DE10135996A1

DE10135996A1 - Verfahren zur Identifizierung metastasierender Tumorzellen

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Publication number: DE10135996A1
Application number: DE10135996A
Authority: DE
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Priority date: 2000-07-25
Filing date: 2001-07-24
Publication date: 2002-03-28
Also published as: JP2004515221A; WO2002008456A8; WO2002008456A3; EP1356095A2; AU2001272558A1; WO2002008456A2; US20040265804A1; CA2416697A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und Behandlung von metastasierenden Tumorzellen, eine Population von cDNA-Sequenzen metastasespezifischer Gene zur Verwendung als Tumormarker zur Identifizierung von humanen Zellen und/oder Gewebe mit Metastasierungspotential und zur Therapie von Krebserkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen sowie die Identifizierung von Verbindungen zur Behandlung von Tumoren.

Das Zellwachstum oder auch die Organogenese werden in höheren Organismen auf komplexe Weise durch differentielle Genexpression reguliert. Insbesondere die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die an der Entstehung von Tumorzellen beteiligt sind, ist aufgrund der großen medizinischen Relevanz Gegenstand intensiver Untersuchungen.

Allerdings sind die Vorgänge, die an der Entstehung eines invasiven Tumors aus primärem Tumorgewebe (Metastasenbildung) beteiligt sind weniger gut untersucht. Bekannt ist, daß einige Grundvoraussetzungen geschaffen werden müssen, damit Tumoren invasieren können. Hierbei handelt es sich um Veränderungen der Mikroumgebung der Zellen, d. h. Proteolyse der Zellen sowie Veränderungen der Adhäsionseigenschaften und Migration. Bislang konnte lediglich eine geringe Anzahl an Genen, die während der Tumorprogression differentiell exprimiert wird, identifiziert werden. Beispielhaft seien einige Proteasegene, wie z. B. uPa oder Matrix- Metalloproteinasen (MMP) genannt (Matrisian L. M. et al., 1990, Curr. Top. Dev. Biol., 24: 219-259 und Matrisian, L. M., Bioessays, 1992, 14: 455-463). Hinsichtlich der adhäsiven Eigenschaften sind verschiedene Integrine (Riuz P. et al., 1993, Cell. Adhes. Commun., 1: 67-81) oder der sogenannte lymphocyte homing-Rezeptor CD44 bekannt (Ponta et al., Frontiers in Bioscience, 1998, 3: 650-656).

Die überwiegende Anzahl und Identität der Gene, die in dem metastatischen Prozeß involviert sind, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Für ein besseres Verständnis der an der Tumorprogression beteiligten Vorgänge ist es allerdings erforderlich eine möglichst große Anzahl an metastasespezifischen Genen eindeutig zu identifizieren.

Außerdem steht bislang kein geeignetes System zur Verfügung, welches mit vertretbarem Aufwand und ausreichender Zuverlässigkeit eine Aussage über den Krebszell-Status und die Wahrscheinlichkeit einer Tumormetastasierung erlaubt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen, wobei als Marker wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß den Fig. A und/oder B oder entsprechend davon abgeleitete vollständige Gensequenzen oder funktionelle Fragmente davon, deren Homologe oder Allele zur Hybridisierung mit Tumorgewebe eingesetzt werden.

Die vorliegende Erfindung schließt auch die Genprodukte (Polypeptide) abgeleitet von den cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß den Fig. A und/oder B oder den entsprechend vollständigen Gensequenzen oder funktionelle Fragmente davon, deren Homologe oder Allele ein. Erfindungsgemäß zählen hierzu auch die Isoformen dieser Polypeptide, die zwar eine veränderte Aminosäuresequenz aufweisen, in ihrer Funktion jedoch gleichwirkend sind.

Gegenstand der Erfindung sind ferner auch Antikörper mit einer spezifischen Bindung an die zuvor genannten Genprodukte, hergestellt unter Verwendung der oben genannten cDNA-Sequenzen und/oder deren Genprodukte.

Erfindungsgemäß umfassen die vollständigen Gensequenzen neben den kodierenden Nukleotidsequenzen auch die zugehörigen regulativen Regionen vor und hinter den kodierenden Bereichen. Unter den regulativen Regionen sind funktionelle Strukturen, wie beispielsweise Promotoren, Terminatoren, Ziel- oder target-Sequenzen, Retentionssignale, Translationsverstärker, Spleißelemente oder Polyadenylierungssignale zu verstehen.

Ein funktionelles Fragment ist erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz, die für ein entsprechendes Polypeptid kodiert, welches seinerseits eine spezifische Aktivität des korrespondierenden Gesamtlängen-Proteins aufweist. Ferner ist unter einem funktionellen Fragment erfindungsgemäß eine Nukleotidsequenz zu verstehen, die unter stringenten Bedingungen zu einem spezifischen Hybridisierungssignal führt.

Hierbei ist kann die Länge des funktionellen Fragments in einem Bereich von wenigstens 10 bis zu mehreren hundert Nukleotiden variieren. Gleiches gilt für ein funktionelles Fragment eines kodierten Proteins, das in seiner Länge in einem Bereich von wenigstens 10 bis 250 Aminosäuren variieren kann.

Unter Homologen sind erfindungsgemäß komplementäre oder mit den cDNA- Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleiteten vollständigen Gensequenzen oder funktionellen Genfragmenten hybridisierende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Hybridisierende Sequenzen umfassen ähnliche Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von DNA oder RNA, die unter stringenten Bedingungen spezifisch mit den erfindungsgemäßen cDNA- Sequenzen interagieren. Ein bevorzugtes aber nicht limitierendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6× Sodium- Chloride/Sodium-Citrate-Puffer (SSC) bei 45°C gefolgt von ein oder mehreren Waschschritten in 0,2× SSC, 0,1% SDS bei 65°C.

Allele sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen, also funktionell äquivalent sind.

Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch des Organismus angepaßte, Nukleotidsequenzen.

Unter einem funktionellen Äquivalent (Allel) versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der ursprünglich isolierten Gensequenzen oder der korrespondierenden vollständigen Gensequenzen oder deren Homologe, die für an der Tumormetastasierung beteiligte Polypepetide kodieren, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Mutationen können sowohl funktionale Veränderungen der regulatorischen Regionen eines Gens als auch ein in seiner Aktivität verändertes Protein bedingen.

Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der erfindungsgemäßen cDNA- Sequenzen oder deren vollständige Gensequenzen, funktionelle Fragmente davon oder deren Homologe erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein. Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, bei denen die regulatorischen Regionen verändert sind, wodurch beispielsweise die Genexpression verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Ausgangsgenfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.

Erfindungsgemäß kann es sich bei den für metastasespezifische Polypeptide oder deren Isoformen kodierende Nukleotidsequenzen um natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifiziell erzeugte Nukleotidsequenzen handeln. Ferner können die zuvor genannten Nukleotidsequenzen aus heterologen Nukleotidsequenzen sowie aus Mischungen der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen bestehen.

Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem durch sie kodierten Genprodukt eine veränderte Aktivität verleiht, die abgeschwächt oder verstärkt sein kann.

Außerdem sind artifizielle Nukleotidsequenzen Gegenstand der Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen Nukleotidsequenzen können beispielsweise durch "Rückübersetzung" von mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine oder durch in-vitro-Selektion erhalten werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotidsequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Menschen spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit gentechnischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene leicht ermitteln.

Die Isolierung der zuvor genannten cDNA-Sequenzen erfolgt erfindungsgemäß aus definierten Adenokarzinom-Systemen der Ratte. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich dabei um das Rattentumorsystem 13762NF (Mamma-Karzinom; Neri et al., JNCI, 1982, Vol. 68 (3), 507-517). Als nicht metastasierende Zellinie wurde die Zellinie MTPa ausgewählt. Die metastasierende Zellinie wird erfindungsgemäß durch die Zellinie MTLY repräsentiert. Ein weiteres erfindungsgemäß bevorzugtes System stellt das Ratten- Pankreas-Karzinom-System Bsp73 mit den Zellinien 1AS bzw. 10AS und ASML dar (Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, (3): 109-123). Als ein Beispiel für ein Ratten-Prostata-Karzinom-System sind die Zellinien G-Subline bzw. AT-1, AT-3, MatLu und MatLyLu als nicht metastasierende bzw. metastasierende Zellinien genannt (lsaacs et al., Prostate, 1986, (9): 261-281). Diese Auswahl ist jedoch nicht limitierend für die vorliegende Erfindung, sondern schließt auch die Verwendung anderer geeigneter Zellinien bzw. Karzinomsysteme ein.

Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von Ratten-Zellinien ist, daß die metastatischen Zellen in vivo ein analoges Metastasierungsverhalten zu menschlichen Krebszellen zeigen (Neri et al., Int. J. Cancer, 1981, 28: 731-738; Matzku et al., Invasion Metastasis, 1983, 3: 109-123). Darüber hinaus lassen sich die Zellinien einfacher handhaben als menschliches Tumorgewebe. Der Einsatz definierter Rattenzellinien bietet gegenüber humanem Tumorgewebe ferner den Vorteil einer hohen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Insbesondere besteht in diesem System die Möglichkeit der genetischen Veränderung der Zellinien und Überprüfung der erworbenen bzw. verlorenen Eigenschaften in Testsystemen. Ferner ist eine einfache Übertragung auf syngene Tiere möglich, wohingegen menschliches Tumorgewebe aufgrund störender Immunantworten in ein aufwendiges künstliches System eines immunodefizienten Empfängers übertragen werden müßte. Darüber hinaus wurden auch einige Hybridisierungen mit menschlichen Mamma- Karzinom-Zellinien durchgeführt. Beispielsweise wurden die verwendeten Zellinien MDA-MB231 und MDA-MB-468 (Cailleau et al., J. Natl. Cancer Inst., 1974, 661-674 und Cailleau et al., In Vitro, 1978 (14): 911-915) u. a. eingesetzt, um z. B. durch Kreuzhybridisierungen zu zeigen, daß die eingesetzte "Ratten-Probe" für eine Analyse menschlichen Tumormaterials geeignet ist.

Die Identifizierung der erfindungsgemäß großen Anzahl an differentiell exprimierten Transkripten metastasespezifischer Gene erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Hier sind die Differenzanalyse SSH (Subtractive Suppression Hybridization; Diatchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1996, 93: 6025-6030) zu nennen, die insbesondere zur Identifizierung seltener Transkripte besonders geeignet ist sowie ein sich daran anschließendes effektives Nachselektionsverfahren mit hohem Probendurchsatz und hoher Zuverlässigkeit, das die Auswahl falsch positiver oder falsch negativer Klone nahezu ausschließt (von Stein et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25 (13): 2598-2602). Als weitere Methoden der Wahl zur erfindungsgemäßen Bestimmung einer Metastasen-spezifischen Expression ausgewählter cDNA-Klone zur Identifizierung metastasierender Tumorzellen sind Northern-Blot- und RT-PCR- Analysen zu nennen, die sich jedoch nicht limitierend auf die vorliegende Erfindung auswirken.

Eine besondere Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt dabei folgende Schritte:

A) Erstellung einer PCR-basierten subtraktiven cDNA-Genbank ausgehend von Gesamt-mRNA-Populationen aus metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen,
B) Identifizierung einer Population unterschiedlicher cDNA-Klone, wobei jede cDNA-Sequenz ein individuelles (potentiell) metastasespezifisches Gen repräsentiert,
C) Erstellung der vollständigen Gensequenz auf der Basis dieser cDNA-Klone,
D) Erstellung einer "sense"- und "antisense"-RNA-Probe ausgehend von wenigstens einer Sequenz ausgewählt aus dieser cDNA-Population oder den entsprechend davon abgeleiteten vollständigen Gensequenzen, insbesondere aus einer Population gemäß den Figuren A und/oder B,
E) Herstellung geeigneter Dünnschicht-Präparate von dem zu untersuchenden Tumormaterial,
F) in-situ-Hybridisierung des zu untersuchenden Tumormaterials mit den zuvor genannten "sense"- und "antisense"-RNA-Sonden und
G) Identifizierung metastasierender Tumorzellen durch Detektion positiver Hybridisierungsprodukte.

In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Identifizierung von an der Metastasierung von Tumorzellen beteiligten Marker-Gene durch die Schritte

a) Erstellung einer PCR-basierten subtraktiven cDNA-Genbank ausgehend von Gesamt-mRNA-Populationen aus metastasierenden und nicht-metastasierenden Tumorzellen,
b) Identifizierung einer Population unterschiedlicher cDNA-Klone, wobei jede cDNA- Sequenz ein individuelles (potentiell) metastasespezifisches Gen repräsentiert,
c) Erstellung der vollständigen Gensequenz auf der Basis dieser cDNA-Klone,
d) Klonierung der cDNA- und/oder vollständigen Gensequenz sowohl in "sense"- als auch in "antisense"-Leserichtung in einen Expressionsvektor
e) Übertragung und anschließende Expression dieses(er) Vektors(en) in nicht- menschliche Säugerzellinien, vorzugsweise Rattenzellinien,
f) Validierung der Beteiligung der in Schritt b) identifizierten Gene an der Metastasierung von Tumorzellen durch Identifizierung von invasiven Tumoren.

Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen dadurch aus, daß wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Figur B an der Metastasierung von Pankreastumorgewebe und ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A an der Metastasierung von Brusttumorgewebe beteiligt sind.

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer außerordentlich großen Population unterschiedlicher cDNA-Klone, repräsentativ für eine entsprechend große Anzahl unterschiedlicher, d. h. individueller metastasespezifischer Gene, so daß mit hoher Zuverlässigkeit eine molekulare Typisierung der verschiedenen klinischen Erscheinungsformen einer Krebserkrankung vorgenommen werden kann. Ebenso kann eine Aussage über die Verlaufskontrolle, d. h. das Krebszellstadium der verschiedenen Erscheinungsformen und insbesondere über das Metastasierungspotential des zu untersuchenden Tumorgewebes getroffen werden.

Die vorliegende Erfindung stellt somit eine Vielzahl von potentiellen Markersequenzen, Markergenen und/oder korrespondierenden Proteinen zur Identifizierung und/oder Behandlung von invasiven Tumorzellen und/oder -geweben bzw. Zellen und/oder Geweben mit einem hohen Metastasierungspotential zur Verfügung.

In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß bevorzugt die cDNA-Sequenzen gemäß Fig. C als Marker zur Identifizierung von metastasierendem humanem Brust und/oder Dickdarmtumorgewebe geeignet sind. Beispielhaft sei hierbei insbesondere auf die Sequenzen verwiesen, die in Fig. C mit CD24 und S7 bezeichnet sind und die besten Kreuzhybridisierungsergebnisse mit humanem Tumorgewebe zeigten. Bei CD24 handelt es sich um ein differenzierungsspezifisches Protein, das während der Reifung von B- und T-Lymphozyten auftritt (Fischer G. F. et al., 1990, J. Immunol., 144: 638-641). Mit Hilfe der CD24 mRNA ist die Detektion von metastasierendem humanen Dickdarmgewebe möglich. Die Hauptaufgabe des ribosomalen Proteins S7 ist die korrekte Faltung der 16S-RNA (Wimberley, B. T. et al., 1997, Structure, 5: 1187-1198). Eine Beteiligung von S7 an der Tumorprogression ist bisher nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung stellt mit der S7 mRNA somit einen neuen Tumormarker für metastasierendes Brustzellgewebe zur Verfügung. Metastasen aus Lymphknotengewebe, welches von einem invasiven Brustzellkarzinom ausgehen, werden durch eine erhöhte Expression beider Tumormarker angezeigt.

Ein Vergleich der Genexpression von Genen und Tumor-assoziierten Molekülen in Zellinien mit unterschiedlichem metastatischen Potential ist in Fig. D dargestellt. Ergebnisse der in-situ-Hybridisierungen sind in Fig. E gezeigt.

Die erfindungsgemäß eindeutige Identifizierung von an der Metastasierung von Tumorgewebe beteiligten cDNA-Klonen ermöglicht auf einfache Weise sowohl eine umfassende Klonierung der vollständigen Gene als auch eine funktionelle Analyse der im Menschen an der Ausprägung eines metastatischen Phänotyps beteiligten Gene. Dies eröffnet gleichzeitig die Möglichkeit, eine Vielzahl an metastasespezifischen, regulatorischen Sequenzen zu untersuchen. Die gewonnenen Erkenntnisse werden besonders bei der weiteren Aufklärung molekularer Regulationsmechanismen zur Tumormetastasierung sehr hilfreich sein.

Die Erkenntnisse der vorliegende Erfindung sind ferner zur besseren Diagnose von Krebserkrankungen, insbesondere der Typisierung des Krebszellstadiums und sich daran anschließende effizienterer Therapiemöglichkeiten geeignet. Zur Behandlung von Tumorerkrankungen ist es denkbar, daß ausgehend von den zuvor genannten cDNA-Sequenzen komplementäre ("antisense") mRNA-Sequenzen, insbesondere kürze Oligonukleotide abgeleitet werden und durch Einbringung dieser "antisense"- mRNASequenzen in Tumorzellen die Expression metastasespezifischer Gene posttranskriptional verringert oder unterbunden wird. Ferner ist eine Behandlung von Tumorerkrankungen denkbar, bei der auf posttranslationaler Ebene durch die spezifische Bindung von Stoffen oder Liganden an metastasespezifische Polypeptide letztere in ihrer Funktion behindert oder blockiert werden und somit die Tumormetastasierung verringert oder unterbunden wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung, wobei eine metastasespezifische Gensequenz abgeleitet von wenigstens einer der cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B in nicht-menschlichen Säugetierzellen, beispielsweise Rattenzellinien exprimiert werden, chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindungen, wie z. B. Proteine, Peptide oder niedermolekulare Verbindungen mit den zuvor genannten Zellen inkubiert werden und anschließend diejenigen Verbindungen ausgewählt werden, die eine modulierende Auswirkung auf die Expression der mit der Tumormetastasierung assoziierten Gene oder auf die Aktivität der durch sie kodierten Proteine zeigen. Ausgehend von diesen Verbindungen ist die Herstellung von Mitteln denkbar, die zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können.

Unter modulierender Wirkung ist erfindungsgemäß eine Verstärkung oder Abschwächung zu verstehen. Hierbei ist erfindungsgemäß neben regulativen Wechselwirkungen an der Zelloberfläche auch eine interaktive Hemmung innerhalb der Zellen umfaßt.

Die Einschleusung und Expression der erfindungsgemäß metastasespezifischen Gensequenzen in den nicht-menschlichen Säugetierzellen kann beispielsweise unter Zuhilfenahme eines geeigneten rekombinanten Vektors erfolgen, enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße Gensequenz abgeleitet von einer cDNA- Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B vollständige Gensequenzen oder funktionellen Fragmente davon, beispielsweise kodierende Sequenzen, ferner regulatorische Nukleotidsequenzen, insbesondere aus der Gruppe der Promotoren, Terminatoren, Ziel-(target)-Sequenzen, Retentionssignale und Translationsverstärker, Spleißelemente, Poly-Adenylierungssignale oder Resistenz-vermittelnde Nukleotidsequenzen sowie Nukleotidsequenzen für die Replikation in der entsprechenden Zielzelle oder die Integration in deren Genom.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Meßsystem zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Gen ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B oder Allele oder Homologe davon sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.

Das erfindungsgemäße Meßsystem bietet hier die Möglichkeit umfangreiche Regulations- und Bindungsstudien durchzuführen, mit dem primären Ziel festzustellen, ob und gegebenenfalls in welchen Bereichen die Verbindung einen Effekt auf die Genexpression ausübt, d. h. diese abschwächt oder verstärkt. Das erfindungsgemäß eingesetzte Meßsystem kann beispielsweise nicht-menschliche Säugetierzelle, bevorzugt eine definierte Rattenzellinie sein.

Eine weitere Variante der vorliegenden Erfindung betrifft ein Meßsystem enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein oder Isoformen davon kodiert durch eine Gensequenz oder deren Homologe ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung. Auch hier bietet das erfindungsgemäße Meßsystem die Möglichkeit umfangreiche Regulations- und Bindungsstudien durchzuführen, mit dem primären Ziel festzustellen, ob und gegebenenfalls in welchen Bereichen die Verbindung an ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein bindet und dieses in seiner Aktivität verändert, d. h. abschwächt oder verstärkt.

Ferner sind die Verbindungen selbst Gegenstand der vorliegenden Erfindung und/oder ihr Einsatz zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Tumorerkrankungen enthaltend Verbindungen identifiziert nach einem zuvor beschriebenen Verfahren oder mit Hilfe eines zuvor beschriebenen Meßsystems.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, deren Homologe oder funktionell äquivalente Sequenzen zum Einsatz in einem der zuvor beschriebenen Verfahren oder Meßsystem. Dies schließt auch den Einsatz von Mischungen der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen ein. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Genprodukte (Polypeptide), die unter Verwendung der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen hergestellt oder davon abgeleitet werden können.

Ebenso sind genetisch veränderte nicht-menschliche Säugetierzellen enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß <b<Fig.</b< A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Fragmente, deren Homologe oder Allele oder einen rekombinanten Vektor der zuvor beschriebenen Art oder Genprodukte der vorgenannten Art Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner Antikörper, die spezifisch an die genannten erfindungsgemäßen Genprodukte binden, wobei diese Antikörper unter Einsatz der erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen und/oder Genprodukte hergestellt werden können.

Ferner kommt erfindungsgemäß eine Sonde zur spezifischen Hybridisierung mit Tumorgewebe zum Einsatz, wobei diese ausgehend von einer cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleiteten vollständigen Gensequenzen, deren Homologe oder funktionell äquivalenten Sequenzen hergestellt wird, eine zur Detektion geeignete, bevorzugt nicht radioaktive Markierung enthält und/oder 30 Nukleotide, bevorzugt 15-20, besonders bevorzugt 10 Nukleotide lang ist.

Ferner ist ein Test-Kit Gegenstand der vorliegenden Erfindung, enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Genfragmente davon oder deren Homologe oder Allele, eine Anleitung zur Herstellung einer zuvor beschriebenen Sonde sowie Anleitungen zur Hybridisierung und Detektion von Nukleotidsequenzen aus Tumorgewebe. Bevorzugt wird der Einsatz einer Mischung mehrerer relevanter cDNA-Sequenzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Verbindungen identifiziert nach einem erfindungsgemäßen Verfahren und/oder durch ein erfindungsgemäßes Meßsystem zur Herstellung von Mitteln, welche zur Tumorbehandlung verwendet werden können. Ebenso schließt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper zur Herstellung von Mitteln, welche zur Tumorbehandlung eingesetzt werden können, ein. Ferner eignen sich die erfindungsgemäßen cDNA-Sequenzen, Genprodukte, Antikörper und/oder Teile davon und/oder die erfindungsgemäßen an der Entstehung von Tumormetastasen beteiligten Verbindungen zum Einsatz in Bereichen der Tumormetastasen-Diagnostik und/oder -Therapie. Dies schließt beispielsweise in Bereichen der Tumordiagnostik auch die Identifizierung von weiteren Metastase- Tumormarkern humanen Ursprungs ein.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher charakterisiert, die sich aber nicht limitierend auf die Erfindung auswirken:

Allgemeine Methoden

Die Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren, allgemeine Klonierungstechniken, DNA-Sequenzierung, RNA-Techniken, Methoden zum Transfer und zur Hybridisierung von Nukleinsäuren sind in Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press beschrieben, ebenso wie allgemeine Vorgehensweisen zur Zellkultivierung und histologische Techniken.

Subtraktive Klonierung von differentiell exprimierten Genen (SSH)

Die Herstellung einer differentiellen cDNA-Bank (Subtraktionsbank) nach dem Prinzip der sogenannten Suppressive Substractive Hybridization ist bei Diatchenko L. et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6025-6030 beschrieben. Die Subtraktionsreaktion erfolgte mit Hilfe des CLONTECH - PCR-Select cDNA Subtraction Kits der Firma Clontech Laboratories, Palo Alto, USA nach Herstellerangaben.

Analyse der cDNA-Klone der Subtraktionsbank am Beispiel der Rattenzellinie 13762

Zur Überprüfung der Effizienz der Subtraktion über eine Southern-Blot Analyse müssen amplifizierte RsaI-Fragmente des Drivers MTPa hergestellt werden, da es sich auch bei der subtrahierten Bank ML um Rsal-verdaute cDNA-Fragmente handelt. Nach Rsal-Verdau der MTPa-cDNA wurden Adaptoren (Eco-Linker) an die Fragmente ligiert und mit Hilfe der entsprechenden PCR-Primer (Eco-Linker- Primer) gemäß den Bedingungen der 2. PCR der SSH amplifiziert. MTLY wurde in Form der Testerfraktion 1c (s. SSH-Handbuch) eingesetzt.

Ligation in einen TA-Vektor

Die Ligation der PCR-Produkte der 2. PCR-Runde der SSH erfolgte in einem TA- Vektor (pCRII.1, Invitrogen). Die Klonierung eines Inserts in den pCR.II.1-Vektor unterbricht die kodierende Sequenz des β-Galactosidase-Gens, sodaß rekombinante Klone (weiß) von Leervektoren (blau) unterschieden werden können. Da die verwendete Taq-Polymerase aber proofreading-Aktivität besitzt, ist es notwendig, die PCR-Produkte nach vorangegangener Phenol/Chloroformextraktion, in einem weiteren Schritt für 15 min bei 72°C mit dATP und einer anderen Taq-DNA-Polymerase (Eurobio-Taq-Polymerase) zu inkubieren und wieder eine Phenol/Chloroformextraktion vorzunehmen. Die Ligation erfolgte mit der dem Vektor beigefügten T4-DNA-Ligase (Invitrogen) im Verhältnis 1 : 1 (je 25 ng Vektor und Subtrahierte Bank).

Transformation in elektrokompetente Bakterien und Blau/Weiß-Sortierung

Die in den pCRII.1-Vektor ligierte Bank wurde in elektrokompetente Bakterien (ELEKTROMAX, Stamm DH10B, Invitrogen) transformiert und auf 15 cm große Bakterienschalen ausplattiert. Die Schalen enthielten neben LB-Agar, das Selektionsantibiotikum Ampicillin (100 µg/ml), sowie 100 µM IPTG und X-Gal (50 µg/ml) zur Blau/Weiß-Sortierung. Die Bakterienschalen wurden bei 37°C inkubiert, bis kleine Kolonien sichtbar waren. Zur besseren Unterscheidung von weißen und blauen Kolonien wurden die Platten anschließend bei 4°C inkubiert.

Picken von Klonen und Kolonie-PCR

Eine Gesamtzahl von 1985 Klonen wurde unter Blau/Weiß-Selektion gepickt, in sterile 96-well-Mikrotiterplatten übertragen, die LB-Medium und Ampicillin enthielten (100 µg/µl). Die Bakterien in diesen Platten wurden für 14 Stunden bei leichtem Schütteln bei RT wachsen gelassen. Zur Durchführung der Kolonie-PCR wurde mit Hilfe einer Multikanalpipette 10 µl einer jeden Bakterienkultur entnommen und in eine 96-well-PCR-Platte übertragen und dort mit je 90 µl sterilem Wasser vermischt. Zur Denaturierung wurde die Platte für 5 min bei 95°C in der PCR-Maschine (Perkin-Elmer 9600 thermal cycler) inkubiert. 5 µl eines jeden Lysats wurden mit einer Multikanalpipette in eine zweite 96-well-PCR-Platte übertragen, in die jeweils 90 µl des PCR-Gemischs vorgelegt worden war. Die cDNA-Fragmente wurden mit Hilfe der Nested Primer 1 und 2 der Subtraktion amplifiziert.

PCR-Mischung (50-µl-Ansatz)

0,5 U Taq Polymerase (Promega), 5 µl 10×PCR-Puffer (Promega), 200 µM dNTPs, je 10 µmol des Nested Primers 1 und 2 der Subtraktionsreaktion + 5 µl des Bakterienlysats.

PCR-Bedingungen

94°C, 30 Sekunden - 68°C, 30 Sekunden - 72°C, 30 Sekunden.

Reverse-Northern-Blot Analyse

Die Überprüfung, welche Klone tatsächlich differentiell exprimierte cDNA- Fragmente enthalten, erfolgte mittels einer Reverse-Northern-Blot-Analyse. Hierzu wurden die amplifizierten cDNA Fragmente (Kolonie-PCR) in identischer Anordnung auf 2 high density-Agarosegele (Centipede™- Gelelektrophoresekammern, Owl Scientific, Woburn, USA) aufgetragen. Es wurden 2 × 96 Proben (2 Mikrotiterplatten) pro Gel aufgetragen. Hierbei ist es von größter Wichtigkeit, daß beide Gele exakt gleich beladen werden. Auf den letzten Platz wurde jeweils eine GAPDH-Kontrolle zur späteren Quantifizierung der Signalstärke aufgetragen. Nach alkalischem Blotten (s. Southern-Blot Analyse) wurden die Membranduplikate mit ³²P-markierter Tester (MTLY)- bzw. Driver (MTPa)-cDNA (jeweils Rsal-verdaut), hybridisiert und autoradiographisch ausgewertet.

Herstellung von Hybridisierungssonden der isolierten cDNA-Fragmente

Die cDNA-Fragmente wurden zur Sondenherstellung dem Prinzip der Kolonie- PCR folgend, mit Hilfe der Nested Primer 1 und 2 der Subtraktion aus den entsprechenden Bakterienklonen amplifiziert.

PCR-Mischung (50-µl-Ansatz)

PCR-Bedingungen

94°C, 30 Sekunden - 68°C, 30 Sekunden - 72°C, 30 Sekunden.

Das Ergebnis der erhaltenden und differentiell exprimierten cDNA-Fragmente ist in Fig. A und Fig. B zusammengefaßt, wobei Fig. A cDNA-Fragmente aus einer Mammakarzinom-spezifischen Bibliothek (MLSSH) repräsentieren und Fig. B cDNA- Fragmente aus einer Pankreas-spezifischen Bibliothek (PLSSH).

Figurenbeschreibung Fig. A

Auflistung der cDNA-Sequenzen der Mamakarzinom-spezifischen Bilbliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (MLSSH).

Fig. B

Auflistung der cDNA-Sequenzen der Pankreas-spezifischen Bilbliothek erhalten durch Suppressive Substractive Hybridization (PLSSH).

Fig. C

cDNA-Sequenzen von CD24 und S7 als Tumormarker für invasives humanes Brust- und/oder Dickdarmtumorgewebe.

Fig. D

Vergleich der Genexpression neuer Gene und Tumorassoziierter Moleküle in Zellinien mit unterschiedlichem metastatischen Potential. Die Abbildung besteht aus Northern-Blots von vier unterschiedlichen Rattentumorsystemen und zwei humanen Brustkrebszellinien. Außer dem Paar MN081/MT450 bestehen alle benutzten Tumorsysteme aus klonalen Zellinien, die von einem primären Tumor abstammen und sich nur in ihrer Metastasierungskapazität unterscheiden. Dieses metastatische Potential ist angezeigt. Jede Spur der Northern-Blots wurde mit je 2 ug poly-A+ RNA beladen. Die Blots wurden mit verschiedenen differentiell experimenten cDNAs, die in den MLSSH und PLSSH Subtraktionsbanken (Screens) isoliert wurden, hybridisiert. Die benutzten Hybridierungsproben wurden zufällig aus den in den MLSSH und PLSSH Screens isolierten metastasierungs-spezifischen Genen ausgewählt. Sie repräsentieren in jeden Fall 10% der isolierten Gene. Eine grobe Klassifizierung (korrelativer Index) soll die Korrelation zwischen der Expression der Gene und dem metastatischen Potential der untersuchten Zellinien beschreiben. Gene, deren Expression in allen metastatischen Zellinien hochreguliert und in allen nicht-metastatischen Zellen nicht vorhanden bzw. signifikant reduziert ist, wurden mit +++ bezeichnet. Gene, die deutlich differentiell aber nicht ausschließlich in metastatischen Zellen exprimiert sind, wurden mit ++ oder + bezeichnet, abhängig von der Stärke der Korrelation der Expression mit dem metastatischen Potential. Die Expression einiger Klone zeigte eine starke Assoziation mit dem metastatischen Potential in nur einem Tumorprogressionsmodell.

Fig. E

In-Situ-Hybridisierung. Schnitte (6 µm) von Formaldehyd-fixierten und in Paraffin- eingebetteten menschlichen Karzinomen wurden mit ³⁵S-UTP oder Fluoreszenz- markierter "sense" und "antisense" RNA hybridisiert und anschließend mit Hämatoxylin und Eosin (H und E) gegengefärbt. Die Karzinome wurden entsprechend der UICC-Richtlinien eingestuft. Die Maßstäbe repräsentieren 100 µm (a, b, e, f), 40 µm (c, d) und 20 µm (g, h).
a-b (a, "sense" kontrolle; b, "antisense" radioaktiv markierte CD24-Probe): CD24- Expression in einem mäßig differenzierten Adenokarzinom des Darms, eingestuft als pT3C; p21; pNO; pM1. Der Schnitt zeigt signifikante CD24-Überexpression in intra duktalen Karzinomzellen (Lokalisation im Zytoplasma), während die nicht- neoplastische Mucosa nur schwach positiv ist (konstante basale Expression).
c-d (c, "sense" kontrolle; d, "antisense" radioaktiv markierte CD24-Probe): CD24- Expression in einem mäßig invasiven duktalen, mäßig differenzierten Brustkarzinom, eingestuft als pT2; pN1bii. Ein positives Signal war im Karzinom, aber nicht im umliegenden Stroma nachweisbar.
e-f (e, "sense" kontrolle; f, "antisense" radioaktiv markierte S7-Probe): S7-Expression in einem mäßig differenzierten Adenokarzinom des Darms, eingestuft als pT3C; p21; pNO; pM1. Der Schnitt zeigt signifikante S7-Überexpression (vorherrschende Lokalisation im Nukleus) im Karzinom, aber sehr schwache Expression in der nicht- neoplastischen Mucosa.
h-g (h, "sense" kontrolle; g, "antisense" Fluoreszenz-markierte S7-Probe): Expression von S7 in einem wenig differenzierten invasiven duktalen Brustkarzinom, eingestuft als PT-1C; G3, N-1B1 oder I, R-O, L-1. Ein starkes nukleares Signal war im intraduktalen Karzinom nachweisbar, aber fast kein Signal wurde im Stroma beobachtet.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung von metastasierenden Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine cDNA-Sequenz ausgewählt aus einer Population gemäß den Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Genfragmente davon oder deren Homologe oder Allele zur Hybridisierung mit Tumorgewebe eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. B an der Metastasierung von Pankreastumorgewebe und/oder ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A an der Metastasierung von Brusttumorgewebe beteiligt sind.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cDNA-Sequenzen gemäß Fig. C an der Metastasierung von humanem Brust- und/oder Dickdarmtumorgewebe beteiligt sind.

4. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine metastasespezifische Gensequenz abgeleitet von wenigstens einer der cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B in nicht-menschlichen Säugetierzellen exprimiert werden,
b) chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindungen mit den zuvor genannten Zellen inkubiert werden,
c) diejenigen Verbindungen ausgewählt werden, die eine modulierende Auswirkung auf die Expression der mit der Tumormetastasierung assoziierten Genen oder auf die Aktivität der durch sie kodierten Proteine zeigen.

5. Meßsystem zur Identifizierung von Verbindungen zur Tumorbehandlung enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Gen ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.

6. Meßsystem gemäß Anspruch 5, enthaltend wenigstens ein mit der Tumormetastasierung assoziiertes Protein kodiert durch ein Gen ausgehend von einer cDNA-Sequenz gemäß Fig. A und/oder B sowie wenigstens eine chemisch, biologisch und/oder pharmazeutisch aktive Verbindung.

7. Verbindungen identifiziert nach einem Verfahren gemäß Anspruch 4 oder mit Hilfe eines Meßsystems gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.

8. cDNA-Sequenzen ausgewählt aus einer Population gemäß Fig. A und/oder B oder davon abgeleitete vollständige Gensequenzen, funktionelle Genfragmente, deren Homologe oder Allele zum Einsatz in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder in einem Meßsystem gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6.

9. Genprodukte hergestellt unter Verwendung wenigstens einer cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8.

10. Genetisch veränderte nicht-menschliche Säugetierzellen enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 oder wenigstens ein Genprodukt gemäß Anspruch 9.

11. Antikörper zur spezifischen Bindung an ein Genprodukt gemäß Anspruch 9, hergestellt unter Verwendung wenigstens einer cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 oder eines Genproduktes gemäß Anspruch 9.

12. Sonde zur spezifischen Hybridisierung mit Tumorgewebe dadurch gekennzeichnet, daß sie ausgehend von wenigstens einer cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8 hergestellt wird, eine zur Detektion geeignete Markierung enthält und/oder 30 Nukleotide, bevorzugt 15-20, besonders bevorzugt 10 Nukleotide lang ist.

13. Test-Kit enthaltend wenigstens eine cDNA-Sequenz gemäß Anspruch 8, eine Anleitung zur Herstellung einer Sonde gemäß Anspruch 12 sowie Anleitungen zur Hybridisierung und Detektion von Nukleotidsequenzen aus Tumorgewebe.

14. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 7 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.

15. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 11 zur Herstellung von Mitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.