DE3783209T2 - Verfahren und apparat zur bestimmung von immunologischen reaktiven substanzen von klinischem interesse. - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Dosierung von klinisch interessanten, immunologisch reaktiven Substanzen. Die Erfindung betrifft in gleicher Weise eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Unter immunologisch reaktiven Substanzen versteht man insbesondere alle Antigene (einschließlich der Haptene) und die Antikörper (monoklonale oder polyklonale Antikörper), die durch Zellfusion oder natürliche oder induzierte Immunisierung erhalten wurden.
• Unter klinisch interessanten, immunologisch reaktiven Substanzen versteht man insbesondere alle Antigen- oder Antikörpermoleküle, deren Dosierung in einer biologischen Probe menschlichen oder tierischen Ursprungs Interesse in der medizinischen Diagnostik, in der klinischen Forschung oder im Anschluß an einen pathologischen Prozeß oder eine durchgeführte Therapie haben könnten.
• Das in diesen immunologischen Dosierverfahren genutzte immunologische Phänomen wird in Fig. 1 wiedergegeben.
• Die am häufigsten eingesetzten Dosierungsverfahren, die auf der Nutzung der Kurve der
• Fig. 1 basieren, sind:
• - die Strahlenimmunodiffusion;
• - die Radioimmundlogie, die Immunoenzymologie und die Immunofluoreszenz;
• - die Nephelometrie.
• Andererseits wurden seit einigen Jahren bestimmte Assays des quantitativen Typs "Latex- Immunoassay" beschrieben, nämlich die Agglutination synthetischer Mikrokügelchen. Bis dahin hatte diese Verfahrensweisen, die in großem Umfang und seit langer Zeit aufgrund ihrer Einfachheit und der niedrigen Kosten angewendet werden, nur einen qualitativen Aspekt (Platte) oder semiquantitativen Aspekt (Becher) gezeigt (vgl. J. M. Singer und C.
• M. Plotz, The Latex Fixation Test, American Journal of Medecine, 21(1956), Seite 888). Die qualitativen oder semiquantitativen Formen (Platte, Karte, Becher) des Latex- Immunoassay bleiben überdies bis zur Stunde stark in der klinischen Diagnostik im Gebrauch und sind Gegenstand zahlreicher Patente und Publikationen, insbesondere im Bereich der Virologie und Mikrobiologie (R. F. Khabbaz, H. C. Standford und Koll., 1985, Measurement of Amikacin in Serum by a Latex Agglutination Inhibition Test, Journal of Clinical Microbiology, 22, Seiten 699 bis 701; US-Patent Nr. 3,488,156 und europäische Patentanmeldung EP-A 186 946).
• Bei diesen Verfahrensweisen des Sortierens oder der Früherkennung wird das Antigen oder der Antikörper auf den synthetischen Mikrokügelchen fixiert, und das Nichtauftreten oder das Auftreten von Agglutination aufgrund des entsprechenden Antigens oder Antikörpers wird im Reagenzglas oder in einem Becher oder auf einer Platte visuell oder turbidimetrisch nach leichtem Rühren zur Homogenisierung der Mischungen der Suspensionen abgeschätzt (siehe beispielsweise Patentanmeldungen EP-A 0 106 122 und EP-A 0 174 195).
• Bestimmte Assays des Typs quantitativer Latex-Immunoassay, wie sie in der Literatur vorgeschlagen wurden (z. B. J. P. Ripoll, A. M. Roch, G. A. Quash und J. Grange (1980), Journal of Immunological Methods, 33, Seiten 159 bis 173; Patentanmeldungen EP-A 0 189 389 und 0 005 978), zeigen im wesentlichen drei Phasen:
• Phase I: Phase einer Fixierung des Antigens oder des Antikörpers an einem Mikrokügelchen aus einem synthetischen Polymer mit einer Größe zwischen 0,01 um und 5 um; die
• Fixierung wird mit jedem bekannten Mittel durchgeführt, das identisch den Mitteln ist, die für die Verfahrensweisen auf einer Platte beschrieben wurden (z. B. US-Patent Nr. 4,217,338);
• Phase II: Phase einer immunologischen Agglutination der synthetischen Mikrokügelchen, die das Antigen oder den Antikörper tragen; diese Phase II des Verfahrens, nämlich die immunologische Agglutination der synthetischen Mikrokügelchen, muß sich auf zwei Ziele ausrichten, nämlich
• - die maximale Verringerung der nicht spezifischen Agglutination der Teilchen; unter nicht spezifischer Agglutination versteht man die Agglutination der Teilchen aufgrund schwacher Wechselwirkungen (des Typs Wasserstoffbindung, ionische Bindung oder Van-der-Waals-Bindungen) zwischen den Mikrokügelchen und den darauf fixierten Proteinen; und
• - die maximale Erhöhung der spezifischen (immunologischen) Agglutination der Teilchen.
• Im Verlauf dieser Phase werden im wesentlichen chemische oder biochemische Schritte durchgeführt, um die Teilchen mit dem Ziel zu stabilisieren, die nicht spezifische Agglutination zu minimieren. Im Verlauf dieser Phase werden die Schritte in gleicher Weise mit dem Ziel durchgeführt, die spezifische Agglutination der Teilchen und damit die Präzision der Dosierung zu erhöhen.
• Zur Verminderung der nicht spezifischen Agglutination der Teilchen schlägt das US-Patent
• Nr. 4,329, 152 vor, diese durch Fixierung von Rinderalbumin zu stabilisieren, das bei einem pH-Wert von genau 10 elektonegativ gehalten wird. Der sehr basische pH-Wert, der so dem Reagens und der Verfahrensführung auferlegt wird, ist mit dem Überleben der Proteine nicht verträglich und ist damit ein schwierig verwendbares Reaktionsmedium. Andererseits wird die Zuverlässigkeit des Verfahrens verringert, denn die Pufferlösungen mit derart basischen pH-Werten sind sehr instabil. Andererseits löst sich das durch hydrophobe Wechselwirkung fixierte Rinderalbumin bei einem pH-Wert von 10 zunehmend von den Teilchen und verliert zunehmend seine Stabilisierungskapazität.
• Die Stabilisierung durch Rinderalbumin bei einem pH-Wert von 8,2 wurde in gleicher Weise gemäß dem US-Patent Nr. 4,250,394 angewendet, das außerdem eine gegenüber der herkömmlichen Dauer stark verringerte Dauer des Rührens vorschlägt. Die manchmal zur Verringerung der nicht spezifischen Agglutination der Teilchen eingesetzten chaotropen Mittel bringen ungünstigerweise den Nachteil mit sich, daß sie die Bindungen zwischen Antigenen und Antikörpern schwächen oder brechen.
• Andere Verfahren zur Stabilisierung, die sehr kompliziert sind und in einem industriell anzuwendenden Reagens unbrauchbar sind, verwenden Mischungen von leichten und schweren Teilchen und deren Zentrifugation, z. B. Patentanmeldung EP-A 0,163,312. Zur Begünstigung der spezifischen Agglutination der Teilchen, d. h. der immunologischen Agglutination, wird in den beschriebenen Verfahren ein herkömmlicher Rührvorgang bei Thermostatisierung des Mediums in einem Wasserbad auf 37ºC oder 40ºC während einer zwischen einer halben Stunde und einer Stunde liegenden Zeitdauer angewendet. Derartige Inkubationszeiten bei 37ºC bedingen eine gewissenhafte und lästige Zeitnahme bei der anfänglichen Zugabe des Reagens in jedem Reagenzglas der Testreihe und im weiteren Verlauf des Verfahrens auch des Stoppens der Reaktion in der Reihe der Reagensgläser, abgesehen davon, daß derartige Inkubationszeiten die unerwünschte nicht spezifische Agglutination der Teilchen begünstigen.
• Die Verstärkung der spezifischen Agglutination (immunologischen Agglutination der Teilchen) wird mitunter in der Weise praktiziert, daß man dem Reaktionsmedium Zusätze wie beispielsweise Dextrose zusetzt, wie sie unter der Handelsbezeichnung "Dextran" bekannt ist, oder Polyethylenglykol zusetzt. Der Nachteil dieser Substanzen besteht darin, daß sie oft in hohem Maße hydrophob sind und daß sie sich daher an die Fc-Fragmente der auf den Mikroteilchen fixierten Antikörper anlagern, die dadurch selbst sehr hydrophob werden und folglich eine nicht immunologische Agglutination der Teilchen mitbringen. Dadurch induzieren sie in den Reaktionen Störungen und mitunter sogar Fehler.
• Die Patentanmeldung EP-A 0 106 122 schlägt in gleicher Weise ein Verfahren zur Dosierung von Immuno-gamma-globulinen vor, das eine Agglutinationsphase der Antikörper mit den Latexteilchen und eine Phase der Messung der Agglutination einschließt. Die Agglutinationsreaktion wird durch einfaches Rühren im Kreis und durch geeignete Verdünnungsschritte kontrolliert.
• Die Patentanmeldung EP-A 0 174 195 betrifft ein Verfahren zur Antikörper- und Antigenagglutination mit dem Ziel, Antigene oder insbesondere Antikörper nachzuweisen. Die Agglutinationsreaktion vollzieht sich in herkömmlicher Weise durch Anwendung eines Latex, Erwärmen während 30 Minuten auf 56ºC, Anwenden von Rinderalbumin und einen Schritt des Rührens auf herkömmliche Weise.
• Außerdem schlägt das US-Patent Nr. 4,250,394 die Messung der Eigenschaften der elektromagnetischen Strahlung einer Probe zur Dosierung einer Verbindung mit immunisierenden Eigenschaften vom Typ Antikörper vor. Die Dosierung umfaßt eine Agglutinationsreaktion, die einen mit Rinderalbumin behandelten Latex einschließt, sowie eine Phase des Rührens auf herkömmliche Weise.
• Es ist eine der Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die nicht spezifische Agglutination der Teilchen zu unterdrücken und gleichzeitig die immunologische, spezifische Agglutination der Teilchen zu verstärken, ohne daß dabei all die oben beschriebenen Nachteile des Standes der Technik auftreten, wobei überdies deutlich die Dauer des Verfahrens verringert werden soll.
• Phase III: Phase der Ablesung des Resultats; derzeit sind die Verfahrensweisen zur Ablesung des Resultats der Agglutination in den quantitativen Latex-Immunoassays die folgenden:
• - Zählung der Teilchen;
• - Messung der Opacität, die auch Turbidimetrie genannt wird und praktisch manchmal im Bereich des sichtbaren oder des infraroten Lichts, am häufigsten jedoch im Bereich des nahen Infrarotlichts durchgeführt wird;
• - Laser-Nephelometrie; und
• - Zentrifugenanalyse.
• Die Laser-Nephelometrie mißt das Licht, das durch Latexteilchen-Aggregate gestreut wird. Diese Technik, die beispielsweise in dem Artikel "J. Grange, A. M. Roch und G. A. Quash, 1977, Journal of Immunological Methods, 18, Seiten 326 bis 375" beschrieben wird, bringt den Nachteil mit sich, daß sie die Verwendung eines teuren und komplizierten Ablesegeräts erforderlich macht.
• Die Zählung von Teilchen, die beispielsweise in dem Artikel "C. G. Magnusson, P. L. Masson, Journal of Allergy Clin. and Immunol., 70 (1982), Seite 326" beschrieben ist, macht in gleicher Weise die Verwendung einer komplexen und teuren Apparatur erforderlich, die sich nur wenige Laboratorien leisten können.
• Die Messung der Opacität im sichtbaren Bereich, auch als "Turbidimetrie im sichtbaren Bereich" bezeichnet, mißt das Licht, das durch die Teilchensuspension durchgelassen wird, d. h. das Licht, das durch die Teilchen weder absorbiert noch durch sie gestreut wird. Die Opacität oder Turbidimetrie von qualitativen oder quantitativen Latex-Immunoassays muß bei einer Wellenlänge durchgeführt werden, die ziemlich nahe der Größe der Teilchen ist.
• Die Gültigkeit der turbidimetrischen Messung bedingt sehr verdünnte Suspensionen, um den gewünschten Filtereffekt sichtbar machen zu können, wie er in der Zusatzanmeldung Nr. 78 28 250 zum französischen Patent Nr. 77 250 49 beschrieben ist, um die Lichtabsorption durch die Teilchen zu minimieren.
• Bei den turbidimetrischen (oder opacimetrischen) Messungen von Latex-Immunoassays im sichtbaren Bereich, wie sie in der Literatur beschrieben werden (z. B. A. M. Bernard, R. R. Lauwerys (1982), Clinica Chemica Acta, 119, Seiten 335 bis 339) werden entsprechend der Größe der Teilchen unterschiedliche Wellenlängen des sichtbaren Bereichs verwendet, beispielsweise 360, 400 und 450 nm und - allgemeiner - zwischen 600 und 750 nm. Die Präzision der turbidimetrischen Ergebnisse ist mäßig, denn die Teilchensuspensionen müssen sehr verdünnt sein, um - wie angegeben wird - die gewünschten Variationen des Filtereffekts zu erhalten und die Absorption der Latices zu minimieren. Außerdem müssen im allgemeinen bei der Durchführung dieser Messungen zur Erhöhung der Präzision des Ergebnisses Ablese-Küvetten verwendet werden, für die wichtig ist, daß ihr optischer Weg in der Größenordnung von 2 bis 4 cm liegt.
• Um stärker konzentrierte Latex-Suspensionen zu verwenden und die Präzision der Dosierungen zu verbessern und um nicht an die Latex-Absorption im sichtbaren oder im ultravioletten Bereich gebunden zu sein, empfehlen das französische Patent FR-A 77/25 049 und sein Zusatzpatent FR-A 78/28 250 zur Ablesung der Teilchen die Opacimetrie im infraroten Bereich. Tatsächlich absorbieren die Latices kein Licht mehr im infraroten Bereich.
• Das US-Patent Nr. 4,203,724 schlägt in gleicher Weise vor, das Ergebnis der Agglutination der Mikroteilchen im infraroten oder fernen infraroten Bereich abzulesen, um nicht durch die tatsächliche Absorption der Mikroteilchen gebunden zu sein, die im ultravioletten oder sichtbaren Bereich erfolgt. Gemäß diesem Verfahren wird eine Opacimetrie der Aggregate der genannten Teilchen im infraroten Bereich durchgeführt, wobei man eine Opacimetrie im infraroten Bereich durchführt, was - wie bereits angegeben - eine teure und komplizierte Apparatur erfordert.
• Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur einfachen und neuen Ablesung des Ergebnisses der spezifischen (immunologischen) Agglutination der Mikroteilchen vorzuschlagen.
• Die wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist also die Beseitigung der zahlreichen Nachteile (der Phasen II und III), wie sie vorstehend aufgezeigt wurden, durch die Durchführung eines Verfahrens und die Bereitstellung einer einfachen und neuen Vorrichtung zur Agglutination und durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Ablesung des Ergebnisses, das in gleicher Weise einfach und neu ist, indem man diesen Typ einer Dosierung im Rahmen eines sehr einfach durchzuführenden, sehr schnell und auch für ein Labor erschwinglichen Verfahrens durchführt.
• Das Verfahren zur Dosierung von klinisch interessanten, immunologisch reaktiven Substanzen gemäß der Erfindung ist also von dem Typ, gemäß dem man
• - zuerst eine immunologisch aktive Substanz, die die Rolle eines Dosier-Reagens spielt, auf natürliche oder synthetische Mikroteilchen aufträgt;
• - die Mikroteilchen mittels der klinisch interessanten, immunologisch reaktiven Substanz agglutiniert; und
• - durch Ablesen das aus der Agglutinationsreaktion hervorgegangene Ergebnis mißt, welches man mit einer Eichskala vergleicht.
• Das Verfahren zur Dosierung gemaß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß sich die Phase der Agglutination in der Weise vollzieht, daß man die beaufschlagten Mikroteilchen einer periodischen Bewegung einer Frequenz zwischen 4 und 40 Hz, vorzugsweise 20 Hz, unterwirft, wobei die Amplitude zwischen einigen Millimetern und einigen Centimetern, vorzugsweise in der Größenordnung von 4 mm, schwankt. In der Tat hat man festgestellt, daß dann, wenn die Frequenz unterhalb von 4 Hz war, dies den Vorteil der Verfahrensweise insoweit verringert, als man die Dauer der Agglutinationsphase verlängert, um ein brauchbares Resultat zu erhalten, und in der Weise, daß die gefundene Wirkung in Anbetracht der nicht spezifischen Agglutination mäßig wird. Wenn andererseits die Frequenz oberhalb von 40 Hz liegt, wird dadurch eine Auflösung der gebildeten Aggregate (Immunkomplexe) durch die agglutinierten Mikroteilchen hervorgerufen.
• Wie aus der vorangehenden Beschreibung ersichtlich wurde, wird in der Agglutinationsphase (Phase II des Verfahrens) als Mittel zur Agglutination gemäß der Erfindung ein mechanisches Verfahren verwendet, um all die Nachteile der chemischen Verfahren, die oben im Hinblick auf eine Verringerung der nicht spezifischen Agglutination der Teilchen oder eine Erhöhung der immunologischen Agglutination der Teilchen beschrieben wurden, zu überwinden. Das mechanische Verfahren erreicht gleichzeitig diese beiden Ziele.
• Dieses mechanische Verfahren basiert auf der Beobachtung, daß die nicht spezifische Agglutination, die mit schwachen Wechselwirkungen zwischen den Teilchen (Bindungen des Typs ionischer Bindungen, Wasserstoffbindungen, Van-der-Waals-Bindungen) verbunden ist, unmöglich gemacht oder stark inhibiert wird durch eine auf die Teilchen ausgeübte periodische Bewegung einer sehr schwachen Amplitude und einer sehr hohen Frequenz, wie auch immer der Verlauf der periodischen Bewegung sei (beispielsweise im wesentlichen geradlinig, kreisförmig oder oval). Es konnte in gleicher Weise gezeigt werden, daß eine derartige Vorgehensweise die spezifische (immunologische) Agglutination der Mikroteilchen, die das Antigen oder den entsprechenden Antikörper tragen, besonders begünstigt und damit eine spezifische, schnelle und überdies bei Umgebungstemperatur durchgeführte Reaktion ermöglicht.
• Die vorliegende Erfindung hat in gleicher Weise zum Gegenstand ein Verfahren zur Dosierung klinisch interessanter, immunologisch reaktiver Substanzen des Typs, gemäß dem man
• - zuerst eine immunologisch aktive Substanz, die die Rolle eines Dosier-Reagens spielt, auf Mikroteilchen aufbringt;
• - die Mikroteilchen mittels der klinisch interessanten, immunologisch reaktiven Substanz agglutiniert;
• - durch Ablesen das aus der Agglutinationsreaktion hervorgegangene Ergebnis abschätzt, welches man mit einer Eichskala vergleicht, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß sich die Phase der Ablesung des Ergebnisses in der folgenden Weise vollzieht:
• - zuallererst bestimmt man durch Aufnahme des ultraviolett-sichtbaren Absorptionsspektrums das Absorptionsmaximum der Teilchen bei ultraviolett-sichtbarem Licht für eine Suspension der nicht agglutinierten Mikroteilchen in flüssigem Milieu, wobei die Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum entspricht, mit λmax bezeichnet wird;
• - danach fährt man nach der immunologischen Agglutinationsreaktion und nach Durchführung einer geeigneten Verdünnung in der Weise fort, daß man das Ergebnis mittels Absorptions-Spektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich abliest, wobei man in der Nähe der wie vorstehend beschrieben bestimmten Wellenlänge λmax bleibt.
• Es ist überraschend, daß man in dieser Phase der Ablesung so vorgehen kann, daß man sich der Absorption der Latexteilchen im ultraviolett-sichtbaren Bereich bedient, insbesondere da die Mikroteilchen Latexteilchen sind, insbesondere in Anbetracht der Tatsache, daß das vorstehend genannte Zusatzpatent FR-A 78/28 250 dieses Phänomen als größeren Nachteil beschrieb. Es scheint so, daß in dem Verfahren zur Ablesung gemäß der Erfindung die wahre Absorption des ultravioletten und sichtbaren Lichts durch die Teilchen selbst ausgenutzt wird, während die turbidimetrischen (opacimetrischen) Verfahrensweisen nur eine scheinbare Absorption der Teilchensuspension messen, d. h. gerade das Licht, das durch die Teilchen nicht absorbiert wird.
• In der Tat hat man beobachtet - und dies ist eines der charakteristischen Merkmale der Erfindung -, daß ein Mikroteilchen aus einem synthetischen Polymer, das das ultraviolettsichtbare Licht absorbieren kann und dessen Größe zwischen 0,01 und 5 um schwanken kann, und je nach Größe und chemischem Aufbau (z. B. Polystyrol, Polyvinyltoluol, Acrylnitril, Styrolbutadien, Copolymere aus Acrylnitril, Acrylsäure und Acrylester, Polyvinylbutadien) ein charakteristisches Absorptionsmaximum des ultraviolett-sichtbaren Lichts mit einem Extinktionskoeffizienten zeigt, der von der Wellenlänge abhängt. Außerdem wurde gezeigt - und diese Beobachtung wird in dem Verfahren zur Ablesung gemäß der Erfindung eingesetzt -, daß dann, wenn man eine Messung in einer wäßrigen Suspension dieser nicht agglutinierten Mikroteilchen durch Absorptions-Spektrophotometrie bei der Wellenlänge λmax durchführt, die dem Absorptionsmaximum des ultraviolettsichtbaren Lichts der nicht agglutinierten Mikroteilchen entspricht (wobei λmax charakteristisch für ein gegebenes Mikroteilchen ist), das Ergebnis überhaupt nicht oder nur sehr schwach durch die Gegenwart von Aggregaten (oder Agglutinaten) dieser selben Mikroteilchen in dem Milieu beeinflußt wird. Denn die Aggregate dieser Mikroteilchen absorbieren je nach ihrer Größe das ultraviolett-sichtbare Licht bei diesem Wert von λmax nicht mehr, wenn ihre Absorptionsmaxima stark verschieden sind von dem Wert λmax, wie er vorstehend definiert wurde.
• Andererseits wurde gezeigt, daß eine Messung der ultraviolett-sichtbaren Absorption einer wäßrigen Suspension der genannten nicht agglutinierten (monomeren) Mikroteilchen durch Spektrophotometrie dem Lambert-Beer'schen Gesetz gehorcht. Dies gilt auch für sehr erhöhte Teilchenkonzentrationen, was ein praktischer Vorteil im Verhältnis zum Prinzip der turbidimetrischen Messungen ist, die sehr verdünnte Suspensionen erfordern.
• In der Praxis ist von Vorteil, daß
• - die periodische Bewegungsbahn von beliebiger Natur sein kann, jedoch mit Vorteil kreisförmig, geradlinig oder oval ist;
• - die Agglutinationsphase bei Umgebungstemperatur abläuft;
• - die den Mikroteilchen auferlegte Dauer der periodischen Bewegung während der Agglutinationsphase eine Funktion der Frequenz der Vibration, der Bewegungsbahn und der Amplitude der Bewegung ist; sie beträgt vorteilhafterweise 10 min bei einer Frequenz von 20 Hz und einer periodischen Kreisbewegung bei einem Kreisdurchmesser von 4 mm;
• - die Mikroteilchen, die für die spektrophotometrische Ablesung der ultraviolettsichtbaren Absorption geeignet sind, aus natürlichen oder synthetischen Stoffen beliebiger absorbierender Natur, insbesondere aus Polystyrol, Polyvinyl-toluol, Acrylnitril, Styrolbutadien, Copolymeren aus Acrylnitril, Acrylsäure und Acrylester und Polyvinylbutadien und vorzugsweise aus Polystyrol bestehen;
• - die Mikroteilchen von beliebiger Form sind, jedoch mit Vorteil in Form von Mikrokugeln vorliegen;
• - der Durchmesser der natürlichen oder synthetischen Mikrokügelchen zwischen 0,01 und 5 um und vorzugsweise nahe bei 0,8 um liegt;
• - die Mikroteilchen aus einem absorbierenden, jedoch nicht farbigen Material bestehen; und
• - es möglich ist, absorbierende Mikroteilchen zu verwenden, die farbig sind; in diesem Fall erfolgt die Ablesung des Ergebnisses der ultraviolett-sichtbaren Absorption durch Spektrophotometrie entweder bei einer Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum des Materials des nicht agglutinierten Teilchens (λmax) entspricht oder bei der Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum der Farbe des betrachteten Teilchens entspricht;
• Die Erfindung betrifft in gleicher Weise eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Diese Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens die folgenden Teile umfaßt:
• - eine erste Reihe von Röhrchen, die wenigstens eine lyophilisierte Eichprobe der zu dosierenden Substanz umfassen;
• - eine zweite Reihe von Röhrchen, die eine immunologisch aktive, die Rolle eines Dosierreagens spielenden Substanz umfassen, die auf Mikroteilchen aufgezogen ist, wobei die als Reagens bezeichnete Suspension in flüssiger Phase vorliegt und die auf das Gewicht bezogene Konzentration der Mikroteilchen zwischen 0,1 und 10% liegt;
• - eine dritte Reihe von Röhrchen, die eine lyophilisierte Probe der Lösung einer Verdünnung der Eichprobe umfassen.
• Die Art und Weise, in der die Erfindung realisiert werden kann, und die Vorteile, die sich daraus ergeben, zeigen sich besser aus dem nachfolgenden Anwendungsbeispiel, das zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung angegeben wird, zusammen mit den beigefügten Figuren. Es zeigen:
• - Fig. 1 ein repräsentatives Diagramm des immunologischen Phänomens, das man sich erfindungsgemäß zunutze macht;
• - Fig. 2 ein repräsentatives Diagramm des Absorptionsspektrums im ultraviolettsichtbaren Bereich einer wäßrigen Suspension von (nicht agglutinierten) Mikrokügelchen aus (nicht gefärbtem) Polystyrol mit einem Durchmesser von 0,8 um;
• - Fig. 3 ein repräsentatives Diagramm von Absorptionsspektren im ultraviolettsichtbaren Bereich von Mikrokügelchen aus Polystyrol mit einem Antikörper (nicht gefärbt) mit einem Durchmesser von 0,8 um, die nicht agglutiniert sind (Kurve I) und agglutiniert sind, mit zunehmenden Konzentrationen von 50 ng/ml (Kurve II), 100 ng/ml (Kurve III), 500 ng/ml (Kurve IV) und 1 ug/ml (Kurve V) des entsprechenden Antigens;
• - Fig. 4 ein repräsentatives Diagramm einer Dosierung von menschlichen Immunogamma-globulinen G nach dem Verfahren gemäß der Erfindung;
• - Fig. 5 ein Diagramm, das die Absorptionsspektren im ultraviolett-sichtbaren Bereich einer wäßrigen Suspension von Mikrokügelchen aus rotem Polystyrol mit einem Durchmesser von 0,8 um veranschaulicht;
• - Fig. 6 ein Diagramm, das die Absorptionsspektren im ultraviolett-sichtbaren Bereich einer wäßrigen Suspension von nicht gefärbten Mikrokügelchen aus Polystyrol einerseits und gelben Mikrokügelchen aus Polystyrol andererseits mit einem Durchmesser von 0,8 um veranschaulicht; die Konzentration an Mikrokügelchen ist in beiden Fällen die gleiche;
• - Fig. 7 eine Ansicht des unterteilten Kastens, der im Zusammenhang mit dem Verfahren zur Durchführung der Erfindung steht.
• Das folgende Beispiel steht im Zusammenhang mit der Dosierung von Antigenen mittels Antikörpern, die auf Mikrokügelchen aufgebracht sind. Es versteht sich, daß das Verfahren auch genauso gut durchgeführt werden kann für die Dosierung von Antikörpern mittels Antigenen, indem man derselben Verfahrensweise folgt, jedoch die Antigene durch die Antikörper ersetzt und umgekehrt.
• Vor der Dosierung im engeren Sinn bringt man zuerst die Antikörper auf die sortierten synthetischen Mikrokügelchen auf, die in gleicher Weise mit "Latex" bezeichnet werden. Diese sind beispielsweise aus Polystyrol, Polyvinyltoluol, Acrylnitril, Styrolbutadien, einem Copolymer aus Acrylnitril, Acrylsäure und einem Acrylester und Polyvinylbutadien hergestellt. Latex-Teilchen K 140, K 109, K 610, ψ 512, ψ 513, ψ 480, ψ 502 (-COOH) oder ψ 169 oder ψ 181 (-CONH&sub2;), die unter diesen Handelsbezeichnungen von der Firma Rhone-Poulenc vertrieben werden, eignen sich beispielsweise sehr gut für das Verfahren.
• Die Aufbringung der Antikörper auf die synthetischen Mikrokügelchen erfolgt in an sich bekannter Weise, d. h. durch ionische, hydrophobe oder kovalente Bindung.
• Bezüglich der Erwähnung von Bindungen des ionischen oder hydrophoben Typs von Antikörpern an die Latex-Mikrokügelchen ist festzustellen, daß diese Bindungen, die auf an sich bekannte Weise durch einfachen Kontakt des Proteins mit dem Träger hergestellt werden, Phänomenen der Lockerung der Proteine vom Träger unterliegen, die in gleicher Weise auch "Ausfällung" genannt werden. Einer der Gründe für die Phänomene der Ausfällung besteht darin, daß ein permanenter Austausch zwischen der Population von Antikörpern des Typs Immuno-gamma-globuline G, die so fixiert sind, und der Population der Immono-gamma-globuline G existiert, die häufig in der zu analysierenden Probe zugegen sind.
• Vorteilhafterweise sind die Verfahren der kovalenten Fixierung zuverlässig und bei diesem Typ Verfahren zur immunologischen Dosierung bevorzugt. Die Verfahren zur kovalenten Fixierung eines Antikörpers oder Antigens auf synthetischen Mikrokügelchen oder auf Latex sind wohlbekannt, so daß es nicht erforderlich ist, sie an dieser Stelle genauer zu beschreiben. Wenn man in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Fixierung des kovalenten Typs durchführt, bezieht man sich vorteilhafterweise auf ein Verfahren zur Fixierung, das in dieser Art von Anwendung bisher nicht beschrieben wurde und gute Ergebnisse liefert. Gemäß diesem Kupplungsverfahren sind die funktionellen Reste, die auf den Mikrokügelchen zugegen und mobilisiert sind, hauptsächliche die folgenden: -COOH, -CONH&sub2;, -CONH, -NH&sub2; und -COOCH&sub3;. Die Reste werden in Acylazido-Reste durch das nachfolgend beschriebene Verfahren überführt, wobei der Azido-Rest mit den Resten -NH&sub2;, -SH oder -OH der biologischen Moleküle (Antigene oder Antikörper) reagiert, die man aufbringen will.
• Beispielsweise werden die Latices mit der Bezeichnung ψ 169 und ψ 181 zuallererst mit Hydrazin in Lösung und danach mit Natriumnitritdämpfen unter milden Reaktionsbedingungen behandelt, bevor sie mit einer Poly-L-Lysin-Antikörpermischung in Kontakt gebracht werden. Die carboxylierten Latices ψ 480 oder ψ 502 werden mit Methanol/Säure carboxymethyliert und danach in Lösung mit Hydrazin und anschließend mit Natriumnitritdämpfen unter milden Reaktionsbedingungen behandelt, bevor sie auf einen geeigneten Träger mit einer Poly-L-Lysin-Antikörpermischung aufgebracht werden.
Beispiel
• Aufbringung menschlicher Anti-Immuno-gamma-globulin-G-Antikörper und menschlicher Anti-β2-Mikroglobulin-Antikörper auf Polystyrolmikrokügelchen ψ 480 und ψ 502 (Hersteller: Firma Rhone-Poulenc) mit einem Durchmesser von 0,8 bzw. 0,85 um
• Diese Aufbringung erfolgte entsprechend verschiedener Phasen, die nachfolgend aufgeführt werden:
• - Methylierung der Carboxylgruppen des Latex: die Veresterung der freien Carboxylgruppen des Latex erfolgte in einem angesäuerten Methanol-Bad über wenigstens 3 und maximal 10 Tage, wobei sich ein Sättigungsniveau im allgemeinen bei einem Mittelwert von 5 Tagen einstellte;
• - energisches Spülen mit Wasser;
• - Behandlung der carboxymethylierten Latex-Teilchen mit Hydrazin während 1 bis 15 Stunden unter Rühren bei 20ºC;
• - energisches Spülen mit Wasser bei 0ºC;
• - Behandlung mit Natriumnitritdämpfen, die mit Chlorwasserstoffsäure angesäuert waren (milde Reaktionsbedingungen), wobei die Bestandteile der Mischung und die Mischung frisch hergestellt wurden und die Reaktion bei 0ºC durchgeführt wurde;
• - energisches Spülen mit einem Kupplungs-Puffer;
• - Aufbringen der Antikörper-Poly-L-Lysin-Mischung; das auf diese Weise an den Latex-Antikörper gekuppelte Poly-L-Lysin hat eine Sättigungswirkung auf die Stellen der Bindung für die Aufbringung (-CON&sub3;) und stabilisiert das Reagens sterisch während seiner Konservierung; die Mengenverhältnisse Antikörper-Poly-L-Lysin schwanken entsprechend der gewünschten Antikörperanreicherung auf den synthetischen Mikrokügelchen und entsprechen der Frage, ob man den rechten oder linken Teil, bezogen auf den Äquivalenzpunkt, der Kurve verwenden möchte, die in Fig. 1 wiedergegeben ist; es ist anzumerken, daß das Verfahren gemäß der Erfindung die Verwendung des rechten und genauso gut des linken Teils der genannten Kurve ermöglicht;
• - Desorption der durch ionische Bindung (KCl 3 M über 15 Minuten) und durch hydrophobe Bindung (KSCN 1 M über 10 Minuten) fixierten Antikörper;
• - Spülen; und
• - Einlagerung.
• Es versteht sich, daß dann, wenn die funktionellen Gruppen der Teilchen -CONH&sub2; (Beispiel: ψ 169 und ψ 181) oder -COOCH&sub3; sind, die Hydrazin-Phase die erste Phase des Aufbringungsverfahrens darstellt.
• Die folgende Phase entspricht der Phase der Agglutination der Mikrokügelchen, die in der folgenden Weise durchgeführt werden kann. Man unterwirft die Latex-Mikrokügelchen einer periodischen Kreisbewegung der Frequenz 20 Hz und einer Amplitude von 4 mm während einer Dauer von 10 Minuten. Dieser Reaktionsschritt erfolgt bei Umgebungstemperatur, woraus sich eine bemerkenswerte Reduktion der Apparatur ergibt (kein Wasserbad oder anderer Typ einer Vorrichtung zum Aufheizen). Der so durchgeführte Agglutinationsschritt erlaubt eine starke Zurückdrängung der nicht spezifischen Agglutinationen der Teilchen. Tatsächlich ist die Effizienz dieses Schrittes auf die nicht spezifische Agglutination der Teilchen sehr groß: Die nicht spezifische Agglutination liegt dann, wenn man eine der vorbeschriebenen Verfahrensweisen wählt, d. h. die Durchführung der Reaktion bei 37ºC über eine halbe Stunde im Wasserbad unter herkömmlichem Rühren, in der Größenordnung von 30 bis 40%. Die nicht spezifische Agglutination gemäß dem Verfahren, das im Rahmen der Erfindung beschrieben wurde, schwankt bei einem Wert von nur 2 bis 5%.
• Außerdem erfordert dieses Verfahren nicht die Stabilisation der Teilchen durch Rinderalbumin oder irgendein anderes ionisches Mittel, das bei stark basischen pH-Werten oder sehr sauren pH-Werten, die mit der Konservierung der Reaktanden nicht verträglich sind, elektronegativ oder elektropositiv gehalten wird.
• Das Verfahren ermöglicht also auf konsequentem Weg das Halten des Reagens und der Eichprobe bei physiologischen pH-Werten (nahe 7) und sichert so eine sehr gute Integrität und ausgezeichnete Konservierung der Bestandteile. Es ist festzustellen, daß ein weiterer Vorteil darin liegt, die Verwendung stabilisierender Proteinsubstanzen zu vermeiden, wie dies das Verfahren erlaubt. Tatsächlich sind stabilisierende Proteinsubstanzen wie beispielsweise Albumin Quellen einer bakteriellen Kontamination, die sehr störend bei einem industriell verwendeten Reagens ist, bevor es mehrere Monate konserviert wird.
• Darüber hinaus ermöglicht das oben beschriebene Verfahren gleichzeitig mit einer sehr deutlichen Verringerung der nicht spezifischen Agglutination der Teilchen eine bemerkenswerte Erhöhung der spezifischen immunologischen Agglutination der Teilchen.
• Ein Sättigungsniveau bei der immunologischen Agglutination der Mikrokügelchen wird schnell in etwa 10 Minuten erreicht. Eine derart kurze Inkubationsdauer impliziert andererseits nicht eine lästige Zeitnahme bei der anfänglichen Zugabe des Reagens oder in der Phase des Stoppens der Reaktion, abgesehen davon, daß sie für den Anwender sehr interessant ist, der ein Dosierungsergebnis extra schnell erhält. Darüber hinaus ist die Effizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die spezifische Agglutination so, daß das Rühren bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden kann, was - wie bereits vorstehend ausgeführt wurde - die Anwendung von Wärmevorrichtungen oder Wasserbädern erübrigt, woraus ein erheblicher Vorteil resultiert und was nennenswert zur Bequemlichkeit beiträgt.
• Erfindungsgemäß hat man also experimentell verwirklicht, daß die nicht spezifische Agglutination, die mit schwachen Wechselwirkungen zwischen den Teilchen (Bindungen des Typs ionische Bindung, Wasserstoffbindung, Van-der-Waals-Bindung) verbunden ist, unmöglich gemacht wird oder stark inhibiert wird durch eine periodische Bewegung, die auf die Teilchen mit sehr schwacher Amplitude und sehr großer Frequenz ausgeübt wird, wobei der Verlauf der Bewegung periodisch ist (beispielsweise etwa geradlinig, kreisförmig oder oval). In gleicher Weib wurde verwirklicht, daß ein solches Verfahren bemerkenswerterweise die spezifische (immunologische) Agglutination der synthetischen Mikrokügelchen, die das Antigen oder den Antikörper tragen, in Gegenwart des entsprechenden Antigens oder Antikörpers begünstigt. So wird eine spezifische, schnelle und bei Raumtemperatur wirksam ablaufende Reaktion ermöglicht.
• Wenn der Agglutinationsschritt durchgeführt wird, bewirkt man eine Verdünnung des Inkubationsmilieus, das die Mikrokügelchen enthält, mit Wasser bis zu einem Volumen von 1 bis 4 ml. Die Verdünnung kann bewirkt werden mit Wasser, einer Kochsalzlösung oder jeder beliebigen anderen passenden Pufferlösung. Das Volumen des Verdünnens entspricht dem einer herkömmlichen Spektrophotometrie-Küvette der Dimension 1·1 cm.
• Danach folgt der Schritt der Ablesung und Messung. Tatsächlich führte man früher in der Agglutinationsphase im engeren Sinn die Messung der Absorptionsspektren im ultraviolettsichtbaren Bereich für eine wäßrige Suspension der nicht gefärbten, nicht agglutinierten Polystyrol-Mikrokügelchen mit dem Ziel durch, das Absorptionsmaximum der Teilchen im ultraviolett-sichtbaren Bereich des Lichts zu bestimmen, wobei λmax die Wellenlänge war, die dieses Absorptionsmaximum wiedergab. Es wurde gezeigt, daß das Absorptionsmaximum λmax, das charakteristisch für ein gegebenes natürliches oder synthetisches Mikrokügelchen ist, identisch ist, unabhängig davon, ob das Mikrokügelchen mit einem Antikörpermolekül oder Antigenmolekül versehen ist oder nicht. Als Beispiel stellt Fig. 2 das Absorptionsmaximum einer konzentrierten Suspension von nicht gefärbten Mikrokügelchen aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 0,8 um im ultraviolett-sichtbaren Bereich dar, wobei das Spektrum identisch ist, wenn die Mikrokügelchen mit einem Antikörper oder einem Antigen versehen sind oder nicht.
• Es ist festzuhalten, das das Gesetz von Mie (Intensität des diffundierten Lichts gegen die Zeit) eine leichte Senkung des Absorptionspeaks hervorruft, da die Diffusion des Lichts gegen die Zeit ein Phänomen ist, das dem Phänomen der Absorption invers ist.
• Nachdem die Wellenlänge λmax so bestimmt wurde, folgt nach dem immunologischen Agglutinationsschritt die Ablesung des Ergebnisses durch Absorptions-Spektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich, wobei man in der Nähe der wie vorstehend beschrieben bestimmten Wellenlänge λmax bleibt. In dem beschriebenen Beispiel hat λmax einen Wert von 380 nm.
• Die Erfahrung zeigt, daß die so gemäß der Erfindung durch Absorptions-Spektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich erhaltenen Ergebnisse einzig und allein die Absorption der Monomere der Mikrokügelchen anzeigen, wobei die Peak-Amplitude (Absorptionsgrad, optische Dichte, Prozentwert der Transmission) proportional zur Konzentration an Mikrokügelchen-Monomeren im Medium ist (Lambert-Beer'sches Gesetz).
• Nun ist es andererseits bei diesem Dosierungstyp bekannt, daß sobald einmal die Reaktion der immunologischen Agglutination abgeschlossen ist, die Konzentration an nicht agglutinierten Restmonomeren proportional zum Logarithmus der Anfangskonzentration an Antigen im Medium ist.
• Das Ergebnis der Ablesung der Reaktion durch Absorptions-Spektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich in der Nähe des Wertes λmax der Absorption der Monomeren der nicht agglutinierten Mikrokügelchen ist also proportional zum Logarithmus der Anfangskonzentration an Antigen im Medium. Es ist festzustellen, daß dieses Verfahren bei beliebiger Natur des Polymeren, insbesondere bei den Polymeren, die vorstehend genannt wurden, und bei beliebiger Größe der Teilchen und ihrer Färbung anwendbar ist. Wenn die Latex-Teilchen farbig sind, kann man die Ablesung entweder beim Wert λmax des Teilchens oder beim Wert λmax der Farbe dieses Teilchens vornehmen. Tatsächlich zeigen im Fall gefärbter Latices die Absorptionsspektren im ultraviolett-sichtbaren Bereich zwei Peaks, von denen der eine der Absorption des Materials (unabhängig von der Farbe) entspricht und der andere der Färbung dieses Materials entspricht.
• Dies wird in Fig. 5 veranschaulicht, die zeigt, daß das Absorptionsspektrum im ultraviolettsichtbaren Bereich des Lichts für rote Mikroteilchen aus Polystyrol zwei Peaks für das Absorptionsmaximum zeigt. Der erste Peak bei 380 nm entspricht dem Absorptionsmaximum der Substanz der Mikroteilchen. Der zweite Peak bei 560 nm für rote Mikroteilchen entspricht dem Absorptionmaximum der Farbe dieser Substanz.
• Das Phänomen kann verwendet werden, um tatsächlich eine Synergie zwischen den beiden Absorptionsmaxima zu erhalten, wie dies in Fig. 6 wiedergegeben ist. Tatsächlich sind in diesem Diagramm zwei Absorptionsspektren des ultraviolett-sichtbaren Lichts von Mikroteilchen aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 0,8 um wiedergegeben. Das erste Spektrum gibt die Absorption der nicht gefärbten Mikroteilchen wieder, während das zweite Spektrum die Absorption der gelb gefärbten Mikroteilchen wiedergibt. Die Mikroteilchen- Konzentration ist in beiden Fällen die gleiche.
• Man beobachtet, daß das erste Spektrum einen Peak bei 380 nm zeigt, der der Wellenlänge des Absorptionsmaximums der Substanz der Mikroteilchen entspricht. Das zweite Spektrum zeigt in gleicher Weise einen Peak bei 380 nm, aber die Amplitude ist höher. Man weiß nun, daß die Wellenlänge des Absorptionsmaximums der Farbe Gelb bei etwa 380 nm liegt. In diesem Fall erzielt man also einen Synergie-Effekt zwischen dem Absorptionsmaximum der Substanz und dem Absorptionsmaximum der Farbe der Mikroteilchen. Dieser Synergie- Effekt ermöglicht für eine gleiche Konzentration Mikroteilchen eine Erhöhung der Präzision der Dosierung.
• Es versteht sich, daß man bei der praktischen Durchführung des Verfahrens ein Interesse daran hat, ein Mikroteilchen eines synthetischen Polymers zu wählen, dessen Natur, Größe und Farbe ein Absorptionsmaximum im ultraviolett-sichtbaren Bereich bei Wellenlängen aufweist, die nicht mit den störenden Wellenlängen wechselwirken, insbesondere nicht mit der Wellenlänge bei 280 nm, die der Absorption der Proteine entspricht. In vorteilhafter Weise werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise carboxylierte Mikrokügelchen aus nicht gefärbtem Polystyrol mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 0,8 um verwendet, deren Absorptionsmaximum im ultraviolett-sichtbaren Bereich bei etwa 380 nm liegt, wie bereits oben angesprochen wurde.
• Diese Wellenlänge geht keine Wechselwirkungen mit dem Absorptionsmaximum der Proteine ein, das bei 280 nm liegt. Diese Wellenlänge von 380 nm kann beispielsweise mittels eines Spektrophotometers oder Photometers selektioniert werden, indem man unterschiedslos eine im ultravioletten oder sichtbaren Bereich arbeitende Lampe verwendet, wobei in Betracht zu ziehen ist, daß der Wert von 380 nm an der Grenze des ultravioletten und sichtbaren Bereichs des Lichts liegt. Außerdem liegt die Ablesung einer Wellenlänge bei 380 nm im sichtbaren Bereich in dem Bereich, der mit normalen photometrischen oder spektrophotometrischen Geräten im Labor erfaßbar ist, woraus sich eine wichtige Vereinfachung hinsichtlich der für das Dosierungsverfahren erforderlichen Apparaturen ergibt.
• Andererseits zeigt die Erfahrung, daß das Absorptionsmaximum λmax charakteristisch für desagglutinierte Mikrokügelchen ist und daß die Agglutinate derselben Mikrokügelchen selbst dann, wenn sie von sehr geringer Größe sind, nicht mehr bei diesem Maximum absorbieren. Tatsächlich hat man beobachtet, daß die Aggregate von synthetischen Mikrokügelchen aus Polymeren ein charakteristisches Absorptionsmaximum im Bereich ihrer Größe aufweisen. Man hat in gleicher Weise beobachtet, daß die Agglutinate ein Absorptionsmaximum aufweisen, das umsomehr in Richtung der größeren Wellenlänge liegt, als ihre Größe wichtig ist. Fig. 3 zeigt (Pfeile) das Absorptionsmaximum von nicht gefärbten Mikrokügelchen aus Polystyrol, die mit einem Antikörper beaufschlagt sind, einen Durchmesser von 0,8 um aufweisen, nicht agglutiniert sind und bei denen die Absorptionsmaxima der Agglutinate mit der Größe dieser Mikroteilchen zunehmen. Man beobachtet
• - einerseits die Absorption der restlichen, nicht über das Antigen agglutinierten Mikrokügelchen (bei λmax), und
• - andererseits die Absorption der Aggregate mit zunehmender Größe, deren Bildung mit zunehmenden Antigenkonzentrationen induziert wird.
• Aus dem Vorstehenden ergibt sich klar, daß dann, wenn man durch Absorptions-Spektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich unter Verbleiben bei einer Wellenlänge, die dem Wert λmax der Absorption der nicht agglutinierten (monomeren) Mikroteilchen entspricht, die Ablesung einer Lösung bewirkt, die eine Mischung von monomeren Mikrokügelchen und Agglutinaten dieser Mikrokügelchen enthält, die so durchgeführte Messung nur die monomeren Teilchen betrifft und damit anzeigt, da nur diese Teilchen bei diesem Maximum eine Absorption zeigen.
• Diese neue Art der Ablesung gemäß der Erfindung zeigt im Vergleich zum vorstehend beschriebenen Stand der Technik zahlreiche Vorteile:
• - sie macht nicht die Verwendung sehr komplizierter und teurer Apparate wie beispielsweise die Verwendung von Teilchenzählern, Laser-Nephelometern oder Intrarot-Opacimetern erforderlich;
• - im Gegensatz zu den turbidimetrischen Verfahrensweisen im sichtbaren Bereich kann das Verfahren mit sehr hohen Teilchenkonzentrationen im Inkubationsmedium angewendet werden, was der Dosierung sehr hohe Präzisionswerte verleiht, die bei der Turbidimetrie (Opacimetrie) im sichtbaren oder nahen Infrarotbereich unmöglich zu erreichen waren. Beispielsweise zeigt die nachfolgende Tabelle I optische Dichten, die durch Ablesung bei Absorptionsspektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich als Ergebnis der Agglutination von nicht gefärbten Mikrokügelchen aus Polystyrol und Antikörper mit einem Durchmesser von 0,8 um erhalten worden waren, und zwar für zwei sehr niedrige entsprechende Antigenkonzentrationen. Tabelle I Anfängliche Antigenkonzentration Optische Dichte (Absorption im ultraviolettsichtbaren Bereich bei 380 nm)
• Die Wellenlänge von 380 nm entspricht dem Absorptionsmaximum bei ultraviolettsichtbarem Licht von monomeren, nicht agglutinierten Mikroteilchen.
• Der durch das Ableseverfahren gemäß der Erfindung zugelassene Grad an Präzision ermöglicht über den Einsatz eines Spektrophotometers die Verwendung von Ableseküvetten eines gängigen Modells (1·1 cm).
• Die in der vorstehenden Tabelle angegebenen Ergebnisse entsprechen einer Messung, die mittels einer herkömmlichen Ableseküvette mit einem optischen Weg von 1 cm durchgeführt wurde. Es bedürfte eines optischen Weges von 4 cm, um dieselbe Präzision bei einer turbidimetrischen Messung zu erhalten, was aus praktischer Sicht schwierig zu realisieren ist.
• Die Vorrichtung zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens umfaßt außer einem Absorptions-Spektrophotometer eines gängigen Modells einen in Fächer unterteilten Kasten und eine Einrichtung, um eine Vibrationsbewegung auf die die Mikrokügelchen enthaltende Lösung aufzubringen.
• Der in Fächer unterteilte Kasten, der in Fig. 7 wiedergegeben wird, weist die Form eines rechtwinkligen Parallelepipeds auf, hat die Ausmaße 13·6·4 cm und wird aus Kunststoffmaterial oder starrem Karton hergestellt. Er weist vier Fächer auf:
• - das erste Fach (1) umfaßt eine Mehrzahl von horizontal und parallel angeordneten Hämolyseröhrchen (4), die verschlossen und etikettiert sind und die Antigenkonzentration vermerkt enthalten; diese enthalten 2 bis 4 Eichproben in lyophilisierter Form;
• - das zweite Fach (2) umfaßt in gleicher Weise eine Mehrzahl horizontal und parallel angeordneter Hämolyseröhrchen (5), jedoch mit größerer Größe, die das gebrauchsfertige Reagens in Form der Antikörper enthalten, die auf Mikrokügelchen aufgebracht sind und in einem geeigneten Verdünnungsmittel aufgeschlämmt sind. Tatsächlich muß das Verdünnungsmittel die Konservierung der Antikörper sowie ihre Stabilität über die Zeit und ihre Unversehrtheit sichern. Die Zahl dieser Röhrchen beträgt vier pro Eichprobe, wobei diese 2,5 ml Reagens umfassen. Die Konzentration (bezogen auf das Gewicht) an Mikroteilchen in dem Reagens liegt vorteilhafterweise zwischen 0, 1 und 10% und besonders vorteilhaft zwischen 1 und 5%;
• - das dritte Fach (3) umfaßt eine Mehrzahl von verschlossenen Röhrchen (6) mit kleinem Durchmesser, die eine Probe der Verdünnungslösung der Eichprobe in lyophilisierter Form enthalten. Die Menge an Verdünnungslösung ist vorteilhafterweise die Menge, die zur Verdünnung einer biologischen Probe nötig ist, beispielsweise die Menge, die nötig ist, um die Verdünnung einer biologischen Probe, die bereits mit destilliertem Wasser verdünnt wurde, auf ein Zehntel der Konzentration zu bewirken; eine Menge von 0,45 ml oder 0,9 ml ist beispielsweise sehr gut passend;
• - das vierte Fach (8) umfaßt wenigstens ein Fläschchen (7) mit Konzentrat der Verdünnungsflüssigkeit.
• Das Mittel, das geeignet ist, um eine periodische Bewegung hoher Frequenz und schwacher Amplitude für die Mikrokügelchen sicherzustellen, umfaßt vorteilhafterweise einen Motor, von dem eine vertikale Achse ausgeht, die eine Nockenscheibe antreibt. Diese Nockenscheibe überträgt auf eine Platte, von der selbst ein Träger für parallel angeordnete Röhrchen ausgeht, eine periodische Bewegung hoher Frequenz und schwacher Amplitude sowie mit kreisförmigem Verlauf. Die Platte mit allgemein länglicher Form bleibt immer parallel zu ihrer Anfangsausrichtung. Das Mittel, das geeignet ist, eine periodische Bewegung sicherzustellen, umfaßt außerdem ein Gehäuse, auf dem man die Anzeige der Rotationsgeschwindigkeit des Motors und den Schalter zum Ingangsetzen anbringt. Die Amplitude der Bewegung ist im vorliegenden Fall auf 4 mm begrenzt, und die angezeigte Frequenz beträgt 20 Hz.
• Wenn man dann wünscht, mit der Dosierung einer Antigenlösung zu beginnen, beispielsweise der Dosierung von beta-2-Mikroglobulin in einem Niereninsuffizienz-Serum, entnimmt man vorab zuerst 50 ul an zu analysierendem Serum, dem man 45 ml destilliertes Wasser zusetzt. Dieser so hergestellten Lösung entnimmt man 50 ul, die man in eines der Röhrchen (6) des Fachs (3) gibt, dessen Inhalt man zuvor mit 0,45 ml destillierten Wassers rekonstituiert hat. Diese Mischung homogenisiert man auf klassische Weise. Danach entnimmt man diesem Röhrchen 50 ul, mischt diese mit 50 ul des gebrauchsfertigen Reagens, d. h. des entsprechenden Antikörpers, der auf die Mikrokügelchen aufgebracht ist und in einem der Röhrchen (5) des Fachs (2) zugegen ist und der zuvor homogenisiert worden war. Die auf das Gewicht bezogene Konzentration an Mikrokügelchen beträgt vorzugsweise etwa 1%.
• Die so gebildete neue Lösung wird auf den festen Träger auf die Platte gestellt, die bereits in Bewegung ist. Die Lösung wird dieser periodischen Bewegung für eine Dauer von 10 Minuten unterworfen, wobei die Frequenz der Vibration 20 Hz ist und die Amplitude 4 mm beträgt. Nachdem man diesen Agglutinationsschritt durchgeführt hat, kommt man zum Verdünnungsschritt. Das erhaltene Volumen wird von 100 ul auf 3,6 ml aufgefüllt, d. h. auf das Volumen, das dem Volumen der spektrophotometrischen Analysezelle entspricht. Den Inhalt des Röhrchens gießt man dann in die Ablesezelle einer Größe von 1·1 cm und führt eine spektrophotometrische Analyse der nicht agglutinierten Mikrokügelchen beim Absorptionsmaximum im ultraviolett-sichtbaren Bereich, in dem Fall bei 380 nm, durch, d. h. an der Grenze zwischen dem sichtbaren und ultravioletten Bereich des Lichts.
• Man kann in gleicher Weise die Ablesung durchführen, indem man die Hämolyseröhrchen unmittelbar in dem Spektrophotometer anordnet. Vorab wird eine der in dem Fach (1) des Kastens vorhandenen Eichproben verwendet, um die repräsentative Gerade (Eichgerade) der Beziehung zwischen der optischen Dichte und dem Logarithmus der Konzentration an Antigen zu bestimmen. Sobald einmal die optische Dichte der erhaltenen Lösung bestimmt ist, vergleicht man diese mit der Eichkurve und leitet daraus in extrem genauer Weise die Antigenkonzentration des Ausgangsserums ab.
• Fig. 4 ist eine Veranschaulichung einer Dosierung menschlicher Immuno-gamma-globuline G mit dem Verfahren und der Vorrichtung entsprechend der Erfindung. In diesem Beispiel wurde der rechte Teil, bezogen auf den Äquivalenzpunkt, der Kurve der Fig. 1, ausgenutzt. Der Korreiationskoeffizient mit der Laser-Nephelometrie, wie er für diese Dosierung bei zehn Seren und cephalorachidischen Flüssigkeiten erhalten wurde, liegt in der Nähe von 1.
• Die folgende Tabelle II ist eine Tabelle zum Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem Radioimmunoassay für die Dosierung von menschlichem beta-2- Mikroglobulin in normalen Seren, Niereninsuffizienzseren und Dialyseflüssigkeiten. Tabelle II Konzentration an B-2-Mikroglobulin (ug/ml) Erfindungsgemäßes Verfahren Radioimmunoassay
• Aus der vorliegenden Erfindung ergeben sich außer den bereits vorstehend genannten Vorteilen weitere Vorteile. Von diesen sind zu nennen:
• - die in situ, d. h. selbst auf dem Krankenbett, mögliche Dosierung, die bis zum heutigen Zeitpunkt ausgesprochen schwierig durchzuführen war aufgrund der Größe der zu ihrer Durchführung erforderlichen Apparatur;
• - eine sehr hohe Schnelligkeit der Durchführung des Verfahrens und der Bestimmung der Ergebnisse, und das mit großer Zuverlässigkeit; dies macht die Verfahrensdurchführung in der Biochemie und Pharmakologie, bei Notfällen und im Anschluß an Transplantationen möglich;
• - Möglichkeit der Durchführung der Analyse in allen üblichen Umgebungstemperaturbereichen.
• Die vorliegende Erfindung ist also insbesondere angepaßt an zahlreiche Bereiche von Forschung und Medizin, insbesondere im Bereich der Cancerologie, Hormonologie, Endokrinologie, klinischen Biochemie, Toxikologie und Mikrobiologie. Andererseits findet die Erfindung großes Interesse im Bereich der Pyretogenkontrolle in der pharmazeutischen Industrie sowie im Bereich der Hämodialyse.

Claims (13)

1. Verfahren zur Dosierung einer klinisch interessanten Substanz, die immunologisch reaktiv gegenüber anderen Substanzen desselben Typs ist (Dosieren eines Antigens mittels eines Antikörpers und umgekehrt), des Typs, gemäß dem man

- zuerst eine immunologisch aktive Substanz, die die Rolle eines Dosier-Reagenz spielt, auf natürliche oder synthetische Mikroteilchen aufbringt;

- die Mikroteilchen mittels der klinisch interessanten immunologisch reaktiven Substanz zum Dosieren agglutiniert;

- durch Ablesen das aus der Agglutinationsreaktion hervorgegangene Ergebnis abschätzt, welches man mit einer Eichskala vergleicht, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Phase der Ablesung des Ergebnisses in der Weise vollzieht, daß man

- zu allererst das Absorptionsmaximum der Teilchen bei ultraviolett-sichtbarem Licht für eine Suspension der nicht agglutinierten Mikroteilchen in flüssigem Milieu bestimmt, wobei die Bestimmung in der Weise durchgeführt wird, daß man das ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektrum der Suspension aufnimmt, wobei die Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum entspricht, mit λmax bezeichnet wird;

- danach das Ergebnis mittels Absorptionsspektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich nach der immunologischen Agglutinationsreaktion und einer Verdünnung des Inkubationsmediums, die in an sich bekannter Weise bewirkt wird, abliest, wobei man in der Nähe der wie vorstehend beschrieben bestimmten Wellenlänge λmax bleibt.

2. Verfahren zur Dosierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen, die zur spektrophotometrischen Ablesung der Absorption im ultraviolett-sichtbaren Bereich geeignet sind, natürliche oder synthetische Mikroteilchen beliebiger absorbierender Natur sind.

3. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen aus synthetischem Polymeren bestehen, die gewählt sind unter Vinyltoluol, Acrylnitril, Styrolbutadien, Acrylestern, Vinylbutadien, Polystyrol und Acrylnitril-Acrylsäurederivaten.

4. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen in Form von Mikrokügelchen vorliegen.

5. Verfahren zur Dosierung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokügelchen sortiert sind und einen Durchmesser zwischen 0,01 und 5 um einschließlich aufweisen.

6. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen nicht gefärbt sind.

7. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroteilchen gefärbt sind, wobei die Ablesung des Ergebnisses durch Absorptionsspektrophotometrie im ultraviolett-sichtbaren Bereich entweder über die Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum des Materials entspricht, aus dem das nicht agglutinierte Mikroteilchen besteht (λmax) oder über die Wellenlänge, die dem Absorptionsmaximum der Farbe des betrachteten Mikroteilchens entspricht, erfolgt.

8. Verfahren zur Dosierung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbe der Mikroteilchen in der Weise gewählt wird, daß man einen Synergieeffekt zwischen dem Absorptionsmaximum des Materials, aus dem das Teilchen besteht, und dem Absorptionsmaximum der Farbe des Teilchens erhält.

9. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension der Mikroteilchen eine wäßrige Suspension ist.

10. Verfahren zur Dosierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Agglutinationsphase in der Weise vollzieht, daß man die Mikroteilchen einer periodischen Bewegung mit einer Frequenz zwischen 4 und 40 Hertz einschließlich und einer Amplitude unterwirft, die von einigen Millimetern bis zu einigen Zentimetern wechselt.

11. Verfahren zur Dosierung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Verlauf der periodischen Bewegung kreisförmig, geradlinig oder unrund ist.

12. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Agglutinationsphase bei Umgebungstemperatur vollzieht.

13. Verfahren zur Dosierung nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Dauer der periodischen Bewegung die den Mikroteilchen während der Agglutinationsphase auferlegt wird, eine Funktion der Frequenz, des Verlaufs und der Amplitude der Bewegung ist und für eine Frequenz von 20 Hertz und eine Bewegung in einem Kreis von 4 mm Durchmesser in der Größenordnung von 10 Minuten liegt.