DD286971A5 - Antivirale und antitumor-zusammensetzung, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft antivirale und Antitumor-Zusammensetzungen fuer die Anwendung als Arzneimittel. Erfindungsgemaesz enthalten die neuartigen Zusammensetzungen{Beseitigung; Besserung; Linderung oder Milderung von krankhaften Zustaenden, die von Viren oder Tumoren hervorgerufen werden wie Gebrechen; Schmerzen; Infektionen}

Description

R¹ - 0 - Cjf^ (I)

^S-R²

in welcher R¹ einen Norbornylrest, einen Tricyclodecylrest, einen Benzylrest, einen Alkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen, einen Furylrest, einen Pyridylrest, einen Chinuclinidylrest, einen Alkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen, der als Substituenton mindestens eine Hydroxygruppe oder Alkoxy gruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder mindestens ein Halogenatom aufweist, oder einen Cycloalkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen bedeutet, der als Substituenten mindestens eine Hydroxygruppe, mindestens eine Alkoxygruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, mindestens eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder mindestens ein Halogenatom aufweist, und R² ein Äquivalent eines einwertigen oder mehrwertigen Metallions, eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, die als Substituent mindestens eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe, eine Alkylaminogruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, eine Dialkylaminogruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in jeder der beiden Alkylgruppen, eine Trialkylaminogruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in jeder der Alkylgruppen oder mindestens ein Halogenatom aufweist oder die 2,3-DihydroxypropylgrL'ppe oder eine w-Hydroxy-ICi-Cj-alkoxy)-methylgruppe ist, und daß man das Xanthat mit der Hilfsverbindung in einem Molverhältnis von 1:6 bis 1:0,25, vorzugsweise 1:3 bis 1:0,5, und speziell bevorzugt 1:2 bis 1:1 vermischt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Hilfsstoff ein anionischer Hüfsstoff ist und daß man eine entsprechende pharmazeutische Zusammensetzung herstellt, insbesondere eine solche, die zur topischen Anwendung, oralen Anwendung oder parenteralen Anwend'"".g geeignet ist, vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Salbe, eines Gels oder eines Sprays oder in Form einer Tablette, einer Kapsel.

4. Verfahren zur Bekämpfung von Viren außerhalb des lebenden menschlichen Organismuses oder lebenden tierischen Organisir uses, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die Stellen, an denen die Viren bekämpft werden sollen, sowohl eine Verbindung mit antiviraler Wirksamkeit, vorzugsweise ein Xanthat mit antiviraler Wirksamkeit, als auch eine die Wirksamkeit der antiviralen Verbindung erhöhende Menge an mindestens einer Hilfsverbindung aufträgt, die in ihrem Molekül mindestens eine lipophile Gruppe und außerdem mindestens ei.ie hydrophile Gruppe aufweist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine pharmazeutische Zusammensetzung, für die Behandlung der Immunschwächekrankheit AIDS, hergestellt wird.

Hierzu 3 Seiten Zeichnungen

Anwendu- gsgeblet der Erfindung

Die Erfindung betrifft untivirale und Antitumor-Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die vorliegende) Erfindung neue Zusammensetzungen, die geeignet sind um Viren und Tumore zu bekämpfen, d. h. vorzugsweise pharmazeutische Zusammensetzungen, die geeignet sind um durch Viren oder Tumore hervorgerufene krankhafte Zustände zu beseitigen, zu bessern, zu lindern oder zu mildern, oder um Viren und Tumore zu bekämpfen. Zu den krankhaften Erscheinungen, die von Viren oder Tumoren hervorgerufen werden, gehören beispielsweise Gebrechen, Schmorzen, Infektionen und Krankheiten.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik In der DE-OS Nr.3146772, und ferner in der GB-PS Nr. 2091244, den CA-PS Nr. 1174978 und 1175047, sowie in der US-PS Nr.4602037, die am 22. Juli 1986 veröffentlicht werden wird, werden Xanthate beschrieben, die interessante pharmakologische Eigenschaften besitzen, insbesondere antivirale Aktivitäten und Antitumor-Aktivitäten oder entsprechende Wirksamkeiten. Ziel der Erfindung Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung einer neuartigen Zusammensetzung mit starker entiviraler und Antitumor-Wirkung. Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete Komponenten aufzufinden, die eine Zusammensetzung mit den

gewünschten Eigenschaften ergeben.

Erfindungsgemäß enthalten die neuartigen Zusammensetzungen zusätzlich zu einem Wirkstoff mit antiviraler Aktivität oder Antitumor-Aktivität, vorzugsweise einem Xanthat, einen ionischen Zusatzstoff, der sowohl mindestens eine Npophile als auch

mindestens eine hydrophile Gruppe aufweist und der die antivirale Aktivität und Antitumor-Aktivität des Wirkstoffes erhöht oder steigert.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß bestimmte Hilfsstoffe oder Zusätze, die selbst keine antivirale Aktivität oder Antitumor-Aktivität aufweisen, die Wirkungsweise der antiviral wirkenden und Antitumor-wirkenden Xanthate erhöhen,

insbesondere derjenigen, die in der DE-OS 3146772 beschrieben sind, die am 2.September 1982 veröffentlicht wurde, sowie in der GB-PS 2091244 genannt sind, die am 28. Juli 1982 veröffentlicht undam 6. Februar 1985erteilt wurde, und diejenigen, die in den Ca-PS Nr. 1,174,978 und 1,175,047 genannt sind, die beide am 25. September 1984 veröffentlicht wurden und ferner auch in dem US-PS Nr.4602037 geoffenbart sind.

Erfindungsgemäß werden Zusammensetzungen mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit zur Verfugung gestellt,

die nützlich sind, um durch Viren und durch Tumore hervorgerufene krankhafte Erscheinungen zu bekämpfen und die als aktiven

Bestandteil eine bekannte Verbindung mit antiviraler Aktivität und Antitumor-Aktivität enthalten, vorzugsweise ein Xanthat und

insbesondere bevorzugt ein solches, welches die folgende allgemeine Formel I

aufweist.

In dieser Formel I bedeutet R' einen Norbornylrest, einen Tricyclodecylrest, einschließlich des Adamantylrestes, einen Benzylrest, einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen, einen Cyrloalkylrest mit

3-20 Kohlenstoffatomen, einen Furylrest, einen Pyridylrest oder einen Chinuclidinylrest (also einen 1-Azabicyclo[2,2,2]-octylrest) oder einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylreot mit 3-20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls als

Substituenten Hydroxygruppen, Alkoxygruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder Halogenatomen aufweist oder einen der

vorhin genannten Cycloalkylreste mit 3-20 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls als Substituenten Hydroxygruppen,

Alkoxygruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen, Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder Halogenatome aufweist und R²

bedeutet ein Äquivalent eines einwertigen oder mehrwertigen Metallions, einen gradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls als Substituenten Hydroxygruppen, Alkoxygruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen, Aminogruppen, Alkylaminogruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen, Dialkylaminogruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen in jeder der beiden Alkylgruppen, Trialkylaminogruppen mit 1 oder 2 Kohlenstoffatomen in jeder der

Alkylgruppen, Halogenatome, 2,3-Dihydroxypropylgruppen oderio-Hydroxy-iCi-CralkoxyJ-methyl-gruppen aufweist. Ein wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist dasjenige, daß sie als weitere Komponente

mindestens einen ionischen Zusatzstoff enthalten, der sowohl mindestens eine lipophile Gruppe als auch mindestens eine hydrophile Gruppe in seinem Molekül aufweist.

Diese beiden Bestandteile sind für die vorliegende Erfindung wesentlich und dementsprechend enthalten die

erfindungsgemäßen Zusammensetzungen diese beiden Bestandteile oder sie bestehen hauptsächlich aus diesen beiden

Bestandteilen. Das ionische Hilfsmittel oder die Verbindung, welche die Wirksamkeit steigert, muß sowohl mindestens eine lipophile Gruppe

als auch mindestens eine hydrophile Gruppe aufweisen und diese Verbindung ist vorzugsweise eine solche, in welcher die lipophile Gruppe eine geradkettige oder verzweigtkettige oliphatische Gruppierung mit 6 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatomen ist, während die hydrophile Gruppe vorzugsweise 1 oder 2 Carboxylgruppen und/oder 1 oder 2 Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen oder Phosphatgruppen aufweist.

Speziell vorteilhaft ist diese ionische Verbindung eine aliphatische Monocarbonsäure oder Dicarbonsäure mit 6 bis einschließlich

18 Kohlenstoffatomen oder eine Monosulfat- oder Disulfat-Verbindung, eine f/ sulfonat- oder Disulfonat-Verbindung oder eine Monophosphat- oder Diphosphat-Verbindung, wobei diese Verbindunge e gleiche Anzahl an Kohlenstoffatomen aufweisen und wobei sie außerdem 1 oder 2 Äthergruppierungen und/oder A ndgruppierungen aufweisen. Des weiteren sind aliphatische Monocarbonsäuren mit 9 bis einschließlich 13 Kohlenstoffatomen, sowie ferner Fettalkoholsulfate, Fettalkohol·

Äthersulfate, Fettalkoholphosphate, Fettalkohol-Ätherphosphate, Alkansulfonate, olefinische Sulfonate, Sulfocarbonsäureester

und Glyzeridsulfate geeignet, wobei diese genannten Verbindungen in jedem Fall 8 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatome aufweisen.

Mit Vorteil können Steroidsäuren, wie zum Beispiel Desoxycholsäure, angewandt werden, vorzugsweise in Form eines Alkalimetallsalzes dieser Säuren, beispielsweise in Form des Natriumsalzes oder Kaliumsalzes. Insbesonders vorteilhaft sind

natürlich vorkommende Fettsäuren oder Fettalkoholsulfate mit 8 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 8 bis einschließlich 14 Kohlenstoffatomen und speziell bevorzugt 10 bis einschließlich 12 Kohlenstoffatomen. Aus dieser Reihe an

Verbindungen scheint eine Kohlenstoffanzahl von 11 Kohlenstoffatomen das Optimum zu sein. Im allgemeinen kann die als Hilfsmittel eingesetzte Verbindung vorteilhafterweise etwa 8 bis etwa einschließlich

24 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 8 bis einschließlich 14 Kohlenstoffatome, enthalten und sie ist vorzugsweise anionisch und sie wird ferner mit Vorteil in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes der anionischen Verbindung eingesetzt, beispielsweise in Form eines Alkalimetallsalzes, wie zum Beispiel als Natriumsalz oder Kaliumsalz dieser Verbindung.

In der Folge werden nun die Zeichnungen kurz erläutert. Figur 1 veranschaulicht den Einbau von radioaktiv markiertem Uridin in Fibronucleinsäure. Als Hilfsmittel wurde bei dieser Untersuchung Undekansäure verwendet und auf der Abszisse ist die Menge an Undekansäure in μg pro ml angegeben. Auf der Ordinate ist die gemessene Menge an Trizium in

³Hcpmxi0'⁴

engeführt. Es wurden Präparate untersucht, die jeweils eine konstante Menge, nämlich 20pg/ml an dem aktiven Bestandteil

DEXA (aktiver Bestandteil D609) enthielten und variable Mengen an dem Hilfsmittel, nämlich lOpg/ml bis lOOpg/ml an der Undekansäure. Die Aufnahme des radioaktiv markierten Uridines wurde an transformierten und nicht transformierten, also

normalen, Fibrinoplastzellen von Mäuseembryonen bestimmt.

In Figur 2 wird das Ansprechen auf eine Behandlung von Tumoren durch intravenöse Injektion veranschaulicht. Die Tumore, die

behandelt wurden, waren induzierte Hauttumore. Auf der Abszisse der Fig. 2 sind die Tage eingetragen, nämlich 1-5 Tage.

Ferner sind oberhalb dieser Zeitskala die Zeitpunkte eingetragen, an denen intravenöse Behandlungen durchgeführt wurden,

und zwar jeweils eine Anzahl von 10, bzw. eine Anzahl von 3 intravenösen Behandlungen. Auf der Ordinate ist die durchschnittliche Tumorgröße in % angegeben. Bei der Kurve, deren Meßpunkte in unausgefüllten Kreisen aufgetragen sind, handelt es sich um die Vergleichsgruppe, an die weder Wirkstoff noch ionische Hilfssubstanz verabreicht wurde. Bei der Kurve, deren Meßpunkte in Dreiecken angegeben ist, wurde an die Tiere nur die ionische Verbindung, nämlich Undekansäure, in einer

Menge von 10mg/kg Körpergewicht verabreicht. Bei der Kurve, deren Meßpunkte in Quadraten eingezeichnet sind, wurde an die Tiere nur der Wirkstoff, also das Xanthat mit der Bezeichnung DEXA verabreicht, und zwar in einer Menge von 10mg/kg Körpergewicht. Bei der Kurve, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Kreisen angegeben sind, wurde an die Tiere sowohl 10 mg DEXA pro kg Körpergewicht, als auch 10mg Undekansäure pro kg Körpergewicht verabreicht. In Fig.3 wurde der synergistische Effekt von verschiedenen Monocarbonsäuren in Kombination mit dem Xanthatwirkstoff der Bezeichnung D609 untersucht. Auf der Abszisse :st die Anzahl der Kohlenstoffatome der jeweiligen Monocarbonsäure

aufgetragen, nämlich 6,8,9,10,11,12,14,16 und 18. Auf der Ordinate ist der Faktorder Hemmung aufgetragen. Die Bestimmung der antiviralen Aktivität und der Cytotoxizität der Kombination aus Wirkstoff und Monocarbonsäure wurde sowohl an nicht infizierten Ritazellen untersucht (siehe die Kurve deren Meßpunkte mit unausgefüllten Dreiecken dargestellt ist) als auch an mit

HSV-1 -infizierten Ritazellen untersucht (siehe die Kurve, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Quadraten dargestellt sind). In Fig.4 wird die Hemmung des Wachstums des Herpesvirus untersucht. Es wurden dazu verschiedene Konzentrationen des Xanthatwirkstoffes mit der Bezeichnung D609 in Kombination mit verschiedenen Gewichtsverhältnissen an Undekansäure

verabreicht.

Auf der Abszisse der Fig. 4 sind d'i verabreichten Konzentrationen in pg/ml aufgetragen. Auf der Ordinate der Fig. 4 ist der Faktor

der Hemmung aufgetragen.

In Fig. 5 sind Ergebnisse der Gelelektrophorese veranschaulicht. Aus diesen Ergebnissen sieht man, daß eine vollständige Hemmung der Vermehrung von HTLVIII-Virus erreicht werden konnte. In Fig.6 sind die Ergebnisse einer Behandlung von Meth-A-Tumor, unmittelbar nach einer Transplantation veranschaulicht. Auf

der Abszisse dieser graphischen Darstellung sind die Tage dargestellt, die nach der Transplantation verstrichen sind. Auf der

Ordinate sind die Anzahl der Tiere dargestellt, die zum jeweiligen Zeitpunkt überlebt hatten. An diejenige Gruppe von Tieren,

deren Meßpunkte in Quadraten veranschaulicht sind, wurde kein Medikament verabreicht und man sieht, daß bei dieser Gruppe an unbehandelten Tieren am 25. Tag nach der Verpflanzung des Tumors alle Tiere gestorben waren. An diejenige Gruppe von

Tieren, deren Meßpunkte mit Kreisen dargestellt sind, wurde sowohl das Xanthat mit der Bezeichnung D609 verabreicht als auch Undekansäure. Man sieht daraus, daß von den renn untersuchten Tieren zwei am 12.Tag gestorben waren, die übrigen 8 Tiere

jedoch nach dem 30.Tag weiterlebten, und zwar ein Alter von mehr als 90 Tagen erreichten.

In Fig.7 sind die Ergebnisse veranschaulicht, die bei einer Behandlung von Meth-A-Tumor erreicht wurden, wenn die

entsprechende Behandlung beträchtlich nach der Transplantation des Tumors gewonnen wurde. Auf der Abszisse ist wieder die

Anzahl der Tage aufgetragen und auf der Ordinate die Anzahl der Tiere, die zum gegebenen Zeitpunkt überlebt hatten. Diejenige Kurve, deren Meßpunkte mit Quadraten dargestellt sind, unveranschaulicht die Ergebnisse der Kontrollgruppe an Tiefen, die

keiner Behandlung unterzogen worden waren. Wie man sieht, waren in dieser Gruppe 23 Tage nach der Verpflanzung des

Tumors sämtliche zehn Tiere gestorben. Bei der Kurve, deren Meßpunkte mit Kreisen dargestellt sind, wurde eine Behandlui.y

sowohl mit dem Xanthat mit der Bezeichnung D609 als auch mit Undekansäure vr rgenommen. Einige Tiere dieser Gruppe überlebten den 30.Tag und dann noch mehr als 65 Tage.

In Fig.8 ist die Empfindlichkeit von verschiedenen Zellen gegenüber einer kombinierten Behandlung mit dem Xanthat mit der Bezeichnung D609 und Undeki'nsi'ure veranschaulicht. Auf der Abszisse dieser Figur ist die Konzentration an D609 und an Undekansäure, die jeweils verwendet wurde, in Mg/ml gegeben, und zwar oberhalb des Bruchstriches die Konzentration an D609, die jeweils bei 5 Mg/ml konstant gehalten wurde und unterhalb des Bruchstriches die Konzentration an Undekansäure, die

0,10,20,40 bzw. 60pg betrug. Auf der Ordinate ist die relative Anzahl der Zellen in % angegeben. Die untersuchten Zellen waren normale Blutlymphozyten, T-Zellen und B-Zellen-Lymphome.

In der Folge werden die Ziele der vorliegenden Erfindung näher erläutert.

Man war bestrebt, eine Zusammensetzung mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit bereitzustellen, die einen bekannten Wirkstoff mit antiviraler Aktivität, bzw. Antitumor-Aktivität enthält, vorzugsweise eine Xanthatverbindung und die als weitere Komponente eine die Aktivität des Wirkstoffes erhöhende Menge an einem ionischen Zusatz oder Hilfsmittel enthält, wobei diese ionische Verbindung sowohl mindestens eine lipophile Gruppe als auch mindestens eine hydrophile Gruppe aufweist. Durch diesen weiteren Zusatz wird auch die Wirksamkeit eines Xanthates mit antiviraler Wirkung an Antitumor-Wirkung auf einen breiteren pH-Bereich ausgedehnt, einschließlich die physiologischen pH-Bereiche. Des weiteren war man bestrebt, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Zusammensetzungen bereitzustellen. Entsprechende erfindungsgemäße pharmazeutische Präparate können eingesetzt werden, um eine antivirale therapeutische Behandlung oder Antitumor therapeutische Behandlung durchzuführen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein pharmazeutisches Präparat, das eine synergistische Wirkung mit einem pharmazeutischen Präparat aufweist, das als Wirkstoff ein Xanthat mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit enthält. Dieses synergistisch wirkende pharmazeutische Präparat enthält eine ionische Verbindung, die in ihrem Molekül mindestens eine lipophile Gruppe und mindestens eine hydrophile Gruppe aufweist und das fragliche Präparat kann gleichzeitig mit dem Xanthat mit antiviraler und Antitumor-Wirksamkeit oder vor oder nach dem Xanthat mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit verabreicht werden um die Bekämpfung der Viren, bzw. der Tumore zu erreichen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von sowohl einem Mittel mit antiviraler Wirksamkeit als auch einer ionischen Verbindung, die in ihrem Molekül mindestens eine hydrophile Gruppe und mindestens eine lipophile Gruppe aufweist, zur Bekämpfung von Viren außerhalb eines lebenden tierischen OVganismuses oder menschlichen Organismuses, beispielsweise zur desinfizierenden Behandlung von Substraten zur Abtötung von darauf befindlichen Viren. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine pharmazeutische Zusammensetzung mit antiviraler und Antitumor-Wirksamkeit, die als Komponenten

(a) ein Xanthat mit antiviraler Wirkung und Antitumor-Wirkung und

(b) einen ionischen Hilfsstoff enthält, der sowohl eine lipophile Gruppe als auch eine hydrophile Gruppe enthält. Bevorzugte Xanthate, deren Wirksamkeit durch den ionischen Hilfsstoff erhöht wird, sind solche, welche die folgende allgemeine Formel I

S - r2 (I)

aufweisen, in welcher

R¹ ein Norbornylrest, ein Tricyclodecylrest, ein Benzylrest, ein Alkylrest mit 3-20 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylrest mit

3-20 Kohlenstoffatomen, ein Furylrest, ein Pyridylrest oder ein Chinuclinidylrest ist oder ein Alkylrest ist, der 3-20 Kohlenstoffatome aufweist und als Substituenten mindestens eine Hydroxygruppe, Alkoxygruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder mindestens ein Haloqenatom aufweist oder zwei oder mehr unterschiedliche der genannten

Substituenten trägt oder ein Cycloalkylrest, der ν /Ό Kohlenstoffatome aufweist und als Substituenten mindestens eine Hydroxygruppe, Alkoxygruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder mindestens ein Halogenatom aufweist oder zwei oder mehr unterschiedliche der genannten Substituenten trägt und wobei R² ein Äquivalent eines einwertigen oder mehrwertigen Metallatoms darstellt oder ein Alkylrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, ein Alkylrest mit 1-6 Kohlenstoffatomen, der als Substituenten mindestens eine Hydroxygruppe, eine Alkoxygruppe mit

1-4 Kohlenstoffatomen, eine Aminogruppe, eine Monoalkylaminogruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in der Alkylgruppe, eine

Dialkylaminogruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen in jeder der beiden Alkylgruppen, eine Dialkylaminogruppe mit

1 -4 Kohlenstoffatomen in jeder der Alkylgruppen oder ein Halogenatom trägt oder eine 2,3-Dihydroxypropyl-gruppe oder einen ü>-Hydroxy-(Ci-C4-alkoxy)-methyl-rest.

Bevorzugte in den Zusammensetzungen enthaltene ionische Hilfsmittel sind solche, in welchen die lipophile Gruppe eine

aliphatische Gruppe mit sechs bis einschließlich 18 Kohlenstoffatomen ist und die hydrophile Gruppe ein oder zwei

Carboxylgruppen, Sulfatgruppen, Sulfonatgruppen oder Phosphatgruppen oder pharmazeutisch annehmbare Salze dieser

genannten Gruppen enthält.

Bevorzugte ionische Hilfsmittel sind entsprechende aliphatische Monocarbonsäuren oder Dicarbonsäuren oder entsprechende Säuren, die fluoriniert sind oder aliphatische Monosulfate oder Disulfate oder Monosulfonate oder Disulfonate oder Monophosphate oder Diphosphate, wobei in jedem der genannten Fälle der lipophile Teil des Moleküls 6 - einschließlich

18 Kohlenstoffatome aufweist oder entsprechende Verbindungen, die ein oder zwei Äthergruppen oder Amidgruppierungen aufweisen oder pharmazeutisch annehmbare Salze der genannten Verbindungen.

Bevorzugte ionische Verbindungen, die als Hilfsmittel geeignet sind, aliphatische Monocarbonsäuren, die 9 bis einschließlich

12 Kohlenstoffetome aufweisen, wobei die entsprechenden Säuren gegebenenfalls fluoriniert sind und ferner pharmazeutisch annehmbare Salze dieser Säuren, sowie 8 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatome aufweisende Fettalkoholsulfate oder

Fettalkoholphosphate oder Fettalkoholätherphosphate oder Fettalkoholäthersulfate oder Alkansulfonate oder olefinische Sulfonate oder Sulfocarbonsäureester oder Glyzeridsulfate oder pharmazeutisch annehmbare Sake der genannten Verbindungen. Typische Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende ionische Hilfsstoffe sind natürlich vorkommende Fettsäuren oder Fettalkoholsulfate, wobei die fraglichen Verbindungen etwa 8 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatome aufweisen oder

pharmazeutisch annehmbare Salze der genannten Verbindungen.

Weitere Beispiele für ionische Hilfsstoffe sind entsprechende anionische Verbindungen, die etwa 8 bis einschließlich 24,

vorzugsweise 8 bis einschließlich 14 Kohlenstoffatome, enthalten.

Bevorzugte Beispiele für Xanthate der vorne angegebenen Formel I sind diejenigen, in welchen R¹ ein Benzylrest, ein Cyc'ohexylrest, ein Tricyclodecylrest, ein 1 -Norbornylrest, ein Dyclododecylrest, ein n-Dodecylrest oder ein

4-lsobornylcyclohexylrest ist und in welchen

R² ein Natriumion oder Kaliumion ist oder einen Alkylrest mit 1-4 Kohlenstoffatomen bedeutet. Diese bevorzugt einzusetzenden Xanthate der Formel I werden vorzugsweise in Kombination mit einer Hilfsverbindung

verwendet; die eine natürlich vorkommende Fettsäure oder ein Fettaikoholsulfat ist, wobei die fraglichen Verbindungen 8 bis einschließlich 14 Kohlenstoffatome aufweisen oder Alkalimetallsalze der genannten Verbindungen sind.

Beispiele für verwendbare Xanthate sind die folgenden: Natrium- oder Kalium-benzylxanthat. Natrium-oder Kalium-cyclohexylxE at, Natrium- oder Kalium-1 -adamantylxanthat, Natrium- oder Kalium-8(9)-tricyclo-[5-2.1.0")-decylxanthat, Natrium- oder Kalium-2-endo- oder exo-bicyclo-[2.2.1 ^Ml-heptylxanthat, Natrium- oder Kalium-cyclododecylxanthat, Natrium- oder Kalium-n-dodecylxanthat, oder Natrium- oder Kalium-4-isobornyl-cyclohexylxdnthat.

Die fraglichen Verbindungen werden mit Vorteil mit einem Hilfsmittel kombiniert, das eine aliphatische Monocarbonsäure mit 9 bis einschließlich 13 Kohlenstoffatomen oder ein Natriumsalz oder Kaliumsalz desselben ist oder das ein Fettalkohuläthersulfat oder -phosphat oder -phosphonat ist, wobei die fraglichen Verbindungen 8 bis einschließlich 18 Kohlenstoffatome aufweisen oder Natriumsalze oder Kaliumsalze derselben sind oder der Hilfsstoff ist ein Alkalimetall-desoxycholat. Typische Beispiele für derartige Hilfsstoffe sind das Natriumsalz oder das Kaliumsalz der Dekansäure, der Undekansäure, der Dodekansäure, der Desoxycholsäure, das Natriumsalz oder Kaliumsalz des Dodecylsulfates oder der Dodecylphosphonsäure. In den entsprechenden Zusammensetzungen ist das Molverhältnis von Xanthat zu Hilfsstoff vorzugsweise in der Größenordnung von 1:6 bis 1:0,25, und vorzugsweise im Bereich von 1:3 bis 1 ;0,5, und insbesondere im Bereich von 1:2 bis 1:1. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen können solche sein, dio zur örtlichen Anwendung (topisch), zur oralen Anwendung oder zur parenteralen Anwendung geeignet sind und beispielsweise können entsprechende pharmazeutische Formulierungen in Form von Salben oder Gelen oder Sprays oder in Form von Tabletten, Kapseln, Sijppositorien oder Lösungen vorliegen, die zur Infusion oder zur Injektion geeignet sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäSen antiviralen und Antitumor-Zusammensetzung, die eine erhöhte antivirale Aktivität, bzw. Antitumor-Aktivität ist, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man zu einor pharmazeutischen Zusammensetzung eine bekannte Xanthatverbindung mit antiviraler Aktivität und Antitumor-Aktivität und ferner eine die Aktivität erhöhende Menge eines ionischen Hilfsmittels formuliert, wobei das ionische Hilfsmittel sowohl mindestens eine hydrophile Gruppe als auch mindestens eine lipophile Gruppe aufweist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird das Molverhältnis des Xanthates zu dem Hilfsmittel vorzugsweise im Bereich von 1:6 bis 1:0,25, speziell bevorzugt im Bereich von 1:3 bis 1:0,5 und insbesondere im Bereich von 1:2 bis 1:1 eingehalten. In den so hergestellten pharmazeutischen Präparaten ist das Hilfsmittel vorzugsweise eine anionische Verbindung und die Präparate können so formuliert werden, daß sie zur topischen Anwendung, zur oralen oder parenteralen Anwendung geeignet sind, wie zum Beispiel vorzugsweise in Form einer Salbe, eines Gels oder eines Sprays oder in Form einer Tablette, einer Kapsel oder eines Zäpfchens oder einer zur Infusion oder Injektion geeigneten Lösung. Die so hergestellten pharmazeutischen Präparate können zur Bekämpfung von Viren und von Tumoren eingesetzt werden.

Des weiteren ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Viren oder Tumoren vorgesehen, bei dem man an das zu behandelnde Tier oder den zu behandelnden Menschen, bzw. an die von einem Virus oder Tumor befallenen Stellen, ein chemotherapeutisches Mittel aufträgt, wobei gleichzeitig oder aufeinander folgend ein Mittel eingesetzt wird, das als Wirkstoff ein Xanthat mit antiviraler Wirkung und Antitumor-Wirkung enthält und außerdem ein pharmazeutisches Mittel eingesetzt wird, das ein synergistisch damit wirkendes ionisches Hilfsmittel enthält, das sowohl mindestens eine lipophile Gruppe als auch mindestens eine hydrophile Gruppe enthält und wobei die Mengen an jedem der beiden pharmazeutischen Mittel so eingehalten werden, d&ß eine antivirale Wirkung oder eine Antitumor-Wirkung erreicht wird.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung von Viren oder Tumoren, indem man an die befallenen menschlichen oder tierischen Patienten ein Mittel verabreicht oder die von einem Virus oder einem Tumor befallenen Stellen mit einem Mittel behandelt, das sowohl eine Xanthatvorbindung mit antiviraler Aktivität und Antitumor-Aktivität als auch ein ionisches Hilfsmittel enthält, das mindestens eine hydrophile Gruppe und mindestens eine lipophile Gruppe aufweist, und wobei die angewandten Mengen so sind, daß eine Beseitigung oder Änderung des krankhaften Zustandes erreicht wird. Bei den erfindungsgemäß zu vorwendenden Hilfsmitteln, die eine synergistische Wirkung mit dem Bestandteil, der antivirale Wirksamkeit oder Antitumor-Wirksamkeit besitzt, aufweisen, ist es vorteilhaft, wenn die hydrophile Gruppe, nämlich vorzugsweise die Carboxylgruppe, die Sulfatgruppe, die Sulfonatgruppe oder die Phosphatgruppe des genannten Hilfsmittels sich an einem Ende des Moleküls befindet, wobei die lipophile Gruppe vorzugsweise eine längere aliphatische Kette ist, wobei die hydrophile Gruppe an ein Ende dieser Kette gebunden ist. Auf diese Weise entsteht ein polares Molekül, das einen hydrophilen .Kopf" und einen lipophilen ,Körper" besitzt. Speziell bevorzugte Carbonsäuren des angegebenen Typuses sind also Carprinsäure, welche die Formel

CHr-(CH₂)a-COOH aufweist, Undekansäure der Formel

CHj-(CH₂I₁T-COOH und Dodekansäure der Formel

CH₁-(CHj)₁₀-COOH.

Die als Hilfsmittel dienenden Verbindungen sind dementsprechend vorzugsweise Verbindungen mit einer anionischen hydrophilen Gruppe. Diese werden speziell bevorzugt in. Form von pharmazeutisch annehmbaren Salzen eingesetzt, insbesondere Alkalimetallsalzen, wobei von diesen wiederum die entsprechenden Natriumsalze oder Kaliumsalze spezioll bevorzugt sind. Es können jedoch auch andere kationische Verbindungen eingesetzt werden, wie zum Beispiel quaternäre Ammoniumsalze, die ebenfalls zum Stande der Technik gehören und auch diese Verbindungen können in manchen Fällen mit Vorteil verwendet werden, wobei sie die Anforderungen treffen müssen, daß sie eine lipophile Gruppe und einen hydrophilen Rest aufweisen. Weitere Beispiele werden in der Folge noch erwähnt.

Entsprechende Carbonsäuren kön.ien fluoriert oder perfluoriert sein, d. h. also einige der an Kohlenstoff gebundenen Wasserstoffatome oder sämtliche an Kohlenstoffatome gebundenen Wasserstoffatome können durch Fluoratome ersetzt sein. Weitere Beispiele für mit dem antiviralen Wirkstoff, bzw. Antitumor-Wirkstoff synergistisch zusammenwirkende Hilfsmittel sind Fettalkoholsulfate, also schwefelsäureester der Fettalkohole, und als Beispiel hierfür seien die Verbindungen Natrium-, Dodecylsulfat und Ammonium-Iaurylsulfat genannt, sowie ferner Fettalkohol-äther-sulfate, also Sulfate von entsprechenden Alkyläthern, wie z. B. die Verbindung der follgenden Formel

R-(O-CH₂-CH₂)Z-OSO₃Na, sowie Natrium-alkylsulphoacetate, also Verbindungen der folgenden Formel

R-O-CO-CH₂-SO₃Na, Sulphocolaurate, das Kaliumsalz eines Laurinsäureosters, das die folgende Formel

CHT-(CHJ)₁O-COO-CHjCH₂-NH-CO-CH₂-SO₃K

aufweist, Alkylol-amide-sulphate (sulphatiarte Fettsäure-alkylolamido), nämlich Verbindungen, welche die folgende allgemeine Forme!

R-C0NH-R'-OSO₃Na

aufweisen, in welcher R' beispielsweise die Gruppe -CH₂- sein kann, Alkansulfonate und Hydroxyalkansulfonate, olefinische Sulfonate, α-Sulpho-fettsäureester, Alkylbenzolsulfonate, beispielswese Dodecylbenzolsulfonate, Sulphosuccinate, wie zum Beispiel entsprechende Monestor der Formel

-COOR

₂COONa oder entsprechende Diester der Formel

O₃Na

HC COOR

H₂C COOR ,

wobei als spezielles Beispiel für einen entsprechenden Diester das Dioctyl-natrium-sulfphosuccinat der Formel

(CH₂ )₃ CH₃

(CH₂). CH₃

2 5

genannt sei.

Als weitere Beispiele für mit dom antiviralen Wirkstoff oder Antitumor-Wirkstoff synergistisch zusammenwirkende Hilfsstoffe

ε·5ίοη Kondensationsprodukte von Fettsäuren genannt, wie zum Beispiel Fet'säure-isolhiomate, Verbindungen der allgemeinen Formel

R-COO-CH₂-CHj-SO₃Na, Fettsäure-methyltauride der Formel

R CO

N-CH₂-CH₂-SO₃Na ,

Fettsäure-sarcoside der Formel

R-CO

-CH₂-COONa

Kondensationsprodukte aus Fettsäuren und Proteinen, also Kondensationsprodukte aus Fettsäure und Polypeptiden, wie zum Beispiel Verbindungen der allgemeinen Formel

R-CO-NH-R-(CO-NH-CH)n-C00M,

also beispielsweise die Verbindung der Formel

R R

H₂₂C_n-CO-NH-CH-(CO-NH-CHIn-COOK.

Weitere geeignete synergistisch wirkende Hilfsmittel sind Fettalkoholätherphosphate, nämlich Phosphorsäureester der Fettalkohole, beispielsweise Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel

R-O-(CH-CH₂-O)n-f-ONa

ONa

wie zum Beispiel ethoxylierte Oleylätherphosphate.

Des weiteren sind Beispiele für synergistisch wirkende Hilfsstoffe Monoglyzeridsulfate, beispielsweise Verbindungen, welche

die folgende Struktur

H₂C-O-CO-R HO-OH H₂C-O-SO₃Na

aufweisen, sowie ferner Sulphoricinoleat (Türkischrotöl) und Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel Na-SOj-O-CnH₃₂-COONa.

Die in den oben genannten Formeln auftretenden Reste R sind Alkylgruppen, deren Länge so dimensioniert ist, daß eine Gesamtzahl an Kohlenstoffatomen in jeder dieser Verbindungen im Bereich von 6-18 erreicht wird. Von den Wirkstoffen mit antiviraler Wirksamkeit, bzw. Antitumor-Wirksamkeit der Formel I sind diejenigen speziell bevorzugt, in

welchen

R¹ der Benzylrest, der Cyclohexylrest, der 1-Adamanylrest, der Tricyclodecylrest, der I-Norbornylrest, der Cyclododecylrest, der

n-Dodecylrest oder der Isobornyl-cyclohexylrest und der Rest

R^] Natrium, Kalium oder eine Alkylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen airstellt. Beispiele für derartige vortoilhafterweise angewandte Wirkstoffe mit antiviraler Wirkung und Antitumor-Wirkung s^!nd die

folgenden Natriumxanthate, bzw. Kaliurnxanthate:

das Benzyl-xanthat, das Cyclohexyl-xanthat, das Adamantyl-xanthat, welches in der Folge mit D424 abgekürzt wird, das 8(9)-Tricyclo-|5.2.1.0ⁱ⁶)-decyl-xanthat, welches in der Folge mit D609 abgekürzt wird, das 2-Endo- oder Exo-bicyclo (2.2.1 ^M)hep1ylxanthat, welches in der Folge mit D611 abgekürzt wird, das Cyclododecyl-xanthat, das in der Folge mit D435 abgekürzt wird, das n-Dodecylxanthat und das 4-lsobornyl-cyclohexyl-xanthat, das in der Folge mit D622 abgekürzt wird.

Das aktive Xanthdt und das seine Wirkung steigernde Hilfsmittel sind in den erfindungsgamäßen pharmazeutischen Präparaten vorzugsweise in einem Molverhältnis anwesend, das im Bereich von 1:6 bis 1:0,25 liegt, wobei speziell bevorzugt das Molverhältnis im Bereich von 1:3 bis 1:0,5 und insbesondere im Bereich von 1:2 bis 1:1 liegt. Diese Molverhältnisse bedeuten also aktives Xanthat:Hilfsmittel.

Die erfindungsp jmäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können topisch, oral oder parental verabreicht werden. Geeignete For.nen für die orale Verabreichung oder parenteral Verabreichung sind Tabletten, Kapseln, Suppositorien und für die Infusion odor Injektion geeignete Lösungen oder Dispersionen. Diese Verabreichungsformen werden unter Verwendung der üblichen pharmazeutisch verträglichen Hilfsmittel, Trägermaterialien, Verdünnungsmittel und Einschlußmittel hergestellt. Die Dosierung, die angewandt werden muß, hängt im Prinzip von der speziellen Anwendungsform und von dem Zweck oder dem Ziel der Anwendung ab, beispielsweise davon, ob eine therapeutische Behandlung oder eine prophylaktische Behandlung durchgeführt werden soll. Die Größe der Einzeldosierung und auch die Art ihrer Anwendung können am besten bestimmt werden, indem man die im einzelnen Fall zu lösenden Probleme in Betracht zieht. Üblicherweise liegt die therapeutisch aktive Menge der erfindungsgemäßen synergistischen Kombination dann, wenn sie in Form einer Injektion verabreicht wird, im Bereich von etwa 0,005mg pro kg Körpergewicht bis etwa 10mg pro kg Körpergewicht und vorzugsweise im Bereich von etwa O₁CI mg pro kg Körpergewicht bis 0,1 mg pro kg Körpergewicht. Zusätzlich zu der erfindungsgemäßen synergistischen Kombination enthalten pharmazeutische Präparate zur oralen oder parenteralen Anwendung üblicherweise einen Puffer, der den pH-Wert im Bereicn zwischen etwa 7 und 8 aufrecht erhält, vorzugsweise bei etwa 7,4 und vorzugsweise außordom Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit, um eine isotone Lösung zu erhalten.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate können auch in lyophllisierter Form oder verfestigter Form hergestellt werden. Wenn ein entsprechendes Präparat eingesetzt werden soll, um einen Virus außerhalb eines lebenden tierischen Körpers oder menschlichen Körpers abzutöten, dann kann die Kombination angewandt werden, ohne daß man den Gesichtspunkt der Therapie oder pharmazeutische Gesichtspunkt in Betracht zieht.

Ein geeignetes Präparat zur topischen Anwendung kann auf einer wäßrigen Basis hergestellt werden, beispielsweise indem man die erfindungsgemäße synergistische Kombination in einer wäßrigen Pufferlösung auflöst und anschließend ein polymeres Verdickungsmittel zusetzt, wie zum Beispiel Polyvinylpyrrolidon.

Eine geeignete ölige Anwendungsform, die zur topischen Anwendung herangezogen werden kann, kann beispielsweise erhalten werden, indem man die erfindungsgemäße Mischung in einem Öl suspendiert und anschließend ein Quellmittel zugibt, wie zum Beispiel Aluminiumstearat und/oder ein pflanzliches aktives Mittel oder ein Tensid, das ein hydrophiles-lipophiles Gleichgewicht, also einen Wert für die hydrophile-lipophile Balance, der in der Folge als HLB-Wert abgekürzt wird, der geeigneter Weise unterhalb von 10 liegt. Beispiele für derartige oberflächenaktive Mittel oder Tenside sind Fettsäuremonoestor von mehrwertigen Alkoholen, beispielsweise Glyzerinmonostearat oder Sorbitan-monooleat.

Eine geeignete fettige Salbe kann beispielsweise hergestellt werden, indem man die beiden erfindungsgemäß zu verwendenden aktiven Substanzen in einer Salbengrundlage suspendiert und anschließend ein oberflächenaktives Mittel oder Tensid zugibt, descen HLB-Wert unterhalb von etwa 10 liegt. Eine Emulcionssalbe kann in ähnlicher Weise hergestellt werden, beispielsweise indem man eine wäßrige Lösung, welche die beiden erfindungsgemäß einzusetzenden aktiven Substanzen enthält, in eine welche Salbenbasis einmischt und ein oberflächenaktives Mittel oder Tensid zugibt, das einen HLB-Wert von unterhalb etwa 10 aufweist.

Alle derartigen Formulierungen zur topischen Anwendung können außerdem Kortservloru -.gsmittel enthalten. Die Konzentration der beiden aktiven Substanzen in der gesamten Mischung beträgt üblicherweise 0,05mg bis 5mg pro 100mg der gesamten Zusammensetzung, vorzugsweise 0,25mg bis 1 mg pro etwa 100mg der gesamten Zusammensetzung, wobei dieser angegebenen Grenzen auch breiter gehalten werden können, und beispielsweise bis zu 10 mg der beiden aktiven Komponenten pro 100mg der gesamten Zusammensetzung eingesetzt werden können.

Die Xanthate der allgemeinen Formel I sind bekannte Verbindungen und sie können hergestellt werden, indem man beispielsweise ein Alkoholat der Formel Il

P'-O-Me II,

in welchem R' die gleiche Bedeutung besitzt wie in den Xanthaten der Formel I und Me ein Alkali netallatom bedoutet, mit Schwefelkohlenstoff der Formel CS₂ umsetzt. Des weiteren können die Xanthate der Formel Il hergestellt werden, indem man einen Alkohol der Formel R'-OH, worin R¹ die gleiche Bedeutung besitzt wie in den Xanthaten der Formel II, mit Schwefelkohlenstoff in Anwesenheit einer Stärkenbase in an sich bekannter Weise umsetzt. Eine derartige Herstellung ist in der deutschen Offenlegungsschrift 3146772 beschrieben und ebenfalls in den anderen veröffentlichten Patentanmeldungen oder Patentschriften, die weiter vorne erwähnt wurden. In diesem Zusammenhang wird besser auf das Bezug genommen, was in diesen Veröffentlichungen bereits geoffenbart ist.

Die zweite Komponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, nämlich die als synergistisches Hilfsmittel wirkende ionische Zusammensetzung, die sowohl eine lipophile Gruppe als auch mindestens eine hydrophile Gruppe aufweist, kann beispielsweise aus käuflich erhältlichen Verbindungen, wie Monocarbonsäuren oder Dicarbonsäuren, Monosulfaten oder Disulfaten, Monosu'foi.aton oder Disulfonaten, Monophosphaten oder Diphosphaten ausgewählt werden, wobei all diese Verbindungen eine gerrdkettige oder verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppierung besitzen, die beispielsweise 6-18 Kohlenstoffatome aufweisen. Verbindungen dieses Typs können mit Vorteil in entsprechende Salze nach an sich bekannten Verfahrensweisen umgewandelt werden, beispielsweise indem man eine Base verwendet, die ein pharmazeutisch annehmbares Salz liefert.

Ausfuhrungsbeispiel Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert. In der Folge werden einige Ergebnisse angeführt, die bei pharmakologischen Tests erhalten wurden.

1. Überprüfung der Cytotoxlzltat

Die getesteten Substanzen waren die folgenden:

Kalium-8(9)-tricyclo-(5.2.1.0* ^e)-decyl-xanthat, also die Verbindung mit dor Bezeichnung D609, die in der Folge als .DEXA" abgekürzt wird.

Dieses Xanthat mit cytotoxischer Wirksamkeit wurde in Kombination mit verschiedenen langkettigen Carbonsäuren getestet, wobei die fraglichen Carbonsäuren in der nachfolgenden Tabelle I angeführt sind.

Es wurden die folgenden Zellkulturen verwendet:

normale Fibroblasten von Hamsterembryonen, also normale Hamster-Embryo-Fibrolilasten, die in der Folge mit ,HEF" abgekürzt werden.

Fibrinoblasten von Hamsterembryonen, die mit dem Rinder-papillom-virus transformiert worden waren, also Hamster-Embryo-Fibroblasten, transformiert mit Bovinem-Papillom-Virus. Diese transformierten Zellen werden in der Folge mit „HEF-BPV" abgekürzt.

Das verwendete Medium war das folgende:

Das Grundmedium, das mit Eagle mit Salzen nach Eagle, welches in der Folge mit .BME" abgekürzt wird, woDei dieses Grundmedium mit 10% fötalem Kälberserum, das in der Folge mit .FBS" abgekürzt wird, ergänzt wurde, und wobei das Medium 1 % Penicillin, Streptomycin enthielt und einen pH-Wert von 7,4 besaß.

Der Test wurde nach der folgenden Methode durchgeführt:

Die erwähnten Zelltypen werde in vitro in dem angegebenen Medium bebrütet. Zu jeder Probe wurde eine Mischung zugesetzt, die 20μρ der oben erwähnten al iven Substanz DEXA enthielt und stufenweise ansteigende Mengen an den Säuren, die in der nachfolgenden Tabelle I angefül.rt sind, enthielten. Die Mengen der Fettsäure, also die Mengen an den entsprechenden synergistisch wirkenden Hilfsmitteln sind ebenfalls in der nachfolgenden Tabelle I angeführt.

Nach drei Tagen wurden die Kulturen mikroskopisch geprüft und dadurch konnte die minimale toxische Konzentration festgestellt werden. Auch die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Getestete HEF-Kultur HEF-BPV-Kultur

Mischung minimale toxische Konzentration

von 20 Mg/ml DEXA + Hilfsmittel DEXA+Hilfsmittel Hilfsmittel in Hilfsmittel in

Mg/ml Mg/ml

DEXA+Dekansäure	100	10
DEXA + Undekansäure	100	10
DEXA + Dodekansäure	40	10
DEXA + Myt.stinsäure	30	10

Aus den in der Tabelle I angegebenen Werten für die minimale toxische Konzentration der Kombination aus 20pg/ml DEXA plus der jeweiligen Säure, sieht man, daß die fragliche Kombination für die Zellkulturen, die transformierte Zellen enthielten, wesehtlich stärker toxisch war als für die Zellkultur, die keine transformierten Zellen enthielt. Dies trifft insbesondere für dta Kombination von DEXA mit Dekansäure und DEXA mit Undekansäure zu, denn diese Mischungen sind gegenüber Zollkulturen von transformierten Zellen zehnmal stärker toxisch als gegenüber Zellkulturen von normalen Zellen.

Bei einem weiteren Cytotoxizitätstest wurden unterschiedliche erfindungsgemäße synergistische Kombinationen bezüglich ihrer Toxizität getestet. Die getesteten Zellkulturen waren Fibroblasten von Mäusenembryos, also Mäuse-Embryo-Fibrobblasten, die in der Folge als .MEF" abgekürzt werden und Fibroblasten von Mäuseembryonen, die transformiert worden waren, wobei diese transformierten Mäuse-Embryo-Fibroblasten in der Folge mit .MEF-K1" abgekürzt werden.

Diese Zellkulturen wurden in dem folgenden Medium bebrütet:

BME + 5% Kälberplasma, unter Zusatz von Penicillin und Steptomycin. Das Medium hatte einen pH-Wert von 7,4.

Die Tests wurden in analoger Weise ausgeführt, wie die Testung der vorher beschriebenen Zellkulturen, jedoch bestand der Unterschied zu dem vorangegangenen Test darin, daß die mikroskopische Auswertung der Tests bereits nach 24 Stunden, und nicht erst nach drei Tagen, erfolgte.

Die bei diesem Test erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle Il zusammengestellt.

Tabellen

MEF MEF-K1

Getestete Mischung minimale toxische Konzentration von

20 ug/ml DEXA + Hilfsmittel DEXA+Hilfsmittel Hilfsmittel pg/ml Hilfsmittel cog/ml

10 40 10

10 20 10 10-20

DEXA+ Kaliumsalz	80
der Dekansäure	-
DEXA+ Dekansäure	80
DEXA + Undekansäure
DEXA+ Kaliumsalz	80
der Undekansäure	60
DEXA+Dodekansäure	60
DEXA + Triedakansäure	80
DEXA+ Tetradekansäure

Aus den in Tabelle Il angegebenen Werten sieht man, daß die getesteten erfindungsgemäßen synergistischen Mischungen viel

stärker toxisch gegenüber transformierten Zellkulturen sind, als gegenüber normalen Zellkulturen.

Die Selektivität der toxischen Wirkung von DEXA. in Kombination mit Undekansäure gegenüber transformierten Zellkulturen ist

aus dem nachfolgenden Test noch deutlicher ersichtlich, der auf der Einführung von Uridin, das mit Tritium markiert ist, basiert.

Das mit Tritium markierte Uridin wird in der Folge als „'H-Uridin" geschrieben. Normale Fibrinoblasten von Mäuseembryos, abgekürzt als ,MEF* und Fibronoblasten von Mäuseembryos, die mit dem Rindtr- Papillon-Virus modifiziert worden waren und die in Folge der .MEF-BPV abgekürzt werden, wurden auf Linbro-Platten gesät,

und zwar in einer Dichte von jeweils 2 χ 10^s Zellen pro Vertiefung. Die auf den Platten befindlichen Zellen wurden mit synergistischen Mischungen aus 20pg/ml an DEXA und ansteigenden Mengen an Undekansäure behandelt, und zwar betrug jeweils die Menge an Undekansäure in der Mischung 10Mg/ml, 20pg/ml, 40^g/ml, öOpg/ml und 80μ9/ιηΙ. Als Medium wurde das Grundmedium gemäß Eagle mit Salz gemäß Eagle verwendet, welches mit 5% Kälberplasnvi ergänzt worden war. Dieses

Medium besaß einen pH-Wert von 7,5 und es wurde unter einer Atmosphäre mit 5% Kohlendioxid gehalten. Nach zwei Tagen wurde neues Medium zugesetzt, welches 1 uCi/ml an ³H-Uridin enthielt, aber welches die oben erwähnte aktive Substanz nicht enthielt. Zwei Stunden später kann die Menge an dem ³H-Uridin mit Säure ausgefällt werden und sie wird in jeder Kultur bestimmt. Ehe

man die Gesamtzählung durchführt, werden die Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht, einschließlich desjenigen ³H-Uridines, das nicht inkorporiert worden war, aufgewaschen. Anschließend werden die Zählungen an den trockenen Kulturen durchgeführt. Die durchschnittlichen Werte der Radioaktivität, die in zwei Kulturen gemessen wurden, sind in der Fig. 1 dargestellt.

Das in Fig. 1 dargestellte Diagramm zeigt, daß die transormierten Zellkulturen (siehe die Kurve mit der Bezeichnung MEF-BPV)

durch die erfindungsgemäßen synergistischen Mischungen selektiv zerstört oder inaktiviert werden. Dies ist daraus zu ersehen, daß die Radioaktivität, d. h. das ³H-Uridin nur in den norm&len Zellkulturen, nicht jedoch in den transformierten Zellkulturen gefunden werden konnte.

2. Testung der antlvlralen Wirkung

Die hemmende Wirkung der aktiven Substanz DEXA der synergistisch wirkenden Kombination aus DEXA und unterschiedlichen Konzentrationen an Dekansäure und an Dekansäure allein, wurde in verschiedenen in vitro Kulturen überprüft, die mit Herpes- Simplex-Virus 1 beimpft worden waren. Diese mit Herpes-Simplex-Virus 1 geimpften Kulturen werden in der Folge als

.HSVVKulturen" abgekürzt.

Das Medium hatte einen pH-Wert von 7,4. Nach zwei Tagen Bebrütung wurde die Ausbeute an dem Virus bestimmt und es wurde

der Prozentsatz der Platten bildenden Einheiten, die basierend auf der englischsprachigen Bezeichnung .plaque-forming units" in der Folge mit«% pfu" abgekürzt wird. Der Prozentsatz an Platten bildenden Einheiten der Viruskulturen, die keiner Behandlung mit Hemm-Mitteln oder Inhibitoren unterworfen worden waren, wird mit 100% angenommen und der % pfu der behandelten

Kulturen wurde auf diesen Wert von 100% bezogen. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt. Tabelle III

Getestete hemmende	% pfu, bezogen auf eine	8,7	18,9
Verbindung	Viruskultur ohne Zugabe	0	24
	von Inhibitoren	0,3	35
DEXA(20Mg/ml)	22,6
DEXAOOpg/ml) + Dekansäure
lOpg/ml
20pg/ml
40pg/ml
Dekansäure
10pg/ml
20 Mg/ml
40ua/ml

Man sieht aus der Tabelle III, daß die Kombination von DEXA plus Dekans£ure eine deutlich stärkere hemmende Wirkung auf die Viruskultur ausübt als die gleiche Konzentration an DEXA alleine und auch als die gleiche Konzentration an Dexansäure alleino. Eine Kombination aus DEXA und dem Natriumsalz des Dodecylsulfates, das in der Folge mit .SDS" abgekürzt wird, zeigt eine

ähnlich Marke Hemmung der Vermehrung des Herpas-Simple <-Virus 1 (HSVI).

In der Folge wurden Untersuchungen an den Zellen Rita PO/37 unternommen. Das verwendete Medium war BME, ergänzt mit 5% FBS plus 1 % Penicillin plus Streptomycin. Der pH-Wert dieses Mediums

betrug 7,4 und es wurde unter einer Atmosphäre mit einem Gehalt von 5% an CO: gezüchtet.

Als Inhibitoren wurden erfindungsgemäße synergetische Kombinationen verwendet, die jeweils 10pg/ml an dem Wirkstoff DEXA plus unterschiedliche Mengen an Dedecylsuuat (abgekürzt als SDS) enthielten, und zwar 10Mg/ml, bzw. 20Mg/ml, bzw.

40pg/ml, bzw. βΟμρ/ιηΙ.

Es erfolgte eine Infektion der Rita Zellen mit MOI, und zwar in einer Menge von 0,05 Platten bildenden Einheiten pro Zelle, also

0,05 pfu/Zelle.

Die Zugabe der Inhibitoren erfolgto eine Stunde nach der Infektion der Zellkulturen, wobei für jeden Rest zwei Parallelkulturen

verwendet wurden.

24 Stunden nach der Infektion erfolgte eine Wiedoreinsammlung der Nachkommen des Virus.

Der Kontrolltiter betrug 7,7 χ 10*pfu/ml. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Tabelle III a Mischung an den Titer Hemmfaktor

aktiven Substanzen pfu/ml

10pg/ml DEXA + 10μ(|ΛηΙ SDS	2,5x102	3X10*
10 Mg/ml DEXA +20 pg/ml SDS	25	3X106
lOpg/ml DEXA + 40pg/ml SDS	25	3X106
10ug/ml DEXA + eOpg/ml SOS	2,5	3x10'

Es wurde ferner dp« Wachstum der nicht infizierten Rita-Zellen unter Zugabe der Kombination der Hemmstoffe getestet, und es

zeigte eich dabei, daß durch die gleiche Kombination an aktiven Substanzen dioses Wachstum praktisch nicht gehemmt wurde.

Analoge Resultate wurden mit einer Kombination von Cyclodcdecyl-xan'.hat (abgekürzt als D435) und Undekansäure erhalten. Diese erfindungsgemäße Wirkstoffkombination wurde auch weiter getestet, beispielsweise auf konfluente Zeilen der Lunge von

menschlichen Embryonen, wobei die Zellen mit HSV-1 infiziert worden waren. Es wurden dabei sehr wirksame Ergebnisse bezüglich der Hemmung erreicht. Der gleiche Effekt konnte verwendet werden, wann statt de:. Xanthates mit der Bezeichnung

D609 die Xanthate mit der Bezeichnung Da24, D611 oder D622 verwendet wurden. Es zeigte sich auch, daß RNA-Viren (einsträngige Viren), wie zum Beispiel der Virus, der eine Entzündung der Mundschleimhaut,

unter Ausbildung von Bläschen, hervorruft, also der Vesicular-Stomatitis-Virus, durch die weiter oben beschriebenen

Kombinationen an aktiven Substanzen gehemmt wird. Ein weiterer Test wurde an Meerschweinchen durchgeführt, die Verletzungen aufwiesen, welche mit HSV infiziert v.'aren. Der Heilungseffekt der erfindungsgemäßen Kombination und dei jenige, der mit dem Hilfsmittel alleine erreicht wurde, wurde

getestet.

Die in der nachfolgenden Taoella IV angegebenen Substanzen wurden in den angegebenen Konzentrationen in eine Vaselinosalbe eingemischt. Diese Salbe wurde auf die mit HSV infizierten Verletzungen auf der Haut der Meerschweinchen

aufgetragen, und zvar zweimal täglich. Die erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV Anzahl der Verletzungen % Heilung Vurwendetes am Beginn der nach36Std. Behandlungsmittel Behandlung Behandlungs-

(96Std.nach zeit

der Infektion) ^

Vaseline mit 10% 8 8 Dekansäure 10 10 Vaseline mit 5% 6 4

DEXA+ 10% 23 14

Dekansäure 16 5 42

11 8

8_ (5

Man sieht aus der Tabelle IV, daß die weitaus besten Ht>uungsresultate unter Verwendung einer erfindungsgemäßen synergistischen Mischung err sieht werden konnten.

Bei einem weiteren Test der antiviralen Wirkung von erfindungsgemäßen Mischungen wurden sechs Meerschweinchot. mit HSV-1 der Wal Linie (Wal lineage) beimpft. 18 Stunden später begann die Behandlung mit einer Vaselinecremo, die F% DEXA und 5% Dekansäure enthielt, und zwar erfolgte die Behandlung zweimal täglich. Nach zwei Tagen der Behandlung, also 72 Stunden nach der Einimpfung, wurden die Tiere getötet und die infizierte Haut wurde entfernt. Die Haut wurde mit flüssigem ' Stickstoff gefroren und dann in einer Schlagmühle der Bezeichnung „Mikro Dismembrator" (tm) zerkleinert. Pro Tier wurden zwsi Proben genommen. Nach dem Zerkleinern folgte eine nachfolgende Wiederaufnahme in einer zehnfachen Menge (Gewicht/Volumen) eines Mediums für Gewebekulturen. Nach einer kurzen Zentrifugidrung, nämlich eine Minute auf einer Zentrifuge der Bezeichnung Eppendorf-desk top centrifuge, wurde der Virurtiter der überstehenden Flüssigkeitsschicht bestimmt. Es zeigte sich, daß kein Virus feststellbar war. Im Cegensatc dazu war der Titer des Testmediums des Leervers jches 1 χ 10⁵pfu/p an Gewebe.

Der Einfluß der Kettenlänge von Monocarbonsäuren auf die an»!-, irale Aktivität und die Cytotoxizität in Kombination mit dom Xanthat der Bezeichnung D609 wird in Fig.3 veranschaulicht. Die Ergebnisse, die bsi den nicht infizierten Rita-Zellen erhalten wurden, sind in der Kurve dargestellt, deren Meßpunkte mit Dreiecken angegeben sind. Die Ergebnisse, die bei den mit HSV-1 infizierten Rita-Zellen erzielt wurden, sind in der Kurve dargestellt, deren Meßpunkte mit Quadrater, angegeben sind. Die Zollen wurden jeweils mit lOpg/ml des Xanthates mit der Bezeichnung D 619 und 40^g/ml jeder der genannten Monocarbonsäuren bei einem pH-Wert von 7,4 behandelt. Die Anzahl der Kohlenstoffatome der jeweils verwendeten Monocarabonsäure ist auf der Abszisse aufgetragen.

Die Viri sausbeute von zwei Kulturen wurde einzeln getestet, indem man einen doppelten Plattentest durchführte. In der Fig. 3 sind ferner die Fehlergrenzen angegeben, in we'chen die Standardabweichung dargestellt !st. Die Zelldichten des doppelt durchgeführten Tests bei den nicht infizierten behandelten Rita-Zellkulturen und bei den unbehandelten ^ita-Zellkulturen wurde nach einer Anfärbung mit Trypan-blau durchgeführt, indem man mit einem Hämetocytometer zählt».

3. Bestimmung der Antltumor-Akilvitai:

Bei diesem Test wurde eine Behandlung der lymphatischen Leukämie bei Mäusen durchgeführt.

An sechs Wochen alte DBA-2-Mäuse wurden intravenös 1 χ 10^D Tumorzellen 9ingeimpft, und zwar Tumorzellen der NCI-Ei-Leukämie. 18 Stunden später unterteilte man in drei Gruppen, wobei jede Gruppe zehn Tiere umfaßte.

Bei einer Gruppe wurde keine Behandlung durchgeführt, und diese stellte die Gruppe zu Vergleichszwecken dar.

Bei der zweiten Gruppe wurde nur eine Behandlung mit dem Xanthat der Bezeichnung .DEXA" durchgeführt, und zwar zuerst 4mal mit je 15mg/kg und dr.in6mal mit je 11 mg/kg Körpergewicht.

Die dritte Gruppe der Mäusti wurde mit öiner erfindungsgemäßen synergistischen Kombination unterworfen, und zwar wurde in der gleichen Weise, wie in der Gruppe 2, und in den dort angegebenen Dosierungen, oine Behandlung mit dem Xanthat der Bezeichnung .DEXA" durchgeführt, und außerdem wjrde an die Tiere Undekansäure verabreicht, und zwar zunächst 4mal in einer Menge von jeweils 7,5 mg/kg Korpergewicht und anschließend 6mal in einer Menge von jeweils 5,5 mg/kg.

Alle Verabreichungen erfolgten intravenös. Die Injektionen wurden in Zeiträumen von einer Stunde verabreicht. Am nachfolgenden Tag, nämlich zwei Tage nach der Einimpfung der Tumorzellen, wurden von jedem Tier Blutproben genommen und die Konzentration der Lymphocyten wurde bestimmt.

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

Anzahl der Lymphocyten χ 10"β pro ml	DEXA	DEXA + Undekansäure	in jeder dieser Gruppen	11,7
unbehandelt	17,9	8,6	15,9	signifikant
13,8	15,0	11,7		ρ < 0,01
11,1	24,1	12,0
15,8	13,0	9,8
17,3	18,6	12,8
12	15,6	18,4
15,7	10,7	11,6
23	14,6	12,4
18,3	13,7	8,4
20,2		10,8
	Durchschnittliche Anzahl «in Lymphocyten x 10'VmI
16,3

Aus den in Tabelle V angeführten Ergebnissen sieht man, daß eine erfindungsgemäße synergistisch wirkende Kombination zu einer wesentlichen Verminderung der Anzahl der Lymphocyten führt.

In der Folge wurde das Zurückgehen von autochthonen Hauttumoren bei Mäusen nach einer systematischen Behandlung mit einer erfindungsgemäßen synergistisch wirkenden Kombination untersucht.

Die bei diesem Versuch verwendete Kombination bestand aus dem Xanthat mit der Bezeichnung DEXA und aus Undekansäure.

Die autochthonen Hauttumore wurde in bekannter Weise bei sieben Wochen alten weiblichen Mäusen der NMRI-Linie induziert.

Hinzu wurde eine topische Behandlung mit einer einzelnen Dosis von 25,6mg an DMBA, aufgelöst in 0,1 ml Aceton durchgeführt, und sieben Tage später erfolgte eine Behandlung mit 6,16mg an TPA, aufgelöst in 0,1 ml Aceton, wobei dieses zuletzt genannte Medium während 23 Wochen zweimal pro Woche aufgetragen wurde.

Drei Wochen nach der Beendigung dieser HdUtkrebs hervorrufenden Behandlung wurde die Chemotherapie des Hautkrebses begonnen, indem man intravenöse Injektionen von 10mg/kg der Testverbindung verabteichte, und zwar wurde diese in einer Konzentration von 1 mg/ml verabreicht. Die zu testende Verbindung war vorher in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung eines pH-Wertee von 7,4 aufgelöst worden. Der pH-Wert dieser Lösung wurde durch die Zugabe von 0,15 molare Natronlauge entsprechend eingestellt.

40 Tiere mit Tumoren wurden ausgewählt, wobei man vier willkürlich zusammengestellte Gruppen bildete.

Eine Gruppe, die 11 Tiere umfaßte, vvurde keiner Behandlung unterzogen. Eine weitere Gruppe, die 10 Tiere umfaßte, wurde mit einem Xanthat der Bezeichnung .DEXA" behandelt.

Eine weitere Gruppe, die 10 Tiere umfaßte, wurde mit Undekansäure behandelt.

Die vierte Gruppe, die 9 Tiere umfaßte, wurde mit einer synergistischen Kombination aus dem Xanthat der Bezeichnung „DEXA" und Undekansäure behandelt. In dieser Gruppe wurde jede der Verbindungen in einer Menge von 1 mg/ml in der angegeber 3n Kochsalzlösung gelöst und die Verabreichung erfolgte so, daß 10mg jeder der beiden Substanzen pro kg Körpergewicht verabreicht wurden.

Die bei diesem Test erzielten Ergebnisse sind in der Fig. 2 veranschaulicht, wobei auf der Zeitachse, also der Abszisse, die Zeitpunkte der Injektionen mit Hilfe von kleinen Rechtecken angezeigt sind. Die Größe aller Tumore (dreidimensional) wurde bestimmt, indem man eine gleitende Tastvorrichtung verwendete. Auf diese Weise wurde die Größe von 35 Tumoren der unbehandelten Tiere, sowie von 40 Tumoren der Tiere, die nur mit Undekansäure behandelt worden waren, und ferner von 37 Tumoren der Tiere, die nur mit DEXA behandelt worden waren und von 35 Tumoren der Tiere, die mit der erfindungsgemäßen synergistisch wirkenden Kombination behandelt worden waren, bestimmt.

Die anfängliche Größe der Tu more variierte zwischen 2 mm³ und 400 mm³. Die Größe jedes einzelnen Tumors wurde während

des Testes beobachtet. Die Vergrößerung der Tumore, bzw. die Verkleinerung der Tumore wurde in Prozent der anfänglichen

Größe dieser Tumore ausgedrückt. Die durchschnittlichen Werte jeder Gruppe sind in Fig. 2 veranschaulicht. Die Gruppe, in der die Meßpunkte in nicht ausgefüllten Kreisen dargestellt sind, ist die Gruppe zu Vergleichszwecken, bei der keine Behandlung durchgeführt wurde. Die Gruppe, bei der

die Meßpunkte durch Dreiecke dargestellt sind, ist die Gruppe, an die nur Undekansäure in einer Menge von 10mg/kg

Körpergewicht verabreicht worden war. Die Gruppe, deren Meßpunkte mit Guadraten dargestellt sind, ist diejenige, an die nur DEXA in einer Menge von 10mg/kg Körpergewicht verabreicht wurde. Die Gruppe, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Kreisen dargestellt sind, ist diejenige, an die sowohl DEXA in einer Menge von

10mg/kg Körpergewicht als auch Undekansäure in einer Menge von 10mg/kg Körpergewicht verabreicht wurde. Die Anzahl der

Tage ist unterhalb der Abszissenachse aufgetragen und oberhalb der Abszissenachse sind die Anzahlen der intravenösen Injektionen (jeweils in Klammer gesetzt) angeführt. Die bedeutende Verkleinerung der Tumore in der Gruppe, die mit einer erfindungsgemäße synergistisch wirkenden Kombination behandelt worden war, wurde nach dem Student's T-Test berechnet. Nach zwei Tagen Behandlung unterschied

sich die Größe der Tumore der Gruppe der behandelten Mäuse beträchtlich von derjenigen der unbehandelten Mäuse, und der bestimmte Wert war ρ < 10"¹⁰. Nach fünf Tagen Behandlung betrug dieser Wert ρ < 10"⁷.

In der Folge wird die subcutane Behandlung eines autochthonen Hauttumors beschrieben.

20 Testtiere des vorher beschriebenen Typs, die durch chemische Einwirkung hervorgerufene Hauttumore aufwiesen, welche in der vorher beschriebenen Weise erzeugt wurden, wurden willkürlich in vier Gruppen aufgeteilt. Die Behandlung der Hauttumore wurde durchgeführt, indem man subcutane Injektionen in unmittelbarer Nachbarschaft der Tumore verabreichte, wobei bei

Portionen von je 0,5ml alle zwei Stunden während zwei Tagen injiziert wurde. Am dritten Tag wurde dann eine Einzeldosis

injiziert. Die injizierte Lösung enthielt 5mg/ml an dem Xanthat mit der Bezeichnung DEXA und 5mg/ml an Undekansäure. Sechs

Tage nach dem Beginn der Behandlung wurde eine photographische und visuelle Auswertung durchgeführt. Das Ergebnis dieses Tests war, daß sämtliche Tumoro in der Größe stark abgenommen hatten und einzelne sogar völlig

verschwunden waren. Alle Tumore hatten ihre Größe auf mindestens 50% der anfänglichen Größe vermindert.

Im folgenden Test wurde die Verkleinerung von autochthonen Hauttumoren bei Mäusen nach einer systemischen Behandlung

mit einer erfindungsgemäßen synergistischen Kombination geprüft, wobei die Kombination das Xanthat mit der Bezeichnung

DEXA und Undekansäure enthielt. Bei NMRI-Mäusen wurden Hauttumore nach dem vorher beschriebenen Verfahren erzeugt. Zwei Tage nach der letzten Auftragung von TPA, wurde die Chemotherapie begonnen. Das Behandlungsmittel wurde an die Tiere durch intravenöse Injektion dreimal täglich verabreicht. Die injizierte Lösung enthielt

1 mg/ml an DEXA und 1 mg/ml an Undekansäure, aufgelöst in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung. Der pH-Wert dieser Lösung wurde unter Verv/endung einer 0,1 Smolaren Natronlauge auf 7,4 eingestellt. Mit jeder Injektion wurden an das Tier 10mg DEXA pro kg Körpergewicht und 10mg Undekansäure pro kg Körpergewicht verabreicht.

Die Tiere wurden am Beginn und am Ende der Behandlung photographiert, wobei die Anzahl an Tumoren auf jedem Tier

bestimmt wurde. Vier Wochen nach der Beendigung der Therapie wurden die Tumore nochmals beurteilt. Es konnten keine wieder auftretenden Tumore, also keine Rückfälle oder Rezidive an denjenigen Stellen festgestellt werden, an denen die Tumore durch die Behandlung verschwunden waren.

Die Erg»r- ..se dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle Vl zusammengefaßt: Tabelle Vl

mit DEXA + Undekamiure behandelte Tiere

Anzahl der Anzahl an Tumoren TieiJ vorderBehandlung nach der Behandlung

1 3 3

3 5 3

4 14 4

5 11 8

6 5 3

7 5 0

8 15 10

9 13 0

10 14 4

11 6 2

insgosamt 91 37 Durch die Behandlung konnte die Anzahl der Tumore um 58% vermindert werden.

1	11
2	4
3	8
4	4
6	4
7	7
8	5
9	10
10	4
11	7

-14- 286 971 Vergleichsgruppe der nicht behandelten Tiere

Anzahl der Anzahl derTumore

* getesteten Tiere am Beginn des Tests am Ende des Tests

10 3 7 2 0 7 5 8 1 5

insgesamt 64 48

Bei den unbehandelten Tieren betrug der Rückgang der Tumore nur 25%.

Aus der Tabelle Vl sieht man also, daß mit einem erf indungsgemäßdn Präparat, das sowohl DEXA als Undekansäure enthält, ein Rückgang der Hauttumore in einem Ausnaß von 59% erreicht werden konnte, während der Rückgang der Hauttumore bei den unbehandelten Tieren nur 25% betrug.

Weitere Tests bezüglich der antiviralen Aktivität und Antitumor-Aktivität der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen wurden wie folgt durchgeführt:

(A) Testung dor antiviralen Aktivität von D 609 + Undekansauro

Es ist bekannt, daß Xanthat-Verbindungen antivirale Aktivität gegen verschiedene DNA-Viren und RNA-Viren unter sauron pH-Bedingungen aufweisen. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung von Sauer, G., Amtmann, E., Melbor, K., Knapp, A., Müller, K., Hummel, K., und Scherm, A. mit dem Titel ,DNA & RNA virus species are inhibited by xanthates, a class of antiviral compounds with unique properties" in Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81,3263-3267 (1984) verwiesen. Durch die vorliegende Erfindung ist es nunmehr möglich geworden, in effektiverer Weise den einzigartig breiten Bereich des antiviralen Spektrums dieser Verbindungen unter Bedingungen eines höheren pH-Wertes und unter physiologischen pH-Bedingungen, nämlich einem pH-Wert in der Gegend von 7,4, zu benützen, indem man erfindungsgemäß die fraglichen Xanthatverbindungen gleichzeitig oder in Kombination mit den ionischen Hilfsmitteln einsetzt, die sowohl mindestens eine hydrophile Gruppe als auch mindestens eine lipophile Gruppe aufweisen.

Das Tricvclodecan-9-yl-xanthat, das in der Folge mit D609 abgekürzt wird, wurde in Kombination mit den ionischen Hilfsmitteln Nati'ium-desoxycholat, Natrium-dodecylsulfat und bestimmten Fettsäuren verwendet, wobei die ionischen Hilfsmittel selbst keim) antivirale Aktivität besitzen. Durch die Kombination von D 609 mit den genannten ionischen Hilfsmitteln, wurde die Vermehrung von verschiedenen DNA-Viren und RNA-Viren in vitro bei einem pH-Wert von 7,4 gehemmt, wie zum Beispiel die Vermehrung von Herpes-simplex-virus, des Virus, der die Entzündung der Mundschleimhaut unter Bläschenbildung (Vesicularstomatitis) hervorruft und des Coxsackie B 4-Virus. Die entsprechenden Ergebnisse sind in der Tabelle VII zusammengestellt. Von den gesättigten Fettsäuren verschiedener Kettenlängen war ein bedeutender Vorteil bezüglich der Kettenlänge bei der Undekansäure, also der geradkettigen Monocarbonsäure mit 11 Kohlenstoffatomen festzustellen. Die Wirksamkeit der Kombination von D 609 mit Undekansäure war um drei Größenordnung«;.ι höher als diejenige von D 609 mit Monocarbonsäuren mit kürzeren Ketten, nämlich Monocarbonsäuren von insgesamt 8 Kohlenstoffatomen und Monocarbonsäuren mit längeren Ketten, nämlich Monocarbonsäuren mit insgesamt 18 Kohlenstoffatomen.

Die Dosis abhängige Kinetik zeigte, daß eine Dosis, welche die Vermehrung von Herpes-simplex-virus um einen Faktor von 1000 hervorrief, noch immer die mftotische Aktivität von nicht infizierten wachsenden Kulturen zu Vergleichszwecken gewährleistete. Eine Mischung in einem Mischungsverhältnis von D609 zu Undekansäure von 1:1 erwies sich am vorteilhaftesten, W'e dies aus Fig. 4 ersichtlich ist. In dieser Figur ist diejenige Kurve, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Kreisen dargestellt sind, in der angegebenen 1:1-Mischung.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Fall des HTLVIII Virus erhalten. Das Wachstum dieses Virus konnte in Gewebekulturen durch eine Mischung aus lOpg/ml an D609 plus 10pg/ml an Undekansäure gehemmt werden, nachdem Anwendungszeiträume von drei bis fünf Tagen stattgefunden hatten. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Fig. 5 veranschaulicht. Die Behandlung mit diesen erfindungsgemäßen Mischungen läßt die mitotische Aktivität von mitogen-atimulierten peripheren menschlichen Blutlymphocyten bei selchen Konzentrationen unverändert, die in der Lage sind, B-Zellenlymphome und T-Zellenlymphome abzutöten. Es sei in diesem Zusammenhang auf den Abschnitt B der Fig. 5 verwiesen. Aus diesem Grunde ist eine Kombination von D609/Undekansäure möglicherweise geeignet, um eine Chemotherapie der Immunschwächekrankheit AIDS durchzuführen.

Tabelle VII Antivirale Wirksamkeit der Kombination aus 0609 + Undekansäure auf RNA-Viren bei einem pH-Wert von 7,4

Art des Virus	Konzentration an D 609 Undekansäure inpg/ml inpg/ml	0 0 40 40	Virusausbeuten [pfu/ml]
VSV	0 5 0 5	0 40	(4,3 ±1) χ 10" (5,6 ± 0,05) x 10« (4,3±0,3)x10e (1,3 ±0,2) x 104
CoxsackieB4	0 10	(1,15±0,2)x10e (7,7 ±0,25) x 104

Die Virusart mit der Abkürzung VSV ist der Virus der Vesicular-stomatitis. Werte für die Virusausbeuten wurden erhalten, indem

man doppelt gezüchtete Kulturen auswertete und die erhaltenen Virusausbeuten wurden zweimal bestimmt. Die Nachkommen des Vesicular-stomatitis-virus wurden zehn Stunden nach der Infektion isoliert, und die Nachkommen des Coxsackie

B4-virus 27 Stunden nach der Infektion isoliert und gezählt. In Fig.4 wird die Hemmung des Wachstums von Herpes-virus durch verschiedene Konzentrationen an D609 und an Undekansäure veranschaulicht. Auf der Abrisse der Fig.4 ist die Konzentration an beiden Komponenten in μρ/ΓηΙ aufgetragen. Das Mischungsverhältnis von D609 zu Undekansäure war jedoch bei den vier dargestellten Kurven unterschiedlich, und zwar betrug das Mischungsverhältnis

von D609 zu Undekansäure bei derjenigen Kurve, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Kreisen dargestellt sind, 1:1, bei derjenigen

Kurve, deren Meßpunkte mit unausgefüllten Kreisen dargestellt sind, 1:2, bei derjenigen Kurve, deren Meßpunkte durch

ausgefüllte Quadrate dargestellt sind, 1:3, und bei derjenigen Kurve, deren Meßpunkte durch unausgefüllte Quadrate dargestellt sind, 0:1, d. h., in diesem Falle wurde nur Undekansäure, doch kein D609 verwendet.

Bei denjenigen Konzentrationen, bei denen eine Hemmung um mehr als einen Faktor von 10³ erreicht wurde, traten gleichzeitig

auch cytotoxische Effekte auf. Niedrigere Konzentrationen riefen jedoch bei den nicht infizierten Zellen zu Vergleichszwecken keine feststellbare Cytotoxizität hervor.

Es ist aus der Fig.4 zu ersehen, daß ein Mischungsverhältnis von D609 zu Undekansäure von 1:1 am wirksamsten ist, und zwar

im Vergleich zu dergleichen Konzentration jeder der beiden Verbindungen alleine und unter Berücksichtigung des kombinierten antiviralen Effektes. Dementsprechend ist es am zweckmäßigsten, in der entsprechenden Mischung ein Verhältnis von 1:1 aufrechtzuerhalten.

In Fig. 5 sind die Ergebnisse einer Gelectrophorese veranschaulicht. In diesem Falle wurden die für HTLVIII spezifischen Nucleinsäuren, nämlich superhelicale DNA, als replikatives Zwischenprodukt insuliort und nach einer Gelelectrophorese und Hybridisierung mit geclontem authentischem radioaktiv markiertem HTLVIII-DNA sichtbar gemacht. Nach einer Behandlung während drei Tagen (Probe a) und einer Behandlung von fünf Tagen (P.'obe c) ist das Signal, das typisch

für die HTLVIII-DNA ist, vollständig verschwunden, während in den unbehandelten mit K37 T-I) mphom infizierten Kulturen (siehe die Proben b und d) die für HTLVIII spezifische DNA festgestellt werden kann, und zwar sowohl die superhelicale Form I, als auch die entspannte kreisförmige Form Il der DNA.

Nach der Spaltung mit einer eine einzige Spaltstelle hervorrufenden Restriktions-endonuclease werden die Form I und die Form Il in die lineare Form III umgewandelt (siehe die Versuche f und h). Die in der Fig. 5 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, daß nach einer Behandlung mit einer Mischung aus dem Xanthat D609

und Undekansäure die Vermehrung von XTLVIII, also die Replikation von HTLVIII vollständig gehemmt werden kann.

B. Testung der Antitumor-Aktivltit einer Kombination aus D609 + UndekansSuro Xanthatverbindungen mit rntiviralen Eigenschaften üben in Kombination mit Monocarbonsäuren einer bestimmten Größe,

vorzugsweise einer Kettenl.inge von 11 Kohlenstoffatomen oder 12 Kohlenstoffatomen eine deutliche Antitumcr-Wirkung in vitro hervor.

Das Tricyclodecan-9-yl-xanthogenat, das mit D609 abgekürzt wird oder das Cyclododecylxanthogenat, das mit D435 abgekürzt

wird, wurden zusammen entweder mit Undekansäure oder mit Dodekansäure an unterschiedliche transformierte Zellen verabreicht, im allgemeinen solche Zellen, die wenig Serum benötigen. Diese Mischungen können zum Tod der Zellen führen.

Wenn man die gleichen Konzentrationen jedoch an nicht transformierte Zellen, sondern an entsprechende normale Zellen

verabreicht, aus denen die transformierten Zellen gebildet worden waren, dann ist eine Schädigung der Zellen entweder nicht festzustellen oder sie ist wesentlich weniger stark.

Die entsprechenden Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VIII zusammengestellt, in der der Einfluß von Mischungen aus D609 + Undekansäure auf normale Zellen und auf transformierte Zellderivate verglichen wird. Die selektive Abtötung von Tumorzellen und von chemisch transformierten Zellen oder durch Viren transformierte Zellen ist aus dem Unterschied in der Überlebensrate ersichtlich, der bis zu einem Faktor von 10"' reicht. Dies ist die Grenze der Feststellbarkeit in experimentellen Testsystemen. Während also normale Zellen durch die angewandte Behandlung beinahe nicht angegriffen werden, überlebten ihre

transformierten Derivate, die niedrige Serumanforderungen zeigten, die gleiche Behandlung nicht.

Das Auftreten eines speziellen Fibrosarkoms, nämlich des Meth-A-Tumors, kann erfolgreich durch eine intraperitoneale Anwendung von einer Kombination aus D609 + Undekansäure verhindert werden. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Fig.6

veranschaulicht.

Selbst bei fortgeschrittenen Stadien dieses Tumors (fünf Tage nach der Einimpfung), kann ein therapeutischer Effekt dieser Mischung nachgewiesen werden. Die entsprechenden Ergebnisse sind in Fig.7 veranschaulicht. In beiden Fällen wies eine Behandlung mit D609 in Abwesenheit von Undekansäure im wesentlichen keinen feststellbaren Antitumoreffekt auf.

Des weiteren ist in Fig.8 die selektive Abtötung von verschiedenen B-Zellenlymphomen und T-Zellenlymphomen durch eine Behandlung einer Mischung aus D609 und Undekansäure veranschaulicht. Aus die er Figur 8 ist ferner ersichtlich, daß periphere menschliche Blutlymphocyten, abgekürzt als pBL, die entsprechende Behandlung überstanden.

Tabelle VIII

Bezeichnung	Zelltyp	stammend von	Verdoppelungszeit	Koloniebildung bei	Überlebensrate
		Lebewesen	in Tagen*	niedriger
				Serumkonzentration··
RITA	Niere	Affe	1,9	-	0,73 δδ
CV-1	Niere	Affe	1,21	-	1,20 δ
C-6	SV 40 tranformiert	Affe	1,65	+	<4ΧΐΟ"βΔΔ
MHF	Embryo
	Fibroblast	Maus	1,14	-	0,60 δ
SV3T3	SV 40 transformiert	Maus	0,53	+	<2ΧΐΟ"βΔΔ
MEF-K1	BPV-1 transformiert	Maus	0,58	+	<3Χ1Ο6ΔΔ

MCA-3F MCA-3D HEL-30

A-PDV

Keratinocyte Keratinocyte

chemisch

transformierte

Keratinocyte

chemisch

transformierte

Keratinocyte

Maus Maus

Maus

Maus

1,5 1,45

0,78

0,65

0,25 δ 0,81 δ

<2χ10"⁶δδ

2χ10"^βΔΔ

HEF HEF-BPV

Fibroblast Hamster BPV-1 transformiert Hamster

1,73 0,48

0,67 δ

<2ΧΐΟ"^βΔΔ

HeIa HEL HTB 72

MRC-5 SV-80

Wi-38

Cervix-Karzinom Mensch

Fibroblast Mensch malignes

Melanom Mensch

Fibroblast Mensch SV-40-transformierter.

Fibroblast Mensch Fibroblast Mensch

1,0 2,35

2,9 2,9

2,85

<3χ10'*δδ 0,54 ή

0,087 δ 0,80 δ

<4x 10"*δδ 0,73 δ

Erläuterungen zur Tabelle VIII

In dieser Tabelle wird die Empfindlichkeit verschiedener Zelltypen auf eine Behandlung mit einen Xanthat und einer Monocarbonsäure veranschaulicht, und es we"fon auch die Wachstumseigenschaften verschiedener Zelltypen veranschaulicht. Die fraglichen Zellen wurden in einer Dichte von 3,8 x 10Vcm² in Kunststoffkolben oder Petrischalen eingesät und das Zellkulturmedium wurde das Grundmedium nach Eagle, ergänzt mit 2,2g an NaHCOj und 1 % Penicillin und Streptomycin eingesetzt, wobei dieses Medium mit BME bezeichnet wird, und dieses Medium wurde vor seiner Verwendung mit 5% fötalem Rinderserum, abgekürzt als FBS ergänzt. Entweder wurde dieses ergänzte Medium verwendet oder ein identisches Medium, das außerdem noch lOpg/ml an dem Xanthat D609 und 40pg/ml an Undekansäure enthielt. Neues Kulturmedium, und zwar entweder solches, das die Wirkstoffkombination enthielt oder frei von dieser war, wurde vier Stunden nach dem Einsäen der Zellen zugesetzt, und die Kulturen wurden in einer Atmosphäre von 5% CO₂ bei einem pH-Wert von 7,4 ± 0,05 bei 37⁰C bebrütet. Sowohl bei den Vurgleichsversuchen als auch bei den behandelten Kulturen wurden immer zwei Parallelansätze gemacht. Nach 24 Stunden wurde das Gewebskulturmedium versetzt und man verwendete jetzt als Medium BME, ergänzt mit 10% FBS. in der vorhergegangenen Tabelle VIII in der Spalte „Überlebensrate" ist die Bezeichnung δ, bzw. die Bezeichnung δδ zu finden. Die Bezeichnung δ bedeutet, daß die Zellen 24 Stunden nach der Entfernung aus dem Medium, das D609 ( Undekansäure enthielt, trypsinisiert wurden, und die Anzahl an lebensfähigen Zellen wurde nach der Anfärbung mit Trypan-blau unter Verwendung eines Neubauer-Hämatocytometers bestimmt. Die Überlebensrate ist das Verhältnis zwischen der Zellenzahl in den unbehandelten Kulturen und in den behandelten Kulturen. Die Bezeichnung δδ bedeutet, daß 10 Tage nach der Bebrütung bei 37⁰C die Kolben zwei Minuten in 2% Formaldehyd fixiert wurden und dann eine Minute mit 0,5% kristallviolett gefärbt wurden. Die Anzahl an Zellen, die in dio Schalen oder Kolben vor der Behandlung eingesät worden war, zeigt die maximale Überlebensrate an. Es war in keinem Fall möglich, überlebende Zellen zu finden.

Die in Tabelle VIII, Spalte 4, angeführte Verdoppelungszeit in Tagen wurde wie folgt bestimmt. In Petrischalen eines Durchmessers von 6cm wurden 4 χ 10⁶ Zellen eingesät und man brütete mit BME + 5% FBS in einer 5% CO₂ enthaltenden Atmosphäre. Nach einem Tag und nach zwei Tagen wurde die Zellzahl in den zwei Schalen bei jeder Zeil-Linie bestimmt. Die Verdoppelungszeit wurde aus den vorher aufgestellten Wachstumskurven extrapoliert. In der vorletzten Spalte der Tabelle VIII wird die Koloniebildung bei niedriger Serumkonzentration beurteilt. Zu diesem Zweck wurden von jedem Zelltyp 10³ Zellen in Petrischalen eines Durchmessers von 6cm eingesät und man bibrütete während zwei Wochen in einem Medium, das 1 % an FBS oder 2% an FBS oder 5% an FBS oder 10% an FBS enthielt. Die Kolonien wurden durch eine Anfärbung mi! kristallviolett nach einer Fixierung in 1 % Formaldehyd sichtbar gemacht.

In Fig.6 werden die Ergebnisse veranschaulicht, die bei einer Behandlung des Meth-A-Tumors unmittelbar nach seiner Transplantation erzielt wurden. Männliche Bslb-c-Mäuse, die &-10 Wochen alt waren und 20g wogen, wurden mit 1 x 10^e Tumorzellen intraperitoneal beimpft. Eine Stunde nach der Transplantation der Tumorzellen wurde die Behandlung der Tiere

begonnen.

Zehn Tiere wurden einmal täglich während eines Zeitraumes von fünf Tagen mit 50 mg an dem Xanthat D 609 pro kg Körpergewicht, sowie 25 Einheiten Insulin pro kg Körpergewicht in isotoner Glucose behandelt. Diese Substanzen wurden

intraperitoneal unter Verwendung von einem ml/20g Körpergewicht des Tieres eingeimpft. Die Ergebnisse sind in der Fig. 6 durch diejenige Kurve veranschaulicht, deren Meßpunkte mit Kreisen angegeben sind.

An eine weitere Gruppe von 10 Tieren wurden statt dessen pro Injektion immer nur 1 ml an Insulin in isotoner Glucose

verabreicht. Die entsprechende Kurve ist in Fig. β diejenige, deren Meßpunkte in Form von ausgefüllten Quadraten angegeben

Man sieht aus der Fig. 6, daß acht Tiere derjenigen Gruppe, die sowohl mit D 609 als auch mit Undekansäure behandelt worden

war, während mehr als 90 Tagen überlebte.

In Fig.7 sind die Ergebnisse veranschaulicht, die erzielt wurden, wenn die Behandlung mit der Kombination aus D 609 plus Undekansäure lange nach der Transplantation des Meth-A-Tumors begonnen wurde. Weibliche Balb-c-Mäuse, die 10-12 Wochen alt waren und 20g pro Tier wogen, wurden intraperitoneal mit 1x10* Meth-A- Tumonellen beimpft. Fünf Tage nach der Transplantation dieser Tumorzellen wurden 10 Tiere mit 50mg/kg Körpergewicht an dem Xanthat mit der Bezeichnung D 609 und 50mg/kg Körpergewicht an dem Kaliumsalz der Undekansäure, sowie 25 Einheiten an Insulin/kg Körpergewicht, in isotoner Glucose jeweils zweimal täglich behandelt. Die entsprechenden Substanzen wurden in Form einer Lösung von 1 ml an jedes der Tiere duf-h Injektion verabreicht. Die entsprechende Behandlung wurde nach 25 Einimpfungen abgeschlossen. Zu Kontrollzwecken wurde eine Gruppe von zehn Tieren nach der Transplantation der Tumof zellen keiner weiteren Behandlung

unterzogen. In Fig. 7 ist die Kurve dieser Tiere der Vergleichsgruppe diejenige, deren Meßpunkte mit ausgefüllten Quadraten veranschaulicht sind.

In Fig.7 ist die Kurve, deren Meßpunkte mit unausgefüllten Kreisen dargestellt sind, diejenigen der Tiere, die mit D 609 plu«? dem Kaliumsalz der Undekansäure behandelt worden waren. Man sieht aus diesen Ergebnissen, daß zwei der getesteten Tiere mehr

als 65 Tage überlebten.

Bei dem beschriebenen Test wurde das Insulin deshalb zugegeben, um den nötigen Wachstumsfaktor im tierischen Körper für

die angestiegene Glucoseproduktion zur Verfügung zu stellen und um das Zellwachstum und die Produktivität sowie die

Stabilität zu erhöhen. In Fig.8 ist die Empfindlichkeit von normalen Blullymphocyten sowie von T-Zellenlymphomen und B-Zellenlymphomen auf eine

kombinierte Behandlung mit dem Xanthat der Bezeichnung D 609 und Undekansäure veranschaulicht.

Periphere Blutlymphocyten, abgekürzt als pBL, wurden durch Zentrifugieren auf Lymphoprep-gradienten isoliert. Die Zellen wurden in einem RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum und 5pg/ml an Phythamagglutinin ergänzt

ist, bebrütet. Nach einem Tag wurden die Zellen durch Zentrifugieren isoliert und auf Mikrotiterplatten übertragen, und zwar in einer Menge von 2 x 10^s Zellen pro Vertiefung. Es wurde jetzt neues Medium zugegeben, in dem jedoch das Phythamagglutinin fehlte, das jedoch mit 10% an lnterleukin-2 ergänzt war. Das Xanthat mit der Bezeichnung D 609 und ansteigende

Konzentrationen an Undekansäure wurden zugesetzt und die entsprechenden Konzentrationen sind auf der Abszisse dor Fig.8

eingetragen und wie man aus dieser ersehen kann, enthielten sämtliche verwendete Präparate 5pg/ml an D 609, während die

Konzentration an der Undekansäure 0pg/ml, lOpg/ml, 20pg/ml, 40pg/ml und schließlich 60pg/ml betrug. In Parallelversuchen wurden 2T-Zellenlymphome, nämlich Jurkat und K37, und 2 B-Zellenlymphome, nämlich Raji und P3HR1,

in der gleichen Weise behandelt. Nach vier Tagen der Bebrütung wurde die Anzahl der lebenden Zellen in jeder Vertiefung bestimmt, indem man die Farbausschlußmethode unter Verwendung von Trypen-blau anwandte.

In den Kulturen von Jurkat, Raji und K37-Zellen, die mit 5pg/ml an D 609 und 40pg/ml an Undekansäure behandelt worden

waren, konnten keine lebenden Zellen festgestellt werden. Die entsprechend behandelten menschlichen peripheren

Blutlymphocvten (siehe die Kurve mit der Bezeichnung pBL) waren jedoch trotz der gleichen Behandlung immer noch in der Lage, mitotische Teilungen durchzuführen. In der Folge wird die antivirale Aktivität von Mischungen aus D 609 plus Undekansäure und D 609 plus Dodecyltrimethylammoniumbromid bei einem pH-Wert von 7,4 verglichen. Die entsprechenden Ergebnisse sind in der

nachfolgenden Tabelle VIII A zusammengestellt.

Tabelle VIII A	antivirale Aktivität	Cytotoxizität
Verbindung	5,8x10' 15	1,6 1,6
Undekansäure Dodecyltrimethyl ammoniumbromid

Bei den in der obigen Tabelle VIII A angegebenen Werten erfolgte die Bestimmung der antiviralen Aktivität wie folgt: Mit HSV-1 infizierte Rita-Zellen (MOI = 0,01 pfu/Zelle) wurden in einem doppelt geführten Versuch getestet, indem man sie 23 Stunden nach der Adsorptionsperiode mit einem Behandlungsmittel behandelte, das lOpg/ml an dem Xanthat der Bezeichnung D 609 und entweder außerdem 40μg/ml an der Undekansäure oder statt dessen 20pg/ml an dem Dodocyltrimethylan-.moniumbromid enthielt. Diese Wirkstoffe befanden sich in dem Medium BME, das mit 5% FBS ergänzt war und 1 % Penicillin -ί- Streptomycin enthielt und einen pH-Wert von 7,4 besaß. Die Vermehrung der Viren wurde in Plattentests bestimmt, und die Virusausbeute wurde mit entsprechenden nicht behandelten Kulturen verglichen. In der Tabelle VIII wird die antivirale Aktivität als Faktor der Hemmung der viralen Titer angegeben, wobei von den zwei Parallelkulturen der Mittelwert angeführt ist.

Die in Tabelle VIII A angegebene Cytotoxizität wurde an nicht infizierten Rita-Zellen bestimmt. Zu diesem Zweck wurden die nicht infizierten Rita-Zellen in der gleichen Weise behandelt, wie dies im vorangegangenen Abschnitt im Zusammenhang mit der a.ntiviralen Aktivität erläutert wurde. Es wurde dann die Zellzahl bestimmt, indem man die Zellen in einer Neubauer Zählkammer z/ihlte. Das Verhältnis zwirchen entsprechenden unbehandelten Kulturen und behandelten Kulturen ist in der Tabelle angegeben, wobei der angeführte Wert der Mittelwert aus den beiden Parallelversuchen ist. Aus den in Tabelle VIII A angeführten Ergebnissen sieht man, daß das kationische Hilfsmittel Dodecyltrimetliylammoniumbromid wesentlich schlechter geeignet ist als die Undekansäure. Man sieht deutlich, daß das Dodecyltrimethyiammoniumbromid wesentlich weniger als die antivirale Aktivität des Wirkstoffes steigert, als die Undekansäure.

Obwohl die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthaltenen Xanthate mit antiviraler Aktivität und Antitumor-Aktivität und insbesondere das Xsnthai rrit der Bezeichnung D 609, alleine verwendet, ihre antivirale Aktivität wirksamer bei einem pH-Wert von 6,8 ausüber, als bei etwas höher liegenden pH-Werten im Bereich von 7,25-7,8, so sind dennoch die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die als weitere Komponente das ionische Hilfsmittel enthalten, wirksame Inhibitoren für das Wachstum von Viren bei physiologischen pH-Werten, die etwa 7,4 betragen. Bei der Durchführung weiterer Untersuchungen wurden Zellkulturen von Rita-Zellen einen Tag nach ihrer Infektion mit HSV-I mit dem Xanthat D 609 behandelt und gleichzeitig mit einem der ionischen Hilfsmittel, die in der nachfolgenden Tabelle IX zusammengestellt sind. Aufgrund der Ergebnisse von Voruntersuchungen wurde in allen Fällen ein Verhältnis von D 609 zu dem ionischen Hilfsmittel von 1:4 eingehalten. Die Ausbeute der Virenvermehrung wurde nach dem Plattentest bestimmt und mit der Ausbeute von unbehandelten infizierten Kulturen verglichen.

Eine kombinierte Behandlung mit D 609 und irgendeinem der drei in der Tnbelle IX zuerst genannten ionischen Hilfsstoffe führte zu einer drastischen Hemmung des Wachstums von HSV-1 bei einem pH-Wert von 7,4. Die erhöhte antivirale Wirkung kann nicht auf eine erhöhte Cytotoxizität zurückgeführt werden, weil zwischen 62,5% und 83% der nicht infizierten Zellen zu Kontrollzwecken, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden, wie die infizierten Zellkulturen, immer noch fähig waren, mitotische Teilungen durchzuführen. Es sei in diesem Zusammenhang auf Tabelle IX verwiesen. Die drei anderen Hilfsmittel, die in der Tabelle IX genannt sind, also das dort an 4. Stelle, 5. Stelle und 6. Stelle genannte ionische Hilfsmittel, zeigten nur eine minimale antivirale Wirksamkeit, wenn man sie mit den ersten drei in der Tabelle genannten Hilfsmitteln vergleicht.

Tabelle IX Antivirale Aktivität von D 609 in Kombination mit Ionischen Hilfsmitteln bei einem pH-Wert von 7,4

	Struktur des	Faktor der Hemmung	Cytotoxizität
	ionischen Hilfsmittels	antivirale	1,6
ionisches Hilfsmittel	CH3(CH2I8COOH	Aktivität
Undekansäure		5,8 XiO3	1,2
Natriumsalz der	C23Hj9O2COONa		1,6
Desoxycholsäure	CH3(CH2I11OSO3Na	1,0 x 101	nicht bestimmt
Natrium-dodecylsulfat	CH3(CH2I11OPO3H2	7,2x103	1,4
Dodecylphosphat	CH3(CH2I11PO3H2	10,4	1.6
Dodecyl-phosphonsäure	CH3(CHj)11N(CH3I3 + Br-	2,8
Dodecyltrimethyiammoniumbromid	15

Die in Tabelle IX in der vierten Spalte angegebene antivirale Aktivität wurde bestimmt, indem Kulturen von mit HSV-I infizierten Rita-Zellen in einem Doppelversuch getrennt während 23 Stunden nach der eine Stunde dauernden Adsorptionsperiode mit einem Behandlungsmittel behandelt wurden, das 10pg/ml an D 609 und 40Mg/ml an jedem der angeführten ionischen Hilfsstoffe enthielt. Die Virusvermehrung wurde anhand von im Doppel durchgeführten Plattentests bestimmt und mit der Virusausbeute von entsprechenden nicht behandelten Kulturen verglichen. Die antivirale Aktivität wird als der Faktor der Hemmung der Virusbildung oder Virusvermehrung angegeben.

Die in Tabelle IX in der letzten Spalte angegebene Cytotoxizität wurde bestimmt, indem nicht infizierte Rita-Zellen in der gleichen Weise, wie oben angegeben, behandelt wurden, und auch dieser Test wurde jeweils doppelt ausgeführt. Die Zellzahl wurde bestimmt, indem man die Anzahl der Zellon unter Verwendung einer Neubauer Zählkammer zählte. Das Verhältnis der Anzahl der Zellen, die in entsprechenden nicht behandelten Kulturen anzutreffen waren, zu der Anzahl der Zellen, die in den behandelten Kulturen anzutreffen waren, ist in der letzten Spalte der Tabelle IX angeführt, wobei in jedem Fall die Mittelwerte aus zwei parallelen Kulturen zur Berechnung herangezogen wurden.

Hemmung von HTLVIII-Vlrus durch eine synergistische Kombination von DEXA plus Undekansäure Zur Vermehrung des HTLVIÜ-Virus wurden K37-Zellen, also T-Zellen von menschlichen Lymphomen, verwendet. Die K37-Zellen

wurden mit HTLVIII-Virus infiziort, undsio wurden während eines Zeitraumes von drei oder fünf Tagen nach der Infektion mit einer synergistischen Mischung behandelt, die lOpg/ml an DEXA und lOpg/ml an Undekansäure enthielt.

Unter diesen Bedingungen wachsen die K37-Zellen immer noch, wie dies durch die Zählung der Zellen nach einer Anfärbung der

vitalen Zellen sichtbar war, und zwar wurde die Zählung vor dem Beginn und am Ende der fünf Tage der Behandlung durchgeführt. Außerdem wurde die gleiche Menge an cellularer mRNA (Northern Blot) in den behandelten und in den unbehandelten Zelle*.) gefunden. Zur gleichen Zeit wurde die DNA von den behandelten 2'ellen und auch von den unbehandelten infizierten Kulturen der K37-Zellen isoliert und mit geclonter authentischer HTLVIII-DNA hybridisiert, welche mit 32_P markiert worden war. Die Ergebnisse wurden autoradiographisch bestimmt.

Ein Zwischenprodukt der Replikation von HTLVIII-Virus ist die superhelicale DNA und dies trifft für alle Retroviren zu. Diese

superhelicale DNA, nämlich die Form I und auch die entspannte oder relaxierte Form Il kann in den unbehandelten infizierten

Kulturen nach drei Tagen und auch nach fünf Tagen nachgewiesen werden, und zwar in der Form von schwarzen Flecken in den Autoradiogrammen, die in den Fig.5b und 5d dargestellt sind. Nach der Spaltung mit einem eine einzige Schnittstelle oder Spaltstelle hervorrufenden Restriktionsenzym, welches die Öffnung

der ringförmigen DNA unter Bildung einer linearen DNA eine einheitliche Länge bewirkt, erhält man die typischen Signale wieder nach drei Tagen, bzw. fünf Tagen. Diese Ergebnisse sind aus den Fig. 5f und 5h ersichtlich.

Es war nicht möglich, in den behandelten Kulturen nach drei Tagen oder nach fünf Tagen entweder die superhelicale DNA

festzustellen (dies ist aus den Fig.5 a und 5c ersichtlich) oder nach der Spaltung die lineare DNA festzustellen (dies ist aus den

Fig. 5e und 5f ersichtlich). Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit dem Xanthat der Bezeichnung DEXA und der Undekansäure

die Replikation des HTLVIII-Virus vollständig hemmt.

Diese Hemmung findet in den K37-Zellen bei einer Konzentration statt, die nicht infizierte Zellen in keiner Weise toxisch schädigt. Nur ein Ansteigen der Konzentration führt zu einer selektiven Zerstörung, nicht nur der K37-T-Iymphomzellen, sondern auch der

anderen menschlichen T-Iymphomzell-Linien und B-Iymphomzell-Linien, wie dies aus der Fig. 8 ersichtlich ist. Die synergistische

Mischung aus DEXA und Undekansäure läßt jedoch die mitogen-stimuüerten menschlichen peripheren Lymphocyten, die mit

pBL abgekürzt werden, bei solchen Konzentrationen ungeschädigt, die selektiv letal für Tumorzellen sind.

Zu diesem Zwecke wurden periphere Blutlymphocyten durch Zentrifugieren über Lymphoprepgradienten isoliert. Die Zellen

wurden in RPMI-1640-Medium, dem 10% an fötalem Kälberserum und δμρ/ηιΙ Phythamagglutinin zugesetzt worden waren, bebrütet. Nach einem Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation pelletiert und auf Mikrotiterplatten transferiert, und zwar in einer Menge von 2 χ 10^s Zellen pro Vertiefung. Auf den Mikrotiterplatten wurden die Zellen in einem neuen Medium gezüchtet, das kein Phythamagglutinin enthielt, das jedoch 10% an lnterleukine-2 enthielt.

Als Behandlungsmittel wurden Mischungen verwendet, die jeweils Spg/ml an dem Xanthat mit der Bezeichnung DEKA

enthielten und ansteigende Mengen an Undekansäure, nämlich Opg/ml, bzw. lOpg/ml, bzw. 20pg/ml, bzw. 40pg/ml, bzw.

60Mg/ml. Diese Ergebnisse sind aus der Fig.8 ersichtlich.

Parallel zu diesem Versuch wurden sowohl T-Zellenlymphome, nämlich Jurkat und K37, als auch B-Zellenlymphome, nämlich Raji und P3HR1 in der gleichen Weise behandelt. Nach einer Bebrütung während vier Tagen wurde die Anzahl an lebenden Zellen durch das Farbausschlußverfahren unter Verwendung von Trypanblau bestimmt. In den Jurkat-, Raji-, und K37-Kulturen,

die mit der Mischung aus δμρ/ΓηΙ an DEXA und 40 Mg/ml an Undekansäure behandelt worden waren, wurden keine lebenden

Zellen gefunden. Behandelte menschliche periphere Blutlymphocyten waren jedoch in der Lage, selbst unter diesen Bedingungen eine mitotische Teilung vorzunehmen. Die spezifische Hemmung der Vermehrung oder Replikation von HTLVIII-Virus und auch die selektive Cytotoxizität gegenüber

menschlichen T-Iymphomtumorzellen und menschlichen B-Iymphomtumorzellen bewirken, daß eine Mischung aus DEXA und

Undekansäure ein wirksames Mittel zur Chemotherapie der Immunschwächekrankheit AIDS ist. Aus den weiter vorne veranschaulichten Versuchsergebnissen sieht man, daß die erfindungsgemäßen synergistischen Mischungen neue antiviral Zusammensetzungen und Antitumor-Zusammensetzungen sind, die einen bekannten Wirkstofft mit

antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit enthalten, vorzugsweise eine entsprechendes Xanthat und ferner ein die

Aktivität erhöhendes Hilfsmittel, das eine ionische Verbindung ist, die in ihrem Molekül mindestens eine lipophile Gruppe und

außerdem mindestens eine hydrophile Gruppe aufweist. Des weiteren werden Verfahren zur Herstellung dioser Mittel beschrieben, und es wird außerdem erläutert, wie diese Mittel eingesetzt werden können, um Viren und Tumore zu bekämpfen.

Die erfindungsgemäßen Mittel haben eine Anzahl an vorteilhaften Eigenschaften. Es sei darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung nicht auf irgendwelche einzelne hier beschriebene Arbeitsverfahren,

spezielle Zusammensetzungen, Methoden und Arbeitsschritte beschränkt werden soll. Für den Fachmann auf diesem Gebiet sind entsprechende Variationen und Modifikationen der hier beschriebenen speziellen Ausführungsarten auf der Hand liegend.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung der antiviralen und Antitumor-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einen Wirkstoff mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirksamkeit und mindestens ein Hilfsmittel, das mindestens eine hydrophile Gruppe und mindestens eine lipophile Gruppe aufweist, vermischt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirkstoff mit antiviraler Wirksamkeit und Antitumor-Wirkung ein Xanthat verwendet, insbesondere ein Xanthat der Formel I