DE10034496A1 - Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren - Google Patents
Blutgruppenserologisches UntersuchungsverfahrenInfo
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Abstract
Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren, bei dem ein flüssiger Testansatz durch Mischen einer erythrozytenhaltigen Probe mit einer erythrozytäre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird, der Testansatz unter definierten Bedingungen inkubiert wird und nach der Inkubation optisch auf eine eventuelle Agglutination der in ihm enthaltenen Erythrozyten untersucht wird, wobei in dem Testansatz zusätzlich als agglutinationsverstärkende Substanz Polyethylenglykol (PEG) eingesetzt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß keine spontane Agglutination der Erythrozyten durch das PEG alleine ausgelöst wird.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.
Gattungsgemäße Verfahren werden zur Untersuchung der immunologischen Ei
genschaften von Erythrozyten und/oder erythrozytären Antikörpern eingesetzt.
Üblicherweise handelt es sich um Flüssigkeitstests, bei denen durch Mischen ei
ner erythrozytenhaltigen Probe mit einer erythrozytäre Antikörper (im folgenden
auch als Antikörper bezeichnet) enthaltenden Probe ein Testansatz hergestellt
wird. Der flüssige Testansatz wird dann über einen definierten Zeitraum (in der
Regel 30 bis 60 min) und unter definierten Bedingungen (z. B. bei 30 Grad Celsi
us) inkubiert und nach Abschluß der Inkubation optisch auf eine eventuelle Ag
glutination der Erythrozyten überprüft.
Zur Agglutination kann es grundsätzlich immer dann kommen, wenn im Testan
satz Antikörper vorliegen, die blutgruppenspezifisch für Oberflächenantigene der
im Testansatz enthaltenen Erythrozyten sind. In diesem Fall kommt es bei Anti
körpern des AB0-Systems (reguläre Antikörper) spontan zu der angesprochenen
Agglutination, die auf eine Vernetzung der Erythrozyten über die Antikörper zu
rückzuführen ist.
AB0-Antikörper umfassen hauptsächlich Immunogluboline von IgM-Typ, die bis
zu 10 Antigen-Bindungsstellen aufweisen, und in der Lage sind einen Abstand
zwischen zwei Erythrozyten von mehr als 300 A zu überbrücken. Dies reicht in
der Regel aus, um die zwischen Erythrozyten aufgrund ihrer relativ starken nega
tiven Oberflächenladungen herrschenden Abstoßungskräfte zu überbrücken
Neben den angesprochenen Antikörpern vom AB0-Typ können weitere erythro
zytäre Antikörper in Blutproben enthalten sein, die im folgenden als irreguläre
Antikörper bezeichnet werden.
Unter die irregulären Antikörper fallen z. B. die Antikörper des Rhesus-Systems,
die üblicherweise mit Anti-D, Anti-E und Anti-C, Anti-c und Anti-e bezeichnet
werden.
Stellvertretend seien weiterhin z. B. die Antikörper des Kell-Systems (Anti-K),
die des Duffy-Systems (Anti-Fya, Anti-Fyb) oder die des Kidd-Systems (Anti-Jka
und Anti-Jkb) erwähnt, um nur einige Beispiele zu nennen. Es sei darauf hinge
wiesen, daß es noch weitere irreguläre Antikörper gibt, die allerdings aus blut
gruppenserologischer Sicht eher untergeordnete Bedeutung haben.
Irreguläre Antikörper sind zumeist Immunoglobuline der IgG-Klasse, die wenige
Bindungsstellen für Antigene besitzen und weiterhin nur eine relativ kurze Strecke
von bis zu ca. 140 A überbrücken können, was zumeist nicht für die Über
brückung der Abstände zwischen Erythrozyten in Lösung ausreicht.
Die Folge ist, daß irreguläre Antikörper zumeist nicht in der Lage sind, ohne un
terstützende Maßnahmen, Erythrozyten zu agglutinieren. Man nennt sie daher
auch in komplette Antikörper, da eine von ihnen bewirkte Agglutination von
Erythrozyten z. B. durch agglutinationsverstärkende Hilfsstoffe unterstützt wer
den muß.
In diesem Zusammenhang ist z. B. ein Test zum Nachweis von irregulären Anti
körpern bekannt, bei dem dem Testansatz Polyvinylpyrrolidon (PVP) zugesetzt
wird. PVP bewirkt, vermutlich über eine Entladung der Oberflächen, daß die
Erythrozyten unspezifisch agglutinieren. In diesem durch PVP hervorgerufenen
agglutinierten Zustand sind die Erythrozyten soweit aneinander angenähert, daß
nun auch irreguläre Antikörper vom IgG-Typ, Spezifizität vorausgesetzt, eine
spezifische Antikörper-Bindung zwischen den Erythrozyten herstellen können. In
einem weiteren Schritt wird dann durch Gabe von z. B. Natrium-Zitratpuffer die
unspezifische durch PVP bewirkte Bindung zwischen den Erythrozyten wieder
aufgehoben. Bleiben die Erythrozyten dann agglutiniert, so spricht dies für eine
spezifische Antikörper-Bindung (und umgekehrt).
Die bekannten agglutinationsverstärkenden Hilfsstoffe führen wie oben ange
sprochen zu einer unspezifischen Agglutination der Erythrozyten. Vor einer Aus
sage, ob eine spezifische antikörperabhängige Agglutination stattgefunden hat,
muß dieser durch die Hilfsstoffe hervorgerufene Vernetzungszustand wieder auf
gehoben werden, was einen zusätzlichen Arbeitsschritt bedeutet. Insbesondere
bei automatisierten Testvorrichtungen bedeutet dieser zusätzliche Schritt zusätz
lichen Konstruktionsaufwand.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein blutgruppenserologisches Untersuchungsver
fahren zu schaffen, mit dem sich z. B. irreguläre Antikörper auf einfachere Weise
als im Stand der Technik nachweisen lassen.
Auch das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren arbeitet mit einem flüssigen
Testansatz, der durch Mischen einer Erythrozytenprobe mit einer möglicherweise
irreguläre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird.
Erfindungsgemäß ist nun vorgesehen, daß als agglutinationsverstärkendes Rea
genz Polyethylenglycol (PEG) eingesetzt wird.
Es hat sich herausgestellt, daß die Verwendung von PEG, zumindest in den wei
ter unten angegebenen Versuchsbedingungen, nicht zu einer unspezifischen Ag
glutination von Erythrozyten führt.
Vielmehr bewirkt der erfindungsgemäße Einsatz von PEG, daß die zwischen den
Erythrozyten auftretenden Abstoßungskräfte soweit reduziert werden, daß auch
irreguläre Antikörper vom IgG-Typ eine Agglutination von Erythrozyten bewir
ken können.
Der wesentliche Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine agglutinationsver
stärkende Substanz eingesetzt wird, die ohne selbst eine Agglutination zwischen
den Erythrozyten zu erzeugen, dennoch eine Vernetzung der Erythrozyten mittels
irregulärer Antikörper ermöglicht.
Im Gegensatz zum Stand der Technik kommt es also hier nicht zu einer unspezi
fischen Agglutination, die im weiteren Verlauf des Verfahrens in einem zusätzli
chen Arbeitsschritt wieder aufgehoben werden müßte. Das erfindungsgemäße
Untersuchungsverfahren läßt sich also in besonders vorteilhafter Weise automati
siert durchführen.
Die Einstellung der Verfahrensparameter, insbesondere der einzusetzenden PEG-
Konzentration, läßt sich vom Fachmann ohne größere Umstände auf die jeweili
gen Bedingungen hin optimieren. Bevorzugt sollte PEG in einer Konzentration
von 4% bis 6% bezogen auf den Testansatz eingesetzt werden.
Mit dieser PEG-Konzentrationen lassen sich alle üblichen Blutproben in erfin
dungsgemäßer Weise aufarbeiten. Übliche Erythrozytenproben enthalten dabei in
der Regel zwischen 0,8 und 2,5 Vol% Erythrozyten. Der Gesamteiweißgehalt in
den Serumproben beträgt üblicherweise zwischen 50 und 90 g/l.
Denkbar ist selbstverständlich auch, daß das erfindungsgemäße Verfahren mit
Proben durchgeführt wird, die andere (höhere oder niedrigere) Konzentrationen
an Erythrozyten und/oder Eiweiß enthalten. Für optimale Ergebnisse muß in sol
chen Fällen ggf. die PEG-Konzentration angepaßt werden, was aber für den
Fachmann kein Problem darstellt.
Denkbar ist, z. B. das PEG zunächst zu der Zellprobe oder Antikörperprobe zu
geben und diese dann mit der anderen Probe zur Herstellung des Testansatzes zu
vermischen.
Bevorzugt wird jedoch eine separate PEG-Lösung mit der Zellprobe und der An
tikörper-Probe zur Herstellung des Testansatzes vermischt.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß
die separat zugesetzte PEG-Lösung auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 einge
stellt wird.
PEG ist im Markt in unterschiedlichen Molekulargewichten, z. B. zwischen 1000
und 12000 erhältlich. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird
PEG mit einem Molekulargewicht von 6000 (PEG 6000) eingesetzt.
Das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren kann grundsätzlich in allen se
rologischen Fragestellen eingesetzt werden, in denen eine durch irreguläre Anti
körper hervorgerufene Agglutination von Erythrozyten nachgewiesen werden
soll.
In aller Regel handelt es sich dabei um die gesetzlich vorgeschriebenen Antikör
persuchtests, d. h. Verfahren, mit denen eventuell in einer Blutspende vorliegende
irreguläre Antikörper nachgewiesen werden sollen. In solchen Antikörpersuch
tests, die eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung darstellen, werden Test-
Erythrozyten mit den entsprechenden irregulären Oberflächenantigenen mit einer
Serum- bzw. Plasmaprobe der zu untersuchenden Blutspende inkubiert.
Denkbar ist selbstverständlich auch die andere Möglichkeit, daß Testantikörper
mit einer unbekannten Zellprobe inkubiert und in der erfindungsgemäßen Weise
untersucht werden.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß es
im Mikrotiterplattenmaßstab durchgeführt werden kann. Seit längerer Zeit sind
spezielle Mikrotiterplatten in Blutgruppenautomaten im Einsatz, deren Kavitäten
zum Boden hin stufentrichterförmig zulaufen. Solche Mikrotiterplatten werden
z. B. von der Firma OLYMPUS Diagnostica GmbH vertrieben.
Aufgrund der speziellen stufentrichterförmigen Ausgestaltung des Bodens kann
in den Kavitäten solcher Mikrotiterplatten das unterschiedliche Sedimentations
verhalten von Einzelerythrozyten einerseits und agglutinierten Erythrozyten andererseits
optisch besonders deutlich differenziert werden, ohne daß eine Zentri
fugation oder die Zugabe weiterer Reagenzien erforderlich ist.
Im Falle einer Agglutination ergibt sich ein über den größten Teil der Bodenflä
che reichender gleichmäßiger Zellrasen. Hat keine Agglutination stattgefunden,
so reichern sich die Erythrozyten auf den untersten Stufen des Bodens an und es
ergibt sich ein klar umrissener gegenüber den darüber liegenden Stufen deutlich
kontrastierter Bereich.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer besonders bevorzugten Ausge
staltung in solchen Milrotiterplatten durchgeführt werden.
Im folgenden soll die Erfindung anhand eines Beispiels erläutert werden.
Das Beispiel beschreibt einen Antikörpersuchtest, bei dem drei Serumproben
(Spuren B-D) mit Testerythrozyten inkubiert wurden. Gemessen wurde gegen
eine üblicherweise in Blutbanken eingesetzte Negativ-Kontrolle (Spur A).
Die Serumprobe in Spur B enthielt Antikörper vom Typ Anti-D, in Spur C Anti
körper vom Typ Anti-N und in Spur D Antikörper vom Typ Anti-K.
Es wurden jeweils 25 µl Erythrozyten-Lösung und 25 µl einer Serumprobe in eine
Kavität einer Mikrotiterplatte vom oben beschriebenen Typ pipettiert und ge
mischt. Pro Test wurden 4 Kavitäten befüllt, in die jeweils 10, 11, 12 und 13µ1
einer 24%-igen PEG 6000-Lösung mit einem pH-Wert von 4,3 gegeben wurden.
Die Erythrozyten-Lösungen enthielten ca. 1,7 Vol% Erythrozyten. Der Ge
samteiweißgehalt in den Serumproben lag in dem oben erwähnten Bereich zwi
schen 50 und 90 g/l.
Wie oben angesprochen ist selbstverständlich auch denkbar, das erfindungsge
mäße Verfahren mit Proben durchzuführen, die andere (höhere oder niedrigere)
Konzentrationen an Erythrozyten und/oder Eiweiß enthalten. Für optimale Er
gebnisse muß in solchen Fällen ggf. die PEG-Konzentration angepaßt werden,
was aber für den Fachmann kein Problem darstellt.
Nach Durchmischen der Testansätze in den Kavitäten wurden die Mikrotiter
platte dann für 60 min bei 30°C inkubiert und anschließend optisch ausgewertet.
Das Ergebnis ist in der Abbildung wiedergegeben.
Die Abbildung zeigt in Aufsicht einen Teil einer Mikrotiterplatte mit den er
wähnten Spuren A-D.
Man erkennt in den Kavitäten der Spur A (Kontrolle) klar umrissene Bereiche
von vollständig sedimentierten Einzelerythrozyten. Hier hat keine Agglutination
stattgefunden, die Ergebnisse sind negativ.
Die Spuren B und D zeigen dagegen positive Ergebnisse. Insbesondere in den
Kavitäten mit den höheren PEG-Konzentrationen ist ein gleichmäßigerer gefärb
ter Bodenbereich zu erkennen, was für einen agglutinierten Erythrozytenrasen
spricht, ausgelöst durch die jeweils in den Serumproben enthaltenen Antikörper
Anti-D bzw. Anti-K.
Die Spur C zeigt eine schwächere Positiv-Reaktion als die Spuren B und D, ist
aber in den höheren PEG-Konzentrationen deutlich von Spur A (Negativ-
Kontrolle) zu differenzieren.
Die Kavitäten mit den niedrigen PEG-Konzentrationen zeigen in den Spuren B
bis D abgeschwächte positive Ergebnisse. Im Testbetrieb werden diese Konzen
trationen nicht eingesetzt. Sie wurden nur hier eingesetzt, um den erfindungswe
sentlichen Einfluß von PEG (bzw der PEG-Konzentration) zu dokumentieren.
Claims (8)
1. Blutgruppenserologisches Untersuchungsverfahren, bei dem ein flüssiger
Testansatz durch Mischen einer erythrozytenhaltigen Probe mit einer
erythrozytäre Antikörper enthaltenden Probe hergestellt wird, der Testan
satz unter definierten Bedingungen inkubiert wird und nach der Inkubation
optisch auf eine eventuelle Agglutination der in ihm enthaltenen Erythro
zyten untersucht wird, wobei in dem Testansatz zusätzlich eine agglutina
tionsverstärkende Substanz enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, daß
als agglutinationsverstärkende Substanz Polyethylenglykol (PEG) einge
setzt wird, wobei die Bedingungen so gewählt sind, daß keine spontane
Agglutination der Erythrozyten durch das PEG alleine ausgelöst wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die PEG-
Konzentration 4% bis 6% bezogen auf den Testansatz beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur
Herstellung des Testansatzes die Zellprobe, die Antikörperprobe und PEG-
Lösung als separate Komponenten miteinander vermischt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert
der PEG-Lösung zwischen 4 und 5 beträgt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß PEG 6000 eingesetzt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß in der Zellprobe Test-Erythrozyten enthalten sind, die in ihren serolo
gischen Eigenschaften bekannt sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,
daß in der Antikörper-Probe Test-Antikörper mit bekannten serologischen
Eigenschaften enthalten sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß das Verfahren in Mikrotiterplatten durchgeführt wird, deren Kavitäten
einen stufentrichterförmig zulaufenden Boden aufweisen.
Priority Applications (3)
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