DD301620A9 - Mutierte mikrobielle alpha-amylasen mit erhoehter waerme-, saeure- und/oder alkalibestaendigkeit - Google Patents

Abstract

Wärmebeständige und säurebeständige alpha-Amylasen werden als genetisch manipulierte alpha -Amylase-Gene, die von Mikroorganismen, die vorzugsweise zur Klasse der Bacilli gehören, isoliert wurden, zur Verfügung gestellt. Sowohl chemische als auch enzymatische Mutagenesemethoden sind z. B. die Hydrogensulfitmethode und die enzymatische Fehleinfügung in gespaltene Heteroduplex DNA. Die mutierten alpha -Amylasen haben hervorragende Eigenschaften, z. B. verbesserte Wärmebeständigkeit über einen weiten pH-Bereich, für industrielle Anwendungszwecke bei der Stärkeverarbeitung und der Textilentschlichtung.

Description

Hierzu 25 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik und stellt neue DNA-Moleküle zur Verfügung, die für Enzyme mit a-Amylase-Aktivität kodierende DNA-Sequenzen aufweisen. Es werden speziell mutierte mikrobielle a-Amylasen mit verbesserten Charakteristika zur Anwendung beim Abbau von Stärke, für die Entschlichtung von Textilien und für andere industrielle Prozesse offenbart. Die vorgestellten a-Amylasen zeigen erhöhte Wärme-, Säure- und Alkalibeständigkeit, wodurch sie ideal für die Ausübung ihrer Aktivität unter bisher nicht anwendbaren Prozeßbedingungen geeignet sind.

Hintergrund der Erfindung

Stärke besteht aus einem Gemisch von Amylose (15 bis 30Ma.-%/Masse) und Amylopectin (70 bis 85 Ma.-%/Masse). Amylose besteht aus linearen Ketten von a-1,4-verknüpfien Glucoseeinheiten mit einer relativen Molekülmasse (MW) von etwa 60000 bis etwa 800000. Amylopectin ist ein verzweigtes Polymer, das a-1,6-Verzweigungspunkte je 24 bis 30 Glucoseeinheiten enthält, seine MW kann bis 100 Millionen betragen.

Zucker von Säure, in Form konzentrierter Dextrosesirupe, sind kürzlich hergestellt worden, und zwar mit Hilfe eines durch Enzym katalysierten Verfahrens, das umfaßt: (1) Verflüssigung (oder Verdünnen) von fester Stärke mit einer a-Amylase zu Dextrinen mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von etwa 7 bis 10, und (2) Saccharifikation der resultierenden verflüssigten Stärke (d. h. des Stärkehydrolysate) mit Amyloglucosidase (auch Glucoamylase oder AG genannt). Der resultierende Sirup hat einen hohen Glucosegehalt. Ein großer Teil des kommerziell erzeugten Glucosesirups wird anschließend enzymatisch zu einem als Isosirup bekannten Dextrose/Fructose-Gemisch isomerisiert.

a-Amylase (EC 3.2.1.1) hydrolysiert Stärke, Glycogen und verwandte Polysaccharide durch die willkürliche Spaltung interner a-1,4-glucosidischer Bindungen. Dieses Enzym wird für eine Reihe wichtiger kommerzieller Zwecke eingesetzt, zum Beispiel in der Zucker-, Brauerei-, Alkohol- und Textilindustrie. a-Amylasen werden aus den verschiedensten Bakterien-, Fungi-, Pflanzen- und Tie· queüen isoliert. Die industriell bedeutendsten a-Amylasen sind die von Bazillen isolierten.

In der ersten Stufe des Stärkeabbauprozesses wird eine Stärkeaufschlämmung durch Erwärmen auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur (bis zu 11O⁰C) gelatiniert. Die gelatinierte Stärke wird in einem kontinuierlichen 2-Stufen-Verfahren durch eine wärmebeständige a-Amylase verflüssigt und zu Dextrin abgebaut. Die wichtigsten Prozeßvariablen sind Stärkekonzentration, α-Amy lasedosis, Temperatur und pH-Wert. Während der Verf lüssigungs-Dextrinbildungs-Reaktion müssen die Prozeßvariablen zur Erzielung guter Umwandlungsverhältnisse innerhalb enger Grenzen gehalten werden, da sonst ernsthafte Filtrationsprobleme auftreten können. Siehe beispielsweise L. E. Coker und K. Venkatasubramanian, in: Biotechnology, S. 165 bis 171, Herausg. P. N. Cheremisinoff, P. B. Quelette, Technicom Publ. Corp. Lancaster Renn. 1985. Eines der häufig¹ auftretenden Probleme ist die einwandfreie Temperaturregelung im Anfangsstadium des Abbauprozesses: Überhitzung führt oftmals zur Denaturierung der a-Amylase, so daß das endgültige Verdünnen nicht ausreichend ist. Eine Möglichkeit, um das zu vermeiden, besteht in der Anwendung wärmebeständigerer a-Amylasen.

Zu diesem Zweck wurde die Zugabe von Calciumionen oder eines Amphiphils vorgeschlagen (siehe z. B. EP-A 0189838), aber diese Lösung hat sich als nicht zufriedenstellend erwiesen.

Es besteht daher immer noch ein erhebliches Interesse an der Bereitstellung von a-Amylasen mit erhöhter Wärmebeständigkeit.

Relevante Literatur

In EP-A 057976 wird die Isolierung eines wärmebeständigen a-Amylase kodierenden Gens von B.stearothermophilus beschrieben, wobei das Gen in ein entweder einen Bacillus oder einen E.coli-Ursprung für die Replikation enthaltendes Plasmid Moniert wird. Das auf diese Weise gewonnene schimärische Plasmid wird füi die Erzeugung von a-Amylase verwendet. Das a-Amylase-Gen wurde ohne irgendwelche weitere Modifikation isoliert und verwendet.

EP-A 0134048 beschreibt ein Verfahren für die erhöhte kommerzielle Produktion von unter anderem a-Amylase, indem ein oder mehrere a-Amylase-Gen(e) in industrielle Bacillus-Stämme kloniert oder exprimiert werden.

EP-A 252666 betrifft eine schimärische a-Amylase mit der allgemeinen Formel O-R-L, worin Q ein N-terminales Polypeptid von 55 bis 60 Aminosäuroresten ist, das zu mindestens 75% den 37 N-terminalen Resten der B. amyloliquefaciens a-Amylase homolog ist, R ein bestimmtes Polypeptid ist und L ein C-terminales Polypeptid von 390 bis 400 Aminosäureresten ist, das zu mindestens 75% den 395 C-terminalen Resten von B. licheniformis a-Amylase homolog ist.

Gray u.a. (J. Bacteriol., 1986,166,635) beschrieben schimärische a-Amylasen, die von dem NH2-terminalen Teil von

B. stearothermophilusc -Amylase und dem COOH-terminalen Teil von B. licheniformis-a-Amylase gebildet wurden. Von den

meisten der Hybridenzymmoloküle wurde nachgewiesen, daß sie weniger beständig als die Ausgangs-Wildtyp-Enzyme waren. Außerdem konnte von keinem aer Hybridmoleküle gezeigt werden, daß es verbesserte Bestandig'-eitseigenschaften bessß. In keiner der oben zitierten Literaturangaben wird die Anwendung von einzelnen Aminosäureau^riduschmöglichkeiten zur Gewinnung neuartiger a-Amylasen beschrieben.

EP-A 0285123 betrifft eine Methode für die vollständige Mutagenese von Nucleinsäuresaquenzen. Als Beispiel wirl die Mutagenese der B. stearothermophllus-a-Amylase beschrieben. Obwohl vermutlich die Möglichkeit besteht, daß uiese Methode zur Gewinnung von B.stearothermophilus-a-Amylase-Mutanten mit besserer Beständigkeit angewandt werden kann, werden keine Beispiele angeführt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft mutierte a-Amylasen und Möglichkeiten zur Gewinnung derartiger Mutanten. Diese mutierten a-Amylasen sind dadurch gekennzeichnet, daß sie sich in mindestens einer Aminosäure von dem Wildtyp-Enzym unterscheiden. Des weiteren werden diese Mutanten kodierende DNAs, diese DNAs in exprimierbarer Form enthaltende Vectoren und diese Vectoren enthaltende Wirtszellen zur Verfügung gestellt.

In einem Aspekt der Erfindung wird willkürliche Mutagenese an Monierten a-Amylase-Genen offenbart. Diese mutierten Gene werden in einem geeigneten Wirtsorganismus unter Anwendung eines geeigneten Vectorsystems exprimiert.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Screening-Methoden für mutierte a-Amylasen beschrieben und angewandt.

Solche Methoden ergeben wärmebeständigere und säurebeständigere a-Amylasen. Außerdem wird diese Methode mit einer leichten Modifikation zur Gewinnung alkalibeständigerer a-Amylasen eingesetzt. Die Expressionsprodukte der auf diese Weise nachgewiesenen Klone werden isoliert und gereinigt.

Ein noch weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft a-Amylasen mit erhöhter Wärmebeständigkeit, wobei durch diese mutierten a-Amylasen die Filtrationsprobleme unter den Einsatzbedingungen des Stärkeabbaus reduziert werden.

Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung werden a-Amylasen mit erhöhter Säurebeständigkeit zur Verfügung gestellt, di6 die Bildung ungünstiger Nebenprodukte wie Maltulose verringern und dabei gleichzeitig die Säuremenge vermindern, die vor der Umsetzung mit Amyloglucosidase zugesetzt werden muß. Die neuen a-Amylasen besitzen vorzugsweise verbesserte Eigenschaften sowohl in bezug auf die Wärmebeständigkeit als auch die Säurebeständigkeit oder in bezug auf Wärmebeständigkeit und Alkalienbeständigkeit.

Nach einem anderen er'indungsgemäßen Aspekt wird nachgewiesen, daß die mutierten Proteine ein besseres Verhalten unter den Anwendungsbedingungen bei der Stärkevorflüssigung aufweisen. Die Alkalienbeständigkeit ist besonders für die Anwendung zur Textilienentschlichtung von Nutzen.

Diese Aspekte werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung und den folgenden Beispielen weiter dargelegt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen In den Zeichnungen stellen dar

Fig. 1: Nucleotidsequenz von pMa5-8

Stanssens u. a., 1987, EMBO Laboratory Course Martinsried, Juli 1987. Hinsichtlich der Beschreibung der verschiedenen Elemente siehe Text.

Fig. 2: Nucleotidsequenz von Plasmld pPROM SPO2-lnsert

Die Konstruktion dieses Vectors wurde in EP-A 0224294 beschrieben. Die a-Amylase-Aminosäuresequenz wird unter den Triplets gekennzeichnet. Die Numerierung beginnt an der ersten Aminosäure des vollentwickelten Proteins (Kuhn u. a., 1982, J. Bacteriol, 149,372). Das SPO2-Promotor-lnsert reicht von Position 61 bis 344.

Fig. 3: Nucleotidsequenz von pMaTLiaS

Dieser Vector wurde von pMa5-8, dem Insert von pPROM SPO2 und einem den TAC-Promotor kodierenden DNA-Fragment konstruiert. Das TAC-Promotor-DNA-Fragment reicht von Position 3757 bis Position 3859. Die a-Amylase-Aminosäuresequenz ist unter den Triplets gekennzeichnet.

Fig.4: Restriktionskarte von pMaTLiaS

Die folgenden einzigartigen Restriktionsenzymstellen stehen für die Spaltkonstruktion in dem a-Amylase-Gen zur Verfugung: BamHI, Spei, Sacll, Kpnl, CIaI, Narl, Sail, Thtllll, Xmalll und BstEII. Sequenzierungsprimer für alle möglichen Spalten sind synthetisiert worden, um eine leichte Bestimmung der Mutationen zu ermöglichen. Plasmid pMcTLia6 ist mit pMaTLia6 identisch, bis auf die Anwesenheit eines Ambor-Codons, dem Ampicillin-Gen (entfernt Seal-Stelle), und das Fehlen eines Amber-Codons in dem Chloramphenicol-Gen (einhergehend mit dem Vorhandensein einer Pvull-Stelle).

Fig. 5: Umriß von Bacillus E. coll Shuttlevector pBMa/c

Der (linke) pMa/c-Abschnitt ermöglicht entsprechende Mutagenese in E. coil, Die (rechte) Bacillus subtllls-Kassette enthält das a-Amylase-Gen (oder irgendein anderes Bacillus-Gen) plus ein minimales Replikon für die Vermehrung in B. subtllls. Nach erfolgreicher Mutagenese in E.coil kann die B.subtllls-Kassette zirkularisiert werden, so daß sich der SP02-Promotor nach der Transformation in Bacillus vor dem a-Amylase-Gen bewegen kann.

Fig. 6: Restriktionskarte von pBMa/d

Dieser Vector ist ein spezifisches Beispiel des in Figur 6 dargestellten Mutagenese-Expressionsvectors.

(1) und (2): Multiple Klonierungsstellen. Das Target-Gen ist in (2) eingefügt. Durch Variieren der Stellen an (1) und (2) können entsprechende Rostriktionsstellen für die unterbrochene Duplexschaffung konstruiert werden:

FDT: Transkriptionsterminator

F1 .ORI: Replikationsursprung, ausgehend von Phage F1

E.coli ORI: Replikationsursprungvon pBR322

BLA: Ampicillinresistenz-Gen

CAT: Chloramphenicolresistenz-Gen

BAC ORI: Replikationsursprung von pUB110

KANAMYCIN: Kanamycin (Neomycin-)resistenz-Gen von pUB 110

SP02: PromotorvonPhageSP02.

Fig. 7: Restrlktionskarto von pBMe/C6Lia6

Das a-Amylaso-Gen von Bacillus lichenlformis wurde an der multiplen Clonierungss'.elle (2) von Figur 6 in pBMa/cl

eingebaut. In dieser Figur ist der SPO2-Promotor durch (2) gekennzeichnet und der E. coll ORI durch (4) dargestellt. Fig. 8: Sequenz von phoA Slgnalsequenzfragmont In pMa/c'TPLIa6

Dargestellt ist die Sequenz von der EcoRI-Stelle oberhalb des TAC-Promotors bis zu den ersten Aminosäuren von

vollentwickelter a-Amylase. Die phoA-Aminosäuresequenz ist unter der DNA-Sequenz dargestellt. Fig. 9: Michaelis-Menten-Dlagrainm für WT und 2D5 a-Amylase

Dieses Diagramm zeigt die anfängliche Geschwindigkeit von Enzymaktivitäten im Verhältnis zur Substratkonzentration

für V ' und 2D5 a-Amylase. Die Analysebedingungen werden in Beispiel 8 beschrieben. Fig. 10: Wärmeinaktivierung von WT und D7 a-Amylase

Dieses Diagramm zeigt die Halbwertszeit von WT und D7 a-Amylase in Abhängigkeit von der Ca²⁺-Konz6..tration bei

einem pH-Wert von 5,5 und 90,5⁰C

Fig. 11: Wärmeinaktivierung von WT und D7 a-Amylase

Wie in Figur 10, mit Ausnahme des pH-Wertes, der 7,0 beträgt

Fig. 12; Wärmeinaktivierung von WT und 2D5 a-Amylase

Dieses Diagramm zeigt die Halbwertszeit von WT und 2 D5 a-Amylase in Abhängigkeit von der Ca²⁺-Konzentration bei pH-Wert 7,0 und 95⁰C.

Fig. 13: Wärmeinaktivierung von WT und D7 a-Amylase in Abhängigkeit vom pH-Wert. Fig. 14: Wärmeinaktivierung von WT und 2 D5 a-Amylase in Abhängigkeit vom pH-Wert. Fig. 15: DE gegen endgültigen pH-Wert, gemessen nach der Verflüssigung bei 11O⁰C.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Unter dem in Verbindung mit „mutierter α-Amy läse" in der vorliegenden Beschreibung angewandten Begriff „zeigt verbesserte Eigenschaften" sind a-Amylasen zu verstehen, die eine höhere enzymatische Aktivität oder eine längere Halbwertszeit unter den Anwendungsbedingungen bei der Stärkeverflüssigung, Textilentschlichtung und anderen industriellen Prozessen aufweisen. Mit „verbesserter Wärmebeständigkeit" ist gemeint, daß das mutierte Enzym seine Aktivität bei einer höheren Prozeßtemperatur beibehält oder daß es bei der gleichen Temperatur langer wirksam ist als das Wildtyp-Enzym, von dem es stammt. Unter „verbesserter Säure (oder Alkali-)beständigkeit" ist zu verstehen, daß das mutierte Enzym bei niedrigeren (oder höheren) pH-Werten besser wirkt als das Wildtyp-Enzym, von dem es stammt.

Es ist vorgesehen, daß die verbesserten Eigenschaften durch den Ersatz von einer oder mehreren Aminosäure(n) erzielt werden. Chromosomen DNA kann von einer Mikroorganismen enthaltenden a-Amylase isoliert werden. Vorzug, weise wird ein zur Gattung Bacillus, besser B. llcheniformis und am besten B. lichenlformis T5 gehörender Mikroorganismus verwendet (EP-A 134048). Die Chromosomen-DNA wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym digeriert und in einen Vector kloniert. Es kann eine Reihe möglicher Selektionswege gewählt werden, z. B. Hybridisierung, immunologischer Nachweis und Nachweis enzymatischer Aktivität. Die Wahl des für die Klonierung der digerierten Chromosomen-DNA verwendeten Vectors wird von der Wahl der zur Verfugung stehenden Methode abhängen. Wird Hybridisierung angewandt, sind keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Wenn der Nachweis jedoch immunologisch erfolgt oder auf enzymatischer Aktivität basiert, dann muß der Vector die richtigen Expressionssignale enthalten. Der tatsächliche Nachweis von a-Amylase enthaltenden Klonen wurde auf stärkehaltigen Agrarplatten vorgenommen. Nach der Züchtung und Inkubation mit I₂ wurden Dampfringe um positive Klone herum nachgewiesen. Als nächster Schritt wird die Sequenz des Gens bestimmt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wird zum Vergleich mit anderen bekannten a-Amylasesequenzen herangezogen, um einen ersten Eindruck von wichtigen Aminosäuren zu gewinnen (z. B. Aktiv-Stelle, Ca²⁺-Bindung, mögliche S-S-Brücken). Ein besserer Hinweis wird gewonnen, wenn die räumliche Struktur ermittelt wird. Da dies sehr arbeitsaufwendig ist, wird oftmals ein anderer Weg gewählt. Beim Fehlen einer räumlichen Struktur werden Voraussageprogramme für die Bestimmung der sekundären Strukturelemente (z. B. α-Helix, ß-Sheet) mit Erfolg angewandt, möglicherweise werden die tertiären Strukturelemente, z. B. ß-Zylinder, bestimmt. Hinsichtlich einer Besprechung siehe Janin, J., und Wodack, S. J., Prog. Biophys. Molec. Biol., 1983,42,21-78. Wertvolle Aminosäureaustauschmöglichkeiten sind vorstellbar. Die Stabilität einer Proteinstruktur wird durch die Nettodifferenz in der freien Energie zwischen gefalteten und ungofalteten Konformationen des Proteins bestimmt. Da der Prolinrest auf weniger Konformationen beschränkt ist als die anderen Aminosäuren, wird die strukturelle Entropie der Auffaltung eines Proteins verringert (und die Stabilität dadurch erhöht), wenn eine Aminosäure durch Prolin ersetzt wird. Eine andere nützliche Substitution ist der Austausch von Glycin gegen Alanin. Reste wie Threonin, Valin und Isoleucin mit verzweigten ß-Kohlenstoffen schränken die Rückgrat-Konformation stärker als nicht-verzweigte Reste ein.

Da ein Teil der Wärmebeständigkeit bestimmter Proteine auf Salzbrücken zurückzuführen ist, kann die Einfügung von Lysin- und Argininresten vorteilhaft sein (Tomozic, S. J., und Klibanov, A. M., J. Biol. Chem. 1988,263,3092-3096). Darüber hinaus kann durch den Austausch von Lysinrer, on gegen Argininreste die Stabilität von Salzbrücken verbessert werden, weil Arginin in der Lage ist, eine zusätzliche Η-Bindung zu bilden. Hinsichtlich eines Überblickes siehe Wigby, D. B., u.a., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1987,149,927-929. Erwähnt wird, daß die Deamidierung von Asparagin und Glutamin zu einer deutlichen Unterbrechung der Enzymstruktur führt, der Ersatz durch Nicht-Amidreste könnte diese Unterbrechung verhindern. Aminosäureaustausche erfolgen am besten durch Mutagenese auf dem DNA-Niveau.

Im Prinzip lassen sich Mutageneseexperimente sofort an isolierten Klonen vornehmen. Das Insert wird jedoch vorzugsweise in einen Mutagenese/Expressions-Vector kloniert. Willkürliche Mutagenese ist möglich, ebenfalls ortsgerichtete Mutagenese. Angesichts der riesigen Menge mutierter Klone bei der früheren Methode und da keine 3 D-Struktur von a-Amylase bekannt ist,

um eine bessere Annahme für ortsgerichtete Mutagenese zu ermöglichen, haben wir uns entschieden, „willkürliche" Mutagenese in spezifischen Regionen vorzunehmen.

Das folgende Vorgehen ist ein möglicher Weg zur Praktizierung der Erfindung.

Zunächst wird das Gen durch die Einführung von „ruhigen" Restriktionsstellen modifiziert. Die Einführung von nichtruhigen Restriktionsstellen ist ebenfalls möglich. Dadurch wird die Deletion spezifischer Regionen des Gens möglich. Zweitens wird das Gen in ein Plasmid kloniert. Durch diese Kombinationen von einem Phagen und einem Plasmid wird die Produktion einsträngiger DNA erleichtert. Andere Wege zur Gewinnung einsträngiger DNA sind ebenfalls möglich. Durch die Hybridisieruhg von geschmolzener doppelsträngiger Vector (plus Insert)-DNA mit einer Vector/Insert-Kombination, die einen Spalt im Insert enthält, wurde gespaltene Heteroduplex-DNA gewonnen (ausführliche Beschreibung siehe Morinaga, Y., u.a., 1984, Biotechnology, 2,636),

Der Spalt wird für chemische und enzymatische Mutagenese herangezogen. Vorzugsweise wandten wir die Hydragensulfitmethode an (Folk und Hofstetter, Cell, 1983,23, 585), und er wird eine enzymatische Fehlinkorperotionsmethode an"ewandt (modifizierte Version von Lehtovaara u.a., Prot. Eng., 1988,2,6jy. Diese Methoden können in einer solchen Weise eingewandt werden, daß jedes einzelne Nucleotid in dem Spalt durch alle drei anderen Nucleotide ersetzt wird (Sättigungs-Mutagenese). Die letztere Methode kann in mehreren Formen angewandt werden. Bei einer davon wird ein synthetischer Primer an den Spalt hybridisiert. Anschließend wird eine Verlängerungsreaktion vorgenommen, bei der das zu dem ersten Desoxynucleotid 3' von dem Primer komplementäre Desoxynucleotid fehlt. Im Prinzip können alle drei der anderen Desoxynucleotide auf diese Weise eingeführt werden. Das kann entweder durch die Anwendung eines Gemisches von drei Desoxynucleotiden oder durch die Anwendung von drei getrennten Reaktionen, von denen jede nur ein Desoxynucleotid enthält, erreicht werden. Eine andere Anwendungsmöglichkeit dieser Methode ergibt willkürliche Klone. Hier werden vier einzelne Reaktionen vorgenommen, von denen jede ein begrenzendes Desoxynucleotid enthält. Dadurch ergeben sich zweite Stränge, die vor jedem einzelnen Nucleotid aufhören. Die anschließenden Schritte können wie oben beschrieben vorgenommen worden. Es wurde sowohl die Hydrogensulfit- als auch die enzymatische Mutagonesemethode zur Gewinnung von Mutanten angewendet.

Zur Prüfung der enzymatischen Eigenschaften empfiehlt es sich, die klonierten Gene in dem gleichen Wi rt zu exprimieren, der im Laufe der Mutageneseexperimente eingesetzt wurde. Das kann im Prinzip jede Wirtszelle sein, vorausgesetzt, daß geeignete Mutagenese/Expressions-Vectorsysteme für diese Zellen zur Verfügung stehen. Meistens eignet sich E. coil besonders dafür, zum Beispiel E. coll WK6. Nach der Züchtung der Kolonien in Mikrotiterplatten wurden Proben aus den Vertiefungen dieser Platten auf Agrarplatten getüpfelt, die einen Stärkezusatz enthielten und auf verschiedene pH-Werte gepuffert waren. Positive Klone können durch Ringbildung nachgewiesen werden. Screening mit entsprechenden Puffern kann angewandt werden, um eine Selektierung in bezug auf Wärmebeständigkeit, Säurebeständigkeit, Alkalibeständigkeit, Salzlösungsbeständigkeit und jede andere Beständigkeit, die ermittelt werden kann, vorzunehmen.

Geeignete Wirtsstämme für die Produktion von mutierten a-Amylasen umfassen transformierbare Mikroorganismen, in denen die Expression von a-Amylase erzielt werden kann. Speziell sind Wirtsstämme der gleichen Spezies oder der gleichen Gattung, von denen die a-Amylase abgeleitet ist, geeignet, wie beispielsweise ein Baclllus-Stamm, vorzugsweise wird ein a-Amylasenegativer Bacillus-Stamm herangezogen, noch besser ein a-Am/lase- und Protease-negativer Baclllus-Stamm. Zum Beispiel wurde B.llchenlformisT9 zur Herstellung großer Mengen mutierter a-Amylasen verwendet. Vorzugsweise werden die zu erzeugenden a-Amylasen in das Kulturmedium (während der Fermentierung) ausgeschieden, was ihre Rückgewinnung erleichtert. Es kann jede geeignete Signalsequenz zur Erzielung von Sekretion eingesetzt werden. Die exprimierte a-Amylase wird aus den Zellen ausgeschieden und kann anschließend mit Hilfe jeder geeigneten Methode gereinigt werden. Gelfiltration und Mono-Q-Chromatographie sind Beispiele für derartige Methoden. Die isolierte a-Amylase wurde hinsichtlich der Wärmeinaktivierung bei verschiedenen Ca²*-Konzentrationen (0,5-15mM) und über einen breiten pH-Bereich (5,5-8,0) getestet. Es wurden auch Tests unter Anwendungsbedingungen vorgenommen. Vor allem wurde mutierte a-Amylase unter den Bedingungen der Stärkeverflüssigung bei einem pH-Wert von 5,5 und 5,25 getestet. Außerdem wurden Anwendungsmöglichkeiten für die Textilschlichtung untersucht.

'ie Eigenschaften einiger der Mutanten, die ausgesondert wurdon, werden unter den verlangten Leistungsbedingungen besser geeignet sein.

Durch die Erfindung werden a-Amylasen mit erhöhter Wärmebestänaigkeit, besserer Säurebeständigkeit und verbesserter Alkalibeständigkeit zur Verfügung gestellt. Im allgemeinen spielt die Anzahl der Aminosäureaustausche keine große Rolle, solange die Aktivität des mutierten Proteins der des Wildtyp-Enzyms gleich oder besser als diese ist. Mutierte a-Amylase unterscheidet sich in mindestens einer Aminosäure vom Wildtyp-Enzym, vorzugsweise weichen die Mutanten in 1 bis 10 Aminosäuren davon ab. Spezifische Mutanten mit verbesserten Eigenschaften sind mutierte a-Amylasen, die an den folgenden Positionen 111,133 und 149 einen oder mehrere Aminosäureaustausche aufweisen (die Numerierung erfolgte in Übereinstimmung mit der B.licheniformis a-Amylase). Zu den bevorzugten Aminosäureaustauschmöglichkeiten gehören Ala-111-Thr, His-133-Tyr und Thr-149-lle.

Derartige mutierte Enzyme zeigen eine verbesserte Leistungsfähigkeit bei pH-Werten unter 6,5 und/oder über 7,5. Die Leistungsfähigkeit wird auch bei hohen Temperaturen verbessert, die zu einer erhöhten Halbwertszeit bei beispielsweise Temperaturen bis zu 110⁰C führen.

Viele der zur Verfügung stehenden a-Amylaseprodukte werden von bakteriellen Quellen gewonnen, vor allem Bacilli, ζ. Β. B. subtllls, B. llchenlformls, B. stearothermophllus, B. coagulans und B. amyloliquefaciens. Diese Enzyme zeigen einen hohen Grad an Homologie und Ähnlichkeit (Yuuki u.a., J. Biochem., 1985,98,1147; Nakajima u. a., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1986, 23,355). Daher können die Kenntnisse über günstige Mutationen, die von einer dieser a-Amylasen gewonnen wurden, zur Verbesserung anderer Amylasen angewandt werden. Die Erfindung bietet einen Weg zur Erlangung derartiger Kenntnisse. Es folgen eine Beschreibung der angewandten Versuchsmethodon und Beispiele zur Veranschaulichung der Erfindung. Die Beispiele dienen nur illustrativen Zwecken und sollen daher den Geltungsbereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.

Versuchsdurchführung Materialien und Methoden

1. Allgemeine Klonlerungstechnlken

Es werden die Klonierungstechniken angewandt, wie sie in den Handbüchern von T. Maniatis u. a., 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory; F.M.Ausubel, u.a., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., New York; B. Perbal, 1988, A practical Guide to Molecular Cloning, 2. Ausg., John Wiley & Sons inc.. New York beschrieben werden. Diese· Handbücher befassen sich ausführlich mit den Protokollen für die Konstruktion und Vermehrung von Rekombinant-DNA-Molekülen, den Verfahrensweisen zur Aufstellung von Genbibliotheken, den Verfahrensweisen zur Sequenzierung und Mutierung von DNA und den Protokollen für die erizymatische Handhabung von DNA-Molekülen.

2. Chemische Mutagenese

Klonierte DNA kann in vitro mit Chemikalien behandelt werden, um Mutationen in die DNA einzubauen. Wenn diese Mutationen auf Aminosäure kodierende Triplet-Codons gerichtet sind, kann durch die mutierte klonierte ONA ein mutiertes Protein erzeugt werden. Eine Methode für die chemische Mutagenese mit Hilfe vor Natriumhydrogensulfit wird von Shortle und Botstein beschrieben (Methods Enzymol., 1983,100,457). Eine zu bevorzugende Methode wird von Folk und Hofstetter beschrieben (Cell, 1983,33,585). Andere Mutagenesemethoden werden von Smith, Ann. Rev. Genet., 1985,19,423 beschrieben. Ein besonders nützliches Protokoll wird von Ausubel u.a., ebenda, beschrieben.

3. Mutagenese an DNA mit gespaltenem Duplex

Es wurde eine auf dem Vorgehen mit gespaltenem Duplex (Kramer u.a., 1984, Nucl. Acids Res., 12,9441) und einem Phasmid (Plasmid/Phage-Hybride) basierende Methode angewandt. Im wesentlichen beruht die Methode auf einem Spalt-Duplex-DNA-Zwischenprodukt, das aus einem gespaltenen Strang ((-!-Strang), der einen Wildtyp-Markierer für antibibiotische Reristenz enthält, und einem Matrizen-Strang ((+!-Strang), dereine Amber-Mutation in dem Antibiotika-Resistenz verleihenden Gen trägt, besteht. Nach der Hybridisierung wird das mutagene Oligonucleotid während der In-vitro-Spaltfüllungs- und Abdichtungsreaktion in den gespaltenen Strang eingefügt. Die resultierenden Moleküle werden verwendet, um einen Wirt mit mangelhafter Fehlanpassungsreparatur (Mut S), in dem die Verknüpfung zwischen der vorgesehenen Mutation und dem Antibiotika-Resistenz-Markierer erhalten geblieben ist, zu transformieren. Die von diesem Stamm isolierte gemischte Phasmid-Population kann sich dann in einen negativen Suppressor-Wirtsstamm abscheiden. Die Transformanten werden auf antiobiotikumhaltiges Medium aufgestrichen, wodurch eine Selektion hinsichtlich der von dem gespaltenen Strang stammenden Nachkommen in Gang gesetzt wird.

Das von P. Stanssens u. a. (Nucl. Acids Res., 1989,17,4441) beschriebene Zvillings-Vector-System pMa/c5-8 ist aus den folgenden Elementen zusammengesetzt:

Pos. 11-105: Bakteriophagen, Terminator

Pos. 121-215: Bakteriophagefd, Terminator

Pos. 221-307: Plasmid pBR322 (Pos. 2069-2153)

Pos. 313-768: Bakteriophage fd, Replikationsursprung (Pos. 5482-5943) Pos.772—2571: Plasmid pBR322, Replikationsursprung und ß-Lactamase-Gen Pos. 2572-2685: TransposonTn903

Pos. 2519-2 772: Tryptophan-Terminator !Double)

Pos. 2 773-3 729: TransposonTn9, Chloramphenicoiacetyltransferase-Gen Pos. 3730-3803: Multiple Klonierungsstellen

Die Sequenz ist in Figur 1 dargestellt.

In dem Vsctor vom pMa-Typ wird Nucleotid 3409 vcn G in A umgewechselt, während im Vector vom pMc-Typ Nucleotid 2238 von G in C umgewechselt wird, wodurch Amber-Stopcodons in dem Acetyltransferase-Gen bzw. ß-Lactamase^:Gen geschaffen werden, die diese Gene inaktiv machen.

Alle genannten Sequenzen wurden von Genbank (TM) (Abgabe 54), National Nucleic Acid Sequence Data Bank, NIH, USA, bezogen. Plasmid pMcb-8 ist unter DSM 4566 hinterlegt. Zur Durchführung von Mutagenese wird das Target-DNA-Fragment in die multiple Klonierungsstelle von pMa5-8 kloniert. Anschließend wird ein gespaltener Duplex zwischen pMa5-8, der die Target-DNA enthält, und pMc5-8 konstruiert.

Der aus der Target-DNA bestehende einsträngige Spalt kann der Mutagenese mit einem mutagenen Oligonucleotid unterworfen werden, wobei mit langen synthetischen Oligonucleotiden, mit einer geringen Menge falsch eingefügter Nucleotide, mit Chemikalien oder enzymatischer Fehleinfügung von Nucleotiden ebenfalls willkürliche Mutagenese PCR angewandt werden kann. Eine ausführliche Beschreibung ist bei Ausubel u.a., ebenda, Perbal, ebenda, zu finden. Als Alternative zur In-vitro-Mutagenese kann In-vivo-Mutagenese entweder mit Hilfe von UV-Licht oder von Chemikalien oder durch den Einsatz eines Mutator-Stammes von E. coil vorgenommen werden (Fowler u.a., J. Bacteriol., 1986,167,130). Mutagene Nucleotide können mit Hilfe von Apparaturen synthetisiert werden, die von Applied Bio Systems zu beziehen sind.

4. Willkürliche Mutagenese durch erizymatische Fehleinfügung von Nucleotiden

Ein gespaltener pMa/pMc-Duplex kann der Primer-Verlängerungs- und Fehloinfügungsmutagenese unterzogen v/erden, wie ursprünglich von Shortle u.a. (Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 1982,79,1588) und von B.C. Cunningham und J.A. Wells (Prot. Eng., 1987,1,319) beschrieben wurde; eine Modifikation dieser Verfahrensweise beschreiben Lehtovaara u. a. (Prot. Eng., 1 i 82,2,63). Diese Methode basiert auf der kontrollierten Anwendung von Polymerasen. Vier Pcpulaiionun von DNA-Molekülen werden zuerst durch Primer-Verlängerung eines gespaltenen Duplex von pMa/pMc erzeugt, so daß sie willkürlich in dem Spalt enden, aber immer unmittelbar von einem bekannten Basentyp (vor A, C, G bzw. T). Jede der vier Populationen wird anschließend in einer getrennten Fehleinfügungsreaktion mutagenisiert, wobei auf die richtige Base jetzt verzichtet werden kann. Auf diese Weise können alle Typen von Basensubstitutionsmutationen in jeder Position des Spaltes erzeugt werden. Der Anwendung von Sequenase (TM) (U.S. Biochemical Corporation) wurde gegenüber dem Einsatz von Klenow-Polymerase der Vorzug gegeben.

-7- 3C1 620

Darüber hinaus wurde MoMuLV-Umkehriranskriptase anstelle von A. M. V.-Umkehrtranskriptasa, die von Lehtovaara u. a. (ebenria) eingesetzt wurde, verwendet.

Um Substitutionen an einem Ort zu garantieren, haben wir die folgende Modifikation in das von Lehtovaara, u. a., ebenda, beschriebene Protokoll eingefügt. In dem Umkehrtranskriptasepuffer sind nicht drei Fehleinfügungsnucleotide vorhanden, sondern nur eines. Zum Beispiel wird das Α-spezifische, begrenzte Base aufweisende Basenverlängerungsgemisch in drei einzelnen Reaktionen mit 250μΜ dCTP, 250μΜ dGTP bzw. 250μΜ dTTP inkubiert. Für eine vollständige Reihe von 4 basenspezifischen begrenzten Verlängerungsgemischen wird insgesamt eine Reihe von 12 einzelnen Fehleinfügungsreaktionen ausgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 1,5 Stunden bei 42°C wird eine Masse (Chase) aller vier Desoxynudeotide in einer Konzentration von 0,5mM zugesetzt, und die Reaktionen werden mindestens weitere 20 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Proben werden dann weiter nach Lehtovaara u. a. (ebenda) bearbeitet, allerdings wird keine Gegenselektion in bezug auf einen uracilhaltigen Strang, sondern eine Gegenselektion, die auf dem pMa/c-Vector basiert, vorg .lommen,

5. Produktion von mutierten a-Amylasen

Transformanten von E.coli Stamm WK6 (Zeil, R., und Fritz, Hj., EMBO J., 1987,6,1809), dia einen Expressionsvector enthalten und jedes der a-Amylase-Gebilde beherbergen, wurden in TB-Medium (10 ml) bei 30°C geimpft. TB-Medium bestand aus 0,017 M KH₂PO₄,0,072 M K₂HPO₄,12g/l Bactotryptone, 24g/l Bacto-Hefeextrakt, 0,4% Glycerin und einem Antibiotikum (Ampiciilin mit pMa- oder Chloramphenicol mit pMc-Gebilden). Proben der Kultur wurden zum Impfen von 250ml TB in 2-Liter-Kolben verwendet. Bei einem ODeoo von 10 bis 12 wurden 0,1 mM IPTG (Isopropyl-ß-d-thiogalactopyranosid) zugesetzt und die Inkubation weitere 12 bis 16 Stunden fortgesetzt.

6. Reinigung von mutierten a-Amylason

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und bei 0⁰C in 20% Saccharose enthaltendem Puffer resuspendiert. Nach einer zweiten Zentrifugation wurden die Zellen in kaltem Wasser resuspendiert. Zellbruchstücke wurden durch eine dritte Zentrifugierung entfernt, und das Überstehende wurde mit 2OmM TRIS-Puffer auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht. CaCI₂ wurde bis zu einer Endkonzentration von 5OmM zugesetzt. Das Material wurde 15min lang bei 70°C wärmebehandelt, und das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Das Überstehende wurde durch 0,22-u-Millipore-Filter filtriert und auf ein Zehntel des Ausgangsvolumens eingeengt.

Weitere Reinigung wurde mit Hilfe von Gelfiltration (aus TSK HW-55-Merck) und Mono-Q-Chromatographie erreicht. Vor der Chromatographie auf Mono S wurde der pH-Wert der enzyriatische Aktivität enthaltenden Fraktionen unter Vei Wendung von Natriumacetat auf 4,8 eingestellt. a-Amylase wurde mit 25OmM NaCleluiert. Um Inaktivierung zu verhindern, wurde der pH-Wert sofort auf 8,0 eingestellt.

Beispiele Beispiel 1

Molekularklonierung von Bacillus llchenlformli a-Amylase-Gen

Von Bacillus llcheniformls T5 (EP-A 134048; CBS 470.83) isolierte Chromosomen-DNA wurde mit Restriktionsenzym EcoRI digeriert und in die EcoRI-Stelle von pUBHOIigiert (Gryczan, T.J., u.a., J. Bacteriol, 1978,134, S.318). Das Ligationsgemisch wurde in Bacillus subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Center) transformiert. Neomycinresistente Kolonien wurden in bezug auf die a-Amylase-Produktion auf Hi-Agarplatten (DIFCO) mit 0,4g/l Stärkezusatz (Zulkowsky-Stärke, Merck) getestet. Nach der Züchtung und der Inkubation m^!t I₂-Dampf wurde eine positive Kolonie, die einen großen deutlichen Ring erzeugte, zur weiteren Charakterisierung dusgewählt. Es zeigte sich, daß das von dieser positiven Kolonie isolierte Plasmid 3,4kb EcoRI-EcoRI-Fragmente, die von dem Bacillus llcheniformls T5 stammten, enthielt. Dieses Plasmid wurde als pGB33 bezeichnet (EP-A 134048; CBS 466.83). Das a-Amylase codierende Insert wurde an eine synthetische Shine-Dalgarno-Sequenz un j den B.akeriophage-SPO2-Promotor ligiert, wodurch Plasmid pProm SPO₂ resultierte (siehe EP-A 0224294; CBS C96.85). Die nach der Methode von Sanger (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, 74, 6463) bestimmte Nucleotidsequenz des Inserts von pProm SPO₂ wird in Figur 2 gezeigt. Die Sequenz zeigt ein einziges großes offenes, eine a-Amylase codierendes Leseraster, das tatsächlich mit der von Yuuki u.a. (ebenda) bestimmten a-Amylasesequenz von Bacillus licheniformis identisch ist. Die ersten 29 Aminosäuren shdeine Signalsequenz, die während der Sekretion der a-Amylase abgespalten wird. Die Numerierung der Aminosäure in dieser Anmeldung bezieht sich auf die Numerierung gemäß dem vollentwickelten Protein. Die Yuuki-Sequenz unterscheidet sich in den folgenden Positionen: An Position 134 ist ein Arg anstelle eines Leu vorhanden; an Position 310 ist ein Ser anstelle eines GIy vorhanden; an Position 320 ist ein AIa anstelle von Ser vorhanden.

Beispiel 2

Konstruktion von Mutagenese/Expresslons-Vectoren pMaTLIaS

Plasmid pROM SPO₂ wurde mit EcoRI und BCIi digeriert, und das 1,8kb EcoRi-Bcll-lnsert wurde gereinigt und in EcoRI-BamHI digerierten pMa5-8 kloniert. Dieser pMa5-8-Vector war zuvor mit einer modifizierten multiplen Klonierungsstelle versehen worden. Das in Figur 1 von Position 3757 bis zu Position 3 786 roichende BamHI-Hlndlll-Fragment wurde gegen eino synthetische DNA-Sequenz ausgetauscht, wie sie in Figur 3 von Position 5647 bis 5660 dargestellt ist. Diese Maßnahme diente dazu, einige Restriktionsstellen innerhalb des a-Amylase-Gens einmal,g zu machen. Das resultierende a-Amylase enthaltende pMa5-8-Derivat wurde mit EcoRI und BamHI digeriert und an ein, eine Kopie des TAC-Promotor tragendes synthetisches ONA-Fragmont ligiert (De Boer u.a., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 1983,80,21). Die Sequenz dieses synthetischen DNA-Fragmentes ist zusammen mit dem endgültigen a-Amylase Mutagenese/Expressions-Vector pMaTLia6 in Figur 3 von Position 3757 bis Position 3859 dargestellt. Dieser endgültige a-Amylase Mutagenese/Expressions-Vector wurde durch die Einfügung verschiedener ruhiger Restriktionsstellen vervollständigt, deren Aufgabe in der Erzeugung von Spalten in dem a-Amylase-Gen während der Mutagenese-Experimente bestand (Figur 4). Zu diesem Zweck wurden die folgenden Mutationen unter Anwendung von ortsgerichteter Oligonucleotid-Mutagenese vorgenommen:

- eine Spel-Stelle wurde durch eine ruhige Mutation eingefügt T49T und S50S

ACT -> ACT AGC -> AGT

- eine Narl-Stelle wurde durch die ruhige Mutation eingefügt A269A

GCG -> GCC

- eine BstEII-Stelle wurde unmittelbar hinter dem TAG-Stop-Codon eingefügt TAGAAGAGC -> TAGGTGACC.

Dieser a-Amylase-Mutagenese-Vector pMaTLia6 ist für die Mutagenose mit Hilfe der Spalt-Duplexmethode geeignet. Durch Digestion geeigneter Restriktionsenzyme hergestellte doppelsträngige pMaTLia6-DNA wurde zu einsträngiger pMcTLia6-DNA hybridisiert.

Die resultierenden einsträngigen Spalten wurden ortsgeric^tetar Mutagenesn, chemischer Mutagenese und willkürlicher anr/matischer Muogenese nach der Beschreibung im experimentellen Teil unterzogen.

Durch die Verfügbarkeit des TAC-Promo\ois vor dem a-Amylase-Gen ist die induzierbare Expression >on a-Amalyse in E.coil durch die Zugabo von IPTC möglich.

Plasmid pMaTLia6 in E.coli WKG wurde am 2. Juni 1989 als CBS 255.89 hinterlegt.

Beispiel 5

Konstruktion eines Baclllus/E.coli Shuttle-Vectors für die Mutagenese und Expression Dieser Vector ermöglicht die Mutagenese eines eingefügten Gens in E.coli und die sofortige Expression in Bacillus. Die für die Konstruktion des Vectors gewählte Verfahrensweise bestand in der Kombination eines pUB110 Derivats (Gryczan, ebenda) mit dem pMa/c-Zwillings-Vectorsystem in einer solchen Form, daß:

1. die B. subtllis-Kassette durch ein einziges Restriktion/Relegation-Experiment entfernt werden kann;

2. verschiedene a-Amylape-Gene und verschiedene Promotoren leicht in diesen Vector kloniert werden können;

3. das klonierte Gen nach der Rezirkularisation unter der Kontrolle eines geeigneten Bacillus-Promotors stehen wird;

4. der Bacillus-Prumotor und das strukturelle a-Amylase-Gen während der Mutagenese in E.coli physikalisch getrennt sind, wodurch eine mögliche lethale Ansammlung von u-Amylase in E.coli verhindert wird.

Eine schematische Darstellung des Shuttle-Vectors wird in Figur 5 gezeigt. Die Struktur der endgültigen Version des Vectors pBMa/cl wird in Figur 6 dargestellt. Vector pBMai wurde am 2. Juni 1989 unter der Nummer CBS 252.89 hinterlegt. Der Vector wurde wie folgt konstruiert:

- Das das REP-Gon und das Neo"-Gen tragende EcoRI-SnaBI-Fragment wuide gereinigt und in EcoRi-Smal digeriertes pUC8 kloniert.

- Das EcoRI-Hlndlll-Fragment dieses pUC8-Derivats wurde in EcoRI-Hindlll digeriertes pMa5-8 kloniert und ergab Plasmid pMa-5-80.

- Das BamHI-Xbal Polylinker-Fragment wurde durch ein synthetisches Fragment von DNA, das den SPOyPromotor von Bakteriophage SPO₂ (Williams u. a., J. Bacteriol.,... (unleserlich!) plus Re&triktion/Erkennungsstellen für Sacll, Apal, Xhol, Sacl, BgI Γ, MIuT und Xbal kodiert, substituiert.

- Die einmalige EcoRI-Stelle von pMa5-80 wurde für die Einfügung eines Polylinkerfragmentes verwendet, wodurch die folgenden Erkennungsstellen EcoRI, Smal, Sacl, EcoRV, Sphl, Kpnl, Xbai und Hindill gebildet wurden.

Für spezifische Zwecke wurden die Derivate pBMa/c2 und pBMa/co aus pBMa/d entwickelt.

- In pBMa/c2 wurde der EcoRI-Hindlll-Polylinker von pBMa/d durch den entsprechenden Polylinker von pUC19 ersetzt.

- In pBMa/c6 wurde außerdom die Sacll-Stelle m dem rechten Polylinker von pBMa/d durch eine Klenow-Reaktion entfernt. Nach der Konstruktion von pBMa/c6 wurde ortsgerichtete Mutageniise am B. lichenlformis n-Amylase-Gen vorgenommen. Dieser Vector wurde durch die Ligation des von pMaTLia6 isolierten BamHI-Hindlll-Fragmentes in das oben genannte pBMa/cC, das durch BamHI und Hindlll gespalten war, konstruiert. Das resultierende Plasmid (Figur 7) kann zur Konstruktion gespaltener Duplaxe zur Mutagenese in E.coli verwendet werden.

Die resultierenden Mutanten sind nach der Restriktion mit Sacl, Religation und Transformation nach Chang und Cohen (Mol. Gen. Genet., 1979,168,111) in Bacillus subtllls 1A40 (BGSC 1 A10) exprimiert worden.

Beispiel 4

Expression von einwandfrei vollentwickelter Bacillus lichenlformis a-Amylase In E.coli Die Charakterisierung der durch pMaTLiaö erzeugten a-Amylase (Beispiel 2) zeigte, daß ein Teil der α-Amylase während der Sekretion ungenau verarbeitet worden war. NH₂-terminale Sequenzierung ergab einen zusätzlichen Alaninrest für in E. coll WK6 erzeugte a-Amylase.

Obwohl es keinen Hinweis gibt, daß dieser zu unterschiedlichen Eigenschaften bei der Amylase führt, haben wir die a-Amylase-Signalsequenz durch die Signalsequenz der alkalischen Phosphatase phoA ersetzt. Zu diesem Zweck wurde ein Mutagenese-Experiment vorgenommen, um eine Fspl- Restriktionsstelle in pMaTLia6 an der Verbindungsstelle von dem Signalpeptid und der ausgereiften α-Amylase einzufügen. Nach der Fspl- und BamHI-Digestion wurde ein die phoA-Signalsequenz kodierendes synthetisches DNA-Fragment (Michelis u.a., J. Bacteriol., 1983,154,366) eingefügt. Die Sequenz dieser Konstruktion wird '.n Figur 8 gezeigt. Es wurde nachgewiesen, daß durch pMa)cTPLia6 erzeugte α-Amylase die richtige NHj-terminale Sequenz besitzt.

Beispiel 5

Screening in bezug auf beständigi a-Amylase

A. Screening in bezug auf säurebeständige u-Amylase-Mutanten

a-Amylase-Mutanten, die sich bei niedrigem pH-Wert besser oder schlechter verhalten als Wildtyp-u-Amylase, können durch einen Vergleich von Ringen auf Stärkeplatten ausgewählt werde.\ die nach dem Färben der Stärke mit einer Jodlösung auf verschiedene pH-Werte gepuffert worden sind.

Methode:

1. Züchtung

Mögliche Mutanten werden in Mikrotiterplatten gezüchtet. Als Züchtungssubstrat dienen 250μΙ Brain-Heart- Infusion-Brühe (DIFCO). Folgende Zugaben werden vorgenommen:

Chloramphenicol 50pg/ml

I.P.T.G. (Sigma) 0,2mM

CaCI₂ 2mM

Kolonien werden mit Hilfe steriler Pinzetten von den Agarplatten entnommen und in getrennten Vertiefungen (96) einer Mikrotiterplatte geimpft. In jeder Platte befinden sich 4 Wildtyp-Kolonien als Kontrolle.

Diese Mikrotiterplatten werden 40 Stunden lang ohne Schütteln bei 37⁰C gehalten.

2. Plat'.entast

Nach dio-,θτι Zeitraum, in dem die a-Amylase erzeugt wird, werden δ-μΙ-Proben aus jeder Vertiefung entnommen und auf zwei verschiedene Arten von Agarplatten (114 x 140mm) aufgetropft. Die erste Art ist eine an Heart-Infusion (DIFCO) reiche Agarpiatto +0,4% Stärke (Zulkowsky Stärke-Merck) + 50pg/ml Chloramphenicol. Nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden bei 37°C dient diese Platte als Speicher für Mutanten.

Die zwaite Art von Platten ist die echte Screeningplatte, die enthält:

Bacto Agar (DIFCO) 1,5%

Zulkowsky Stärke 0,2%.

Agar und Stärke werden in synthetischem Leitungswasser (STW) gelöst. Bei diesem handelt es sich um entmineralisiertes Wasser plus

CaCI₂ 2mM

MgCI₂ 1mM

NaHCO₃ 2,5mM

BSA ΙΟμς/ηπΙ.

Die Screeningplatten werden durch eine lOOfache Verdünnung einer öM Vorratslösung von Kaliumacetatpuffer in diesem Medium gepuffert. Dio pH-Werte der Vorratslösung betragen 4,80, 5,0 und 5,2 bei Raumtemperatur. Die in den Agarplatten gemessenen endgültigen pH-Werte sind etwas niedriger als diejenigen der Vorratslösungen. Aus jeder Vertiefung werden 5μΙ Kultur auf 3 Screeningplatten mit unterschiedlichen pH-Werten aufgetropft.

Der pH-Bereich wird in einer solchen Weise gewählt, daß bei der Wildtyp-a-Amylase a· 'f der Platte mit dem niedrigsten pH-Wert nur geringe oder keine Aktivität zurückbleibt.

3. Färbung

Die Screeningplatten werden 2 Stunden lang bei 55°C inkubiert. Nach diesem Zeitraum wird eine I₂-Lösung über die Platten gegossen. 10 χ I₂-Lösung enthält 30g I₂ und 70g Kl je Liter.

Das Ausmaß der Fleckenbeseitigung wird mit der zurückbleibenden a-Amylase-Aktivität bei diesem pH-Wert korreliert. Diejenigen Mutanten, die sich als besser als die Wildtypkontrolle erwiesen, werden für eine zweite Screeningrunde gewählt. Wildtyp-Ringe sind bei diesem Experiment sehr gut reproduzierbar.

4. Zweites Screening

Positive Mutanten werden von der ergiebigen Platte entnommen und auf frischen HI-Platten + Chloramphenicol gereinigt. 4 einzelne Kolonien werden von jedem Mutanten entnommen und wieder in ähnlicher Form wie bei dem ersten Screening getestet. Außerdem werden Serionverdünnungen dieser Kulturen mit STW vorgenommen, und diese Verdünnungen werden auf Screeningplatten mit neutralem pH (pH = 7,0) aufgetropft. Durch einen Vergleich mit Wildtyp-Kulturen kann entschieden werden, ob das bessere Verhalten bei niedrigem pH-Wert auf eine insgesamt bessere a-Amylaseproduktion oder auf die wirklich beständigere a-Amylase zurückzuführen ist.

Die das zweite Screening „überlebenden" Mutanten werden durch Bestimmen der Nucleotidsequenz von demjenigen Teil des Gens, der der Mutagenese unterzogen wurde, charakterisiert.

B. Screening In bezug auf alkalibeständige a-Amylase

Das Screening in bezug auf alkalibeständige a-Amylasen wird in einer ähnlichen Weiso vorgenommen, wie es für säurebeständige a-Amylase angewandt wurde. Nach der Züchtung in Mikrotiterplatten werden B-pl-Proben aus jeder Vertiefung entnommen und auf Speicherplatten und auf die eigentliche Screeningplatte nufgetropft. Letztere ist zusammengesetzt aus:

Bacto Agar (DIFCO) 1,5%

Zulkowsk/Stärke 0,2%

und ergänzt durch entmineralisiertes Wasser plus

CaCI₂ 2mM

MgCI₂ 1 mM

NaHCO₃ 2,5 mM

BSA ΙΟμοΛηΙ.

Die Screeningplatten werden mit 5OmM Carbonat/Hydrogencarbonat-Puffer auf pH-Werte von 9,0, 9,5 und 10,0 gepuffert. Der pH-Bereich wird so gewählt, daß bei dem höchsten pH-Wert geringe oder keine Aktivität der Wildtyp-a-Amylase zu verzeichnen ist. Nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 55°C wird eine I₂-Lösung über die Platten gegossen. Für eine zweite Screeningrunde werden diejenigen Mutanten, die einen besseren Ring als das Wildtyp-Enzym aufweisen, ausgewählt. Diese zweite Screeningrunde wird in einer ähnlichen Weise wie das Screening in bezug auf Säurebeständigkeit vorgenommen.

C. Screening in bezug auf wärmebeständige a-Amylase-Mutanten

a-Amylase-Mutanten, die bei einer hohen Temperatur ein besseres oder schlechteres Verhalten als die Wildtyp a-Amylase zeigen, können gleichfalls durcii einen Vergleich der Ringe auf den Stärkeplatten, die durch die zurückbleibende Amylaseaktivität in dem Kultursubstrat nach der Erwärmung entstehen, ausgewählt werden.

Methode:

1. Mutanten werden in der gleichen Weise wie für das pH-Screening gezüchtet.

2. Die Mutanten werden auf Hl-Agarplatten wie für das pH-Screening repliziert.

3. Die einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatten werden mit Einwegkappen (Flow Laboratories) verschlossen, um das Verdampfen von Kultursubstrat während des Erwärmungsvorganges zu verhindern.

4. Mikrotiterplatten werden 1 Stunde lang in einem Wassjrbad auf 95°C gehalten. Nach dem Erwärmen werden die Mikrotiterplatten in eine Zentrifuge gestellt, um die gesamte Probe am Boden der Mikrotiterplatte zu sammeln.

5. Das Screening in bezug aufwärmebeständige Mutanten wurde folgendermaßen ausgeführt:

Aus jeder Vertiefung wurden 5μΙ Kultur auf neutrale Sei eeningplatten aufgetropft (siehe pH-Screening). Diese Platten wurden 1 Stunde lang bei 55"C inkubiert. Nach com Färben der Stärke mit der Jodlösung können Mutanten und Kontrollen in bezug auf zurückgebliebene a-Amylase-Aktivit ?t durch Vergleichen der Helligkeit der Flecken (Ringe) gescreent werden. Falls die Restaktivität der Kontrollen zu h ich ist, müssen Serienverdünnungen angefertigt und auf die Screeningplatte aufgetropft werden, um Mutanten ermitteln zu können, die wärmebeständiger als das Wiidtyp-Enzym sind.

6. Mögliche interessierende Mutanten werden weiter wie bei der pH-Screeningmethode getestet.

Eine Kombination von Screeningart A oder B mit Art C kann angewandt werden, wenn eine Kombination von Eigenschaften verlangt wird. Nach der ernten Screeningrunde in bezug auf alkalibeständige a-Amylase kann zum Beispiel eine zweite Screeningrunde hinsichtlich der Wärmebeständigkeit vorgenommen werden. Diejenigen Mutanten, die sich bei beiden Tests als positiv erweisen, können als Kandidaten ausgewählt werden, die eine Kombination von verlangten Eigenschaften aufweisen.

Beispiel 6

Hydrogensulfit-Mutagenese von pMaTLIaß

Einsträngige DNA von pMaTLia6 wurde mit Sacll-Clal digei !ertem pMcTI ·ζΖ hybridisiert, um einen Heteroduplex mit einem von Position 4315 bis 4569 reichenden Spalt zu gewinnen (Figur C). Diuser Heteroduplex wurde der Hydrogensulfit-Mutagenese unterzogen (siehe experimenteller Teil).

Nach der Transformation in E.coil WK6 Mut 6 (Zeil, R., und Fritz, H. J., ebenda) und der Selektion auf Chloramphenicol enthaltenden Agarplatten (50Mg/ml) wurden Plasmidpools isoliert und in E.coil WK6 transformiert. E.coil WK6 Mut S wurde als CBS 472.88, E.coil WK6 als CBS 473.88 hinterlegt. Resultierende Transformanten wurden in BHI-Medium (DIFCO), das 2,OmM CaCI₂,50pg/ml Chlorampb micol und 0,2OmM IPTG (SIGMA) enthielt, 40 Stunden lang bei 37°C in Mikrotitervertiefungen ohne Schütteln gezüchtet. Das bcreening in bezug auf pH-beständige Mutanten wurde wie in Beispiel 5 beschrieben vorgenommen.

Etwa 300Cm^R Transformanten wurden gescreent. Die durch DNA-Sequenzierung bestimmte Mutationshäufigkeit betrug durchschnittlich 0,4 Mutation/Molekül über dem Spalt. Ein säurebeständiger Mutant, D 7, wurde nach dem pH-Screening identifiziert. Die Sequenzierung dieses Mutanten ergab Mutation H133Y, die ihren Ursprung in einer Mutation des kodierenden Triplets von CAC bis TAC hatte.

Mutant D7 erwies sich auch bei der Screeninganalyse hinsichtlich der Wärmebeständigkeit als positiv (Beispiel 5).

Die DNA-Sequenzierung erfolgte bei oinsträngiger DNA mit einem spezifischen Oligonucleotid, das für die Exprimierung unmittelbar vor dem Sacll-Clal-Fragment ausgelegt war. In einem getrennten Mutagenese-Experiment wurden 1000 Cm" Tranäformanten gescreent. Nach dem pH-Screening wurde ein weiterer säurebeständiger Mutant, 2D5, identifiziert. Dieser Mutant hat die folgenden Mutationen:

H133 Y CAC -> TAC

T1491 ACA -» ATA.

H"'rogensulfit-Mutagenese ist in einer ähnlichen Form, wie sie eben beschrieben wurde, am Clal-Sall-Spalt, der von Portion 4569 bis Position 4976 von Figur 3 reicht, angewandt worden. Etwa 300Cm^R Transformanten wurden gescreent (Mutationshäufigkeit 0,6 Mutationen/Molekül). Es wurden keine säurebeständigen Transformanten gefunden. Eine Anzahl .säurelabiler Mutanten wurde ermittelt. Von diesen säurelabilen Mutanten können einige ein verschobenes pH-Spektrum haben, was zu einem alkalibeständigeren Phänotyp führt.

Belspi ' 7

Enzymatlsche Mutagenese von pMaTLIa6

Einsträncjige pMaTLia6 (Figur 4) wurde mit CIaI-SaII digerierter pMcTLia6 zur Gewinnung eines von Position 4569 bis 4976 (Figur 3) reichenden Heteroduplex hybridisiert. Der gespaltene Duplex wurde einer enzymatischenFehleinfügungs-Mutagenese nach der Beschreibung im experimentellen Teil unterzogen.

Eine nach dATP-begrenzter Primerverlängerung gewonnene Probe wurde in drei Teile aufgespalten und in Gegenwart von Umkehrtranskriptase mit dCTP, dGTP bzw. dTTP inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten bei 37°C wurde eine Mengo (chase) mit allen vier dNTP's und Klenow-Polymerase gegeben, T4-DNA-Ligase wurde zugesetzt, um die Verlängerung bis zu vollkommen doppelsträngigen Molekülen zu beenden.

Diese Moleküle wurden in E. coll WK6 Mut S transformiert, und Plasmidpols wurden gewonnen. Diese Plasmidpools wurden anschließend in E. coll WK6 transformiert, und die Kolonien wurden auf Chloramphenicol (50Mg/ml) enthaltende Agarplatten selektiert. Resultierende Mutanten wurden in bezug auf die Beständigkeit von a-Amylase nach der Beschreibung in Beispiel 5 gescreent.

Bei einem anderen Experiment wurde der Spel-Sacll-Spalt begrenzter Primervorlängerung mit dATP, dCTP, dGTP bzw. dTTP unterzogen. Diese Primerpools wurden durch Fehleinfügung mutagenisiert (siehe experimenteller Teil). 100Cm" Transformanten wurden auf pH-Platten getestet (Beispiel 5), und von Mutant M29 wurde ermittelt, daß er bei niedrigem pH beständiger ist. Die Sequenz der Mutation wurde bestimmt:

A111T GCG -> TCG.

-11- 301 670

Beispiel 8

Eigenschaften bestandiger Mutanten

Zwei aus den Hydrogensulfit-Mutagenese-Exporimenten gewonnene Mutanton wurclon woiter charakterisiert. Wio ο on beschrieben führte DNA-Sequenzierung zu den folgenden Aminosäureaustauschmöglichkoiton:

- D7 enthielt ein Tyrosin an Position 133 anstelle eines Histidins(D7 ^ H 133Y),

- 2D5 enthielt die D-7-Mutation, und außerdem war Threonin 149 durch Isoleucin ersotzt worden (2 D5 « H133 Y. TK9I). a) Messung der enzymatischen Aktivität

Die enzymatische Aktivität von B.llchenHormUa-AmylaseWTund von Mutanten wurdo untor Anwendung von 4 Nitrophenylmaltopentaosid (4 NP-DP5) als Substrat gemessen, 4 Nitrophonol und Maltopontaoso worden gebildot, dieso Roaktiun konn durch Messen der Veränderung in OD405 verfolgt werden. Die Analyse wurde bei 35⁰C in 5OmM MOPS, 5OmM NaCI, 2 niM CaCI, (pH 7,15) und 0-1 mM 4NP-DP5 vorgenommen.

Anfangsraten wurden gemessen, und E-Nitiophenol wurde als iO000l/M/cm angenommen. Figur 9 zeigt dio Ergebnisse fur WT und 2D5-a-Amylasen. Vmax und Km wurden berechnet und si.to in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Vmax(pMol/min/mg) Km (mM)

WT 66,7 ±0,9 0,112 ±0.005

2D5 66,3 ±0,7 0,119 ±0,004

Tabelle I zeigt ganz deutlich, daß die Mutationen von α-Amylase 2D5 di« onzymatischo Aktivität nicht in orhoblichor Woiso beeinflussen.

b) Einfluß von Ca³* auf die Wärmeinaktivierung

Versuche zur Wärmeinaktivierung wurden für WT, D7 und 2D5 bei unterschiedlichen Calciumkonzentrationon vorgenommen.

Die Verfahrensweise war folgendermaßen:

1) Demetallislerung

Enzym (2-3mg/ml) 25h lang dialysiort in 3x11. 2OmMMOPS

5mMEDTA

5mM EGTA, pH 7,0 3 x 1L 2OmM MOPS, pH 7,0.

2) Remotallislerung

- 500μΙ Puffer 10OmM (z. B. MES, MOPS, EPPS)

- 145μΙ demelallisiertos Enzym (z.B. 2,15mg/ml)

- 100μΙ CaCI₂ (100, 50,30, 20,10, 5 oder 2,5mM)

- XMlK₂SO₄(IOOmM)

- (255 -χ)μΙΗ₂Ο

(CaCI₂J endgültig (K₂SO₄] endgültig

(mM) (mM)

0,25 14,75

0,5 14,5 ^

1 14

2 13

3 12 5 10 10 0

+ - pH MES,i.Q.6,77beinaumlemperolurwird6,0bei90'Corgeben(pKa6,15pKa/'C -· -0,011). - pKa stammte von Merck-Tabollo (Zwitterionische Puffereubetanjon)

3) WSrmeinaktivieruiig

1 ml bei Raumtemporatur vorinkubiorte Enzymlösung wurde in goschlossoron Pierce-Fläschchen (toflonboschichteto Dichtungen) in einer Konzentration von etwa 0,2mg/ml auf 90,5⁰C odor 95°C erwärmt. In rogolmäßigon Abstünden von 0 und 6 h wurden öO-pl-Proben mit einer Spritze entnommon und auf Eis gokühlt. Reaktivitäten bind mit 4 NP-DP5 (0,5mM) bestimmt worden.

Die Halbwortszeiten wurden mit Hilfo eines einfachen οχροηοηΙίυΙΙοη Vcirzögorungs-Anpassungsprogramms ((lHAPHAD) bestimmt.

Die Figuron 10 und 11 zoigon Halbwertszoiton von WT- und D7-a-Amylason boi pH-Worton von 5,5 bzw. 7,0 in Abhängigkeit von

der Ca²*-Konzentration bei 90,5⁰C. Die Ca²*-Abhängigkoit von 2 D5 wurdo nur boi pH 7,0 boi 95°C bestimmt (Figur 12). Es ist auch

zu erkennen, daß sich dio Ca²*-Abhongigkoit der Mutanton nicht von dor von WT unterscheidet.

c) Wftrmobestandigkeit von mutierten a-Amyloson boi vorschludonon pH-Werten Die pH-Abhängigkoit dor Wärmoinaktivioruno wurdo für D7 und 2D5 boi £)0,5°C bzw. 95^rC untor /vnwondung dos Puffors und» obiger Beschreibung boi oinor 1 mM Ca'*-Konzontration bostimmt. Es knnn dio Schlußfolrjorung gozogon wordon, daß dio Wärmeboständigkeit von D7 und 205 über den gosamton pH-Boroich orh.iblich jugonommon l>nt (bis zum Doppolton hol 2l)f>) (Figuren 13 und 14).

Beispiel 9 Produktion von mutierten Enzymen In Bacillus

Mutationen in der B.licheniformis a-Amylase, die durch Expression in E. coll WK 6 identifiziert wurden, wurden auf zwei unterschiedlichen Wegen auf einen Bacillus-Expressionsvector übertragen.

a. Mit Hilfe der einmaligen Restriktionsstellen innerhalb des α-Amylase-Gens (Figur 4) wurden Mutationen tragende Fragmente von pMaTLia6-Mutanten isoliert und in die homologe Position von pBMa6.Lia6 subkloniert. Das letztere Plasmid, das entweder in E.coll oder Bacillus repliziert werden kann, wurde anschließend mit Sacl digeriert und mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert. Nach der Transformation in Bacillus subtilis 1A10 wurde ein hoher Grad von a-Amylase-Produktion unter der Kontrolle des SPO₂-Promotors erzielt. Rezirkularisierte pBMa6.Lia6 wird pB6.Lia6 genannt, um die Entfernung des E. coli-Anteils des Vectors zu kennzeichnen.

b) Einsträngige pBMa6.Lia6-DNA wurde von E.coll gewonnen und mit Restriktionsenzym digerierter doppelsträngiger pBMc.6Lia6 digeriert, um einen gespaltenen Duplex mit dem beabsichtigten Spalt in dem a-Amylase-Gen zu erhalten. Dieser Spalt wurde anschließend ortsgerichteter Mutagenese mit einem Oligonucleotid (wie im experimentellen Teil beschrieben) unterzogen, das die verlangte Mutation kodiert. pBMc6.Lia6-Vector wird dann nach obiger Beschreibung in einen Vector des pB6.Lia6-Typs transformiert. Eine Kombination von verschiedener Mutation an einem Ort kann durch Methode a) vorgenommen werden, wenn die Mutationen in verschiedenen Spalten vorhanden sind, vorzugsweise wird aber Methode b) angewandt.

Die Mutationen der Mutanten D7 und 2 D 5 wurden mit Hilfe von Methode a) in pBMa6.Lia6 übertragen, indem die Sacll-Sall-Fragmente ausgetauscht wurden, und a-Amylase wurde aus dem Medium von transformiertem Bacillus subtilis 1A10 zurückgewonnen. Überstehendes beider Mutanten wurde den Screeningverfahren der Beispiele unterzogen, und es wurde bestätigt, daß beide Mutanten a-Amylase produzieren, die säurebeständiger und wärmebeständiger als a-Amylase ist, die von Wildtyp-pB6.Lia6 erzeugt wird.

Der Phänotyp d6r α-Amylase-Mutationen in Bacillus unterscheidet sich somit nicht vom Phänotyp in E. coil. Schließlich wurden pB6.Lia6-Mutanten in Bacillus licheniformis T9 transformiert, bei dem es sich um ein proteasenegatives, a-Amylase-negatives, a-Amylase-negatives Derivat von Bacillus licheniformis T5 handelt (Ep-0253455, CBS 470.83). Wirts T9 wurde zur Erzeugung großer Mengen von a-Amylase-Mutanten in einem homologen System eingesetzt. Durch die Entfernung des Chromosomen-a-Amylase-Gens ist dieser Stamm für die Produktion von mutierter a-Amylase sehr geeignet, weil keinerlei verunreinigende Wildtyp-a-Amylase erzeugt wird. Von diesem Stamm gewonnenes Enzym ist für die industrielle Anwendungserprobung verwendet worden. Es wurde die industrielle Verwendung der Mutanten pB6.Lia6.2D5 und pB6.Lia6.D7 demonstriert.

Peispiel 10

Anwendungstest von mutierter a-Amylase unter den Bedingungen der Stärkeverflüssigung Zur Erprobung von mutierter a-Amylase 2 D5 unter realistischeren Bedingungen wurden die Fermentationsbrühe (von Beispiel 9) durch Ultrafiltration gereinigt und das Enzym mit 50% Propylenglycol formuliert.

Es wurden drei Proben getestet:

893701: WT B. licheniformis T5 a-Amylase 1530TAU/g

893703: 2D5 Mutant, hergestellt als WT 2820TAU/g

Maxamyl 0819 Kommerzielle Probe 7090TAü/g.

Ein TAU (wärmebeständige a-Amylase-Einheit) wird als die Menge Enzym definiert, die unter standardisierten Bedingungen 1 mg Stärke pro Minute in ein Produkt umwandelt, daß nach der Reaktion mit Jod die gleiche Absorption für eine Bezugsfarbe bei 620nm aufweist. Standardbedingungen sind pH 6,6; 3O⁰C; Reaktionszeit: 20min. Als Bezugsfarbe dienen 25g CoCI₂ · 6H₂O, 3,84g K₂Cr₂O₇ und 1 ml HCL (1 M) in 100ml destilliertem H₂O.

1. Verflüssigungstest bei niedrigem pH (5,5 und 5,25)

Die Temperatur der Stärkeaufschlämmung wird so schnell wie möglich auf 110°C ±0,5°C erhöht und 6 Minuten lang auf diesem Wertgehalten.

Die Verflüssigung wird bei kontinuierlichem Fließen (5,4l/h) realisiert. 3 Proben von 135ml (1,5 Minuten Verflüssigung) werden nach 45,60 und 75 Minuten Verflüssigung entnommen und zwei Stunden !eng auf 95³C gehalten. Danach werden 50ml der Probe mit 0,4ml H₂SO₄ N angesäuert, um einen pH-Wert von 3,5 zu erzielen, und 10 Minuten lang in ein siedendes Bad gesetzt, um die enzymntische Aktivität vor der D. E.-Bestimmung zu stoppen.

Der übrige feil der Probe wird gekühlt, um die enzymatische Restaktivität zu bestimmen.

Aufschlämmungszusammensetzung:

3,3kg Maisstärke D.S. 88% (2,904kg Trockenstärke)

5,451 Brunnenwasser (40T.H.)

Trockensubstanz der Aufschlämmung beträgt 33%.

Der pH wird mit 1 N Schwefelsäure oder 1 N NaOH auf 5,5 korrigiert.

Enzymkonzentration: 4/TAU/g Trockenstärke.

Die Fließgeschwindigkeit wird zwei- oder dreimal während des Versuchs überprüft.

2. Bestimmung von D.E.

Die Trockensubstanz verflüssigter Stärke wird mit einem Refraktometer überprüft (etwa 34%). D.E. wird mit H üfe der allgemein bekannten Lane Eynon Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 15 wiedergegeben.

3. Enzymatische Restaktivität

Amylaserestaktivität in verflüssigter Stärke wird mit Hilfe eines Brabender-Amylographen bestimmt.

40 g Kartoffelstärke 3JO ml destilliertes W asser mit 50 ⁰C

50 ml TrisPuffer 0,05 M, pH 6,50 5 ml CaCI₂-2H₂O von 30 g/l

Die Temperatur wird auf 80 ⁰C erhöht (1,5 °/min), nach Stabilisierung der Viskosität (10 min) werden 5 ml verdünnte verflüssigte Stärke (7 g bis 50 ml mit destilliertem Wasser) zugegeben, die Abnahme der Viskosität nach 20 Minuten wird gemessen, diese Abnahme ist eine Funktion der enzymatischen Aktivität. Mit Hilfe einer Standardkurve mit bekannter enzymatischer Konzentration kann die Restaktivität in T.A.U. ermittelt werden.

Mutierte 2 D5 verhält sich erheblich besser bei pH < 5,5 und 110 ⁰C als WT-Enzyme. Eine Verbesserung von 2—3 DE-Einheiten bei pH 5,25 kann mit mutierter 2D5 erzielt werden.

Beispiel 11 Anwend"ngstest von mutierter a-Amylase unter den Bedingungen der Textilentschlichtung

Zur Prüfung der industriellen Anwendungsmöglichkeit von alkalischer a-Amylase-Mutanten wird ein Test in bezug auf die Beständigkeit bei 20 ⁰C in der folgenden Lösung durchgeführt:

1,4% H₂O (35%)

1,0-1,5% Natriumhydroxid (100%)

15-20 ml/l Natriumsilicat (38 Be)

0,3-0,5% Alkylbenzensulfonat (Lanaryl N.A. ICI)

0,5—1,0% Organisches Stabilisierungsmittel (Tinoclarite G).

Nach einer Inkubationszeit von 2,6 Stunden sollten die hinsichtlich ihrer beabsichtigten Eigenschaften ausgewählten ü-Amylase-Mutanten irgendwelche zurückbleibende Enzymaktivität besitzen.

Claims (21)

1. Mutierte α-Amylase, wobei es sich um das Expressionsprodukt einer mutierten, eine a-Amylase kodierenden DNA-Sequenz handelt, dadurch gekennzeichnet, daß die mutierte a-Amylase eine Aminosäuresequenz besitzt, die sich in mindestens einer Aminosäure von dem Wildtyp-Enzym unterscheidet, und daß die mutierte α-Amylase verbesserte Eigenschaften bei der Anwendung zum Abbau von Stärke und/oder der Textilentschlichtung zeigt, wobei die verbesserten Eigenschaften auf den Austausch von Aminosäuren zurückzuführen sind.

2. a-Amylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie verbesserte Wärmebeständigkeit aufweist.

3. α-Amylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie verbesserte Beständigkeit bei einem pH-Wert unter 6,5 und/oder über 7,5 aufweist.

4. α-Amylase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie verbesserte Wärmebeständigkeit und Säurebeständigkeit aufweist.

5. α-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Originalgen, von dem das mutierte Enzym abgeleitet ist, von einem Mikroorganismus, vorzugsweise einem Bacillus-Stamm, gewonnen wird.

6. a-Amylase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen von einem Wildtyp-Gen aus der B.stearothermophilus, B.iicheniformis und B.amyloliquefaciens umfassenden Gruppe ausgewählten Stammes abgeleitet ist.

7. α-Amylase nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich dieses Enzym von der von Bacillus licheniformis gewinnbaren Wildtyp-a-Amylase durch einen Aminosäureaustausch an einer oder an mehreren Position(en) 111,113 und 149 oder an entsprechenden Positionen in jeder beliebigen homologen a-Amylase unterscheidet.

8. α-Amylase nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere der folgenden Aminosäureaustauschmöglichkeit(en): Ala-111-Tr, His-133-Tyr, Thr-149-lle enthält.

9. Mutiertes Gen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine a-Amylase nach der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.

10. Expressionsvector, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mutiertes Gen nach Anspruch 9 aufweist.

11. Wirtszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Expressionsvector nach Anspruch 10 beherbergt.

12. Wirtszelle, die im wesentlichen nicht in der Lage ist, vor der Transformation extrazelluläre amylolytische Enzyme zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem Expressionsvector nach Anspruch 10 transformiert ist.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um B. licheniformis T9 handelt.

14. Bacillus/E.coli-Shuttle-Vector, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des Monierten Gens in E. coli durch die physikalische Trennung der regulierenden Sequenzen von dem Strukturgen unmöglich gemacht worden ist, und daß die Expression des Monierten Gens in Bacillus durch die Digestion mit einem einzigen Restriktionsenzym und anschließende Rezirkularisierung wieder hergestellt werden kann.

15. Methode zur Herstellung eines amylolytischen Enzyms mit verbesserten Eigenschaften für die Anwendung beim Stärkeabbau oder der Textilentschlichtung, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Schritte umfaßt:

- Mutagenisierung eines klonierten Gens, das ein in Frage kommendes amylolytisches Enzym oder ein Fragment davon kodiert;

- Isolierung des gewonnenen mutierten Amylase-Gens oder solcher Gene;

- Einfügung des gewonnenen mutierten Amylase-Gens oder solcher Gene in einen geeigneten Wirtsstamm zur Expression und Produktion;

- Gewinnung der erzeugten mutierten Amylase und

- Identifizierung derjenigen mutierten Amylasen mit verbesserten Eigenschaften zur Anwendung für den Stärkeabbau oder die Textilentschlichtung.

16. Verfahren zur Erzeugung einer mutierten α-Amylase, dadurch gekennzeichnet, daß

- eine Wirtszelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13 in einem geeigneten Medium kultiviert wird;

- die erzeugte α-Amylase gewonnen wird.

17. Anwendung der α-Amylase nach einem der Ansprüche I bis 8 für den Stärkeabbau und die Textilentschlichtung.

18. Verfahren für den Abbau von Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß eine mutierte a-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt wird.

19. Verfahren zur Entschlichtung von Textilmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß eine mutierte a-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 8 eingesetzt wird.

20. Stärkeabbauzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mutierte a-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 8 aufweist.

21. Textiientschlichtungszusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine mutierte a-Amylase nach einem der Ansprüche 1 bis 8 aufweist.