CN117305279B - 高活性和高耐热性的α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高活性和高耐热性的α‑淀粉酶突变体，来源于超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii，其氨基酸序列见SEQ ID NO:3，DNA序列见SEQ ID NO:4。具有活性高，稳定性好等优点，突变体的活性是野生型的1.6倍，在110℃的稳定性是野生型的2.4倍。经过在枯草芽孢杆菌W800N中表达，α‑淀粉酶突变体的酶比活力约为764U/mg，产量可达到的1751U/ml。适用于食品加工等领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种高活性和高耐热性的α-淀粉酶突变体及其制备方法和应用，属于蛋白表达技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase)是一种能够水解淀粉分子中α-1,4-糖苷键的酶，其在生物体内分布广泛，存在于微生物、植物和动物组织中。α-淀粉酶在工业上具有很高的应用价值，被广泛应用于食品、饲料、医药等领域的水解反应中，同时也是生物医药领域的研究热点之一。α-淀粉酶根据来源不同可分为四类：植物α-淀粉酶、动物α-淀粉酶、细菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶。不同来源的α-淀粉酶在性质和结构上存在一定的差异，但都具有相同的作用机制，即通过水解淀粉分子中的α-1,4-糖苷键来分解淀粉。植物α-淀粉酶主要存在于植物的种子、块茎和果实中，其结构与底物亲和力较高，具有较宽的底物特异性。动物α-淀粉酶主要存在于动物的唾液、胰脏和消化道中，其结构与底物亲和力较低，但具有较高的催化效率。细菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶具有多种来源，其中细菌α-淀粉酶具有较宽的底物特异性，而真菌α-淀粉酶则具有较窄的底物特异性。
α-淀粉酶在食品、饲料、医药等领域具有广泛的应用前景。在食品领域，α-淀粉酶可用于制作糖浆、葡萄糖等糖类制品，也可用于制作低聚糖、功能糖等新型糖类制品。在饲料领域，α-淀粉酶可用于提高饲料的利用率和动物的生长速度。在医药领域，α-淀粉酶可用于治疗糖尿病和其他糖代谢性疾病。具体来说，α-淀粉酶在食品加工中可以水解淀粉生成糊精、低聚糖等，提高食品的口感和营养价值。在饲料工业中，α-淀粉酶可以提高饲料的消化吸收率，促进动物生长。在医药领域，α-淀粉酶可用于制作药物载体和药物前体，同时也可以作为治疗剂和诊断剂用于疾病治疗和诊断。
尽管α-淀粉酶在各个领域的应用前景广阔，但仍存在一些问题需要进一步研究和解决。首先，不同来源的α-淀粉酶性质和功能存在差异，因此需要进一步了解其作用机制和构效关系。其次，目前α-淀粉酶的工业化生产主要依赖于微生物发酵法，但在发酵过程中存在产酶周期长、产酶效率低等问题，因此需要研究新的生产方法和提高产酶效率。此外，在使用α-淀粉酶的过程中也需要注意温度、pH值等参数的调节，以避免对底物和产物造成不良影响。尽管α-淀粉酶具有广泛的应用前景，但仍需要在了解其作用机制、提高产酶效率、优化使用条件等方面进行深入研究。随着科技的进步和研究的深入，相信α-淀粉酶在未来将会得到更加广泛的应用和推广。
发明内容
本发明发现了一种高活性和高耐热性的α-淀粉酶PyaAMY，来源于超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii，其氨基酸序列见SEQ ID NO:1，DNA序列见SEQ ID NO:2。对α-淀粉酶PyaAMY进行改造，获得α-淀粉酶突变体，氨基酸序列见SEQ ID NO:3，DNA序列见SEQ IDNO:4。突变体系对PyaAMY序列进行包含但不限于G3R、N4G、K5V、T6D、I7P、A8S、T9R、F10K、A11E、I12N、L13H、V15S、V15L、F16D、L17E、S18I、S18D、L19F、L20K、T21A、P23F、V24G、S25M、A26T、E27R、T28S、L29A、E30F、N31A、G32R、G33L、V34P、I35L、L36W、Q37K、A38Q、F39Q、Y40K、W41L、D42K、V43K、P44K、T45G、G46L、G47F、C165N、T360A中的一种或多种点突变组合。
本发明还公开了上述的α-淀粉酶突变体的表达载体。
所述载体为pHT01。
在表达载体中，α-淀粉酶突变体的N端连接有pelB信号肽和组氨酸标签。
本发明还公开了上述的α-淀粉酶突变体的表达宿主菌。
所述宿主菌为枯草芽孢杆菌W800N。
本发明还公开了上述的α-淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)在α-淀粉酶突变体的N端加上pelB信号肽和组氨酸标签，将其编码基因利用无缝克隆的方式构建到pHT01载体，获得α-淀粉酶突变体的表达载体pHT01-pelB-改造后PyaAMY；
(2)将表达载体pHT01-pelB-改造后PyaAMY转化到枯草芽孢杆菌W800N中，筛选出阳性单克隆；
(3)对筛选出的单克隆进行培养、诱导表达，纯化，获得α-淀粉酶突变体。
上述的α-淀粉酶突变体具有相较于野生型α-淀粉酶PyaAMY更高的α-淀粉酶活性，可用于水解淀粉分子。
本发明提供了一种高活性和高耐热性的α-淀粉酶突变体，来源于超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii，其氨基酸序列见SEQ ID NO:3，DNA序列见SEQ ID NO:4。具有活性高，稳定性好等优点，突变体的活性是野生型的1.6倍，在110℃的稳定性是野生型的2.4倍。经过在枯草芽孢杆菌W800N中表达，α-淀粉酶突变体的酶比活力约为764U/mg，产量可达到的1751U/ml。适用于食品加工等领域的应用。
附图说明
图1嗜热菌来源α-淀粉酶的结构聚类分析结果。
图2pTH-pelB-PyaAMY表达载体示意图。
图3SDS-PAGE检测发酵液上清中PyaAMY的表达量。
图4发酵液上清中α-淀粉酶PyaAMY活性测定。
图5PyaAMY的纯化结果。
图6PyaAMY的酶活测定。
图7PyaAMY的最适反应pH测定。
图8PyaAMY的最适温度测定。
图9PyaAMY在110℃中的半衰期测定。
图10PyaAMY的RMS稳定性打分。
图11改造后PyaAMY的RMS稳定性打分。
图12pTH-pelB-改造后PyaAMY表达载体示意图。
图13SDS-PAGE检测发酵液上清中改造后与改造前PyaAMY的表达量对比。
图14发酵液上清中α-淀粉酶改造后与改造前PyaAMY的活性对比。
图15改造后PyaAMY的纯化结果。
图16改造后与改造前PyaAMY酶活测定对比。
图17改造后与改造前PyaAMY的最适反应pH对比。
图18改造后与改造前PyaAMY的最适温度对比。
图19改造后与改造前PyaAMY在110℃中的半衰期测定对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但实施例的描述不对本发明的保护范围产生任何限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。
实施例1高活性和高耐热性的新型α-淀粉酶的查找。
在本实施例中，我们利用生物信息学技术对高活性和高耐热性的α-淀粉酶进行了检索和分析。具体流程如下：
利用结构聚类的方法，在极端微生物数据库ExtremeDB(http://extrem.igib.res.in)中对包含淀粉酶结构域的蛋白进行检索，共找到72种耐热菌种的α-淀粉酶(见图1)。其中来源于超嗜热火球菌Pyrococcus yayanosii的α-淀粉酶PyaAMY(氨基酸序列见SEQ IDNO:1，DNA序列见SEQ ID NO:2)之前并没有被报道，是筛选新型α-淀粉酶的理想靶标。
实施例2PyaAMY的表达。
为了检测PyaAMY的性能，我们使用枯草芽孢杆菌对PyaAMY进行表达，为了保证α-淀粉酶PyaAMY能够分泌到细胞外，我们在PyaAMY的蛋白质N端加入了pelB信号肽和组氨酸标签(pelB信号肽的氨基酸序列见SEQ ID NO:5，DNA序列见SEQ ID NO:6，组氨酸标签的氨基酸序列见SEQ ID NO:7，DNA序列见SEQ ID NO:8)。融合的基因合成于广州艾基生物，并由广州艾基生物无缝克隆至枯草芽孢杆菌常用表达载体pHT01(购自生物风)中。质粒图谱见图2。
我们将合成的质粒转化到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800N(购自HonorGene)感受态中，涂布在含50mg/L氯霉素的TB固体培养基中，37℃培养过夜。挑取单克隆至含50mg/L氯霉素的TB固体培养基中，37℃200rpm震荡培养至OD值达到0.8-1.0。加入终浓度为1mM的IPTG，37℃200rpm震荡培养12h。上清液使用SDS-PAGE检测蛋白的表达，并使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃(超嗜热火球菌最适生长温度)下测定酶活性。
SDS-PAGE结果见图3，含pelB的PyaAMY在培养基上清中有明显表达，而不含pelB的PyaAMY在培养基上清没有明显表达。
α-淀粉酶活性测定结果见图4，含pelB的PyaAMY在培养基上清中的α-淀粉酶浓度是1206U/ml，不含pelB的PyaAMY在培养基上清中的α-淀粉酶浓度只有176U/ml。含pelB的PyaAMY在培养基上清中的α-淀粉酶浓度是不含pelB的PyaAMY浓度的6.8倍。
实施例3PyaAMY的纯化。
为了检测PyaAMY的性能和稳定性，我们对枯草芽孢杆菌上清中表达的PyaAMY进行表达纯化。100ml培养基上清经10kD滤膜超滤至10ml体积，加入10ml PBS(pH7.5)，超滤至10ml体积，再加入10ml PBS(pH7.5)。直至无明显培养基颜色。
将处理好的培养基上清装载到Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒(购自生工生物)中，按照其说明书进行蛋白纯化和脱盐处理。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE检测。见图5。
实施例4PyaAMY的酶学性质确定。
为了检测PyaAMY的性能和稳定性，我们对枯草芽孢杆菌上清中纯化的PyaAMY进行了酶学性质检测。
酶比活性测定：我们使用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(购自生工生物)测定了纯化后的PyaAMY的蛋白浓度，再使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃下测定了不同浓度纯化的PyaAMY的活性。
结果见图6，PyaAMY的酶比活力为487U/mg。
最适pH测定：在不同反应pH中，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃下测定了纯化后的酶活性(10ug)。
结果见图7，PyaAMY的最适pH为6.5，且在4.5-8.5的pH范围内具有较高的酶活性。
最适温度测定：在不同温度中，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)测定了纯化后的酶活性(10ug)。
结果见图8，PyaAMY的最适反应温度为80℃，且在70-100℃的温度范围内具有较高的酶活性。
半衰期测定：在110℃中处理不同时间，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)测定了处理后的酶活性(10ug)。
结果见图9，PyaAMY在110℃中半衰期约为20min。
实施例5PyaAMY的稳定性分析和改造。
为了进一步提高PyaAMY的稳定性，我们对PyaAMY的氨基酸序列在110℃下进行了自由度均方根(Root mean square,RMS)分析。结果见图10，我们发现PyaAMY蛋白N端的RMS打分较高，影响了PyaAMY的稳定性。随后我们我们用foldx对PyaAMY的N端和中间区域进行稳定性预测和改造，改造后的PyaAMY的氨基酸序列见SEQ ID NO:3，DNA序列见SEQ ID NO:4。我们对改造后的PyaAMY的氨基酸序列在110℃下进行了RMS分析。结果见图11，无论是N端还是整体的蛋白质序列上，改造后的PyaAMY的RMS打分明显比野生型PyaAMY低，具有更好的稳定性。
实施例6改造后PyaAMY的表达。
为了检测改造后PyaAMY的性能，我们使用枯草芽孢杆菌对改造后PyaAMY进行表达，为了保证α-淀粉酶PyaAMY能够分泌到细胞外，我们在改造后PyaAMY的蛋白质N端加入了
pelB信号肽和组氨酸标签(pelB信号肽的氨基酸序列见SEQ ID NO:5，DNA序列见SEQ ID NO:6，组氨酸标签的氨基酸序列见SEQ ID NO:7，DNA序列见SEQ ID NO:8)。融合的基因合成于广州艾基生物，并由广州艾基生物无缝克隆至枯草芽孢杆菌常用表达载体pHT01(购自生物风)中。质粒图谱见图12。
我们将合成的质粒转化到枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800N(购自HonorGene)感受态中，涂布在含50mg/L氯霉素的TB固体培养基中，37℃培养过夜。挑取单克隆至含50mg/L氯霉素的TB固体培养基中，37℃200rpm震荡培养至OD值达到0.8-1.0。加入终浓度为1mM的IPTG，37℃200rpm震荡培养12h。上清液使用SDS-PAGE检测蛋白的表达，并使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃(超嗜热火球菌最适生长温度)下测定酶活性。
SDS-PAGE结果见图13，改造后与改造前PyaAMY在培养基上清中表达水平基本相当。
α-淀粉酶活性测定结果见图14，改造前PyaAMY在培养基上清中的α-淀粉酶浓度是1206U/ml。改造后PyaAMY在培养基上清中的α-淀粉酶浓度是1751U/ml，是改造前的1.46倍。
实施例7改造后PyaAMY的纯化。
为了检测改造后PyaAMY的性能和稳定性，我们对枯草芽孢杆菌上清中表达的改造后PyaAMY进行表达纯化。100ml培养基上清经10kD滤膜超滤至10ml体积，加入10ml PBS(pH7.5)，超滤至10ml体积，再加入10ml PBS(pH7.5)。直至无明显培养基颜色。
将处理好的培养基上清装载到Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒(购自生工生物)中，按照其说明书进行蛋白纯化和脱盐处理。将纯化的蛋白进行SDS-PAGE检测。见图15。
实施例8改造前和改造后PyaAMY的酶学性质对比。
为了比较改造前和改造后PyaAMY的性能和稳定性，我们对枯草芽孢杆菌上清中纯化的PyaAMY进行了酶学性质检测。
酶比活性测定：我们使用BCA法蛋白质浓度测定试剂盒(购自生工生物)测定了改造前和改造后PyaAMY的蛋白浓度，再使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃下测定了不同浓度纯化的改造前和改造后PyaAMY的活性。
结果见图16，改造前PyaAMY的酶比活力为487U/mg。改造后PyaAMY的酶比活力为764U/mg，是改造前的1.58倍。
最适pH测定：在不同反应pH中，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)在90℃下测定了纯化后的酶活性(10ug)。
结果见图17，改造前和改造后PyaAMY对pH的响应比较类似。
最适温度测定：在不同温度中，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)测定了纯化后的酶活性(10ug)。
结果见图18，改造后PyaAMY的最适反应温度为100℃，比改造前PyaAMY的最适反应温度略高，且在110℃中活性降低的幅度更小。
半衰期测定：在110℃中处理不同时间，我们使用α-淀粉酶活性检测试剂盒(购自索莱宝)测定了处理后的酶活性(10ug)。
结果见图19，改造后PyaAMY在110℃中半衰期约为49min，是改造前PyaAMY的2倍以上。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高活性和高耐热性的α-淀粉酶突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
2.权利要求1所述的α-淀粉酶突变体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
4.权利要求1所述的α-淀粉酶突变体的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述载体为pHT01。
6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述α-淀粉酶突变体的N端连接有pelB信号肽和组氨酸标签。
7.权利要求1所述的α-淀粉酶突变体的表达宿主菌。
8.根据权利要求7所述的表达宿主菌，其特征在于所述宿主菌为枯草芽孢杆菌W800N。
9.权利要求1所述的α-淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于其步骤包括：
(1)在权利要求1所述的α-淀粉酶突变体的N端加上pelB信号肽和组氨酸标签，将其编码基因利用无缝克隆的方式构建到pHT01载体，获得α-淀粉酶突变体的表达载体pHT01-pelB-改造后PyaAMY；
(2)将表达载体pHT01-pelB-改造后PyaAMY转化到枯草芽孢杆菌W800N中，筛选出阳性单克隆；
(3)对筛选出的单克隆进行培养、诱导表达，纯化，获得α-淀粉酶突变体。
10.权利要求1所述的α-淀粉酶突变体在水解淀粉分子中的应用。
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