DE10034496A1 - Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren - Google Patents

Abstract

Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren, bei dem ein flüssiger Testansatz durch Mischen einer erythrozytenhaltigen Probe mit einer erythrozytäre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird, der Testansatz unter definierten Bedingungen inkubiert wird und nach der Inkubation optisch auf eine eventuelle Agglutination der in ihm enthaltenen Erythrozyten untersucht wird, wobei in dem Testansatz zusätzlich als agglutinationsverstärkende Substanz Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß keine spontane Agglutination der Erythrozyten durch das PEG alleine ausgelöst wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.

Gattungsgemäße Verfahren werden zur Untersuchung der immunologischen Ei­ genschaften von Erythrozyten und/oder erythrozytären Antikörpern eingesetzt.

Üblicherweise handelt es sich um Flüssigkeitstests, bei denen durch Mischen ei­ ner erythrozytenhaltigen Probe mit einer erythrozytäre Antikörper (im folgenden auch als Antikörper bezeichnet) enthaltenden Probe ein Testansatz hergestellt wird. Der flüssige Testansatz wird dann über einen definierten Zeitraum (in der Regel 30 bis 60 min) und unter definierten Bedingungen (z. B. bei 30 Grad Celsi­ us) inkubiert und nach Abschluß der Inkubation optisch auf eine eventuelle Ag­ glutination der Erythrozyten überprüft.

Zur Agglutination kann es grundsätzlich immer dann kommen, wenn im Testan­ satz Antikörper vorliegen, die blutgruppenspezifisch für Oberflächenantigene der im Testansatz enthaltenen Erythrozyten sind. In diesem Fall kommt es bei Anti­ körpern des AB0-Systems (reguläre Antikörper) spontan zu der angesprochenen Agglutination, die auf eine Vernetzung der Erythrozyten über die Antikörper zu­ rückzuführen ist.

AB0-Antikörper umfassen hauptsächlich Immunogluboline von IgM-Typ, die bis zu 10 Antigen-Bindungsstellen aufweisen, und in der Lage sind einen Abstand zwischen zwei Erythrozyten von mehr als 300 A zu überbrücken. Dies reicht in der Regel aus, um die zwischen Erythrozyten aufgrund ihrer relativ starken nega­ tiven Oberflächenladungen herrschenden Abstoßungskräfte zu überbrücken

Neben den angesprochenen Antikörpern vom AB0-Typ können weitere erythro­ zytäre Antikörper in Blutproben enthalten sein, die im folgenden als irreguläre Antikörper bezeichnet werden.

Unter die irregulären Antikörper fallen z. B. die Antikörper des Rhesus-Systems, die üblicherweise mit Anti-D, Anti-E und Anti-C, Anti-c und Anti-e bezeichnet werden.

Stellvertretend seien weiterhin z. B. die Antikörper des Kell-Systems (Anti-K), die des Duffy-Systems (Anti-Fya, Anti-Fyb) oder die des Kidd-Systems (Anti-Jka und Anti-Jkb) erwähnt, um nur einige Beispiele zu nennen. Es sei darauf hinge­ wiesen, daß es noch weitere irreguläre Antikörper gibt, die allerdings aus blut­ gruppenserologischer Sicht eher untergeordnete Bedeutung haben.

Irreguläre Antikörper sind zumeist Immunoglobuline der IgG-Klasse, die wenige Bindungsstellen für Antigene besitzen und weiterhin nur eine relativ kurze Strecke von bis zu ca. 140 A überbrücken können, was zumeist nicht für die Über­ brückung der Abstände zwischen Erythrozyten in Lösung ausreicht.

Die Folge ist, daß irreguläre Antikörper zumeist nicht in der Lage sind, ohne un­ terstützende Maßnahmen, Erythrozyten zu agglutinieren. Man nennt sie daher auch in komplette Antikörper, da eine von ihnen bewirkte Agglutination von Erythrozyten z. B. durch agglutinationsverstärkende Hilfsstoffe unterstützt wer­ den muß.

In diesem Zusammenhang ist z. B. ein Test zum Nachweis von irregulären Anti­ körpern bekannt, bei dem dem Testansatz Polyvinylpyrrolidon (PVP) zugesetzt wird. PVP bewirkt, vermutlich über eine Entladung der Oberflächen, daß die Erythrozyten unspezifisch agglutinieren. In diesem durch PVP hervorgerufenen agglutinierten Zustand sind die Erythrozyten soweit aneinander angenähert, daß nun auch irreguläre Antikörper vom IgG-Typ, Spezifizität vorausgesetzt, eine spezifische Antikörper-Bindung zwischen den Erythrozyten herstellen können. In einem weiteren Schritt wird dann durch Gabe von z. B. Natrium-Zitratpuffer die unspezifische durch PVP bewirkte Bindung zwischen den Erythrozyten wieder aufgehoben. Bleiben die Erythrozyten dann agglutiniert, so spricht dies für eine spezifische Antikörper-Bindung (und umgekehrt).

Die bekannten agglutinationsverstärkenden Hilfsstoffe führen wie oben ange­ sprochen zu einer unspezifischen Agglutination der Erythrozyten. Vor einer Aus­ sage, ob eine spezifische antikörperabhängige Agglutination stattgefunden hat, muß dieser durch die Hilfsstoffe hervorgerufene Vernetzungszustand wieder auf­ gehoben werden, was einen zusätzlichen Arbeitsschritt bedeutet. Insbesondere bei automatisierten Testvorrichtungen bedeutet dieser zusätzliche Schritt zusätz­ lichen Konstruktionsaufwand.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein blutgruppenserologisches Untersuchungsver­ fahren zu schaffen, mit dem sich z. B. irreguläre Antikörper auf einfachere Weise als im Stand der Technik nachweisen lassen.

Auch das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren arbeitet mit einem flüssigen Testansatz, der durch Mischen einer Erythrozytenprobe mit einer möglicherweise irreguläre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird.

Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, daß als agglutinationsverstärkendes Rea­ genz Polyethylenglycol (PEG) eingesetzt wird.

Es hat sich herausgestellt, daß die Verwendung von PEG, zumindest in den wei­ ter unten angegebenen Versuchsbedingungen, nicht zu einer unspezifischen Ag­ glutination von Erythrozyten führt.

Vielmehr bewirkt der erfindungsgemäße Einsatz von PEG, daß die zwischen den Erythrozyten auftretenden Abstoßungskräfte soweit reduziert werden, daß auch irreguläre Antikörper vom IgG-Typ eine Agglutination von Erythrozyten bewir­ ken können.

Der wesentliche Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine agglutinationsver­ stärkende Substanz eingesetzt wird, die ohne selbst eine Agglutination zwischen den Erythrozyten zu erzeugen, dennoch eine Vernetzung der Erythrozyten mittels irregulärer Antikörper ermöglicht.

Im Gegensatz zum Stand der Technik kommt es also hier nicht zu einer unspezi­ fischen Agglutination, die im weiteren Verlauf des Verfahrens in einem zusätzli­ chen Arbeitsschritt wieder aufgehoben werden müßte. Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren läßt sich also in besonders vorteilhafter Weise automati­ siert durchführen.

Die Einstellung der Verfahrensparameter, insbesondere der einzusetzenden PEG- Konzentration, läßt sich vom Fachmann ohne größere Umstände auf die jeweili­ gen Bedingungen hin optimieren. Bevorzugt sollte PEG in einer Konzentration von 4% bis 6% bezogen auf den Testansatz eingesetzt werden.

Mit dieser PEG-Konzentrationen lassen sich alle üblichen Blutproben in erfin­ dungsgemäßer Weise aufarbeiten. Übliche Erythrozytenproben enthalten dabei in der Regel zwischen 0,8 und 2,5 Vol% Erythrozyten. Der Gesamteiweißgehalt in den Serumproben beträgt üblicherweise zwischen 50 und 90 g/l.

Denkbar ist selbstverständlich auch, daß das erfindungsgemäße Verfahren mit Proben durchgeführt wird, die andere (höhere oder niedrigere) Konzentrationen an Erythrozyten und/oder Eiweiß enthalten. Für optimale Ergebnisse muß in sol­ chen Fällen ggf. die PEG-Konzentration angepaßt werden, was aber für den Fachmann kein Problem darstellt.

Denkbar ist, z. B. das PEG zunächst zu der Zellprobe oder Antikörperprobe zu geben und diese dann mit der anderen Probe zur Herstellung des Testansatzes zu vermischen.

Bevorzugt wird jedoch eine separate PEG-Lösung mit der Zellprobe und der An­ tikörper-Probe zur Herstellung des Testansatzes vermischt.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß die separat zugesetzte PEG-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 einge­ stellt wird.

PEG ist im Markt in unterschiedlichen Molekulargewichten, z. B. zwischen 1000 und 12000 erhältlich. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird PEG mit einem Molekulargewicht von 6000 (PEG 6000) eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren kann grundsätzlich in allen se­ rologischen Fragestellen eingesetzt werden, in denen eine durch irreguläre Anti­ körper hervorgerufene Agglutination von Erythrozyten nachgewiesen werden soll.

In aller Regel handelt es sich dabei um die gesetzlich vorgeschriebenen Antikör­ persuchtests, d. h. Verfahren, mit denen eventuell in einer Blutspende vorliegende irreguläre Antikörper nachgewiesen werden sollen. In solchen Antikörpersuch­ tests, die eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung darstellen, werden Test- Erythrozyten mit den entsprechenden irregulären Oberflächenantigenen mit einer Serum- bzw. Plasmaprobe der zu untersuchenden Blutspende inkubiert.

Denkbar ist selbstverständlich auch die andere Möglichkeit, daß Testantikörper mit einer unbekannten Zellprobe inkubiert und in der erfindungsgemäßen Weise untersucht werden.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß es im Mikrotiterplattenmaßstab durchgeführt werden kann. Seit längerer Zeit sind spezielle Mikrotiterplatten in Blutgruppenautomaten im Einsatz, deren Kavitäten zum Boden hin stufentrichterförmig zulaufen. Solche Mikrotiterplatten werden z. B. von der Firma OLYMPUS Diagnostica GmbH vertrieben.

Aufgrund der speziellen stufentrichterförmigen Ausgestaltung des Bodens kann in den Kavitäten solcher Mikrotiterplatten das unterschiedliche Sedimentations­ verhalten von Einzelerythrozyten einerseits und agglutinierten Erythrozyten andererseits optisch besonders deutlich differenziert werden, ohne daß eine Zentri­ fugation oder die Zugabe weiterer Reagenzien erforderlich ist.

Im Falle einer Agglutination ergibt sich ein über den größten Teil der Bodenflä­ che reichender gleichmäßiger Zellrasen. Hat keine Agglutination stattgefunden, so reichern sich die Erythrozyten auf den untersten Stufen des Bodens an und es ergibt sich ein klar umrissener gegenüber den darüber liegenden Stufen deutlich kontrastierter Bereich.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer besonders bevorzugten Ausge­ staltung in solchen Milrotiterplatten durchgeführt werden.

Im folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels erläutert werden.

Das Beispiel beschreibt einen Antikörpersuchtest, bei dem drei Serumproben (Spuren B-D) mit Testerythrozyten inkubiert wurden. Gemessen wurde gegen eine üblicherweise in Blutbanken eingesetzte Negativ-Kontrolle (Spur A).

Die Serumprobe in Spur B enthielt Antikörper vom Typ Anti-D, in Spur C Anti­ körper vom Typ Anti-N und in Spur D Antikörper vom Typ Anti-K.

Es wurden jeweils 25 µl Erythrozyten-Lösung und 25 µl einer Serumprobe in eine Kavität einer Mikrotiterplatte vom oben beschriebenen Typ pipettiert und ge­ mischt. Pro Test wurden 4 Kavitäten befüllt, in die jeweils 10, 11, 12 und 13µ1 einer 24%-igen PEG 6000-Lösung mit einem pH-Wert von 4,3 gegeben wurden.

Die Erythrozyten-Lösungen enthielten ca. 1,7 Vol% Erythrozyten. Der Ge­ samteiweißgehalt in den Serumproben lag in dem oben erwähnten Bereich zwi­ schen 50 und 90 g/l.

Wie oben angesprochen ist selbstverständlich auch denkbar, das erfindungsge­ mäße Verfahren mit Proben durchzuführen, die andere (höhere oder niedrigere) Konzentrationen an Erythrozyten und/oder Eiweiß enthalten. Für optimale Er­ gebnisse muß in solchen Fällen ggf. die PEG-Konzentration angepaßt werden, was aber für den Fachmann kein Problem darstellt.

Nach Durchmischen der Testansätze in den Kavitäten wurden die Mikrotiter­ platte dann für 60 min bei 30°C inkubiert und anschließend optisch ausgewertet. Das Ergebnis ist in der Abbildung wiedergegeben.

Die Abbildung zeigt in Aufsicht einen Teil einer Mikrotiterplatte mit den er­ wähnten Spuren A-D.

Man erkennt in den Kavitäten der Spur A (Kontrolle) klar umrissene Bereiche von vollständig sedimentierten Einzelerythrozyten. Hier hat keine Agglutination stattgefunden, die Ergebnisse sind negativ.

Die Spuren B und D zeigen dagegen positive Ergebnisse. Insbesondere in den Kavitäten mit den höheren PEG-Konzentrationen ist ein gleichmäßigerer gefärb­ ter Bodenbereich zu erkennen, was für einen agglutinierten Erythrozytenrasen spricht, ausgelöst durch die jeweils in den Serumproben enthaltenen Antikörper Anti-D bzw. Anti-K.

Die Spur C zeigt eine schwächere Positiv-Reaktion als die Spuren B und D, ist aber in den höheren PEG-Konzentrationen deutlich von Spur A (Negativ- Kontrolle) zu differenzieren.

Die Kavitäten mit den niedrigen PEG-Konzentrationen zeigen in den Spuren B bis D abgeschwächte positive Ergebnisse. Im Testbetrieb werden diese Konzen­ trationen nicht eingesetzt. Sie wurden nur hier eingesetzt, um den erfindungswe­ sentlichen Einfluß von PEG (bzw der PEG-Konzentration) zu dokumentieren.

Claims (8)

1. Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren, bei dem ein flüssiger Testansatz durch Mischen einer erythrozytenhaltigen Probe mit einer erythrozytäre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird, der Testan­ satz unter definierten Bedingungen inkubiert wird und nach der Inkubation optisch auf eine eventuelle Agglutination der in ihm enthaltenen Erythro­ zyten untersucht wird, wobei in dem Testansatz zusätzlich eine agglutina­ tionsverstärkende Substanz enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, daß als agglutinationsverstärkende Substanz Polyethylenglykol (PEG) einge­ setzt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß keine spontane Agglutination der Erythrozyten durch das PEG alleine ausgelöst wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die PEG- Konzentration 4% bis 6% bezogen auf den Testansatz beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung des Testansatzes die Zellprobe, die Antikörperprobe und PEG- Lösung als separate Komponenten miteinander vermischt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der PEG-Lösung zwischen 4 und 5 beträgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß PEG 6000 eingesetzt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zellprobe Test-Erythrozyten enthalten sind, die in ihren serolo­ gischen Eigenschaften bekannt sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in der Antikörper-Probe Test-Antikörper mit bekannten serologischen Eigenschaften enthalten sind.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in Mikrotiterplatten durchgeführt wird, deren Kavitäten einen stufentrichterförmig zulaufenden Boden aufweisen.