DE19937234C2

DE19937234C2 - Borna Disease Virus (BDV)- spezifische Nukleinsäuresequenzen - ihre Anwendung in Diagnostik und Therapie

Info

Publication number: DE19937234C2
Application number: DE1999137234
Authority: DE
Inventors: Haimo Klaus Enbergs; Thomas Wilhelm Vahlenkamp; Hermann Mueller
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 1999-08-07
Filing date: 1999-08-07
Publication date: 2003-02-13
Anticipated expiration: 2019-08-08
Also published as: DE19937234A1

Abstract

Die Erfindung erlaubt erstmals den Nachweis BDV-spezifischer Nukleinsäuren in Zellen des peripheren Blutes und Blutprodukten tierischer oder humaner Herkunft in einem automatisierten und standardisierten, sehr sensitiven Nachweisverfahren. In dieser Form ist sie für die virologische Routine-Diagnostik vorgesehen und ermöglicht die Untersuchung großer Probenchargen (Blutbank, Diagnostik-Labors). Mit Hilfe dieses Verfahrens ("BDV EASY QUANT") ist es erstmals möglich, bis zu 10 Kopien der p40-, p24- und gp18-spezifischen RNA des Erregers in biologischen Materialien reproduzierbar nachzuweisen. Die Validierung des Nachweisverfahrens erfolgt durch Einsatz von synthetischen RNA-Standards ("BDV EASY QUALIBRATE").

Description

Die Erfindung betrifft ein automatisiertes Verfahren zum Nachweis p40-, p24- und gp18-spezifischer Ribonukleinsäure (RNA) des BDV in biologischem Material tierischer und humaner Herkunft. In dieser Form ist es für die virologische Routine- Diagnostik vorgesehen und ermöglicht die Untersuchung großer Probenchargen (Blutbank, Diagnostik-Labors). Mit Hilfe dieses Verfahrens ("BDV-EASY-QUANT") ist es erstmals möglich, bis zu 10 Kopien der p40-, p24- oder gp18-spezifischen RNA des Erregers in biologischen Materialien reproduzierbar nachzuweisen. Die Validierung des Nachweisverfahrens erfolgt durch Einsatz von synthetischen RNA- Standards ("BDV-EASY-QUALIBRATE").

Durch die molekularbiologische Charakterisierung des BDV (Briese et al., 1994; Cubitt et al., 1994) als Virus mit nichtsegmentiertem, einzelsträngigem, 8.9 kb langem RNA-Genom negativer Polarität ist es möglich (durch Kenntnis der entsprechenden Nukleotidsequenz und der hiervon während der Virusvermehrung angefertigten messenger-RNAs [m-RNAs]), einen Nachweis für virusspezifische Nukleinsäuren in biologischem Material zu führen (Richt et al., 1993; Zimmermann et al., 1994; Sorg et al., 1995; Sauder et al., 1998). Dazu wird ein biochemisches Verfahren mit der Bezeichnung Reverse-Transkriptions-Polymerase-Ketten-Reaktion (RT-PCR) eingesetzt. Diese Methode macht die Umsetzung der nachzuweisenden, virusspezifischen RNA durch Einsatz von spezifischen Primern in eine komplementäre DNA (cDNA) möglich, die im folgenden Schritt exponentiell bis in den nachweisbaren Bereich vermehrt (amplifiziert) wird. Die so hergestellten Amplifikate (PCR-Produkte) werden anschließend zur Darstellung und Bestimmung ihrer Größe in der Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt. Nach dieser Elektrophorese ist es möglich, durch Einsatz fluoreszierender Farbstoffe die amplifizierte DNA im Gel unter UV-Licht-Bestrahlung sichtbar zu machen. Sind Amplifikate mit der richtigen Größe vorhanden, kann auf die Anwesenheit des Erregers im biologischen Material geschlossen werden. Zur Klärung der Spezifität der erhaltenen Amplifikate ist es allgemein üblich, diese mit sequenzspezifisch DNA-spaltenden Enzymen oder durch Hybridisierung mit spezifischen Sonden zu untersuchen. Neuerungen dieses bisher beschriebenen Verfahrens betreffen den Versuch der Bestimmung der Nachweisgrenze und der Validierung durch Einsatz von synthetischen, virusspezifischen RNA-Molekülen. Diese Standards stimmen in überwiegendem Maße in ihrer Nukleotidsequenz mit denen in virusinfizierten Zellen vorkommenden RNA-Molekülen (Wildtyp-RNA) überein. Durch molekularbiologische Techniken sind sie jedoch so verändert, daß sie von den Wildtyp-Molekülen unterschieden werden können. Interne Standards werden als Reaktionskontrolle (Positiv-Kontrolle) sowie zur Bestimmung der Nachweisgrenze des eingesetzten Verfahrens verwendet (Sauder et al., 1998).

Ein im folgenden dargestelltes, BDV-spezifisches RNA-Nachweisverfahren wurde weder publiziert noch patentiert. Die Literaturstellen, auf welche in der Charakterisierung des Standes von Wissenschaft und Technik Bezug genommen worden ist, sind nachstehend aufgeführt.

Literatur

Briese, T.; Schneemann, A.; Lewis, AJ.; Park, YS.; Kim, S.; Ludwig, H.; Lipkin WI (1994): "Genomic organization of Borna disease virus". Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 4362-66.
Cubitt, B.; Oldstone, C.; de la Torre, JC. (1994): "Sequence and genome organization of Borna disease virus". J. Virol. 68: 1382-96.
Richt, JA.; Clements, JE.; Herzog, S.; Pyper, J.; Wahn, K.; Becht, H. (1993): "Analysis of virus-specific RNA species and proteins in Freon-113 preparations of the Borna disease virus". Med. Microbiol. Immunol. 182: 271-280.
Sauder, C.; de la Torre, JC. (1998): "Sensitivity and reproducibility of RT-PCR to detect Borna disease virus (BDV) RNA in blood: implications for BDV epidemiology". J. Virol. Methods 71: 229-45.
Sorg, I.; Metzler, A. (1995): "Detection of Borna disease virus RNA in formalin-fixed, paraffin-embedded brain tissues by nested PCR". J. Clin. Microbiol. 33: 821-3.
Zimmermann, W.; Dürrwald, R.; Ludwig, H. (1994): "Detection of Borna disease virus RNA in naturally infected animals by a nested polymerase chain reaction". J. Virol. Methods 46: 133-43.

Bisher dargestellte Verfahren haben den Nachteil, daß sie für den Nachweis geringer Mengen virusspezifischer RNA, wie sie im Blut natürlich BDV-infizierter Spezies anzutreffen sind, nicht ausreichend sensitiv und daher nicht geeignet sind. Da die bisher verwendeten Verfahren nur zu experimentellen Zwecken konzipiert sind, können größere Probenzahlen (< 50) nicht in kurzen, vergleichbaren Zeiträumen untersucht werden. Die in diesen Verfahren verwendeten Reagenzien sind nicht optimal aufeinander abgestimmt. Bis heute beinhalten die Verfahren Arbeitsabläufe, die durch eine Vielzahl manueller Tätigkeiten gekennzeichnet sind und nur teilweise automatisiert wurden. Vor allem die Darstellung und die Auswertung der Untersuchungsergebnisse nach Amplifizierung der DNA in einer "nested RT-PCR" bestehen aus mehreren nacheinander ablaufenden, manuellen Verfahrensschritten. Neben dem erhöhten Zeitaufwand besteht überdies die Gefahr, daß Untersuchungsergebnisse im Laufe der langwierigen Prozeduren verfälscht werden.

Diese Tatsachen mindern die Reproduzierbarkeit und den Vergleich der mit diesen Nachweisverfahren erhaltenen Ergebnisse. Eine Quantifizierung der in biologischem Material nachgewiesenen, BDV-spezifischen RNA wurde bis heute nicht durchgeführt.

Die vorstehend beschriebenen Nachteile des Standes von Wissenschaft und Technik haben folgende Ursachen.

1. Ursachen, die die Sensitivität der angewandten Verfahren betreffen

Zum Nachweis vorhandener, virusspezifischer RNA in biologischem Material werden in den bisher dargestellten Methoden lediglich ein spezifischer Primer (antisense) oder "random-Hexamere" verwendet. Die Verwendung nur eines Primers führt dazu, daß lediglich RNA-Moleküle mit positiver Polarität in eine cDNA umgeschrieben und nachgewiesen werden können. Die genomische RNA (negative Polarität), die die Erbsubstanz des Erregers darstellt, bleibt dabei unberücksichtigt. Testsysteme unter Anwendung von "random-Hexameren" haben sich für den BDV-spezifischen Genomnachweis als weniger sensitiv erwiesen (Sauder et al., 1998).

Des weiteren sind die für die Amplifikation benutzten Nukleotidsequenzen aufgrund der Länge der von ihnen hergestellten DNA-Fragmente ungeeignet. Dies führt vor allem beim Schritt der reversen Transkription zur unvollständigen cDNA-Synthese.

Dies beeinflußt entscheidend die Effizienz der Amplifikation und damit die Nachweissensitivität. Bisher eingesetzte Verfahren bedienen sich einer Vielzahl von Reagenzien, die nicht oder nur teilweise aufeinander abgestimmt sind.

2. Ursachen, die eine Quantifizierung BDV-spezifischer RNA nicht zulassen

Aufgrund der exponentiellen Vermehrung der Zielmoleküle in einer PCR kann von der Menge des PCR-Produktes nicht auf die Anzahl virusspezifischer RNA-Moleküle in der Ausgangsprobe geschlossen werden. Routinemäßig wird keine definierte Anzahl synthetisch hergestellter RNA-Moleküle in Verdünnungsreihen den biologischen Proben hinzugegeben. Durch die fehlende Kenntnis des Verhältnisses von Wildtyp-Amplifikaten zu synthetischen Amplifikaten ist die Anzahl der in der Probe vorhandenen Wildtyp-RNA-Moleküle nicht bestimmbar. Bisher verfügbare Verfahren ermöglichen ebenfalls keine Quantifizierung während der Analyse.

3. Ursachen, die die mangelnde Standardisierbarkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens betreffen

Die Ursachen für die bisher fehlende Standardisierung sind das Ergebnis mehrerer zusammenwirkender Faktoren. Vorhandene Verfahren sind bisher nicht für den Routineeinsatz in der virologischen Diagnostik konzipiert worden. Eine Vielzahl von Reagenzien wird verwendet, die nicht optimal aufeinander abgestimmt sind. Bis heute existiert kein Verfahren, das vom Beginn der RNA-Isolierung bis zur Auswertung der Ergebnisse nach einem vereinheitlichten Protokoll durchgeführt wird. Durch die Verwendung einer "nested RT-PCR" und die große Anzahl manueller Verfahrensschritte, die vor allem im Bereich der Darstellung und Auswertung erhaltener Teilergebnisse zu finden ist, wird die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt.

4. Ursachen, die die mangelnde Automatisierung des Verfahrens betreffen

Die zur Zeit für den BDV-RNA-Nachweis angewandten Verfahren sind für den Durchsatz einer begrenzten Zahl von Proben im Rahmen des experimentellen Gebrauchs konzipiert und beinhalten daher fast ausschließlich manuelle Verfahrensschritte. Herkömmliche, auf Agarose-Gelelektrophorese beruhende Detektionssysteme eignen sich nicht zur Automatisierung von Verfahren mit hohem Probendurchsatz.

Die Erfindung hat das Ziel, ein automatisiertes, standardisiertes und sehr sensitives Verfahren für den Nachweis BDV-spezifischer RNA in biologischem Material zu entwickeln, welches die Quantifizierung bereits während der Analyse erlaubt.

Die Erfindung hat die Aufgabe, die Ursachen der Nachteile des Standes von Wissenschaft und Technik zu überwinden.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst.

Zu 1.

Für den Genomnachweis benutzte Zielsequenzen wurden hinsichtlich ihrer Eignung für eine effiziente Amplifizierung evaluiert. Durch Verwendung von zwei spezifischen Primern bei der Umsetzung der RNA in eine cDNA wird auch die Erbsubstanz des BDV im biologischen Material nachgewiesen. Dafür wurden Primer ("BDV-EASY- PRIM p40, BDV-EASY-PRIM p24, BDV-EASY-PRIM gp18") für alle drei Zielsequenzen (p40, p24, gp18) unter Einhaltung sämtlicher Kriterien für die Auswahl von Oligonukleotiden optimal konfiguriert und auf die Reagenzien des Systemkits abgestimmt. Die Auswahl von Primern, die eine möglichst kurze Nukleotidsequenz eingrenzen, führt zu einer effizienteren cDNA-Synthese und erhöht somit die Sensitivität des Verfahrens.

Zu 2.

Durch Zugabe (in Verdünnungsreihen) einer definierten Anzahl synthetisch hergestellter RNA-Standards ("BDV-EASY p40 QUALIBRATE, BDV-EASY p24 QUALIBRATE, BDV-EASY gp18 QUALIBRATE") kann die Anzahl BDV-spezifischer RNA-Moleküle quantifiziert werden. Nach Eichung des Systems und durch die Wahl von Fluorochrom-markierten Primern können alle erhaltenen, spezifischen PCR- Produkte bereits während der Analyse (ohne gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte) quantifiziert werden.

Zu 3.

Die Konfektionierung des Verfahrens als vorgefertigtes System in Form eines "Kits", bestehend aus definierten und miteinander abgestimmten Primern und Reagenzien gewährleistet seine Standardisierung und somit höchstmögliche Prozessivität und Reproduzierbarkeit.

Die Eliminierung der "nested RT-PCR" durch die Verwendung des Taqman-Realtime- RT-PCR-Systems verringert die Gefahr von Kontaminationen.

Zu 4.

Die Durchführung des Verfahrens von der RNA-Isolierung bis zur Messung der PCR- Produkte auf Mikrotiterplatten und die Verwendung Roboter-gestützter Pipettier- Systeme gewährleisten einen hohen Probendurchsatz sowie die Gleichförmigkeit der Verfahrensschritte.

Die Erfindung besteht in der Präsentation einer neuen automatisierten Methode zum gleichzeitigen Nachweis und der Quantifizierung von drei BDV-spezifischen Nukleinsäuren in Blutpräparaten. In dieser Methode werden u. a. nachstehende Systeme miteinander kombiniert (siehe Anhang, Abb. 10).

1. Die automatisierte RNA-Isolierung wird mit dem QIA-BioRobot-9600-System unter Verwendung des QIAamp-96-Viral-RNA-BioRobot-Kit durchgeführt.
2. Die Taqman-Realtime-RT-PCR wird nach den vom Hersteller (Perkin-Elmer) empfohlenen Protokollen durchgeführt.

Die für die Proteine p40, p24 und gp18 des BDV-kodierenden Genomabschnitte, die zur Etablierung des Systems verwendet werden und erstmalig von experimentell BDV- infizierten Mäusen sequenziert wurden, sind als SEQ ID No. 1 bis 3 angegeben.

Diese Sequenzen wurden zur Herstellung der RNA-Standards ("BDV-EASY p40 QUALIBRATE, BDV-EASY p24 QUALIBRATE, BDV-EASY gp18 QUALIBRATE") verwendet und sind als SEQ ID No. 4 bis 6 angegeben.

Die Sequenzen der für den Nachweis des p40, p24 und gp18 von BDV verwendeten Primer ("BDV-EASY-PRIM p40, BDV-EASY-PRIM p24, BDV-EASY-PRIM gp18") sind als SEQ ID No. 7 bis 9 angegeben.

Die Erfindung wird nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiel

Die Abkürzungen "mM" und "µM" stehen für die Einheiten mmol/l bzw. µmol/l.

A) Vorbereitende Arbeiten:
- - Binden der Primer ("BDV-EASY-PRIM p40, BDV-EASY-PRIM p24, BDV-EASY- PRIM gp18"), entsprechend 1 µl einer 10-µM-Konzentration, an die MikroAmp- optical-96-well-reactionplate" (Perkin Elmer).
B) RNA-Isolierung aus Zellen des peripheren Blutes mit dem RNeasy-blood-kit (Qiagen, Hilden), entsprechend den Anweisungen des Herstellers und anschließende, quantitative Bestimmung der RNA-Mengen.
C) BDV-Einschritt-RT-PCR mit dem ABI-PRISM-7700-Sequence-Detector (Perkin Elmer)

Tabelle 1

Reagenzien für einen 50-µl-Reaktionsansatz

Tabelle 2

Reaktionsablauf der Einschritt-RT-PCR mit Temperaturprofil zum Nachweis von p40-, p24- und gp18-RNA

Mit Hilfe der Ergebnisse der BDV-p40-, -p24- und -gp18-Positiv-Kontrollen (unterschiedliche Fluorochrom-Emission) wird eine Eichkurve erstellt. In Proben ohne BDV-spezifische Nukleinsäuren kommt es zu keiner Fluorochrom-Emission. In Proben, in denen BDV-spezifische Nukleinsäuren vorhanden sind, werden diese anhand der erstellten Eichkurve direkt quantifiziert.

Die technischen und ökonomischen Vorteile der Erfindung liegen in der Entwicklung eines automatisierten, standardisierten und hoch-sensitiven Verfahrens für den gleichzeitigen Nachweis von drei BDV-spezifischen RNAs in biologischem Material. Dieses Verfahren ermöglicht erstmals die Untersuchung von RNA aus Zellen von Blutprodukten in einer großen Anzahl von Proben und trägt deshalb wesentlich zur Qualitätskontrolle und Produktsicherheit von Blutprodukten bei.

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 1

Die in maschinenlesbarer Form aufgezeichneten Angaben sind mit dem geschriebenen Sequenzprotokoll identisch.

BDV-M-p40-Sequenz

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 2

BDV-M-p24-Sequenz

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 3

BDV-M-gp18-Sequenz

Im einzelnen:

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 4

BDV-EASY-p40-QUALIBRATE

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 5

BDV-EASY-p24-QUALIBRATE

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 6

BDV-EASY-p24-QUALIBRATE

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 7

Primer für das BDV-p40-Gen

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 8

Primer für das BDV-p24-Gen

Sequenzprokoll SEQ ID-Nr. 9

Primer für das BDV-gp18-Gen

Claims

1. Genomabschnitte p40, entsprechend SEQ ID No. 1; p24, entsprechend SEQ ID No. 2, und gp18, entsprechend SEQ ID No. 3 des BDV von experimentell infizierten Mäusen.

2. BDV-RNA-Standards: BDV-EASY p40 QUALIBRATE, entsprechend SEQ ID No. 4; BDV- EASY p24 QUALIBRATE; BDV-EASY, entsprechend SEQ ID No. 5, und gp18 QUALIBRATE, entsprechend SEQ ID No. 6.

3. BDV-spezifische Oligonukleotide: BDV-EASY PRIM p40, entsprechend SEQ ID No. 7; BDV- EASY PRIM p24, entsprechend SEQ ID No. 8, und BDV EASY PRIM gp18, entsprechend SEQ ID No. 9.

4. Verfahren zum quantitativen Nachweis von gleichzeitig drei BDV-spezifischen RNAs in biologischem Material, dadurch gekennzeichnet, daß:

a) Oligonukleotide nach Anspruch 3 an Mikrotiterplatten gebunden werden,
b) gleichlaufend EDTA-behandelte Blutproben oder Blutprodukte einer Erythrozytenlyse unterzogen werden und in einer Mirotiterplatte die Gesamt-RNA aus den Zellen des biologischen Materials isoliert wird, wobei die gesamte zelluläre und virale RNA erfaßt wird,
c) in vitro transkribierte Standard-RNA nach Anspruch 2 als externe Reaktionskontrolle auf die Mikrotiterplatten pipettiert wird,
d) die isolierte Gesamt-RNA quantifiziert und in die Mikrotiterplatte pipettiert wird,
e) nach Zugabe des Enzyms und des Puffers die RNA revers transkribiert und unmittelbar amplifiziert wird,
f) die spezifischen PCR-Produkte von drei BDV-spezifischen RNAs mittels Fluorochroma (FAD, Tamra) quantitativ nachgewiesen werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologischen Material um Spenderblut und Blutprodukte handelt.

6. Testkit, als "BDV-EASY-QUANT" bezeichnet, zum quantitativen Nachweis von gleichzeitig drei BDV-spezifischen RNAs, enthaltend:

a) Mikrotiterplatten mit gebundenen Oligonukleotiden nach Anspruch 3;
b) jeweils drei Positiv-Kontrollen in vitro transkribierter, synthetischer RNA der Genomabschnitte p40, p24 und gp18 des BDV nach Anspruch 2, wobei die Kopienzahl zwischen 20 und 200 beträgt;
c) Mittel zur automatisierten RNA-Isolierung aus Zellen und Taqman-RT-PCR, wie Enzyme, Detergentien zur RNA-Isolierung und Puffer;
d) übliche Hilfs- und Trägerstoffe.

7. Testkit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Mikrotiterplatten ebenso wie die Primer für den gleich zeitigen Nachweis des p40, p24 und gp18 von BDV in einer Reaktionsvertiefung - Multiplex-RT-PCR - geeignet sind.

8. Testkit nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopienzahl in den Positiv-Kontrollproben zwischen 20 und 200 beträgt.