte entstehen voneinander abgegrenzte Felder von Arrays aus festgelegten Mischungen von Synthese-Beads, die mit Testsubstanzen beladen sind.
  • Zur Übertragung der Testsubstanzen werden die Trägerplatte und die vorzugsweise planare Testplatte aufeinander gelegt. An den Trägerharz-Beads bilden sich, idealerweise unterstützt durch ein Medium, vorzugsweise singuläre Kontaktzonen aus. Das die Übertragung unterstützende Medium ist bevorzugt ein Lösungsmittelfilm, vorzugsweise aus Wasser oder Pufferlösung.
  • Mit physikalischen, biologisch/enzymatischen oder chemischen Methoden werden die Testverbindungen an den Linkern (Prinzip 1) von den Synthese-Beads abgespalten und anschließend innerhalb der Kontaktzonen, vermittelt durch Prinzip 2 und Prinzip 3, auf die Oberfläche der Testplatte übertragen. Dabei sorgt Prinzip 2 für eine spezifische und ortsaufgelöste Interaktion der Testverbindungen mit der Testoberfläche.
  • Der Oberflächen-Kontakt zwischen Trägerplatte, Trägerharz-Bead und Testplatte ist vom Material und der Größe der Synthese-Beads, dem verwendeten Medium sowie den Eigenschaften der Oberflächen und der Testumgebung, die vorzugsweise fallspezifisch aufeinander abgestimmt werden, bestimmt. Als Interaktionsprinzip (Prinzip 2) werden grundlegende chemische, physikalische und biologische, vorzugsweise kovalente, ionische, elektrostatische, adhesive oder Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen genutzt.
  • Auf der Testplatte entsteht nach Trennung von der Trägerplatte ein stochastisches, in Relation zur Trägerplatte spiegelbildlich angeordnetes Array von Testsubstanzen (1).
  • Darin liegen die Testverbindungen, bedingt durch den direkten Kontakt zwischen den Synthese-Beads und den Oberflächen und unter Nutzung der Prinzipien 2 und 3, in weitgehend singulären, homogenen Substanz-Spots vor. Die Verbindungen sind durch das auf den Assay angepasste biokompatible Übertragungsprinzip (Prinzip 2) in einheitlicher Ausrichtung auf der Unterlage fixiert und durch den auf den Assay angepassten biokompatiblen Spacer (Prinzip 3) räumlich voneinander sowie von der Unterlage getrennt.
  • Aufgrund der Beladung der Synthese-Beads mit mehreren Molekülen einer Testsubstanz können von einer Trägerplatte durch Wiederholung des Übertragungsprozesses mehrere identische Testplatten als Kopien hergestellt werden. Auch kann die übertragene Substanzmenge durch die Dauer und Intensität des Übertragungsprozesses gesteuert werden, was zur Herstellung von Konzentrationsreihen genutzt werden kann.
  • Die geeigneten Nachweise zur Untersuchung der Interaktion der Testsubstanzen mit spezifischen Zielmolekülen, sogenannten Targets, die vorzugsweise aus nativen, modifizierten Zellen bzw. dem Diagnosematerial isoliert werden und sortenrein oder in Targetmischungen, löslich oder auf/in Zellen gebunden vorliegen, werden direkt auf der Testplatte durchgeführt.
  • Die Zuordnung von in den vorzugsweise medizinisch-biologischen oder diagnostischen Tests positiv/negativ identifizierten Spots zu den entsprechenden Testsubstanzen erfolgt mittels intelligenter Verfahren der Mustererkennung. Dazu wird die Trägerplatte durch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren übertragbare Marker gekennzeichnet. Diese Marker sind vorzugsweise Trägerharz-Beads, die mit Verbindungen beladen sind, die Fluoreszenz-Farbstoffe enthalten sowie die Prinzipien 1 bis 3 aufweisen. Die Marker werden zusammen mit dem Synthese-Bead-Gemisch auf die Trägerplatte aufgetragen. Idealerweise sind die markierten Trägerharz-Beads stochastisch über die gesamte Fläche der Trägerplatte verteilt. Anhand der Überlagerung von aus mindestens 3 Punkten bestehenden Marker-Mustern auf der Träger- und der Testplatte wird eine exakte Bestimmung der Koordinaten sämtlicher Spots auf den Platten und damit eine eineindeutige Zuordnung der einzelnen Substanz-Spots auf den Testplatten zu den Synthese-Beads auf der Trägerplatte möglich. Alternativ können Markierungen oder eine Skala direkt auf den Platten angebracht werden. Ein Beispiel für die spiegelbildliche Übertragung des Marker-Musters von der Träger- auf die Testplatte sowie ein mögliches Koordinatensystem zeigt 1.
  • Mathematische Algorithmen zu Korrektur von Übertragungsfehlern, wie Verzerrungs-, Torsions- und Schrumpf-Effekten, können zur Verbesserung der Genauigkeit der Zuordnung benutzt werden.
  • Mit geeigneten Analysenmethoden, vorzugsweise Laserdesorption und Massenspektrometrie, können die entsprechend wirksamen Testsubstanzen durch Analyse der auf den positiv/negativ getesteten Trägerharz-Beads verbleibenden Testverbindungs-Moleküle identifiziert werden.
  • Die Erfindung umfasst ferner Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es findet vor allem Einsatz bei der Durchführung von biochemischen und biologischen Testserien, bei denen die Wirkung einer großen Anzahl von Verbindungen, bevorzugt Peptide, Proteine und organische Moleküle, in möglichst einem Arbeitschritt vergleichend untersucht werden soll. Insbesondere in der Untersuchung der biologischen Aktivität spezifischer Testsubstanzen, in der Untersuchung zellbiologischer Proben, in Antikörpertests und in der medizinisch-biologischen Diagnostik liegen erfindungsgemäße Anwendungsfelder.
  • In der Pharmazie eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren vor allem für die Untersuchung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen im Rahmen der Wirkstoff-Entwicklung, wo die Interaktion einer großen Anzahl Testsubstanzen mit isolierten Targets, wie Zellen und Mikroorganismen, betrachtet wird.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren der hier erstmals beschriebenen ortsaufgelösten Übertragung stochastisch angeordneter Arrays von Testsubstanzen ohne Pipettierschritte und apparatetechnischen Aufwand löst die Probleme nach dem Stand der Technik, die bei den bislang üblichen Methoden zur Präparation von Testumgebungen für Screening-Versuche und durch die Miniaturisierung medizinisch-biologischer Tests entstehen. Das betrifft sowohl die die Probleme der enormen Zunahme der erforderlichen Pipettierschritte mit der Zunahme der zu testenden Substanzen als auch das ungünstige Verhältnis von Oberfläche zu Volumen.
  • Die Erfindung löst die oben genannten Probleme, indem stochastisch angeordnete Arrays von Testsubstanzen durch direkten Kontakt zwischen Synthese-Beads und vorzugsweise planaren Oberflächen hergestellt und übertragen werden. Es entstehen Arrays singulärer, jeweils aus Molekülen einer einzelnen Verbindung bestehender Substanz-Spots. Die Untersuchungen zur Interaktion der Testsubstanzen werden direkt auf der Testoberfläche durchgeführt. Auf diese Weise entfallen sämtliche Pipettierschritte zur Herstellung einer Testumgebung. Das bietet den Vorteil, dass die Anzahl der Arbeitsschritte für die Übertragung der Testverbindungen und damit der Zeitaufwand für die Präparation unabhängig von der Zahl der Testsubstanzen ist. Durch die idealerweise monomolekulare Beschichtung der Testplatte ist die Durchführung der Tests in einer Testebene möglich, was einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellt.
  • Nach der Präparation einer Trägerplatte können mehrere identische Testplatten mit sehr hoher Präzision hergestellt werden. Der zeitliche Aufwand für die Übertragung ist überschaubar. Der Übertragungsprozess an sich nimmt einen Zeitraum von ca. 20 s in Anspruch, unabhängig von der Zahl der Testsubstanzen und der Größe der Träger-/Testplatten.
  • Abhängig von der Größe der Trägerharz-Beads ist eine mit handelsüblichen Bio-Chips vergleichbare Beladung der Testoberflächen möglich. Beispielsweise konnten bei einem Bead-Durchmesser von 20 μm 250.000 Beads pro cm2 auf der Testplatte immobilisiert werden.
  • Die räumliche Zuordnung der nach der Durchführung der medizinisch-biologischen oder diagnostischen Tests vorliegenden Spots zu den Trägerharz-Beads auf der Trägerplatte ist in Abhängigkeit vom Bead-Durchmesser mit einer Variabilität von weniger als mit 2 μm möglich.
  • Das Prinzip der stochastischen Verteilung der Testsubstanzen auf den Testplatten, der geringe Zeitaufwand und die Möglichkeit der Herstellung von Testplatten-Kopien ermöglichen es nunmehr, die Tests mit hoher Redundanz durchzuführen. Dies beinhaltet mit gegenüber Zufallseffekten oder Umgebungseinflüssen an einzelnen Molekülen oder Positionen der Testplatte sehr robusten Tests einen weiteren Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Zudem können durch Wahl der Abspaltungsbedingungen Konzentrationsreihen erstellt werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen ist somit sehr flexibel, robust und ohne technischen Aufwand durchführbar.
  • Näheres zu besonders bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. Die Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
  • In den beiliegenden Abbildungen zeigt:
  • 1 Schematische Darstellung der korrespondierenden Spot-Muster auf einer Trägerplatte (Bild rechts) und der zugehörigen Testplatte (Spiegelbild links) nach Durchführung eines Bindungs-Assays mit Fluoreszenz-Farbstoffen.
  • 2 Syntheseschema zur Anbindungen des Photolinkers 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure an ein Synthese-Bead und zur nachfolgenden Methylamidierung.
  • 3 Syntheseschema zur photochemischen Abspaltung des synthetischen Konjugates vom Synthese-Bead an der 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure.
  • 4 Strukturformel von Pam3Cys-OH.
  • 5 Strukturformel eines immobilisierten Konjugates, das alle drei Prinzipien enthält.
  • 6 Strukturformel eines Zwischenproduktes nach Anbindung des Pam3Cys-OH und vor Anbindung der biologisch aktiven Testverbindungen über die β-Alanine.
  • 7 Syntheseschema zur Anbindung des Photolinkers (Schritt 1).
  • 8 Syntheseschema zur Methylamidierung des Photolinkers (Schritt 2).
  • 9 Syntheseschema zur Anbindung von Fmoc-Aminosäuren (Schritt 3).
  • 10 Syntheseschema zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen (Schritt 4).
  • 11 Syntheseschema zur photochemischen Abspaltung des Synthese-Konjugates (Schritt 7).
  • 12 ESI-MS von Pam3Cys-SK3K(βA-βA-Aca-Aca-Biotin)-NCH3.
  • 13 ESI-MS einer Pam3Cys-SK3K(βA-βA-Dipeptid)-NCH3-Kollektion aus 400 Einzelverbindungen (aan = Aminosäure).
  • 14 Ausschnitt des ESI-MS einer Pam3Cys-SK3K(βA-βA-Dipeptid)-NCH3-Kollektion aus 400 Einzelverbindungen mit Zuordnung der Peptid-Sequenzen.
  • 15 Mikroskopische Aufnahme einer durch Pulverbeschichtung und Kämmen erzeugten Beschichtung mit Trägerharz-Beads (Ø 20 μm, Bildausschnitt 780 × 600 μm).
  • 16 Mikroskopische Aufnahme einer durch Tauchbeschichtung und Kämmen erzeugten Beschichtung mit Trägerharz-Beads (Ø 20 μm, Bildausschnitt 2600 × 2000 μm).
  • 17 Mikroskopische Aufnahme einer durch Zentrifugalbeschichtung und Kämmen erzeugten Beschichtung mit Trägerharz-Beads (Ø 20 μm, Bildausschnitt 2600 × 2000 μm).
  • 18 Schematische Darstellung der räumlichen Struktur einer am Trägerharz-Bead gekoppelten Testverbindung.
  • 19 Schematische Darstellung eines mit einer Testverbindung beladenen und in der Klebstoffschicht der Trägerplatte immobilisierten Trägerharz-Beads.
  • 20 Schematische Darstellung des Übertragungsprozesses von Testverbindungen von der Oberfläche eines Trägerharz-Beads zur Testoberfläche.
  • 21 Schematische Darstellung eines aus der Übertragung von einem Trägerharz-Bead resultierenden singulären Substanz-Spots auf der Testplatte.
  • 22 Strukturformel von Pam3Cys-SK3K(Carboxyfluorescein)-NCH3.
  • 23 Strukturformel von Pam3Cys-SK3K(Aca-Tetramethylrhodamin)-NCH3.
  • 24 Mikroskopische Aufnahmen der Spot-Muster von Fluoreszenz-markierten Beads auf der Trägerplatte (oben links), einer ersten Testplatte (unten links), einer zweiten Testplatte (unten rechts) und Darstellung der Überlagerung aller drei Platten (oben rechts) (Bildausschnitte 520 × 400 μm). In der überlagerten Darstellung sind Rhodamin-markierte Beads hellgrau, Fluorescein-markierte Beads weiß und nicht markierte Beads dunkelgrau dargestellt. In den Aufnahmen der Testplatten sind nur die Fluoreszenzen der Rhodamin- und der Fluorescein-markierte Beads sichtbar. In der Aufnahme der Trägerplatte sind alle Beads sichtbar.
  • Ausführungsbeispiele
  • Beispiel A – Ausführung der Prinzipien
  • Für die Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden bei der Synthese der Testverbindungen zusätzliche funktionelle Gruppen in die Molekülstruktur eingebaut, die die beschriebenen Prinzipien repräsentieren.
  • Prinzip 1 – orthogonal spaltbarer Linker
  • Grundlage dieses Prinzips ist ein zu den Syntheseschritten orthogonal spaltbarer Linker. Der an die NH2-Funktionalität der Trägerharz-Beads angebundene Photolinker 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure bietet nach der Substitution mit Methylamin eine Amidgruppe für die Ankopplung und/oder Synthese der gewünschten Testsubstanzen.
  • Hierfür wurde die klassische Festphasensynthese mit Fmoc- und Aloc-Schutzgruppenchemie angewandt. Die Seitenketten wurden zudem mit klassischen Aminosäureschutzgruppen wie Boc und tBu geschützt.
  • Nach vollendeter Synthese und dem Aufbringen der Bead-Monolayer auf die Trägerplatte wurde das Synthesekonjugat durch UV-Bestrahlung gezielt freigesetzt. Mit der Bestrahlungsdauer, der Wellenlänge und der Intensität des verwendeten UV-Lichts konnte die Menge des pro Synthese-Bead freigesetzten synthetischen Konjugates beeinflusst werden.
  • Der verwendete Photolinker war während der Synthese stabil. Die Photolyse hinterließ eine Methylamid-Gruppe am synthetischen Konjugat, die die vorzugsweise medizinisch-biologischen Tests nicht beeinflusste.
  • Die Syntheseschemata zur Anbindung des Photolinkers an die Trägerharz-Beads sowie zum Abspaltungsmechanismus sind in 2 und 3 angegeben.
  • Prinzip 2 – Übertragungsprinzip
  • Grundlage dieses Prinzips ist eine übertragende und verankernde funktionelle Gruppe im Synthesekonjugat, die stets an die Testumgebung und die Funktionalisierung der Testoberfläche angepasst wird. Vorzugsweise verwendet man grundlegende chemische und physikalische Interaktionen wie hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen, kovalente oder ionische Bindungen, Photoaffinität oder biologische Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen.
  • In dem dargestellten Beispiel wurden die Testsubstanzen durch Anbindung von Pam3Cys-OH (4) der Firma EMC microcollections GmbH mit einer lipophilen Funktionalität versehen. Die Testplatten wurden mit Trimethoxypalmitoylsilan lipophil beschichtet. Die hydrophobierten Oberflächen wiesen danach gegenüber Wasser einen Kontaktwinkel von 110 bis 115° auf. Sobald die Pam3Cys-Konjugate mit der Oberfläche der Testplatte in Kontakt kamen, verankerten sie sich durch hydrophobe Wechselwirkungen und richteten sich in einer dichten, geordneten Molekül-Schicht aus. Es wurde ein Platzbedarf von 0,8 nm2 pro Molekül ermittelt.
  • Die gegenseitigen Anziehungskräfte waren so stark, dass die Substanz-Schicht auf der Testplatte in wässrigen Lösungen stabil war. Nur mit lipidlösenden organischen Lösungsmitteln, wie Dichlormethan, lässt sich diese Verankerung wieder lösen.
  • Prinzip 3 – biokompatibler Spacer
  • Prinzip 3 besitzt als Spacer zwei funktionelle Eigenschaften. Einerseits soll es die lipophile Pam3Cys-Gruppe (stellvertretend für alle Konjugate aus Prinzip 2) räumlich vom biologisch aktiven Teil des Synthesekonjugates trennen. Damit wird der Einfluss der Eigenschaften des Grundkonjugates, wie die aufgrund des Prinzips 2 stark reduzierte Wasserlöslichkeit der Testsubstanzen oder Toxizitätseffekte, auf die Testergebnisse minimiert. Andererseits soll es die gegenseitige Ausrichtung der Gesamtkonjugate auf der Testoberfläche unterstützen. Als biokompatibler Spacer wurde das Pentapeptid Serin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin verwendet. Als seitliche Verlängerung des am Photolinker angekoppelten Lysins wurden 2 Moleküle β-Alanin angebunden. Im weiteren wurden an dieser Funktionalität die biologisch aktiven Konjugate synthetisiert.
  • Hieraus ergab sich das in 5 dargestellte Gesamtkonjugat.
  • Die biologisch aktiven Konjugate konnten mit üblicher Festphasensynthese hergestellt werden. Aufgrund der Prinzipien 1 bis 3 verhielten sich alle Gesamtkonjugate bei der Übertragung der Arrays von der Trägerplatte zur Testplatte, unabhängig von der individuellen Testsubstanz, ähnlich. Zudem sorgte die positive Ladung der Lysine für eine erhöhte Wasserlöslichkeit und die gegenseitige ionische Abstoßung der einzelnen Konjugate.
  • Beispiel B – Festphasensynthese eines Grundkonjugates
  • Das Trägerharz TentaGel S-NH2 wurde mit dem Photolinker 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure beladen (Schritt 1) und mit Methylamin substituiert (Schritt 2).
  • Anschließend wurde der Spacer durch schrittweise Ankopplung von Fmoc-Lys(Aloc)-OH, 3 Molekülen Fmoc-Lys(Boc)-OH und Fmoc-Ser(tBu)-OH, jeweils nach Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe, aufgebaut (Schritte 3 und 4). Nach erneuter Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe wurde das Pam3Cys-OH als lipophile Gruppe angebunden. Das entstandene Grundkonjugat zeigt 6.
  • Nach Abspaltung der Aloc-Schutzgruppe (Schritt 5) des ersten Lysins wurden 2 Moleküle Fmoc-β-Alanin-OH sowie die biologisch aktive Testverbindung in der Seitenkette angebunden. Die 5 zeigt das nach der Abspaltung der Boc- und aller weiteren Schutzgruppen (Schritt 6) entstandene Gesamtkonjugat.
  • Die nach der Trennung vom Trägerharz (Schritt 7) resultierende Verbindung wies hydrophobe Eigenschaften mit einer dennoch guten Wasserlöslichkeit von mindestens 1 mg/ml auf.
  • Der Erfolg der einzelnen Syntheseschritte wurde mittels HPLC-ESI-MS überprüft. Dazu wurden jeweils Proben des mit dem Zwischenprodukt beladenen Trägerharzes entnommen und alle Schutzgruppen abgespalten (Schritt 6). Das Synthesekonjugat wurde photochemisch vom Trägerharz getrennt (Schritt 7) und das Zwischenprodukt analysiert.
  • Die einzelnen Syntheseschritte sind im Folgenden detailliert beschrieben. Alle angegebenen Mengen beziehen sich auf eine Ausgangsmenge von 1 g Trägerharz.
  • Schritt 1 – Anbindung des Photolinkers an das Trägerharz (7)
  • 1 g TentaGel S-NH2-Harz (Rapp Polymere GmbH; Beladungskapazität 0,25 mmol/g; Durchmesser 20 μm) wurde 4-mal mit je 5 ml DMF gewaschen.
  • 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure (3 Equiv.; 0,195 g; 0,75 mmol) und HOBt·H2O (3 Equiv.; 0,115 g; 0,75 mmol) wurden in 12,5 ml DMF gelöst, DIC (3 Equiv.; 1,16 ml; 7,5 mmol) wurde zugegeben und die Lösung 30 min bei Raumtemperatur gerührt.
  • Anschließend wurde die Lösung zu dem gewaschenen Harz gegeben und die Mischung mindestens 16 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert, gewaschen (je 6 × 5 ml DMF, DCM, MeOH) und unter Vakuum getrocknet.
  • Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit dem Kaiser-Ninhydrin-Test überprüft.
  • Schritt 2 – Methylamidierung des Photolinkers (8)
  • Zu dem getrockneten Harz wurden 8 ml trockenes DMSO und anschließend 8 M Methylamin in EtOH (20 Equiv.; 0,575 ml; 4,6 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 3–3,5 h bei Raumtemperatur geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert und gewaschen (3 × 8 ml DMSO, 6 × 8 ml DMF, 6 × 8 ml DCM, 6 × 8 ml MeOH, 3 × 8 ml DMF).
  • Der Chloranil-Test war positiv.
  • Schritt 3 – Anbindung von Fmoc-Aminosäuren (9)
  • 3 Equiv. einer Fmoc-Aminosäure oder einer anderen Verbindung mit einer Carboxyl-Gruppe, wie z. B. Pam3Cys-OH, und HOBt·H2O (3 Equiv.; 0,115 g; 0,75 mmol) wurden in 8 ml DMF gelöst und DIC (3 Equiv.; 1,16 ml; 7,5 mmol) wurde zugegeben. Im Falle des Pam3Cys-OH wurde eine Mischung aus DCM und DMF (1:1 v:v) verwendet, um die Löslichkeit zu verbessern.
  • Die Lösung wurde zu dem Harz gegeben und die Mischung mindestens 45 min, bei längerkettigen oder schlecht löslichen Aminosäuren mindestens 3 h, geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert und mit 8 × 8 ml DMF gewaschen.
  • Der Chloranil-Test war negativ.
  • Schritt 4 – Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen (10)
  • Eine Lösung aus Piperidin in DMF (8 ml; 30% v:v) wurde zu dem Harz gegeben und die Mischung 20 min geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert, 1-mal mit 8 ml DMF gewaschen und nochmals für 15 min mit einer Lösung aus Piperidin in DMF (8 ml; 30% v:v) geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert und mit 6 × 8 ml DMF gewaschen.
  • Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit dem Kaiser-Ninhydrin-Test überprüft. Bei negativem Testergebnis wurde die Abspaltung mit doppelter Inkubationszeit wiederholt.
  • Schritt 5 – Abspaltung der Aloc-Schutzgruppen
  • Pd(PPh3)4 (1,1 Equiv.) wurde in 10 ml DCM mit 5% Essigsäure und 2,5% Morpholin gelöst.
  • Die Lösung wurde zu dem 5-mal mit DCM gewaschenen Harz gegeben und die Mischung mindestens 6 h geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert und je 5-mal mit DCM mit 5% Essigsäure, reinem DCM, DMF und DCM gewaschen.
  • Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit dem Kaiser-Ninhydrin-Test überprüft.
  • Schritt 6 – Abspaltung der Boc- und Seitengruppen
  • 8 ml einer Lösung aus 95% TFA und 5% H2O (v:v) wurden zu dem Harz gegeben und die Mischung 40–60 min geschüttelt.
  • Das Harz wurde abfiltriert und mit 8 × 8 ml DMF gewaschen.
  • Die Vollständigkeit der Reaktion wurde mit dem Kaiser-Ninhydrin-Test überprüft.
  • Schritt 7 – Photochemische Abspaltung vom Trägerharz (11)
  • Zur Überprüfung der Synthese wurden jeweils 5 mg Harz entnommen und in 1 ml 80% tert. Butylalkohol/Wasser aufgenommen. Die Mischung wurde 10 min geschüttelt und abfiltriert.
  • Anschließend wurde nochmals 1 ml 80% tert. Butylalkohol/Wasser zugegeben. Nun wurde die Mischung für 90 min mit UV-Licht der Wellenlänge 365 nm bestrahlt und anschließend abfiltriert.
  • Die Bestrahlung wurde nach nochmaliger Zugabe von 1 ml 80% tert. Butylalkohol/Wasser mit einer Belichtungszeit von 30 min wiederholt und das Harz anschließend abfiltriert.
  • Das Harz wurde mit 400 μl Ethanol gemischt und nach 3 min Inkubationszeit abfiltriert.
  • Die Filtrate aller Schritte der UV-Bestrahlung wurden vereinigt, schockgefroren und lyophilisiert.
  • Das erhaltene farblose Pulver wurde für die weiteren Untersuchungen verwendet.
  • Beispiel C – Kopplung des Grundkonjugates mit Biotin
  • An das gemäß Ausführungsbeispiel B hergestellte Grundkonjugat wurde Biotin, stellvertretend für verschiedene potentiell bioaktive Verbindungen, angebunden und das Reaktionsprodukt analytisch untersucht.
  • Durchführung der Kopplungsreaktion
  • Für die Synthese wurden 50 mg des mit dem Grundkonjugat beladenen Harzes (6) verwendet.
  • Als Spacer-Seitenkette wurden 2 Moleküle β-Alanin und 2 Moleküle ε-Aminocapronsäure an das Aloc-geschützte Lysin und anschließend das Biotin angekoppelt. Danach wurden alle Schutzgruppen abgespalten (Schritte 3 bis 6 in Ausführungsbeispiel B).
  • 10 mg des mit dem Syntheseprodukt beladenen Trägerharzes wurden für die folgende photochemische Abspaltung eingesetzt. Dabei wurde die Abspaltungsprozedur in Abweichung zu Schritt 7 in Ausführungsbeispiel B 4-mal wiederholt.
  • Analyse des Reaktionsproduktes
  • Ein Teil der resultierenden 3,2 mg der Testverbindung Pam3Cys-SK3K(βA-βA-Aca-Aca-Biotin)-NCH3 wurde in Wasser gelöst und mittels HPLC-ESI-MS analysiert.
  • In dem in 12 dargestellten Massenspektrum (kalkulierte Masse 2118 g/mol) repräsentieren die Peaks
    707,1 [MH3]3+
    1059,7 [MH2]2+
    712,5 [MH3]3+ Oxidationsprodukt mit einem oxidierten Schwefel-Atom
    1067,8 [MH2]2+ Oxidationsprodukt mit einem oxidierten Schwefel-Atom
    717,6 [MH3]3+ Oxidationsprodukt mit zwei oxidierten Schwefel-Atomen
    1075,5 [MH2]2+ Oxidationsprodukt mit zwei oxidierten Schwefel-Atomen
  • Wie aus dem Massenspektrum erkennbar ist, stellt die Zielverbindung das Hauptprodukt dar.
  • Beispiel D – Kopplung des Grundkonjugates mit einer chemischen Bibliothek
  • Nach dem Split-and-Mix-Prinzip wurde auf das Grundkonjugat (6) nach 2 Molekülen β-Alanin als Spacer-Seitenkette eine Dipeptid-Bibliothek synthetisiert. Hierzu wurden die 20 proteinogenen Aminosäuren verwendet, was zu 400 verschiedenen Konjugaten führte.
  • 8 mg dieser Bibliothek wurden mittels photochemischer Abspaltung freigesetzt und aufkonzentriert. Die erhaltenen Massenspektren (13 und 14) zeigen klar, dass es sich um eine Bibliothek handelt. Die höchsten und niedrigsten Massen sowie die häufigsten Peaks wurden den entsprechenden Aminosäuren zugeordnet.
  • Beispiel E – Herstellung einer Trägerplatte mit einer Bead-Monolayer
  • Ausgangspunkt für den ortsaufgelösten Übertragungsprozess der Testsubstanzen ist die Fixierung der Synthese-Beads auf einer Trägerplatte, idealerweise in einer Monolayer.
  • Als Trägerplatte wurde ein Kunststoff-Polymer verwendet, auf das eine dünne, nur wenige Mikrometer dicke, UV-durchlässige sowie erwiesenermaßen biologisch inaktive Klebstoffschicht aufgebracht wurde.
  • Um eine Bead-Monolayer herzustellen, benötigt man 4 Teilschritte, die im Folgenden beschrieben sind.
  • Spezifizierung der Beads
  • Die Trägerharz-Beads besitzen im trockenen, ungequollenen Zustand eine einheitliche Größe von 20 μm im Durchmesser. In einem Gramm trockenem Material sind 240 Millionen Beads enthalten. Die mittlere Beladung des Trägerharzes beträgt 240 μmol pro g. Dies entspricht einer Ladungskapazität von ca. 1 pmol bzw. 6·10–11 Molekülen pro Bead.
  • Alle Trägerharz-Beads besitzen eine einheitliche Struktur, Größe, Form, Beladung und Funktionalisierung. Im folgenden wird eine NH2-Funktionalisierung der Beads verwendet.
  • Vereinzeln der Beads
  • Um aus dem Bead-Pulver die Trägerharz-Partikel zu einer Monolayer auf der Trägerplatte formen zu können, ist es unabdingbar, diese zuvor zu vereinzeln, da bei der Synthese gelegentlich Verklebungen auftreten.
  • Hierfür wurden die Beads in 60°C warmem tert. Butylalkohol aufgenommen, für 20 min mit Ultraschall behandelt und anschließend für weitere 20 min geschüttelt, wobei die Temperatur stets über 40°C gehalten wurde.
  • Waren die Beads im Pulver noch nicht genügend vereinzelt, wurden sie 1 h in n-Methyl-pyrrolidinon geschüttelt und danach 3-mal mit Diethylether gewaschen. Anschließend wurden sie wieder in 60°C warmer tert. Butylalkohol aufgenommen und die ursprüngliche Prozedur wiederholt.
  • Die Lösung mit den vereinzelten Beads wurde durch flüssigen Stickstoff schockgefroren und bei –80°C und 0,5 mbar Druck lyophilisiert.
  • Es blieb ein feines Pulver zurück, welches weniger als 0,5‰ nichtvereinzelte Beads enthielt.
  • Aufbringen der Beads auf die Trägerplatte
  • Für diesen Teilschritt können alternativ drei verschiedene Beschichtungstechniken verwendet werden.
  • Bei der Pulverbeschichtung wurde die Trägerplatte mit der Klebstoffschicht nach unten im oberen Teil einer Beschichtungskammer montiert. Ein von unten in die Beschichtungskammer eintretender Gasstrahl verwirbelte die dort am Boden liegenden Beads und trug sie zur Trägerplatte, wo sie haften blieben. Sobald die Klebstoffschicht bedeckt war, hafteten keine weiteren Beads mehr an der Trägerplatte. Es bildete sich vornehmlich eine Monolayer aus. Bei der Tauchbeschichtung wurden die Beads auf die Klebstoffschicht der Trägerplatte gestreut, bzw. die Trägerplatte wurde in die Beads getaucht. An dem Klebstofffilm blieben nur Beads haften, die direkten Kontakt mit der Trägerplatte hatten. Eine Monolayer entstand. Überschüssiges Material wurde durch Abstreichen, Abpinseln bzw. Abblasen mit einem Gasstrahl entfernt.
  • Bei der Zentrifugalbeschichtung wurde die Trägerplatte zusammen mit den Beads in die Beschichtungskammer gegeben. Die Beschichtungskammer wurde so in eine Zentrifuge eingelegt, dass die Beads durch die Zentrifugalkraft in die Klebstoffschicht der Trägerplatte gedrückt wurden. Danach wurde die Beschichtungskammer umgedreht, sodass durch die bei der erneuten Zentrifugation entstehenden Fliehkräfte die überschüssigen Beads von der Trägerplatte entfernt wurden. Abstand und Drehzahl wurden jeweils so gewählt, dass die Beads fest in die Klebstoffschicht eingedrückt bzw. nicht wieder aus dieser herausgelöst wurden. Zurück blieb eine Monolayer.
  • Immobilisierung der Beads auf der Trägerplatte
  • Mikroskopische Aufnahmen der beschichteten Trägerplatten zeigten noch einige Bead-Cluster und Überlagerungen. Außerdem waren die Beads noch nicht genügend fixiert. Deshalb erfolgte als nächster Schritt das Kämmen.
  • Dazu wurde ein Metallgrat in einem spitzen Winkel zur Zugrichtung über die Oberfläche der Bead-beschichteten Trägerplatte gezogen. Hierbei war die Spitze des Grates so zu führen, dass die darunter liegenden Beads in die Klebstoffschicht hineingedrückt wurden. Durch die Ziehbewegung ordneten sich die Beads zu einer dichten Lager, Fehlstellen in der Schicht wurden geschlossen.
  • Entfernung nicht fixierter und/oder hinausragender Beads
  • Im zweiten Schritt des Kämmens wurde der Grat in einem stumpfen Winkel zur Zugrichtung auf der Trägeroberfläche angesetzt. Hierdurch wurden überstehende Beads, nicht fest haftende Bruchstücke und Bead-Cluster angehoben und aus der Beschichtung entfernt.
  • Abschließend wurde die Trägeroberfläche mit Druckluft abgeblasen, um Bruchstücke und Staub zu entfernen.
  • Es entstand eine Monolayer, die nahezu keine überstehenden Beads oder Cluster mehr enthielt.
  • Vergleich der Beschichtungstechniken
  • Mit allen drei Beschichtungstechniken konnte eine Bead-Monolayer erreicht werden. Pulverbeschichtung und Tauchbeschichtung zeigen nach dem Kämmen nahezu ideale Schichten (15 und 16). Auch die Zentrifugalbeschichtung ergibt eine Monolayer (17). Diese ist jedoch nicht so dicht gepackt, wie die aus den beiden anderen Techniken resultierenden Schichten.
  • Die Größe der Trägerplatte kann bei allen drei Techniken prinzipiell beliebig gewählt werden.
  • Beispiel F – Übertragung eines stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen auf die Testplatte
  • Die hier beispielhaft verwendeten Screening-Verbindungen waren über den photochemisch spaltbaren Linker 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure an den NH2-funktionalisierten Trägerharz-Beads verankert. Als bioinerter Spacer wurde das Pentapeptid Serin-Lysin-Lysin-Lysin-Lysin mit einer β-Alanin-β-Alanin-Seitenkette und als lipohile Gruppe Pam3Cys-OH verwendet (18). Als Testplatte diente ein Objektträger mit durch Trimethoxypalmitoylsilan hydrophobierter Glas-Oberfläche.
  • Die beschichtete Seite der entsprechend Ausführungsbeispiel E präparierten Trägerplatte, die auf einer Fläche von 25 × 74 mm ca. 4 Millionen Beads trug (19), wurde mit Wasser befeuchtet. Nach kurzer Verweilzeit von wenigen Minuten wurde die Testplatte mit der lipophilisierten Seite auf die Beschichtung der Trägerplatte aufgelegt. An jedem Bead bildete sich eine singuläre Kontaktzone zwischen der Träger- und der Testplatte aus.
  • Durch Einstrahlung von UV-Licht (365 nm) wurde der Photolinker gespalten. Die vom Trägerharz getrennten Testverbindungen diffundierten durch die feuchte Quellschicht der Beads (20). Sobald sie die Oberfläche der Testplatte erreichten, traten die lipophilen Gruppen in Wechselwirkung mit der hydrophoben Oberfläche. Die Moleküle der freigesetzten Testverbindungen richteten sich, unterstützt durch den in ihrer Struktur enthaltenen Spacer, auf der Testoberfläche zu einer dichten, festhaftenden Monolayer aus.
  • Nach der Entfernung der Trägerplatte verblieb pro Synthese-Bead ein isolierter Substanz-Spot, der ausschließlich Moleküle einer Testverbindung enthielt (21). Die Substanz-Spots waren spiegelbildlich zu dem Bead-Array auf der Trägerplatte angeordnet.
  • Unter den gewählten Reaktionsbedingungen (Bestrahlungs- und Verweilzeiten) war der Abspaltungs- und Übertragungsprozess nicht vollständig. Es verblieb deshalb noch genügend synthetisches Konjugat der Testverbindungen an den Beads. Somit konnte eine Trägerplatte durch Wiederholung des Prozesses zur Herstellung mehrerer identischer Testplatten (Kopien) verwendet werden.
  • Beispiel G – Evaluierung des Transfers
  • Transfer von Fluorophoren
  • Für die interne Kontrolle des Transfers und der Zuordnung von Spot-Mustern wurden auf dem Grundkonjugat (6) Fluorophore nach den in Ausführungsbeispiel C beschriebenen Methoden an der Stelle des Biotins verankert. Dabei wurden Carboxyfluorescein (22) und Tetramethylrhodamin (23) verwendet.
  • Die fluoreszierenden Beads wurden, wie in Ausführungsbeispiel E beschrieben, auf eine Trägerplatte aufgebracht. Davon wurden nach den Methoden von Ausführungsbeispiel F drei nahezu identische Testplatten hergestellt.
  • Um die Zuordnung des Spot-Musters der Schicht zu dem Bead-Muster der Trägerplatte zu erleichtern, wurde keine dichte Monolayer aufgetragen.
  • Die eineindeutige Zuordnung der einzelnen Spots war innerhalb einer Variationsbreite von maximal 1 μm möglich. Auch Torsions-Effekte konnten korrigiert werden. Lediglich Verformungen der Testplatten führten zu geringfügigen Abweichungen (24).
  • Einfluss von Bindungs-Reaktionen auf der Testoberfläche
  • Zur Kontrolle der Stabilität des Spot-Musters auf den Testplatten während der medizinisch-biologischen Tests wurde ein weiterer Versuch durchgeführt. Dafür wurde ein stochastisch angeordnetes Array aus nicht beladenen, mit Carboxyfluorescein und mit Biotin beladenen Trägerharz-Beads nach den Methoden von Ausführungsbeispiel E auf eine Trägerplatte aufgetragen. Davon wurden drei identische Testplatten nach den Methoden von Ausführungsbeispiel F hergestellt.
  • Auf den Testoberflächen wurde eine Bindungsreaktion mit einem Fluoreszenz-markierten Streptavidin durchgeführt. Die Spot-Muster aller vier Platten wurden anschließend verglichen. Nach Korrektur der Torsions- und Verzerrungs-Effekte war eine Zuordnung der Spots mit einer Variationsbreite von maximal 2 μm möglich.
  • Somit konnte gezeigt werden, dass die nach dem Transfer des Arrays durchgeführte Bindungsreaktion keinen Einfluss auf die Stabilität des Spot-Musters auf der Testplatte hatte. Einzelne nachgewiesene Übertragungsfehler sind aufgrund der redundanten Information aus dem stochastischen Array unproblematisch.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (38)

  1. Verfahren zur Herstellung und Anwendung von stochastisch angeordneten Arrays von Testsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Array zufällig verteilter Substanzen von einer Trägerplatte auf eine Testoberfläche übertragen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Übertragung ortsaufgelöst unter Beibehaltung der räumlichen Anordnung erfolgt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die ortsaufgelöste Übertragung in Abhängigkeit vom Durchmesser der Trägerpartikel mit einer Abweichung von weniger als 2 μm möglich ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mit einer Trägerplatte eine oder mehrere identische Testplatten hergestellt werden können.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man 5.1. die Testsubstanzen mit spezifisch auf das Verfahren abgestimmten Eigenschaften ausstattet, 5.2. die Testsubstanzen an ein Trägerharz bindet, 5.3. die beladenen Trägerharz-Beads auf eine Trägerplatte aufbringt, 5.4. die Testsubstanzen von der Trägerplatte auf eine oder mehrere Testplatten überträgt, 5.5. die Substanz-Tests direkt auf den Testoberflächen durchführt, 5.6. die Substanz-Spots auf den Testplatten den Trägerharz-Beads auf der Trägerplatte zuordnet und 5.7. die Testsubstanzen auf den beladenen Trägerharz-Beads ortsgenau an der entsprechenden Position der Trägerplatte identifiziert.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt 5.1. hergestellten Testverbindungen neben dem aktiven, bevorzugt dem biologisch aktiven, Teil die Prinzipien 5.1.1. eines orthogonal zu den Syntheseschritten spaltbaren Linkers, 5.1.2. eines Übertragungsprinzips und 5.1.3. eines biokompatiblen Spacers einzeln oder in beliebiger Kombination aufweisen.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der orthogonal zu den Syntheseschritten spaltbare Linker durch physikalische, biologisch/enzymatische oder chemische Methoden gespalten werden kann.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der orthogonal zu den Syntheseschritten spaltbare Linker ein Photolinker, bevorzugt 4-Bromomethyl-3-nitrobenzoesäure ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Übertragungsprinzip funktionelle Gruppen repräsentiert, die adhesive oder elektrostatische Wechselwirkungen, ionische oder kovalente Bindungen oder Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen mit der Oberfläche der Testplatte eingehen können.
  10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Übertragungsprinzip durch eine hydrophobe Gruppe, bevorzugt Pam3Cys-OH realisiert ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der biokompatible Spacer den aktiven, bevorzugt den biologisch aktiven, Teil der Testsubstanz-Moleküle vom Übertragungsprinzip und der Testoberfläche räumlich trennt.
  12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der biokompatible Spacer durch die räumliche Trennung die Beeinflussung der Testergebnisse durch Übertragungsprinzip und/oder Testoberfläche verhindert.
  13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der biokompatible Spacer eine lineare Molekülkette, bevorzugt eine peptidische Verbindung, besonders bevorzugt ein Pentapeptid mit kurzen Seitenketten ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Prinzipien 5.1.1. bis 5.1.3. vor, während und/oder nach der Synthese, bevorzugt der Festphasensynthese, der Testsubstanzen eingeführt werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt 5.2. realisierte Anbindung an das Trägerharz vor, während und/oder nach der Synthese, bevorzugt der Festphasensynthese, der Testsubstanz-Moleküle erfolgt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Testsubstanz-Moleküle über den orthogonal zu den Syntheseschritten spaltbaren Linker an das Trägerharz gebunden sind.
  17. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt 5.3. eine dichte Monolayer von stochastische verteilten, mit verschiedenen Testsubstanzen beladenen Trägerharz-Beads auf der Trägerplatte aufgetragen wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch von Trägerharz-Beads aus verschiedenen Synthesen aufgetragen wird.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass Gemische von Trägerharz-Beads aus verschiedenen Synthesen oder auch Trägerharz-Beads aus einer Synthese in räumlich getrennten Kompartimenten der Trägerplatte aufgetragen werden.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Monolayer durch 5.3.1. Vereinzeln der Trägerharz-Beads, 5.3.2. Pulver-, Tauch- oder Zentrifugalbeschichtung, 5.3.3. anschließendes Kämmen und 5.3.4. Entstauben erzeugt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Trägerplatte eine biokompatible, nichttoxische Klebstoffschicht aufgetragen ist.
  22. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt 5.4. realisierte Übertragung der Testsubstanzen durch 5.4.1. Spaltung des orthogonalen Linkers, 5.4.2. Diffusion der Testsubstanz-Moleküle in der Quellschicht der Trägerharz-Beads, 5.4.3. Wechselwirkung des Übertragungsprinzips mit der Testoberfläche, 5.4.4. Ausrichtung der Testsubstanz-Moleküle auf der Testoberfläche und 5.4.5. Bindung des Übertragungsprinzips an der Testoberfläche erfolgt.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der Testplatte, passend zum jeweiligen Übertragungsprinzip modifiziert, bevorzugt hydrophobiert ist.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Übertragungsprozess durch einen die Trägerharz-Beads umhüllenden Film eines Mediums, bevorzugt Wasser oder Pufferlösung, vermittelt wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Übertragung der Testsubstanzen in singulären Kontaktzonen zwischen der Testplatte und den Trägerharz-Beads erfolgt.
  26. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass pro Trägerharz-Bead ein homogener Substanz-Spot, enthaltend nur eine Testsubstanz, auf der Testplatte erzeugt wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt 5.4. zur Erzeugung mehrerer identischer Testplatten wiederholt werden kann.
  28. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt 5.5., die Untersuchungen der Aktivität und/oder Wirkungsweise der Testsubstanzen, direkt auf der Oberfläche der Testplatte durchgeführt wird.
  29. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in Verfahrensschritt 5.6. realisierte Zuordnung der Substanz-Spots durch intelligente Mustererkennungsverfahren erfolgt.
  30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerplatte und die Testplatte mit Markierungen, die zur Definition eines Koordinatensystems geeignet sind, versehen sind.
  31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Trägerplatte ein stochastisches Muster aus durch das Verfahren nach Anspruch 1 übertragbaren Markern, bevorzugt aus Trägerharz-Beads, die mit Fluoreszenz-Farbstoff-Molekülen, enthaltend die Prinzipien 5.1.1. bis 5.1.3., beladen sind, aufgetragen wird.
  32. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass anhand eines durch die Markierungen und/oder Marker-Muster definierten Koordinatensystems jedem Testsubstanz-Spot eindeutige Koordinaten zugewiesen werden können.
  33. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass aufgrund der ermittelten Koordinaten eine eineindeutige Zuordnung jedes Testsubstanz-Spots zu dem ursprünglichen Trägerharz-Bead möglich ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass Übertragungsfehler wie Verzerrungs-, Torsinns- und Schrumpfungs-Effekte durch spezielle mathematische Algorithmen korrigiert werden können.
  35. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Verfahrensschritt 5.7., der Nachweis der chemischen Struktur ausgewählter Testsubstanzen, direkt auf der Trägerplatte an den zugeordneten Trägerharz-Beads erfolgt.
  36. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man es für umfangreiche Testreihen zur Untersuchung von Wechselwirkungen der Testsubstanzen mit spezifischen Zielmolekülen einsetzen kann.
  37. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man es für umfangreiche Testreihen zur Untersuchung der biologischen Aktivität von Testsubstanzen, bevorzugt für Wirkstoff-Screenings und Antikörpertests einsetzen kann.
  38. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man es für die medizinisch-biologische Diagnostik einsetzen kann.
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