DE60213890T2

DE60213890T2 - Reaktionssondenchip und detektionssystem

Info

Publication number: DE60213890T2
Application number: DE60213890T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hirakata-shi NAGASAWA
Original assignee: Ebara Corp
Current assignee: Nagasawa Hiroshi Fujisawa-Shi Kanagawa Jp
Priority date: 2001-01-24
Filing date: 2002-01-24
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2022-01-25
Also published as: EP1226871A2; EP1226871A3; JP2002218974A; EP1226871B1; DE60213890D1; US20020127585A1

Description

Diese Erfindung betrifft einen Reaktionssondenchip, welcher verwendet wird zur Diagnose von Genen und physiologischen Funktionen und welcher die Erkennung von vielen funktionalen Molekülen ermöglicht, und ein Detektionssystem zum Detektieren eines Reaktionsprodukts, welches durch den Reaktionssondenchip erhalten wird.
Beschreibung des relevanten technischen Hintergrunds
Die Detektion von Polymorphismus aufgrund der Variation eines Gens, insbesondere die Variation von einer Basis (Sequenz), ist effektiv zur Diagnose einer Krankheit, welche Mutation oder Ähnlichem zugeschrieben wird, zum Beispiel Krebs. Seine Detektion ist auch notwendig für Richtlinien über Ansprech- und Abwehrreaktionen von Medikamenten, und trägt zur Analyse von Genen bei, welche zu Ursachen von Krankheiten verschiedener Faktoren in Beziehung stehen und trägt zur vorhersagenden medizinischen Behandlung bei. Die Verwendung eines so genannten DNA Chips ist bekannt, um für diese Detektion effektiv zu sein.
Ein bis jetzt verwendeter DNA Chip, welcher kurze DNA Stränge hat, welche daran befestigt sind, ein so genannter Genchip von Affymetrix, verwendet normalerweise 10.000 oder mehr Oligo-DNA Fragmente (DNA Sonden), welche auf einem Silizium- oder Glassubstrat von einem Zentimeter quadratisch durch Photolithographietechnik hergestellt sind. Wenn eine DNA Probe, zum Beispiel mit Fluoreszenz markiert, auf diesen DNA Chip gebracht wird, binden DNA Fragmente, welche Sequenzen haben, welche zu den Sonden auf dem DNA Chip komplementär sind, an die Sonden. Nur die gebundenen Teile können durch Fluoreszenz unterschieden werden, und die bestimmten Sequenzen der DNA Fragmente in der DNA Probe können erkannt und quantitativ bestimmt werden. Es wurde bereits gezeigt, dass dieses Verfahren dazu in der Lage ist, Mutation eines Onkogens zu detektieren oder Genpolymorphismen zu detektieren.
Ein Microarray (eine Mikroanordnung), welches cDNAs hat, welche auf einer Glasplatte angeordnet sind, wird auch verwendet.
WO 9603212 A1 betrifft ein Gerät zur multidimensionalen Leitungskombinatorischen Bibliothekssynthese und weist Verfahren und Geräte auf zum Synthetisieren von kombinatorischen Bibliotheken von chemischen Verbindungen, insbesondere zum Synthetisieren von N<2> oder N<3> Verbindungen, auf. Insbesondere wird ein Gerät zur zweidimensionalen oder dreidimensionalen Leitungssynthese vorgesehen. Ein multidimensionales Leitungsgerät zur molekularen Synthese weist Folgendes auf: (a) ein erstes Array von Zellen, welche entlang einer oder mehreren Achsen angeordnet sind; (b) mindestens ein zweites Array von Zellen, welche entlang einer oder mehrerer Achsen angeordnet sind; und (c) Mittel zur Kommunikation unter dem ersten und zweiten Array von Zellen und zu und von jeder Zelle in den Arrays von Zellen; und (d) Mittel zum Bewegen von Substraten und Reagenzien unter diesen Mitteln zur Kommunikation.
DE 200 05 738 U offenbart ein dicht gepacktes Einrichtung, in welchem verschiedene Targetmoleküle in einer großen Anzahl von Probenflächen gebunden sind, wobei Trägerplatten verwendet werden, welche dicht gepackte Kapillarstrukturen enthalten und eine sehr große innere Oberfläche trotz kleiner äußeren Abmessungen haben. Eintausend mal mehr Moleküle können gebunden werden als auf einer flachen äußeren Oberfläche einer vergleichbaren Größe. Querkontamination wird verhindert durch das Fehlen von Querverbindungen zwischen den Kapillaren. Verdampfung wird minimiert durch eine kleine äußere Oberfläche. Nachdem die innere Oberfläche der Kapillaren silanisiert wurde, werden Peptide und Peptidomimetics in der Art und Weise eines lokalen Targets synthetisiert. Die molekularen Interaktionen der Komponenten der Substanzbibliothek mit aktiven Substanzen in einer Lösung oder einer Suspension werden im Weg eines Verfahrens der lokal aufgelösten optischen Detektion untersucht. Die Hantierung, insbesondere das Reinigen und das Abdecken mit Substanzen, wird durch Spülen von Flüssigkeiten durch die Kapillarplatte ausgeführt.
Die früheren Technologien haben jedoch einige Probleme bereitet.
Damit ein DNA Chip produziert werden kann unter Verwendung von zum Beispiel Photolithographie werden mindestens 4 Photomasken benötigt zur Synthese in einer Stufe, und ein Zyklus von Photolithographie, Koppeln und Waschen muss vier mal wiederholt werden. Weil diese Prozedur für die notwendige Stranglänge wiederholt werden muss sind hohe Kosten involviert. In veränderten Mustern müssen die Photomasken entsprechend verändert werden. DNA Chips von verschiedenen Designs, welche die Bedürfnisse flexibel erfüllen, waren nicht verfügbar.
Ein DNA Microarray Chip, welcher mit einer Lösung von synthetischen Oligonucleotiden mit einer hohen Dichte betupft bzw. bespritzt wird, wurde als ein alternatives Verfahren vorgeschlagen. Dieser Typ von Chip muss sich einer komplizierten Prozedur unterziehen, welche die Einfügung einer Modifikationsgruppe nachfolgend auf Oligonucleotidsynthese, Abschneiden der modifizierten Oligonucleotide von dem Träger, gefolgt von Entfernen und Reinigung, aufweist, um Oligonucleotide zu erhalten, und Reaktion der Oligonucleotide mit funktionellen Gruppen, welche auf Fixierglas eingeführt werden. Somit ist dieser Chip teuer, wie ein DNA Chip, welcher auf Photolithographie basiert.
Während der Detektion mit diesen Reaktionschips ist die Hybridisierung lokalisiert, um zu einem Verlust in der quantitativen Bestimmbarkeit zu führen, und ein Gerät, welches für die Hybridisierung dediziert ist, soll verwendet werden und zu einer lange andauernden Reaktion gebracht werden. Somit ist die Detektion von verschiedenen Stücken von genetischer Information, einschließlich einer für den Zweck von Knochenmarktransplantation, durch die Verwendung von Reaktionschips, arbeitsintensiv und zeitaufwendig und führt zu einer Vielzahl von Ausgaben.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein angenehmeres Verfahren zum Vorbereiten eines DNA Chips zu etablieren, und einen Reaktionsdetektionschip und ein Detektionssystem vorzusehen, welches in verschiedenen Diagnosen von physiologischen Funktionen, einschließlich DNA Polymorphismus, verwendet werden kann.
Um das vorstehend genannte Ziel zu erreichen führten die vorliegenden Erfinder mehrere Studien auf Materialien für und Formen von Reaktionssondenchips aus. Durch diese Studien versuchten sie, einen Reaktionssondenchip zu realisieren, welcher auf der Oberfläche einen hohen Grad von Integration hat, vergleichbar zu demjenigen, welcher durch die vorher stehend genannten Photolithographie Einrichtungen erhalten wird, ohne die Verwendung von photolithographischen Technologien, welche einen langen, komplizierten Reaktionsprozess erfordern, Schwierigkeit in der Erreichung von verschiedenen Zielen auferlegen und hohe Kosten involvieren, und ohne die Verwendung einer Einrichtung, welche zur Hybridisierung dediziert ist.
Basierend auf diesen Studien fanden die Erfinder heraus, dass die oben beschriebenen Probleme gelöst werden können durch Füllen und Halten von Trägern in einer Vielzahl von hindurch gehenden Löchern, welche in einem Substrat gleichmäßig angeordnet sind, wobei die Träger verschiedene Sondenmoleküle haben, welche für die jeweiligen Löcher fixiert sind, und dann Einführen einer Probe in die Träger gefüllten Löcher. Diese Erkenntnis führte sie dazu, die vorliegende Erfindung auszuführen.
Die vorliegende Erfindung löst die oben genannten Probleme durch einen Reaktionssondenchip gemäß Anspruch 1.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung können von den abhängigen Ansprüchen erhalten werden.
Auch wird ein Reaktionsprodukt-Detektionssystem gemäß Anspruch 6 vorgesehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Reaktionsdetektionschip einfach vorgesehen werden, welcher reaktive Substanzen auf seiner Oberfläche integriert hat, wobei die reaktiven Substanzen Proteine aufweisen, welche zufällig willkürliche Konfigurationen haben oder Oligonucleotide, welche willkürliche Basissequenzen haben. Der Detektionschip kann ohne den Bedarf für spezielle Ausrüstung wie Photolithographieausrüstung vorgesehen werden.
Ferner kann die Reaktionszeit dramatisch verkürzt werden, die Reproduzierbarkeit der Reaktion kann verbessert werden, und der gesamte Durchsatz kann erhöht werden. Somit wird die Präparation eines Reaktionssondenchips für DNA oder Ähnliches, welcher individuelle Bedürfnisse erfüllt, nötig, was zu medizinischer Behandlung nach besonderer Anweisung beiträgt.
Die vorliegende Erfindung wird voller verstanden werden von der detaillierten Beschreibung, welche unten stehend gegeben wird, und den beigefügten Zeichnungen, welche nur im Weg der Illustration gegeben werden, und somit nicht einschränkend für die vorliegende Erfindung sind, und wobei Folgendes gilt:
1 ist eine Draufsicht eines Reaktionssondenchips gemäß der vorliegenden Erfindung;
2(a) bis 2(d) sind teilweise Schnittansichten, welche die Zustände der Disposition von durch verschiedene Träger hindurch gehenden Löchern eines Substrats in dem Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung zeigen, wobei die Träger von 2(a) bis 2(d) eine poröse Substanz, eine poröse Membran, ein nicht gewebter Stoff, und ein poröses Glaspulver, jeweils fixiert zu der Membran oder Ähnlichem, sind;
3(e) bis 3(g) sind vergrößerte teilweise Schnittansichten, welche die poröse Substanz, den nicht gewebten Stoff, und das poröse Glaspulver fixiert auf dem nicht gewebten Stoff jeweils zeigen;
4(h) und 4(i) sind vergrößerte teilweise Querschnittsansichten der Träger, welche Sondenmoleküle haben, welche daran fixiert sind, wobei die Träger die poröse Substanz in 4(h) und der nicht gewebte Stoff in 4(i) sind;
5 zeigt im Querschnitt den Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung, welcher den Träger hat, welcher in den Löchern gehalten wird, und einen Stapel der Reaktionssondenchips;
6(j) bis 6(l) sind erklärende Schnittansichten des Reaktionssondenchips der vorliegenden Erfindung, welche in einer Reaktionszelle fixiert sind, 6(j) zeigt den fixierten Zustand auf dem Reaktionschip in der Reaktionszelle, 6(k) zeigt den anfänglichen Zustand des Einfügens und des Saugens einer Fluoreszenz markierten Probe, und 6(l) zeigt den verteilten Zustand von hybridisierten Spots in dem Reaktionschip;
7 ist eine Schnittansicht, welche das Prinzip der Fluoreszenzselektion zeigt, welche Fluoreszenzemission von den hybridisierten Spots in dem Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung zeigt wenn sie ultravioletter Strahlung ausgesetzt wird;
8 ist eine Draufsicht, welche den verteilten Zustand von Spots bei der Hybridisierung des Reaktionssondenchips der vorliegenden Erfindung zeigt;
9 ist eine konzeptionelle Ansicht eines Fluoreszenzselektionssystems unter Verwendung des Reaktionssondenchips der vorliegenden Erfindung; und
10 ist eine schematische Zeichnung eines Detektionssystems, in welchem die konzeptionelle Ansicht des Fluoreszenzdetektionssystems der vorliegenden Erfindung von 9 als Einrichtungen ausgedrückt ist.
Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden detaillierter beschrieben mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen.
1 ist eine exemplarische Zeichnung, welche die Beziehung zwischen einem Substrat, welches den Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung repräsentiert, und einen Träger, welcher Sondenmoleküle daran fixiert hat, zeigt, wobei das Substrat eine Vielzahl von diskreten hindurch gehenden Löchern hat, welche regelmässig darin angeordnet sind. 1 illustriert in einer Draufsicht den angeordneten Zustand von mehreren hindurch gehenden Löchern 3 in einem Substrat 2, welche mit einem Träger 1 gefüllt sind und diesen halten.
2(a) bis 2(d) sind teilweise Schnittansichten, welche den Zustand der Disposition von verschiedenen Trägern 1 in den hindurch gehenden Löchern 3 des Substrats 2 in dem Reaktionssondenchip, welcher in 1 gezeigt ist, zeigen. Die Träger sind flüssigkeitspermeabel, und Materialien, welche solche Eigenschaften haben, werden kollektiv als „poröses Medium oder Medien" bezeichnet. Verschiedene Materialien können als die porösen Medien verwendet werden. 2(a) zeigt einen Zustand, in welchem eine poröse Substanz 1a als der Träger 1 vollständig gefüllt ist und in dem hindurch gehenden Loch 3 gehalten wird. 2(b) zeigt einen Zustand, in welchem die poröse Substanz 1a in eine untere Hälfte des hindurch gehenden Lochs 3 gefüllt ist. 2(c) zeigt einen Zustand, in welchem eine poröse Membran 1b oder ein nicht gewebter Stoff 1c als der Träger 1 an der unteren Oberfläche des hindurch gehenden Lochs 3 angeklebt ist (pastenartig zum Anheften gebracht ist). 2(d) zeigt einen Zustand, in welchem ein feines Pulver von porösem Glas 1d ferner als ein Träger an die Membran 1b oder den nicht gewebten Stoff 1c fixiert ist. Die poröse Membran 1b hat flüssigkeitspermeable Mikroporen, und weist einen mikroporösen Film auf.
Die 3(e) bis 3(g) sind vergrößerte Schnittansichten, welche die Mikrostrukturen der porösen Medien zeigt, welche in den 1 und 2(a) bis 2(d) verwendet werden. In diesen Zeichnungen repräsentieren schwarze Tei le die festen Teile des porösen Mediums, während weiße Teile die porösen Teile des porösen Mediums repräsentieren. 3(e) ist eine vergrößerte Schnittansicht der porösen Substanz 1a als der Träger 1. 3(f) ist eine vergrößerte Schnittansicht des nicht gewebten Stoffs als der Träger 1. 3(g) ist eine vergrößerte Schnittansicht, welche die verwickelte Bindung des feinen porösen Glaspulvers 1d, welcher auf den Fasern des nicht gewebten Stoffs 1c fixiert ist, zeigt.
Die 4(h) und 4(i) sind vergrößerte Schnittansichten, welche die Mikrostrukturen des Trägers 1 zeigen, welche Sondenmoleküle 4 darauf fixiert haben. 4(h) illustriert den Zustand der Sondenmoleküle 4, welche in der porösen Substanz 1a (schattierte Teile) fixiert sind. 4(i) zeigt den Zustand der Sondenmoleküle 4, welche auf dem Substrat der Fasern (schattierte Teile) des nicht gewebten Stoffs 1c fixiert sind.
5 ist eine Schnittansicht des Reaktionssondenchips 5, in welcher der Träger 1, welcher verschiedene Sondenmoleküle 4, 4 und so weiter daran fixiert hat, befüllt wird und in einer Vielzahl von den hindurch gehenden Löchern 3, 3 etc. regelmäßig angeordnet in dem Substrat 2, zusammen mit einer Schnittansicht, welche einen mehrschichtigen Stapel der Reaktionssondenchips 5 zum gleichzeitigen Präsentieren von vielen der Reaktionssondenchips 5, 5 ..., welche die gleichen Charakteristika haben, zeigt.
Die 6(j) bis 6(l) sind Schnittansichten zum Erklären des Zustands der Detektion einer Probe mit der Verwendung des Reaktionssondenchips 5, welcher in einer Reaktionszelle 6 fixiert ist. 6(j) ist eine Schnittansicht, welche einen Zustand des Fixierens zeigt, in welcher das Bezugszeichen 7 einen Probeneinlass bezeichnet, 8 einen Probensauganschluss bezeichnet, und die anderen Bezugszeichen bezeichnen Teile, welche die gleichen Funktionen wie früher beschrieben haben. 6(k) ist eine Schnittansicht, welche einen Zustand zeigt, in welchem eine Fluoreszenz markierte Probe 9 damit anfängt, eingefügt und gesaugt zu werden. 6(l) ist eine Schnitt ansicht von hybridisierten Spots 10, 10 beim Binden an mehrere Typen von spezifischen Sondenmolekülen 4.
Die 7 und 8 sind Ansichten, welche die Prinzipien der Detektion von den hybridisierten Spots 10, 10 durch einen Fluoreszenzdetektor illustrieren. 7 ist eine Schnittansicht zum Erklären eines Zustands, in welchem der Reaktionssondenchip 5, welcher die hybridisierten Spots 10, 10, wie in 6(l) gezeigt ist, aufweist, mit ultraviolett (UV) Strahlung 11 bestrahlt wird, und nur die Spots 10, 10 emittieren Fluoreszenz 12. 8 ist eine Draufsicht, welche den verteilten Zustand der hindurch gehenden Löcher 3 zeigt, welche die hybridisierten Spots 10, 10 entlang der Vielzahl von hindurch gehenden Löchern 3 aufweisen, regelmässig angeordnet in dem Substrat 2. 8 zeigt auch die Orte der Emissionen von der Fluoreszenz 12 bei den Spots, 10, 10 ... in der Vielzahl von hindurch gehenden Löchern 3 des Substrats 2.
9 ist eine konzeptionelle Ansicht eines Fluoreszenzdetektionssystems unter Verwendung des Reaktionssondenchips der vorliegenden Erfindung. In einem Detektionsteil 14 wird ultraviolette Strahlung von einer Anregungslichtquelle 15 auf den Reaktionssondenchip gerichtet, Fluoreszenz, welche emittiert wird, wird Fluoreszenzdetektion 16 ausgesetzt und Daten über die detektierte Fluoreszenz werden zu einem Datenverarbeitungsteil 17 zum Verarbeiten der Daten transferiert.
10 drückt die konzeptionelle Sicht von 9 schematisch als Einrichtungen aus. Diese Zeichnung zeigt ein Detektionssystem, in welchem hybridisierte Spots, welche in einem Hybridisierungsgerät 18 erhalten werden, zur Fluoreszenz durch ein Fluoreszenzbetrachtungsgerät 19 betrachtet werden, welches aus einem Lichtquellenteil 20, einem Modulaufnahmeteil 21, und einer Betrachtungseinheit 22 besteht, und erhaltene Daten werden durch den Datenverarbeitungsteil 17 verarbeitet.
Als nächstes werden die Materialien für und die Abmessungen des Substrats, Trägers, etc., welche in den Zeichnungen beschrieben sind, erklärt.
Der Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung kann durch einen Prozess vorbereitet werden, welcher folgende Schritte aufweist:
Vorsehen eines Substrats;
Öffnen eines regelmäßigen Arrays von diskreten hindurch gehenden Löchern in dem Substrat, welche mindestens zwei seiner Oberfläche verbinden;
Fixieren eines Trägers, welcher eine reaktive Oberfläche hat, wie ein Pulver von porösem Glas, eine poröse Membran oder nicht gewebter Stoff, an mindestens einem der hindurch gehenden Löcher, wobei der Träger auf seiner Oberfläche eine reagierende Substanz wie DNA, RNA oder PNA, Antigen, Antikörper oder Epitope davon, Enzyme, Proteine oder ein funktionelles Fragment davon trägt.
Alternativ kann die reaktive Substanz auf der Oberfläche des Trägers nach dem Befestigen von letzterem an mindestens einem der hindurch gehenden Löchern durchgeführt werden.
Das Substrat kann ein Material sein, welches nicht verändert ist und stabil für das Detektionssystem, und welches Oberflächencharakteristika haben muss, welche zum Befestigen des Trägers geeignet sind. Das bevorzugte Substrat ist ein Glassubstrat wie Quarzglas und Borsilikatglas, oder ein anorganisches Substrat wie ein Siliziumwaver. Jedoch kann ein organisches Substrat wie ein Polyesterfilm oder ein Polyethylenfilm verwendet werden, wenn ein Verfahren zum Binden dessen zu dem Träger erarbeitet werden kann. Geeignete Oberflächenbehandlung kann auf die Oberfläche des Substrats angewandt werden, um zum Beispiel Kompatibilität mit einem Trägerbinder einzustellen.
Bezüglich seiner Form ist das Substrat insbesondere bevorzugterweise eine flache Platte, wie ein Film oder ein Blatt. Wenn das Substrat in der Plattenform ist, ist die Dicke oder Größe des Substrats nicht eingeschränkt. Die Dicke des Substrats wird wie gewünscht bestimmt, in Betrachtung der Formstabilität, welche für das Substrat benötigt wird. Die Größe des Substrats wird wie gewünscht bestimmt, in Betrachtung von zum Beispiel der Anzahl der hindurch gehenden Löcher, welche in der Oberfläche des Substrats vorgesehen sind.
Die Abmessung der Vielzahl von hindurch gehenden Löchern, welche regelmäßig in dem Substrat angeordnet sind, ist nicht eingeschränkt, aber ist bevorzugterweise 0,5 bis 2 mm, insbesondere bevorzugterweise ungefähr 1 mm.
Der Träger ist ein Material zum Tragen einer reaktiven Substanz (Sondenmoleküle) wie DNA, RNA oder PNA, Antigen, Antikörper oder ein Epitop davon, Enzym, Protein oder eine Funktionalstellenpolypeptitkette davon. Bevorzugte Beispiele des Trägers sind poröse Materialien, wie ein Pulver von porösem Glas, eine poröse Membran, und ein nicht gewebter Stoff. Die Formen der Poren können von irgendwelchen Formen sein, solang das poröse Material eine poröse Struktur hat. Geeignete Oberflächenbehandlung wird bevorzugterweise auf die Oberfläche des Trägers angewandt, um zum Beispiel die Kompatibilität mit der reaktiven Substanz einzustellen. Der Träger in dem hindurch gehenden Loch soll eine Struktur haben, in welcher, wenn eine Flüssigkeit während des Tragens der reaktiven Substanz oder während der Reaktion zur Detektion fließt, die Flüssigkeit durch das hindurch gehende Loch von der Oberseite zur Unterseite fließen kann.
Dies bedeutet, dass das poröse Material, als der Ort der Reaktion, ein Material sein kann, welches die Reaktionssondenmoleküle fixiert oder wächst. Es gibt keine Einschränkung für den Typ des Materials, aber poröses Glaspulver oder ein Glasfaserfilterpapier (nicht gewebter Stoff) ist bevorzugt.
Das Verfahren des Tragens der reaktiven Substanz (Sondenmolekül) auf dem Träger muss nicht spezifiziert werden. Jedoch können alle Mittel, welche zum Befestigen verwendbar sind, verwendet werden, wie ein Verfahren, welches das Befestigen einer Aminogruppe an die Oberfläche des Trägers, und dann Befestigen einer Polypeptidkette mit der Verwendung von Glutaraldehyd, aufweist. Die reaktive Substanz einer besonderen Größe muss nicht befestigt und getragen werden, sondern es ist erlaubt, die reaktive Substanz auf dem Träger zu synthetisieren, wie in der Synthese von Oligonucleotiden oder Oligopeptiden, und die Verwendung wird nicht verändert.
Die Größe und Form des Trägers kann willkürlich gewählt werden. Bei Betrachtung der Tatsache, dass der Träger, welcher viele verschiedene reaktive Substanzen trägt, auf dem Substrat befestigt ist, ist der bevorzugte Träger jedoch ein Pulver mit eins bis einhundert Mikrometer, insbesondere bevorzugterweise drei bis zwanzig Mikrometer. Dies ist so, weil eine größere Partikelgröße bevorzugt ist in Bezug auf die Arbeitseffizienz des Prozesses zum Tragen der reaktiven Substanz, aber eine kleinere Partikelgröße ist bevorzugt, wenn der Träger nach dem Tragen der reaktiven Substanz befestigt wird. Die Befestigung des Trägers auf das Substrat wird durch Dispergieren des Trägers in einem Lösungsmittel, wie Wasser, zusammen mit einem Zellulose basierten Kleber, wie Zellulosenitrat, und Anordnen oder Drucken der Dispersion auf das Substrat mittels eines Spenders, Besprenklers (Spotters) oder Ähnlichem durchgeführt.
Die Porengröße des porösen Glaspulvers oder der Membranen ist bevorzugterweise 0,1 bis 0,5 μm, und die feinen Lücken des nicht gewebten Stoffes oder Filterpapiers sind bevorzugterweise mehrere Mikrometer oder weniger. Eine zu kleine Porengröße macht es schwierig, die Fluoreszenz markierte Probe zu filtern, so dass eine Porengröße von 0,1 μm oder mehr notwendig ist.
Die „Reaktivität" in der „reaktiven Sonde", welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, bezieht sich nicht nur auf die Eigenschaften der Veränderung einer chemischen Struktur oder Ähnlichem, welche ionischer Bindung oder kovalenter Bindung durch eine chemische Reaktion zugeschrieben werden kann, sondern auch auf die Eigenschaften des Bringens von anderen Substanzen auf andere Weise in Bindung, wie van der Waals Kraft, Wasserstoffbindung, koordinative Bindung, chemische Adsorption oder physikalische Absorption. Beispiele einer solchen reaktiven Sonde sind, aber natürlich nicht eingeschränkt auf, Enzyme, Antigene, DNA Fragmente, Antikörper, Epitope und Proteine.
Wenn ein Oligonucleotid, ein DNA Fragment, welches auf dem Träger synthetisiert wurde, als die reaktive Sonde verwendet wird, zum Beispiel, kann seine Hybridisierung mit einer zu detektierenden DNA Probe zu der Detektion einer DNA führen, welche eine bestimmte Sequenz hat.
Der Vorbereitungsprozess für den Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung und ein Detektionssystem, welches ihn verwendet, werden beschrieben werden.
Der Reaktionssondenchip der vorliegenden Erfindung hat eine Struktur, in welcher das Substrat mit den hindurchgehenden Löchern perforiert ist und die Reaktionssonden sind dort fixiert (1 und 2(a) bis 2(d)). An dem Ort der Reaktion, wie das poröse Medium oder der nicht gewebte Stoff, sind die Sondenmoleküle befestigt wie in den 4(h) und 4(i) gezeigt ist.
Die Form des Reaktionsorts in dem hindurch gehenden Loch kann einige Fälle aufweisen, wie in 2(a) bis 2(d) gezeigt ist. In einigen dieser Fälle soll das hindurch gehende Loch groß genug sein, um den Durchtritt eines Gens oder Ähnlichem, welches analysiert werden soll, zu erlauben, und soll ausgebildet sein, um ein Reaktionssondenmolekül zu halten.

1) mit dem Substrat von solch einer Struktur können Oligo-DNAs in vielen Schichten in situ und gleichzeitig synthetisiert werden, und als Reaktionssondenmoleküle verwendet werden. In diesem Fall, wie in 5 gezeigt ist, werden die Reaktionssondenmoleküle an dem gleichen Ort in jedem der hindurch gehenden Löcher des Sondenchips gestapelt, wobei viele Chips mit den gleichen Charakteristika zur gleichen Zeit präpariert werden können. Wenn die Reaktionschips gestapelt sind und eine Flüssigkeit 13 von der Oberseite zu der Unterseite durch ein hindurch gehendes Loch nach einander fließt, wie in 5 gezeigt ist, soll Vorsicht angewendet werden, um das jeweilige hindurch gehende Loch flüssigkeitsdicht zu halten, so dass die Flüssigkeit nicht durch den Zwischenraum zwischen den Substraten fließt, um in das lateral benachbarte hindurch gehende Loch einzudringen.
2) Unter Verwendung der Löcher, welche ähnlich aufeinander aufgesetzt sind, können cDNAs oder Ähnliches in vielen Schichten gleichzeitig auf den Trägern getragen werden. Somit können cDNA befestigte Chips leicht präpariert werden.

Zur Detektion unter Verwendung des derart präparierten Chips wird eine Probe von Fluoreszenz markierter cDNA oder Ähnlichem auf den Reaktionschip 5 eingeführt, welcher in der Reaktionszelle 6 fixiert ist (6(j)). Die Probe wird langsam zu der entgegengesetzten Seite gesaugt, wodurch die Probe in der Nähe der Sondenmoleküle (6(k)) passiert werden kann. Somit kann Hybridisierung leicht stattfinden (6(l)). Gemäß dieser Prozedur tritt die Reaktion prompt und gleichmäßig auf, und das Gerät zur Hybridisierung wird vereinfacht.
Der Chip, welcher die Reaktion beendet hat, wird unverändert detektiert, durch einen konventionellen Fluoreszenzdetektor (7 und 9). Gemäß diesem System werden deshalb Hybridisierung, Detektion und Analyse integral gehandhabt (10).
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, welche in keiner Weise die Erfindung einschränken.
Beispiel 1:
Ein Quarzglassubstrat (Länge 70 mm, Breite 25 mm, Dicke 0,5 mm), welches 10 × 5 regelmäßig angeordnete hindurch gehende Löcher von 1 mm im Durchmesser hat, wurde präpariert. Ein Pulver von porösem Glas mit einer Porengröße von 100 Nanometer und einer Partikelgröße von 10 Mikrometer wurde in die hindurch gehenden Löcher gefüllt und gebacken. Die oberen und unteren Oberflächen des Substrats wurden geglättet durch Polieren. Das Substrat wurde chemisch gereinigt, und die Oberfläche wurde aminiert unter Verwendung eines Silankupplungsagenten. Zehn der Substrate wurden übereinander gestellt, eines auf dem anderen, und verschiedene Typen von cDNAs wurden an die jeweiligen hindurch gehenden Löcher durch das gewöhnliche Verfahren fixiert.
Die Substrate wurden in eine Reaktionszelle von Polypropylen platziert, und Fluoreszenz markierte cDNA, welche detektiert werden soll, wurde in die Reaktionszelle eingeführt und reagierte. Nach der Reaktion und dem Waschen wurden die Chips von der Zelle entfernt, und durch einen Fluoreszenzdetektor analysiert.
Beispiel 2:
Ein Polyethylenterephthalatsubstrat (Länge 50 mm, Breite 30 mm, Dicke 0,3 mm), welches eine Anordnung von hindurch gehenden Löchern von 2 mm im Durchmesser hat, wurde präpariert. Ein Glasfaserfilterpapier wurde zwischen die Substrate sandwichartig eingeführt, und der Verbund wurde Wärmegedichtet, um ein Reaktionschipsubstrat zu präparieren. Einhundert der Substrate wurden übereinander gefügt, eines auf dem anderen, und Reagenzien wurden sequentiell durch die jeweiligen Löcher, vertikal kommunizierend miteinander, durchgeleitet, um verschiedene Oligonucleotide zu synthetisieren.
Die Substrate wurden in eine Reaktionszelle aus Polypropylen platziert, und Fluoreszenz markierte cDNA, welche detektiert werden soll, wurde in die Reaktionszelle eingeführt, und reagierte. Nach der Reaktion und dem Reinigen wurden die Chips von der Reaktionszelle entfernt, und durch einen Fluoreszenzdetektor analysiert.
Beispiel 3:
Ein Pürexglassubstrat (Länge 80 mm, Breite 30 mm, Dicke 0,5 mm), welches eine Anordnung von hindurch gehenden Löchern von 0,5 mm im Durchmesser hat, wurde präpariert. Eine poröse Membran, welche regenerierte Zellulose aufweist, wurde an die obere Oberfläche des Substrats angeklebt bzw. aufgestrichen. Separat wurde ein Pulver von porösem Glas mit einer Porengröße von 100 Nanometern und einem Teilchendurchmesser von 5 Mikrometern präpariert, und verschiedene Oligonucleotide wurden durch das gewöhnliche Verfahren synthetisiert. Diese Materialien wurden in die jeweiligen Löcher gedippt, und eine verdünnte Lösung von Zellulosenitrat, ein Zellulose basierter Kleber, wurde tropfenweise hinzugefügt, um das poröse Glaspulver zu fixieren.
Die Substrate wurden in eine Reaktionszelle aus Polypropylen platziert, und Fluoreszenz markierte cDNA, welche detektiert werden soll, wurde in die Reaktionszelle eingeführt, und reagierte. Nach der Reaktion und dem Waschen wurde der Chip von der Zelle entfernt, und durch einen Fluoreszenzdetektor analysiert.
In all den Beispielen emittierten die hybridisierten Spots eine starke Fluoreszenz beim Aussetzen zu ultravioletter Strahlung. Die Sequenzen von DNA Fragmenten in der DNA Probe wurden durch den Fluoreszenzdetektor aufgeklärt.

Claims

Ein Reaktionssondenchip, der Folgendes aufweist: ein Substrat mit einer Vielzahl von diskreten, regelmäßig angeordneten hindurchgehenden Löchern; und eine poröse Membran oder ein nicht gewebter Stoff als ein Träger, und zwar aufgeklebt (pastenartig zum Anhaften gebracht) auf das Substrat um so die hindurchgehenden Löcher zu schließen, wobei der Träger Sonden- oder Probenmoleküle daran befestigt aufweist derart, dass die Sonden- oder Probenmoleküle unterschiedlich entsprechend den hindurchgehenden Löchern sind, wobei die Proben- oder Sondenmoleküle aus der Gruppe ausgewählt sind, die Folgendes aufweist: DNAs, RNAs, PNAs und Fragmente davon; Oligonucleotide mit willkürlichen Basensequenzen; Antigene; Epitope eines Antikörpers; Antikörper und Enzyme, Proteine und funktionelle Fragmente der Enzyme oder Proteine.
Das Reaktionssondenchip nach Anspruch 1, wobei der Träger an dem die Sondenmoleküle befestigt sind, ein Pulver aus porösem Glas ist, und wobei das Pulver aus porösem Glas verwickelt oder verbunden ist mit der porösen Membran, oder einem nicht gewebten Stoff, aufgeklebt auf das Substrat um so die hindurchgehenden Löcher zu schließen.
Das Reaktionssondenchip nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Substrat ein Film bzw. eine Schicht oder ein Flächenelement ist.
Das Reaktionssondenchip nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Substrat ein organisches Substrat oder ein anorganisches Substrat ist.
Das Reaktionssondenchip nach Anspruch 2, wobei das Pulver aus porösem Glas eine Teilchengröße von 1 bis 100 Mikrometer besitzt.
Ein Fluoreszenzdetektionssystem, welches Folgendes aufweist: – ein Reaktionssondenchip gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, – eine Anregungslichtquelle (15), und – einen Fluoreszenzdetektor (16).