CS275793B6 - Production method of the antivirus and antitumour agent - Google Patents

Description

Vynález se týká nových prostředků vhodných pro použití při potírání virů a nádorů, tj. oři eliminaci, zlepšování, úlevě nebo zmírnění virů a nádorů a stavů z nich vyplývajících, například postižení, infekcí nebo chorob, přičemž tyto přípravky kromě známé antivirově a protinádorově účinné xanthátové sloučeniny obsahují iontovou pomocnou látku mající lipofilní a hydrofilní skupinu, která zlepšuje nebo zvyšuje protivirovou a protinádorovou účinnost těchto účinných sloučenin. Vlastním předmětem vynálezu potom je dále popsaný způsob výroby těchto prostředků.The invention relates to novel compositions suitable for use in combating viruses and tumors, i.e., to eliminate, ameliorate, ameliorate or alleviate viruses and tumors and conditions resulting therefrom, for example, afflictions, infections or diseases, wherein these formulations in addition to the known antiviral and anti-tumor xanthate the compounds comprise an ionic excipient having a lipophilic and hydrophilic group which improves or enhances the antiviral and antitumor activity of these active compounds. The object of the present invention is the process for the production of these compositions.

V německém zveřejňovacím spise č. 31 46 772, stejně jako v britském pat. spise č.In German publication no. 31 46 772, as well as in British Pat. file no.

091 244, kanadských pat. spisech č. 1 174 978 a 1 175 047 a americkém pat. spise č.091 244, Canadian Pat. Nos. 1,174,978 and 1,175,047; and U.S. Pat. file no.

602 037, vydaném 22. července 1986 jsou popsány xantháty, které mají zajímavé farmakologické vlastnosti, zejména protivirovou a protinádorovou aktivitu nebo účinek.No. 602,037, issued July 22, 1986, discloses xanthates having interesting pharmacological properties, particularly anti-viral and anti-tumor activity or activity.

Nyní byio nalezeno, že některé pomocné látky, které samotné nevykazují protivirovou nebo protinádorovou účinnost, zlepšují účinnost protivirově a protinádorově účinných xanthátů, zejména těch, které jsou popsány v německém zveřejňovacím spise č. 31 46 772 zIt has now been found that some excipients which do not themselves exhibit anti-viral or anti-tumor activity improve the efficacy of anti-viral and anti-tumor xanthates, particularly those described in German Patent Publication No. 31 46 772 of

2. září 1982, v britském pat. spise č. 2091244, zveřejněném 28. července 1982 a udělenémSeptember 2, 1982, British Pat. No. 2091244, published Jul. 28, 1982, and assigned

6. února 1985, v kanadských pat. spisech č. 1 174 978 a 1 175 047, oba z 25. září 1984 a ve dříve citovaném americkém pat. spise.February 6, 1985, in Canadian Pat. U.S. Patent Nos. 1,174,978 and 1,175,047, both September 25, 1984 and U.S. Pat. rather.

Vynález se proto týká protivirových a protinádorových přípravků, které jsou použitelné ke zmírnění stavů vyvolaných viry a nádory a které obsahují jako aktivní složku protivirově a protinádorově účinnou xanthátovou sloučeninu obecného vzorce IThe invention therefore relates to anti-viral and anti-tumor agents which are useful for alleviating viral and tumor-induced conditions and which contain, as an active ingredient, an anti-viral and anti-tumor xanthate compound of the formula I

ve kterémin which

R¹ představuje benzylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, adamantylovou skupinu, bicykloheptylovou skupinu, tricyklododecylovou skupinu, cyklododecylovou skupinu, dodecylovou skupinu nebo 4-isobornylcyklohexylovou skupinu aR ¹ represents benzyl, cyclohexyl, adamantyl, bicycloheptyl, tricyclododecyl, cyclododecyl, dodecyl or 4-isobornylcyclohexyl and

R znamená sodík, draslík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, a alespoň jednu iontovou pomocnou látku obsahující lipofilní i hydrofilní skupinu.R represents sodium, potassium or a C 1 -C 4 alkyl group, and at least one ionic excipient comprising both a lipophilic and a hydrophilic group.

Shora uvedená pomocná látka se účelně volí ze skupiny zahrnující alifatické monokarboxylové kyseliny s 9 až 13 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, ethersulfáty, fosfáty nebo fosfonáty mastných alkoholů s 8 až 18 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, a soli deoxycholové kyseliny s alkalickými kovy.The adjuvant is suitably selected from the group consisting of aliphatic monocarboxylic acids having from 9 to 13 carbon atoms and their sodium and potassium salts, ether sulfates, phosphates or phosphonates of fatty alcohols having from 8 to 18 carbon atoms and their sodium and potassium salts, and deoxycholic acid salts. with alkali metals.

S výhodou obsahují shora zmíněné pomocné látky 11 atomů uhlíku.Preferably, the abovementioned excipients contain 11 carbon atoms.

Tyto pomocné látky také zvyšují účinnost antivirově a protinádorově účinného xanthátu v širším rozmezí pH, včetně fyziologického pH.These excipients also increase the efficacy of antiviral and antitumor xanthate over a wider pH range, including physiological pH.

Účinky prostředků podle vynálezu jsou zřejmé z připojených výkresů, kde na obr. 1 je graf znázorňující distribuci radioaktivního uridinu v přeměných a nepřeměněných (normálních) fibroblastových buňkách embrya myší po různých kombinacích aktivní složky (0609) a pomocné látky, kde množství aktivní složky je fixováno na 20 /ug/ml a množství pomocné látky se pohybuje mezi. 10 až 100 yug/ml, na obr. 2 je graf znázorňující reakci indukovaných kožních nádorů ňa intravenózní (IV) léčbu přípravky podle vynálezu a na jejich jednotlivé složky.v korelovatelných koncentracích (10 mg/kg), na ob’-. 3 je graf znázorňující vlivy délky řetězce monokarboxylových kyselin na protivirovou účinnost a cytotoxicitu v kombinaci s 0609 na neinfikované i HSV-l-lnfikované Rita buňky, na obr. 4 je graf znázorňující inhibici růstu viru herpes po různých koncentracích 0609 v kombinaci s různýmiThe effects of the compositions of the invention are apparent from the accompanying drawings, wherein Fig. 1 is a graph showing the distribution of radioactive uridine in transformed and unconverted (normal) fibroblast cells of mouse embryo after various combinations of active ingredient (0609) and excipient, wherein the amount of active ingredient is fixed to 20 µg / ml and the amount of excipient is between. 10 to 100 yug / ml, FIG. 2 is a graph showing the response of induced skin tumors to intravenous (IV) treatment with the compositions of the invention and to their individual components at correlable concentrations (10 mg / kg) per ob. 3 is a graph showing the effects of monocarboxylic acid chain length on antiviral activity and cytotoxicity in combination with 0609 on both uninfected and HSV-1-infected Rita cells; FIG. 4 is a graph showing inhibition of herpes virus growth after various concentrations of 0609 in combination with various

CS 275793 B 6 poměry undekanové kyseliny, na obr. 5 jsou zobrazeny výsledky gelové elektrofořezy prokazující úplnou inhibici replikace viru HTLVIII, na obr. 6 jsou výsledky léčby Mcth-A nádoru Liozprus třednč po transplantaci za použití kombinace 0609 a kyseliny undekanové, na obr. 7 jsou výsledky léčby Meth-A nádoru především po transplantaci za použití kombinace D609 a kyseliny undekanové a na obr.8 je graf vyjadřující citlivost normálních krevních lymfocytů a lynifomů T-buněk a B-buněk na kombinaci 0609 a kyseliny undekanové.Fig. 5 shows gel electrophoresis results showing complete inhibition of HTLVIII virus replication; Fig. 7 shows the results of treatment of a Meth-A tumor mainly after transplantation using a combination of D609 and undecanoic acid; and Fig. 8 is a graph expressing the sensitivity of normal blood lymphocytes and T-cell and B-cell lynifomas to a combination of 0609 and undecanoic acid.

Jak již bylo shora řečeno, je vlastním předmětem vynálezu způsob výroby protivirového a protinádorového prostředku se zlepšenou účinností, na bázi protiví rove a protinádorově účinných xanthátu, vyznačující se tím, že se xanthát obecného vzorce IAs stated above, the object of the present invention is a process for the production of an anti-viral and anti-tumor composition with improved efficacy, based on anti-cancer and anti-tumor xanthates, characterized in that the xanthate of the formula I

ve kterém r! představuje benzylovou skupinu, cykiohexylovou skupinu, adamantylovou skupinu, bicykloheptylovou skupinu, tricyklodecylovou skupinu, cyklododecylovou skupinu, dodecylovou skupinu nebo 4-isobornylcyklohexylovou skupinu ain which r! represents benzyl, cyclohexyl, adamantyl, bicycloheptyl, tricyclodecyl, cyclododecyl, dodecyl or 4-isobornylcyclohexyl; and

R znamená sodík, draslík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, při teplotě nepůsobící destruktivně na jednotlivé komponenty smísí s pomocnou látkou vybranou ze skupiny zahrnující alifatické monokarboxylové kyseliny s 9 až 13 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, ethersulfáty, fosfáty nebo fosfonáty mastných alkoholů s 8 až 18 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, a soli deoxycholové kyseliny s alkalickými kovy,íiiv molárnim poměru xanthátu k pomocné látce od 1 : 6 do 1 : 0,25.R is sodium, potassium or a C 1 -C 4 alkyl group, mixed with an excipient selected from the group consisting of C 9 -C 13 aliphatic monocarboxylic acids and their sodium and potassium salts, ether sulfates, phosphates or phosphonates of C8-C18 fatty alcohols and their sodium and potassium salts, and alkali metal deoxycholic acid salts, in a molar ratio of xanthate to excipient of from 1: 6 to 1: 0.25.

Výhodnou účinnou látkou obecného vzorce I je benzylxanthát sodný nebo draselný, cyklohexylxanthát sodný nebo draselný,A preferred active ingredient of the formula I is sodium or potassium benzyl xanthate, sodium or potassium cyclohexyl xanthate,

1- adamantylxanthát sodný nebo draselný,Sodium or potassium adamantylxanthate,

8(9)-tricyklo^5,2,l,0^’^Jdecylxanthát sodný nebo draselný,8 (9) -tricyclo ^ 5.2, l, 0 ^ ´ ^ Sodium or potassium decyl xanthate,

2- endo- nebo exo-bicyklo[2,2,1^’heptylxanthát sodný nebo draselný, cyklododecylxanthát sodný nebo draselný, n-dodecylxanthát sodný nebo draselný nebo2- sodium or potassium endo- or exo-bicyclo [2.2.1.1 ', heptylxanthate, sodium or potassium cyclododecylxanthate, sodium or potassium n-dodecylxanthate, or

4-isobornylcyklohexylxanthát sodný nebo draselný.Sodium or potassium 4-isobornylcyclohexylxanthate.

Podle vynálezu je pro hydrofilní skupinu, jmenovitě karboxylovu, sulfátovou, sulfonátovou nebo fosfátovou skupinu pomocné látky výhodné, aby byla umístěna na jednom konci s výhodou prodloužené alifatické části, která představuje lipofilní skupinu, čímž se vytváří polární molekula s hydrofilní hlavou a iipofilním tělem. Zejména výhodnými karboxylovými kyselinami tohoto typu jsou kyselina dekanová, undekanové a kyselina dodekanová. Pomocné látky jsou proto s výhodou sloučeniny s aniontovou hydrofilní skupinou, které jsou s výhodou používány ve formě farmaceuticky snášenlivých solí, zejména jako soli s alkalickými kovy, a zejména jako sodná nebo draselná sůl, ačkoliv četné kationtové sloučeniny, například ve formě kvarterních amoniových solí, jsou dostupné podle dřívějšího stavu techniky a lze jich v některých případech s výhodou použít za předpokladu, že vyhovují dalším požadavkům, například Iipofilním a hydrofilním zbytkům, jak je ukázáno dále.According to the invention, it is preferred for the hydrophilic group, namely the carboxyl, sulfate, sulfonate or phosphate group of the excipient, to be located at one end of the preferably elongated aliphatic moiety which represents the lipophilic group, thereby forming a polar molecule with hydrophilic head and iipophilic body. Particularly preferred carboxylic acids of this type are decanoic, undecanoic and dodecanoic acids. The adjuvants are therefore preferably compounds with an anionic hydrophilic group, which are preferably used in the form of pharmaceutically acceptable salts, in particular as alkali metal salts, and in particular as sodium or potassium salts, although numerous cationic compounds, for example in the form of quaternary ammonium salts, they are available in the prior art and can in some cases be advantageously used provided they meet other requirements, for example lipophilic and hydrophilic residues, as shown below.

Karboxylová kyselina může být také fluorována nebo peříluorována, což znamená, že v takových karboxylových kyselinách některé, mnohé nebo všechny atomy vodíku C-H vazeb lze nahradit atomy fluoru.The carboxylic acid can also be fluorinated or perfluorinated, meaning that in such carboxylic acids some, many, or all of the hydrogen atoms of the C-H bonds can be replaced by fluorine atoms.

CS 275793 B 6CS 275793 B 6

Dalšími příklady pomocných látek tohoto typu jsou sulfáty mastných alkoholů (estery kyseliny sírové s mastným alkoholem), například dodecylsulfát sodný (SDS), laurylsulfát amonný, sulfáty etherů mastných alkoholů (alkylethersulfáty), například R-ÍO-CHj-CHg^-OSO^Na a podobně, fosfáty etherů mastných alkoholů (estery fosforečné kyseliny s mastným alkoholem) například sloučeniny vzorce ⁰ Other examples of excipients of this type are fatty alcohol sulphates (sulfuric acid esters of fatty alcohol), for example sodium dodecyl sulphate (SDS), ammonium lauryl sulphate, fatty alcohol ether sulphates (alkyl ether sulphates), for example R-10-CH 3 -CH 2 -OSO 4 Na. and the like, fatty alcohol ether phosphates (phosphoric acid fatty alcohol esters) of, for example, a compound of Formula ⁰

R-0-(CH₉-CH₉-0) -P-ONaR-O- (CH ₉ -CH ₉ -O) -P-ONa

Z Z Π |Z Z Π |

ONa jako ethoxylovaný oleyletherfosfát a podobně.ONa such as ethoxylated oleyl ether phosphate and the like.

Molárni poměr xanthátu obecného vzorce I k pomocné látce se s výhodou pohybuje od 1 : 3 do 1 : 0,5, zejména od 1 : 1 do 1 : 2.The molar ratio of xanthate (I) to excipient is preferably from 1: 3 to 1: 0.5, in particular from 1: 1 to 1: 2.

Prostředky podle vynálezu lze aplikovat lokálně, orálně nebo parenterálně. Vhodné orální nebo parenterálni aplikační formy jsou tablety, tobolky, čípky a infuzní nebo injekční roztoky. Tyto aplikační formy jsou připravovány v kombinaci s obvyklými farmaceuticky snášenlivými pomocnými látkami, nosiči a ředidly.The compositions of the invention may be administered topically, orally or parenterally. Suitable oral or parenteral dosage forms are tablets, capsules, suppositories, and infusion or injection solutions. These dosage forms are prepared in combination with conventional pharmaceutically acceptable excipients, carriers, and diluents.

Dávkování, kterého má být použito, závisí v principu na specifické aplikační formě a na účelu nebo předmětu použití, například na terapii nebo profylaxi. Velikost jednotlivé dávky stejně jako aplikační režim lze nejvýhodněji stanovit pomocí individuálního hodnocení příslušného případu. Terapeuticky účinné množství kombinace podle vynálezu, použité pro jednu injekci, leží obvykle v rozmezí dávky přibližně 0,005 až přibližně 10 mg na kg tělesné hmotnosti, s výhodou v rozmezí přibližně 0,01 až přibližně 0,1 mg na kg tělesné hmotnosti. Kromě kombinace podle vynálezu tyto orální nebo parenterálni aplikační formy obsahují obvykle pufr, který udržuje hodnotu pH přibližně mezi 7 až 8, zvláště asi na 7,4 a pro isotonické nastavení se přidává chlorid sodný, mannit nebo sorbit. Mohou být připraveny také v lyofilizované nebo ztužené formě. Pochopitelně, když účelem je usmrcení viru mimo organismus žijícího zvířete, lze použít kombinace bez terapeutických nebo farmaceutických úvah.The dosage to be used depends in principle on the specific dosage form and the purpose or object of use, for example therapy or prophylaxis. The individual dose size as well as the dosing regimen can most preferably be determined by individual assessment of the case. The therapeutically effective amount of the combination of the invention used for a single injection is generally in the dosage range of about 0.005 to about 10 mg per kg body weight, preferably in the range of about 0.01 to about 0.1 mg per kg body weight. In addition to the combination according to the invention, these oral or parenteral dosage forms usually contain a buffer which maintains a pH of between about 7 to 8, in particular about 7.4, and isotonic adjustment of sodium chloride, mannitol or sorbitol. They can also be prepared in lyophilized or solidified form. Of course, when the purpose is to kill the virus outside the organism of a living animal, combinations without therapeutic or pharmaceutical considerations can be used.

Vhodný přípravek pro lokální aplikaci lze připravit na vodné bázi, například rozpuštěním kombinace podle vynálezu v roztoku vodného pufru s následujícím přidáním polymerního zahuštovadla, například polyvinylpyrrolidonu.A suitable topical formulation may be prepared on an aqueous basis, for example by dissolving the combination of the invention in an aqueous buffer solution followed by the addition of a polymeric thickener, such as polyvinylpyrrolidone.

Vhodnou olejovitou aplikační formu pro lokální aplikace lze získat například suspendováním kombinace podle vynálezu v oleji, následujícím přidáním botnadla, například stearátu hlinitého a/nebo rostlinného aktivního činidla nebo tensidu, jehož hodnota HLB (hydrofilně-lipofolní rovnováha) je účelně nižší než 10, například monoesteru vicemocného mastného alkoholu s mastnou kyselinou, například glycerin-monostearátu nebo sorbit-monooleátu.A suitable oily dosage form for topical applications can be obtained, for example, by suspending the combination of the invention in oil, followed by the addition of a botulinum, for example aluminum stearate and / or a vegetable active agent or surfactant, whose HLB (hydrophilic-lipophol balance) a polyhydric fatty alcohol with a fatty acid, for example glycerin monostearate or sorbitol monooleate.

Vhodnou tukovu mast lze připravit například suspendováním obou složek prostředku podle vynález v máslovém základu a potom přidáním tensidu s hodnotou nižší než 10. Emulzní mast lze získat podobně, například mícháním vodného roztoku obou aktivních složek podle vynálezu do měkkého mastového základu a přidáním tensidu s hodnotou HBL nižší nežA suitable fat ointment can be prepared, for example, by suspending both components of the composition of the invention in a butter base and then adding a surfactant of less than 10. An emulsion ointment can be obtained similarly, e.g. by mixing an aqueous solution of both active ingredients of the invention into a soft ointment base and adding a surfactant with HBL. lower than

10. Všechny takové lokální aplikační formy mohou obsahovat také konzervační látky. Koncentrace obou aktivních látek v celkové směsi je obvykle asi 0,5 mg až 5 mg, s výhodou 0,25 až 1 mg, až přibližně 100 mg celkové směsi, v širším rozmezí až do 10 mg na 100 mg celkové směsi.10. All such topical dosage forms may also contain preservatives. The concentration of both active agents in the total composition is usually about 0.5 mg to 5 mg, preferably 0.25 to 1 mg, to about 100 mg of the total composition, in a wider range of up to 10 mg per 100 mg of the total composition.

Xantháty obecného vzorce I jsou známé a lze je připravit například reakcí alkoholátu obecného vzorce R^-O-Me, kde R¹ má výše uvedený význam a Me značí atom alkalického kovu, se sirouhlíkem, nebo reakcí alkoholu, který odpovídá výše uvedenému alkoholátu, se sirouhlíkem v přítomnosti silné alkalické báze způsobem o sobě známým. Taková příprava je popsána v německém zveřejnovacím spisu č. 31 46 772 a v dalších zveřejněných přihláškách a vynálezech citovaných shora. V tomto kontextu je činěn výslovný odkaz na tyto zveřejněné dokumenty.Xanthi formula I are known and can be prepared for example by reacting an alcoholate of the formula R-O-Me, wherein R ¹ is as defined above and Me represents an alkali metal atom, with carbon disulphide or by reacting an alcohol corresponding to the alcoholate above, the carbon disulfide in the presence of a strong alkali base in a manner known per se. Such preparation is described in German Patent Publication No. 31 46 772 and in other published applications and inventions cited above. In this context, explicit reference is made to these published documents.

CS 275793 Β 6CS 275793 Β 6

Druhá složka přípravku podle vynálezu, jmenovitě iontová pomocná látka s hydrofilním i lipofilním zbytkem, je obvykle volena z komerčně dostupných produktů.The second component of the composition of the invention, namely the ionic excipient with both a hydrophilic and a lipophilic residue, is usually selected from commercially available products.

Testy farmakologických účinků prostředků podle vynálezu, včetně dosažených výsledků a jejich diskuse, ale i objasnění shora zmíněných obrázků, jsou uvedeny dále.Tests of the pharmacological effects of the compositions of the invention, including the results obtained and their discussion, as well as an explanation of the above-mentioned figures, are given below.

1. Cytotoxicita1. Cytotoxicity

Zkoušené látky:Test substances:

8(9)-tricyklo-5,2,1,0^’Sdecylxanthát draselný (D609) zkratka DEXA, kombinovaný s různými karboxylovými kyselinami s dlouhým řetězcem, které jsou uvedeny v následující tabulce.8 (9) -tricyclo-5,2,1,0- "Potassium decylxanthate (D609) abbreviation DEXA, combined with various long chain carboxylic acids, which are listed in the following table.

Použité buněčné kultury:Cell cultures used:

normální fibroplasty embrya křečka (HEF);normal hamster embryo fibroplasts (HEF);

fibroplasty embrya křečka transformované sérem hovězího papilonu (HEF-BPV).hamster embryo serum (HEF-BPV) transformed hamster embryo fibroplasts.

Prostředí:Environment:

Eagleho základní prostředí s Earleho solemi (BME), doplněné 10¾ fetálním telecím sérem (FBS); 1 % penicilinu, streptomycinu; pH = 7,4.Eagle's Baseline with Earle Salts (BME), supplemented with 10¾ fetal calf serum (FBS); 1% penicillin, streptomycin; pH = 7.4.

Způsob:Way:

Uvedené typy buněk se inkubují in vitro v uvedeném prostředí. Ke každému vzorku se přidá kombinace sestávající ze 20 ^ul výše uvedené účinné látky DEXA a postupně zvyšovaných množství mastné kyseliny (uvedeno v následující tabulce). Po uplynutí doby tří dnů se kultury mikroskopicky vyšetří, čímž se určí minimální toxická koncentrace. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.Said cell types are incubated in vitro in said medium. To each sample is added a combination consisting of 20 µl of the above-mentioned DEXA active ingredient and progressively increased amounts of fatty acid (shown in the following table). After a period of three days, the cultures were examined microscopically to determine the minimum toxic concentration. The results are summarized in the following table.

Tabulka 1Table 1

Zkoušená kombinace DEXA + adjuvans Test combination DEXA + adjuvant HEF-kultura HEF-BPV-kultura minimální toxická koncentrace 20 /Ug/ml DEXA + adjuvans adjuvans yug/ml adjuvans /Ug/nil HEF-culture HEF-BPV-culture minimum toxic concentration 20 / Ug / ml DEXA + adjuvant yug / ml adjuvant / Ug / nil DEXA + děkanové kyselina DEXA + undekanová kyselina DEXA + dodekanová kyselina DEXA + myristová kyselina DEXA + decanoic acid DEXA + undecanoic acid DEXA + dodecanoic acid DEXA + myristic acid 100 10 100 10 40 10 30 10 100 10 100 10 40 10 30 10

Tabulka 1 ukazuje, že kombinace aktivní látky DEXA a mastné kyseliny je podstatně toxičtější k transformované buněčné kultuře než k buněčné kultuře, která nebyla transformována. To se týká zejména kombinace s kyselinou děkanovou a undekanovou, přičemž tyto kombinace jsou 10 x toxičtější k transformované buněčné kultuře než k normální buněčné kultuře.Table 1 shows that the combination of DEXA and fatty acid is significantly more toxic to transformed cell culture than to a cell culture that has not been transformed. This is particularly true of the combination with decanoic acid and undecanoic acid, which combinations are 10 times more toxic to transformed cell culture than to normal cell culture.

V dalším testu cytotoxicity byly zkoušeny různé kombinace podle vynálezu se zřetelem na jejich toxicitu, v buněčných kulturách fibroblastů embrya myší (MEF) a přeměněných fibroblastů embrya myší (MEF-K1). Tyto buněčné kultury byly inkubovány v následujícím prostředí: BME, 5% telecí plasma, penicilín, streptomycin, pH = 7,4. Testy byly prováděny analogicky k výše uvedeným údajům, ale s tím rozdílem, že mikroskopické hodnocení byloIn another cytotoxicity assay, various combinations of the invention were tested for toxicity in cell cultures of mouse embryo fibroblasts (MEF) and transformed mouse embryo fibroblasts (MEF-K1). These cell cultures were incubated in the following media: BME, 5% calf plasma, penicillin, streptomycin, pH = 7.4. The tests were performed in analogy to the above data, except that microscopic evaluation was

CS 275793 B 6 prováděno po uplynutí doby 24 hodin, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2.CS 275793 B 6 after 24 hours, the results are summarized in Table 2 below.

Tabulka 2Table 2

Zkoušená kombinace OEXA + ajuvansTest combination OEXA + ajuvans

DEXA DEXA + + K-dekanoát K-decanoate DEXA DEXA + + děkanova kyselina decanoic acid DEXA DEXA + + undekanová kyselina undecanoic acid DEXA DEXA + + K-undekanoát K-undecanoate DEXA DEXA + + dodekanová kyselina dodecanoic acid DEXA DEXA + + tridekanová kyselina tridecanoic acid DEXA DEXA + + tetradekanová kyselina tetradecanoic acid

MEF MEF MEF-K1 MEF-K1 minimální toxická minimal toxic koncentrace concentration 20 /ug/ml DEXA + 20 µg / ml DEXA + adjuvans adjuvant adjuvans yug/ml yug / ml adjuvant adjuvans yUi adjuvant yUi 80 80 10 10 - - 40 40 80 80 10 10 80 80 10 10 60 60 20 20 May 60 60 10 10 80 80 10-20 10-20

Tabulka 2 ukazuje, že zkoušené kombinace jsou mnohem toxičtější k přeměněným buněčným kulturám, než k normálním buněčným kulturám.Table 2 shows that the combinations tested are much more toxic to transformed cell cultures than to normal cell cultures.

Selektivita toxické účinností OEXA kombinované s kyselinou undekanovou proti přeměněným buněčným kulturám je dokonce zřetelnější v následujícím testu, který spočívá v zavedení tritiovaného uridinu (^H-uridinu).The selectivity of the toxic efficacy of OEXA combined with undecanoic acid against transformed cell cultures is even more evident in the following assay, which is based on the introduction of tritiated uridine (1H-uridine).

Normální fibroblasty embrya myší (MEF) a fibroblasty embrya myší, transformované virem hovězího papxlonu (MEF-BPV), byly vysety na Linbro-destičky (2x10^ buněk do 1 vpichu) a působeno na ně kombinací 20 ^ug/ntl OEXA a vzrůstajícím množstvím kyseliny undekanové (10, 20, 40, 60 a 80 yUg/ml). Jako prostředí bylo použito základní Eagleho prostředí s Earleho solí, doplněné 5% telecí plasmou, při hodnotě pH 7,5 v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého. Po uplynutí doby dvou dnů bylo přidáno nové prostředí, které obsahovalo 1 .uCi/ml 3 'Normal mouse embryo fibroblasts (MEF) and bovine papxlon virus transformed fibroblasts (MEF-BPV) were plated on Linbro-plates (2x10 6 cells per injection) and treated with a combination of 20 µg / ntl OEXA and increasing amounts. undecanoic acid (10, 20, 40, 60 and 80 µg / ml). As the medium, a base Eagle medium with Earle salt supplemented with 5% calf plasma was used at pH 7.5 in an atmosphere with 5% carbon dioxide. After two days, a new medium containing 1 µCi / ml 3 'was added.

H-uridinu, ale které neobsahovalo výše uvedenou aktivní látku. 0 dvě hodiny později bylo v každé kultuře stanoveno množství ^H-uridinu, který lze vysrážet kyselinou. Před provedením celkového odečtu se vymyjí πízkomolekulární složky, včetně ^H-uridinu, který nebyl inkorporován. Potom se provádí odečet v suché kultuře. Průměrné hodnoty radioaktivity měřené na dvou kulturách jsou uvedeny na obr. 1.H-uridine but which did not contain the aforementioned active ingredient. Two hours later, the amount of 1H-uridine which can be acid precipitated was determined in each culture. Before the total reading is taken, the low molecular weight components, including 1 H-uridine, which have not been incorporated, are eluted. Subsequently, readings are carried out in a dry culture. The mean values of radioactivity measured on two cultures are shown in Figure 1.

Diagram na obr. 1 ukazuje, že přeměněné buněčné kultury jsou ničeny nebo selektivně inaktivovány pomocí kombinace podle vynálezu v důsledku skutečnosti, že radioaktivita, tj. ^H-uridin je nalézána jenom v normální buněčné kultuře, nikoliv však v přeměněné buněčné kultuře.The diagram in Fig. 1 shows that the transformed cell cultures are destroyed or selectively inactivated by the combination of the invention due to the fact that the radioactivity, i.e. 1H-uridine, is found only in normal cell culture, but not in the transformed cell culture.

A. Antivirová účinnostA. Antiviral activity

Inhibiční účinnost aktivní látky OEXA, kombinace DEXA a kyseliny děkanové v různých koncentracích a kyseliny děkanové samotné byly zkoušeny v různých kulturách in vitro, inokulovaných virem herpes simplex 1 (HSVl-kultura). Prostředí mělo hodnotu pH 7,4. Po dvou dnech inkubace byl stanoven výtěžek viru a jednotky tvořící plaky (pfu), což je uvedeno v procentech, byly vypočteny se zřetelem k příslušné kultuře bez inhibičních přídavků, jak je uvedeno v následující tabulce.The inhibitory activity of OEXA, DEXA and decanoic acid at various concentrations and decanoic acid alone were tested in different in vitro cultures inoculated with herpes simplex 1 virus (HSV1-culture). The pH was 7.4. After two days of incubation, virus yield was determined and the plaque forming units (pfu), expressed as a percentage, were calculated with respect to the respective culture without inhibitory additions as shown in the following table.

CS 275793 Β (CS 275793

Tabulka 3Table 3

Zkoušené inhibitory Inhibitors tested % pfu vztažená na virovou % pfu based on viral kulturu bez inhibitorů culture without inhibitors OEXA (20 /Ug/ml) OEXA (20 / Lg / ml) 22,6 22.6 DEXA (10 /ug/ml) + DEXA (10 µg / ml) + děkanova kyselina decanoic acid 10 /Ug/ml 10 µg / ml 8,7 8.7 20 /Ug/ml 20 µg / ml 0 0 40 /Ug/ml 40 µg / ml 0,3 0.3 děkanova kyselina decanoic acid 10 yug/ml 10 yug / ml 18,9 18.9 20 /Ug/nil 20 / gg / nil 24 24 40 yug/ml 40 yug / ml 35 35

Tabulka 3 ukazuje, že kombinace DEXA a kyseliny děkanové vede k významně vyšší inhibiční účinnosti než jednotlivé složky kombinace.Table 3 shows that the combination of DEXA and decanoic acid results in significantly higher inhibitory potency than the individual components of the combination.

Kombinace DEXA a dodecylsulfátu sodného (SOS) inhibovala podobně mohutně reprodukciThe combination of DEXA and sodium dodecyl sulfate (SOS) inhibited similarly powerful reproduction

HSV1.HSV1.

Buňky:Cells:

Rita P 0(37)Rita P 0 (38)

Prostředí:Environment:

BME, 5% FBS, 1% penicilín + streptomycin, pH 7,4, 5%BME, 5% FBS, 1% Penicillin + Streptomycin, pH 7.4, 5%

C02-atmosféra.CO2-atmosphere.

Inhibitory:Inhibitors:

/ug/ml DEXA + 10, 20, 40, 80 yug/ml dodecylsulfátu (SDS)/ µg / ml DEXA + 10, 20, 40, 80 µg / ml dodecyl sulfate (SDS)

Infekce Rita buněk pomocí Μ0Ι:Infection of Rita cells with Μ0Ι:

0,05 pfu/buňky0.05 pfu / cells

Přídavek inhibitorů:Addition of inhibitors:

hodinu po infekci (2 jednotlivé kultury)one hour after infection (2 individual cultures)

Rekolekce virových potomků:Recolution of viral offspring:

hodin po infekcihours after infection

Kontrolní titr:Control titer:

7,7 x 10^ pfu/ml.7.7 x 10 6 pfu / ml.

CS 275793 β 6CS 275793 β 6

kombinace combination účinných effective látek substances titr píu/ml titr piu / ml inhibiční faktor inhibitory factor 10 ug/ml 10 µg / ml DEXA + 10 DEXA + 10 ug/ml µg / ml SOS SOS 2,5 x 10² 2.5 x 10 ² 3 x 10⁴ 3 x 10 ⁴ ti n ti n + 20  + 20 11 11 II II 25 25 3 x 10⁵ 3 x 10 ⁵ 11 II 11 II + 40  + 40 >1 > 1 II II 25 25 3 x 10⁵ 3 x 10 ⁵ 11 II 11 II + 80  + 80 11 11 11 11 2,5 2.5 3 x 10⁶ 3 x 10 ⁶ Růst neinfikovaných účinných látek Growth of uninfected active substances Rita Rita buněk cells nebyl prakticky inhibován stejnou kombinací was not practically inhibited by the same combination

Analogické výsledky byly získány s kombinací cyklododecylxanthátu (D435) a kyseliny undekanové. Tato kombinace byla'zkoušena také například na shluklých buňkách lidských embryonálních plic infikovaných HSV-1 s velice účinnými inhibičnými výsledky. Stejného účinku se dosáhne, když se použije 0424, D611 nebo 0622 místo D609.Analogous results were obtained with a combination of cyclododecylxanthate (D435) and undecanoic acid. This combination has also been tested, for example, on clumped HSV-1 infected human embryonic lung cells with very potent inhibitory results. The same effect is obtained when 0424, D611 or 0622 is used instead of D609.

Také bylo nalezeno, že RNA virus (jednovláknový virus), například virus vesikulární stomatitidy, je inhibován kombinací aktivních látek, jak je popsáno v předchozím.It has also been found that an RNA virus (single-stranded virus), for example a vesicular stomatitis virus, is inhibited by a combination of active ingredients as described above.

V dalším testu, prováděném na morčatech s poškozeními po HSV infekci, byl sledován hojivý účinek kombinace podle vynálezu a samotné pomocné látky.In another test conducted in guinea pigs with lesions following HSV infection, the healing effect of the combination of the invention and the adjuvant itself was monitored.

Látky uvedené v tabulce 4 byly smíchány s vaselinovou mastí v uvedených koncentracích a mast byla potom aplikována ‘na poškození indukovaná HSV na pokožce morčat (dvakrát denně).The substances listed in Table 4 were mixed with vaseline ointment at the indicated concentrations and the ointment was then applied to HSV-induced lesions on guinea pig skin (twice daily).

Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.The results are shown in Table 4.

Tabulka 4Table 4

Léčivo Drug Počet poškození Number of damage na počátku léčby (96 hodin po očkování) at the start of treatment (96 hours after vaccination) po 36 h léčby after 36 h of treatment zhojení v % healing in% vazelina s 10 'i děkanové kyseliny vazelina s 5 % DEXA + 10 % děkanové kyseliny petroleum jelly with 10 'i decanoic acids Vaseline with 5% DEXA + 10% decanoic acid 8 10 9 6 23 16 11 8 8 10 9 6 23 16 11 8 8 10 9 4 14 5 0 6 8 10 9 4 14 5 0 6 0 42 0 42

CS 275793 Β 6CS 275793 Β 6

Tabulka 4 ukazuje, že daleko nejlepších hojivých účinků se dosahuje kombinací podle vynálezu.Table 4 shows that the far best healing effects are achieved by the combination of the invention.

V dalším testu antivirového účinku kombinace bylo očkováno šest morčat HSV-1 Walovy linie. Osmnáct hodin později začala léčba (dvakrát denně) vazelínovou masti obsahující 5 °-í DEXA a 5 % kyseliny děkanové. Po dvou dnech léčby (72 hodin po naočkování) byla zvířata usmrcena a infikovaná kůže byla odstraněna. Byla zmrazená kapalným dusíkem a potom rozmělněna v kladivovém mlýnu Mikro Dismembrator (tm) (dva vzorky na zvíře), přičemž se potom znovu vnese do desetinásobku (hmot./obj.) tkáňového živného prostředí. Po krátkém odstředění (1 minutu na Eppendorfově stolní odstředivce) byl stanoven titr viru v horní vrstvě.In another test for the antiviral effect of the combination, six guinea pigs HSV-1 were vaccinated. Eighteen hours later, treatment (twice daily) with petroleum jelly containing 5% DEXA and 5% decanoic acid began. After two days of treatment (72 hours after inoculation), the animals were sacrificed and the infected skin was removed. It was frozen with liquid nitrogen and then pulverized in a Micro Dismembrator (tm) (two samples per animal), then reintroduced into ten times (w / v) tissue culture medium. After a brief centrifugation (1 minute on an Eppendorf table centrifuge), the virus titer in the upper layer was determined.

Výsledek: virus není dotegovato]ný. Titr čistého zkoušeného média byl 1 x 1 O*’ pl'u/g tkáně .Result: the virus is not doped. The titre of the pure test medium was 1 * 10 < 3 > pl'u / g tissue.

Vliv délky řetězce mouokarhoxy1ovýcli kyselin na antivirovou aktivitu a cyLotoxi i: i tu v kombinaci s 0609 je uveden na obr. 3.The effect of myocarboxylic acid chain length on antiviral activity and cyLotoxicity in combination with 0609 is shown in Figure 3.

Neinfikované (Z\ ) a HSV-l-infikované Rita buňky byly léčeny 10 /Ug/ml 0609 a 40 yUg/ml jednotlivé monokarboxylové kyseliny (při pH 7,4).Uninfected (Z 1) and HSV-1-infected Rita cells were treated with 10 µg / ml 0609 and 40 µg / ml single monocarboxylic acid (at pH 7.4).

Výtěžek viru ze dvou kultur byl hodnocen individuálně duplicitně plakovým testem. Naměřené omyly ukazují standarni odchylku. Buněčné hustoty duplicitních neinfikovaných léčených a neléčených Rita buněčných kultur byly stanoveny pro vybarvení trypanovou modří pomocí hematocytometru.Virus yield from the two cultures was evaluated individually by duplicate plaque assay. Measured errors indicate standard deviation. Cell densities of duplicate uninfected treated and untreated Rita cell cultures were determined for trypan blue staining with a hematocytometer.

3. Protinádorová účinnost:3. Anti-tumor efficacy:

Léčení lymfatické leukemie u myší.Treatment of lymphatic leukemia in mice.

Šest týdnů staré DBA-2 myši byly očkovány intravenozně pomocí 1 x 10^ nádorových buněk (NCI-vaječná leukemie). 18 hodin později byly vytvořeny 3 skupiny zvířat, každá po 10 zvířatech. Jedna skupina nebyla léčena a představovala kontrolní skupinu. Druhá skupina byla léčena jenom DEXA (4 x 15 mg/kg, potoni 6 x 11 mg/kg). Třetí skupina byla léčena kombinací podle vynálezu, tj. DEXA a kyselinou undekanovou (DEXA léčba jako ve skupině 2, potom kyselina undekanová 4 x 7,5 mg/kg, potom 6 x 5,5 mg/kg).Six week old DBA-2 mice were vaccinated intravenously with 1 x 10 6 tumor cells (NCI-egg leukemia). 18 hours later, 3 groups of animals were created, each of 10 animals. One group was not treated and was a control group. The second group was treated only with DEXA (4 x 15 mg / kg, potoni 6 x 11 mg / kg). The third group was treated with the combination of the invention, ie DEXA and undecanoic acid (DEXA treatment as in Group 2, then undecanoic acid 4 x 7.5 mg / kg, then 6 x 5.5 mg / kg).

Veškerá aplikace byla intravenózní. Injekce byly podávány v intervalech 1 hodiny. Následující den (2 dny po naočkování nádorovými buňkami) byl každému zvířeti odebrán vzorek krve a stanovena koncentrace lymfocytů. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 5.All application was intravenous. Injections were given at 1 hour intervals. The next day (2 days after seeding with tumor cells), a blood sample was collected from each animal and lymphocyte concentration determined. The results are summarized in Table 5 below.

Tabulka 5Table 5

počet lymfocytů x 10^-^/mllymphocyte count x 10 ^- ? / ml DEXA DEXA DEXA + undekanová kyselina DEXA + undecanoic acid neléčeno not treated 13,8 13.8 17,9 17.9 8,6 8.6 11,1 11.1 15,0 15.0 11,7 11.7 15,8 15.8 24,1 24.1 12,0 12.0 17,3 17.3 13,0 13.0 9,8 9.8

IAND

CS 275793 B 6CS 275793 B 6

Tabulka 5 - pokračováníTable 5 - continued

neléóeno neléóeno DEXA DEXA DEXA + undekanové kyselina DEXA + undecanoic acid 12 12 18,6 18.6 12,8 12.8 ¹⁵ ’^{7 15} ' ⁷ 15,6 15.6 18,4 18.4 23 23 10,7 10.7 11,6 11.6 18 ,i 18, i 14,6 14.6 12,4 12.4 20,2 20.2 13,7 13.7 8,4 10,8 8.4 10.8 celková hodnota x 10^-é mltotal value x 10 mL ^-é 16,3 16.3 15,9 15.9 11,7 signifikantní P 4 0,01 11.7 significant P 4 0.01

Tabulka 5 ukazuje, že kombinace podle vynálezu vede k význačnému snížení počtu lymfocytů.Table 5 shows that the combination of the invention results in a significant reduction in lymphocyte count.

Regrese autochtonních kožních nádorů u myší po systémové léčbě kombinací podle vynálezu, pomoci DEXA a kyseliny undekanové:Regression of autochthonous skin tumors in mice after systemic treatment with DEXA and undecanoic acid combinations according to the invention:

Kožní nádory byly indukovány známým způsobem u sedm týdnů starých samic myší NMRI linie. To zahrnovalo lokální aplikaci jedné dávky 25,6 mg DMBA, rozpuštěné v 0,1 ml acetonu, a sedm dní později 6,16 mg TPA rozpuštěné v 0,1 ml acetonu, přičemž toto médium se aplikuje dvakrát týdně po dobu 23 týdnů.Skin tumors were induced in a known manner in seven week old female NMRI line mice. This included topical administration of a single dose of 25.6 mg of DMBA dissolved in 0.1 ml of acetone, and seven days later, 6.16 mg of TPA dissolved in 0.1 ml of acetone, this medium being applied twice a week for 23 weeks.

Tři týdny po skončení provokační aplikace začala chemoterapie pomocí intravenózní injekce 10 mg/kg zkoušené látky (1 mg/ml), předem rozpuštěné v 0,9¾ roztoku NaCl o pH 7,4. Hodnota pH byla nastavena přidáním 0,15M NaOH. Bylo vybráno 40 zvířat s nádory, tvořících 4 arbitrážní skupiny. 11 zvířat nebylo léčeno, 10 zvířat bylo léčeno DEXA, 10 zvířat bylo léčeno kyselinou undekanovou a 9 zvířat bylo léčeno kombinací DEXA a kyseliny undekanové (1 mg na ml, 10 mg/kg každé látky).Three weeks after the challenge, chemotherapy was started by intravenous injection of 10 mg / kg of test substance (1 mg / ml), previously dissolved in 0.9¾ NaCl pH 7.4. The pH was adjusted by the addition of 0.15M NaOH. 40 tumor-bearing animals were selected, forming 4 arbitration groups. 11 animals were not treated, 10 animals were treated with DEXA, 10 animals were treated with undecanoic acid and 9 animals were treated with a combination of DEXA and undecanoic acid (1 mg per ml, 10 mg / kg each).

Na ilustrativním obr. 2 jsou znázorněny doby injekcí pomocí malých šipek na ose času. Velikost.všech nádorů (3 rozměry) byla určena pomocí posuvného měřítka. Takto byla stanovena velikost 35 nádorů ňeléčených zvířat, 40 nádorů zvířat léčených kyselinou undekanovou, nádorů zvířat léčených DEXA a 35 nádorů zvířat léčených kombinací podle vynálezu. Počáteční velikost nádorů se pohybovala mezi 2 a 400 mnP. Během testu byla sledována velikost každého jednotlivého nádoru. Přírůstek nebo regrese byly vyjádřeny v procentech původní velikosti. Průměrné hodnoty každé skupiny jsou uvedeny na obr. 2. Významnost regrese u nádorů léčených kombinací podle vynálezu byla vypočtena podle Studentova T-testu. Po dvou dnech léčby se velikost nádoru v léčené skupině lišila značně od neléčené skupiny, přičemž p 10^_1° a po 5 dnech léčby p Z. 10⁷.Illustrative Fig. 2 shows the injection times using small arrows on the time axis. The size of all tumors (3 dimensions) was determined by caliper. In this way, 35 tumors of untreated animals, 40 tumors of animals treated with undecanoic acid, tumors of animals treated with DEXA and 35 tumors of animals treated with the combination according to the invention were determined. Initial tumor sizes ranged between 2 and 400 mnP. The size of each individual tumor was monitored during the test. The increment or regression was expressed as a percentage of the original size. The mean values of each group are shown in Figure 2. The significance of regression in tumors treated with the combination of the invention was calculated according to the Student's T-test. After two days of treatment, the tumor size in the treatment group differed considerably from the untreated group, with p 10 ^-1 and after 5 days of treatment p Z. 10 ⁷ .

CS 275793 B 6CS 275793 B 6

Subkutánní léčba autochtonních kožních nádorů zkušebních zvířat (popsaného druhu) s chemicky indukovanými kožními nádory, vytvořenými, jak je popsáno, bylo rozděleno arbitrážně do čtyř skupin. Léčení bylo prováděno subkutánní injekci v bezprostřední blízkosti nádorů injekci tří dávek 0,5 ml každé dvě hodiny během dvou dní. Třetí den byla vstříknuta jedna dávka. Injekční roztok obsahoval 5 mg/ml DEXA a 5 mg/ml kyseliny undekanové. Šest dní po započaté léčbě bylo prováděno fotografické i vizuální hodnocení.Subcutaneous treatment of autochthonous skin tumors of test animals (described species) with chemically induced skin tumors generated as described was arbitrarily divided into four groups. Treatment was performed by subcutaneous injection in the immediate vicinity of the tumors by injecting three doses of 0.5 ml every two hours over two days. On the third day, a single dose was injected. The solution for injection contained 5 mg / ml DEXA and 5 mg / ml undecanoic acid. Six days after the initiation of treatment, both photographic and visual evaluation was performed.

Výsledek:Result:

Všechny nádory významně ustoupily, četné zmizely zcela a všechny zredukovaly počáteční velikost nejméně o 50 %.All tumors have subsided significantly, numerous have disappeared completely, and all have reduced the initial size by at least 50%.

Regrese autochtoních kožních nádorů u myší po systémové léčbě kombinací podle vynálezu pomocí DEXA a kyseliny udekanovéRegression of autochthonous skin tumors in mice after systemic treatment with the combination of the invention with DEXA and udecanoic acid

Kožní nádory u NMRI myší byly vyvolány dříve popsaným způsobem. Dva dny po poslední aplikaci TPA bylo započato s chemoterapií. Léčivo bylo podáno zvířatům intravenózní injekci třikrát denně. Každá injekce obsahovala 10 mg/kg DEXA a 10 mg/kg kyseliny undekanové (1 mg/ml každé sloučeniny, rozpuštěné v 0,9 % NaCl). Hodnota pH roztoku byla nastavena naSkin tumors in NMRI mice were induced as previously described. Two days after the last TPA administration, chemotherapy was started. The drug was administered to animals by intravenous injection three times a day. Each injection contained 10 mg / kg DEXA and 10 mg / kg undecanoic acid (1 mg / ml of each compound dissolved in 0.9% NaCl). The pH of the solution was adjusted to

7,4 pomocí 0,15M NaOH. Zvířata byla fotografována na začátku a na konci léčby a stanoven počet nádorů u každého zvířete. Čtyři týdny po skončení léčby byly nádory hodnoceny znovu. Nebyl zaznamenán růst a žádná recidiva v místech, kde nádory zmizely. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 6.7.4 with 0.15M NaOH. The animals were photographed at the beginning and at the end of treatment and the number of tumors in each animal was determined. Four weeks after treatment, tumors were re-evaluated. There was no growth and no recurrence where the tumors had disappeared. The results are summarized in Table 6 below.

Tabulka 6Table 6

pokusné zvíře experimental animal před léčbou before treatment po léčbě after treatment léčivo drug 1 1 3 3 3 3 3 3 5 5 3 3 4 4 14 14 4 4 5 5 11 11 8 8 6 6 5 5 3 3 7 7 5 5 0 0 DEXA + DEXA + 8 8 15 15 Dec 10 10 undekanové undecane 9 9 .. 13 .. 13 0 0 kyselina acid 10 10 14 14 4 4 i.V. i.V. 11 11 6 6 2 2 Celkem Total 91 91 37 37 = 59% regrese = 59% regression

CS 275793 B 6CS 275793 B 6

Tabulka 6 - pokračováníTable 6 - continued

pokusné zvíře experimental animal před léčbou before treatment po léčbě after treatment léčivo drug 1 1 11 11 10 10 2 2 4 4 3 3 3 3 0 0 7 7 4 4 4 4 2 2 6 6 4 4 0 0 kontrola control 7 7 7 7 7 7 8 8 5 5 5 5 9 9 10 10 8 8 10 10 4 4 1 1 11 11 7 7 5 5 Celkem Total 64 64 48 48 = 25% regrese = 25% regression

Tabulka 6 ukazuje, že kombinace podle vynálezu, která obsahuje DEXA a kyselinu undekanovou, vede k 59¾ regresi kožních nádorů, zatímco regrese u neléčených zvířat byla jenom 25%.Table 6 shows that the combination of the invention, which contains DEXA and undecanoic acid, leads to 59¾ regression of skin tumors, whereas regression in untreated animals was only 25%.

Následují zkušební údaje, týkající se protivirových a protinádorových přípravků podle vynálezu.The following are test data for the anti-viral and anti-tumor formulations of the invention.

(A) Antivirová aktivita 0609/undekanová kyselina(A) Antiviral activity 0609 / undecanoic acid

Bylo ukázáno, že xanthátové sloučeniny vykazují antivirovou aktivitu proti různým DNA a RNA virům za kyselých podmínek (G. Sauer, E. Amtman, K. Melber, A. Knap, K. MÍiller,Xanthate compounds have been shown to exhibit antiviral activity against various DNA and RNA viruses under acidic conditions (G. Sauer, E. Amtman, K. Melber, A. Knap, K. Miiller,

K. Humniel, A Scherm: DNA and RNA virus jsou inhibovány xantháty, antivirovými látkami jedinečných vlastností. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81, 3263-3267 (1904)). Nyní je možné efektivněji užívat jedinečné široké protivirové spektrum těchto sloučenin za vyšších a fyziologických hodnot pH (pH 7,4) za současného nebo kombinovaného podání některých iontových pomocných látek majících hydrofilní i lipofilní zbytek. Tricyklodekan-9-yl-xanthát (D609), v kombinaci s pomocnou látkou desoxycholátem sodným, dodecylsulfátem sodným a některými mastnými kyselinami, které nemají antivirovou aktivitu vlastní, ínhibuje replikaci různých DNA a RNA virů (například herpes simplex, vesikulární stomatitida a Coxsackie B 4) in vitro při pH 7,4 (tabulka 7). Mezi nasycenými kyselinami s různou délkou řetězce zaujímá významné místo v účinnosti kyselina undekanová (11 C atomů), která je o tři řady účinnější než kratší kyselina monokarboxylová (8 C atomů) nebo delší monokarboxylová kyselina (18 C atomů). Kinetické studie zabývající se otázkou dávka-odpověS odhalily, že dávka, která inhibovala replikaci viru herpes faktorem 1 000, ještě dovolovala mitotickou aktivitu v neinfikovaných rostoucích kontrolních kulturách. Směs v poměru 1 : 1 0609/undekanová kyselina, jak lze vidět z obr. 4, (pevné kruhy) byla nejvýhodnější.K. Humniel, A Scherm: DNA and RNA virus are inhibited by xanthates, antiviral agents of unique properties. Why. Nati. Acad. Sci. USA 81, 3263-3267 (1904)). It is now possible to more efficiently use the unique broad antiviral spectrum of these compounds at higher and physiological pH values (pH 7.4) with concomitant or combined administration of some ionic excipients having both hydrophilic and lipophilic residues. Tricyclodecan-9-yl-xanthate (D609), in combination with the adjuvant sodium deoxycholate, sodium dodecyl sulfate and certain fatty acids that do not possess antiviral activity, inhibits the replication of various DNA and RNA viruses (eg herpes simplex, vesicular stomatitis 4 and Coxsackie B) ) in vitro at pH 7.4 (Table 7). Among the saturated acids with different chain lengths, undecanoic acid (11 C atoms) occupies an important position, which is three rows more effective than the shorter monocarboxylic acid (8 C atoms) or the longer monocarboxylic acid (18 C atoms). Dose-response kinetic studies revealed that the dose that inhibited herpes virus replication by a factor of 1000 still allowed mitotic activity in uninfected growing control cultures. A 1: 10609 / undecanoic acid mixture, as seen in Figure 4, (solid rings) was most preferred.

Podobné údaje byly získány i v případě viru HTLVIII, který by měl být inhibován v tkáňové kultuře 10 ug 0609 kombinované s 10 yUg/ml kyseliny undekanové po aplikaci v rozmezí tří a pěti dnů. Léčba kombinací ponechává mitotickou aktivitu periferních lymfocytů lidské krve nedotčenou v takových koncentracích, které jsou schopné usmrtit lymfomy B- a T-buněk (sekce B, obr. 6). To činí kombinaci 0609/undekanová kyselina potenciálně vhodnou pro chemoterapii AIDS.Similar data were obtained for the HTLVIII virus, which should be inhibited in tissue culture of 10 µg 0609 combined with 10 µg / ml undecanoic acid after administration between three and five days. Treatment with the combination leaves the mitotic activity of human blood peripheral lymphocytes intact at concentrations that are capable of killing B- and T-cell lymphomas (section B, Fig. 6). This makes the 0609 / undecanoic acid combination potentially suitable for AIDS chemotherapy.

CS 275793 S 6CS 275793 S 6

Tabulka 7Table 7

Druh viru Type of virus 0609 (yug/ml) 0609 (yug / ml) undekanová kyselina (yug/ml) undecanoic acid (yug / ml) výtěžek viru ^a (pfu/ml) ^and virus yield (PFU / ml) VSV^b VSV ^b 0 0 0 0 (4,3 - 1,00) x 10⁶ (4.3 - 1.00) x 10 ⁶ 5 5 0 0 (5,6 i 0,05) x 10⁶ (5.6 and 0.05) x 10 ⁶ 0 0 40 40 (4,3 í 0,30) x 10⁶ (4.3 0 0.30) x 10 ⁶ 5 5 40 40 (1,3 - 0,20) x 10⁴ (1.3 - 0.20) x 10 ⁴ Coxsacki c Coxsacki c 0 0 0 0 (1,15 í (1,20) x 10⁶ (1.15 µ (1.20) x 10 ⁶⁾ 10 10 40 40 (7,70 - 0,25) x 10⁴ (7.70 - 0.25) x 10 ⁴

hodnoty byly získány zkoušením duplicitních kultur, a výtěžky získaných virů byly stanoveny duplicitně. VSV progeny byly izolovány 10 hodin a Coxsackie B4 24 hodin po infekci.values were obtained by testing duplicate cultures, and the yields of the obtained viruses were determined in duplicate. VSV progeny were isolated 10 hours and Coxsackie B4 24 hours after infection.

Obr. 4: Inhibice růstu viru herpes různými koncentracemi D 609 a kyseliny undekanové.Giant. 4: Inhibition of herpes virus growth by various concentrations of D 609 and undecanoic acid.

Koncentrace obou složek je uvedena na prvé souřadnici. D 600 a kyselina undekanová byly míchány v následujících poměrech:The concentration of both components is given at the first coordinate. D 600 and undecanoic acid were mixed in the following ratios:

, 1 : 1; O 1 : 2; 1 : 3; □ 0 : 1 (undekano vá kyselina). Koncentrace, jejichž výsledkem je inhibice větší než faktor 10* byly doprovázeny cytotoxickými efekty. Nižší koncentrace však nevyvolávaly rozeznatelnou cytotoxicitu neinfikovaných kontrolních buněk., 1: 1; O 1: 2; 13; □ 0: 1 (undecanoic acid). Concentrations resulting in inhibition greater than factor 10 * were accompanied by cytotoxic effects. However, lower concentrations did not induce a recognizable cytotoxicity of uninfected control cells.

Koncentrace 1 : 1 (0609/undekanová kyselina) byla nalezena jako nejefektivnější se zřetelem na koncentraci jednotlivých látek a jejich kombinovaný antivirový efekt. Doporučuje se proto používat sloučeniny v poměru 1:1.The 1: 1 concentration (0609 / undecanoic acid) was found to be most effective with respect to the concentration of the individual substances and their combined antiviral effect. It is therefore recommended to use the compounds in a 1: 1 ratio.

Obr. 5: HTVIII specifická nukleová kyselina (superhelikální DNA jako replikativní intermediát) byla izolována a zviditelněna po gelové elektroforese a hybridizaci klonovanou auten tickou radioaktivně značenou HTLVIII DNA. Po léčbě po dobu tří dnů (linie a) a pěti dnů (linie c) signál, který je typický pro HTLVIII DNA je zcela zrušen, zatímco u neléčených infikovaných (K37 T-lymfon) kultur (linie b a d) lze vidět HTLVIII specifickou DNA (jak superhelikální forma I, tak i relaxovaná kruhová forma II DNA). Po štěpení restrikční endonukleázou jsou formy I a II převáděny v lineární formu III (linie f a h). Tyto údaje ukazují, že po takovém léčení lze dokonale inhibovat replikaci HTLVIII, . (B) Protinádorová účinnost D609/undekanová kyselinaGiant. 5: HTVIII specific nucleic acid (superhelical DNA as a replicative intermediate) was isolated and visualized after gel electrophoresis and hybridization with cloned authentic radiolabeled HTLVIII DNA. After treatment for three days (line a) and five days (line c), the signal that is typical of HTLVIII DNA is completely abolished, whereas in untreated infected (K37 T-lymphon) cultures (line bad) HTLVIII specific DNA ( both superhelical form I and relaxed circular form II DNA). After restriction endonuclease digestion, forms I and II are converted to linear form III (lines f and h). These data show that HTLVIII replication can be completely inhibited after such treatment. (B) Anti-tumor activity of D609 / undecanoic acid

Xanthátové sloučeniny s antivirovými vlastnostmi vykazují v kombinaci s monokarboxylovými kyselinami střední velikosti (s výhodou s řetězcem s 11 nebo 12 atomy uhlíku) protrahovanou protinádorovou aktivitu in vitro.Xanthate compounds having antiviral properties in combination with medium-sized monocarboxylic acids (preferably 11 or 12 carbon chains) exhibit protruded antitumor activity in vitro.

Tricyklodekan-9-yl-xanthogenát (0609) nebo cyklododecylxanthogenát (D435), podány spo lu s undekanovou nebo dodekanovou kyselinou různým přeměněným buňkám (obvykle projevující požadavek nízké koncentrace séra) mohou způsobit buněčnou smrt. Když jsou podány ve stejné koncentraci normálním buňkám, ze kterých pocházejí přeměněné deriváty, je takový efekt málo zřejmý nebo méně silný.Tricyclodecan-9-yl-xanthogenate (0609) or cyclododecylxanthogenate (D435), co-administered with undecanoic or dodecanoic acid to various transformed cells (usually requiring low serum concentration) may cause cell death. When administered at the same concentration to the normal cells from which the converted derivatives are derived, such an effect is less obvious or less potent.

CS 275793 B 6CS 275793 B 6

To je dokumentováno údaji v tabulce 8, kde je srovnáván účinek D609/kyselina undekanová na normální a přeměněné buňky. Selektivní usmrcení nádorových buněk (a chemicky pomocí virů nebo přeměněných buněk) je zřejmé z rozdílu míry přežívání dosahující až k faktoru 10 ⁶, který je limitem detegovatelnosti v systémech pokusného testu. Protože normální buňky zůstávají většinou nedotčeny léčbou , jejich přeměněné deriváty (projevující požadavek nízké koncentrace séra) tutéž léčbu nepřežívají.This is documented by the data in Table 8 where the effect of D609 / undecanoic acid on normal and converted cells is compared. Selective killing of tumor cells (and chemically by viruses or transformed cells) is evident from a difference in survival rates up to a factor of 10 ⁶ , which is the limit of detectability in test systems. Since normal cells remain largely unaffected by treatment, their converted derivatives (requiring low serum concentration) do not survive the same treatment.

Meth-A-nádoru (fibrosarkomu) lze úspěšně zabránit intraperitoneální aplikací kombinace 0609/kyselina undekanová. Dokonce v progresivních stadiích (5 dní po očkování) lze prokázat terapeutický efekt. Léčba pomocí 0609 v nepřítomnosti kyseliny undekanová neměla v podstatě žádný prokazatelný protinádorový efekt.Meth-A-tumor (fibrosarcoma) can be successfully prevented by intraperitoneal administration of the 0609 / undecanoic acid combination. Even in the progressive stages (5 days after vaccination) a therapeutic effect can be demonstrated. Treatment with 0609 in the absence of undecanoic acid had essentially no detectable antitumor effect.

Dále selektivní usmrcení různých lymfomú B- a T-buněk (ve srovnání s periferními lidskými lymfocyty (pBL), které jsou odolné léčbě) je dokumentováno na obr. 8.Further, the selective killing of various B- and T-cell lymphomas (as compared to peripheral human lymphocytes (pBL) that are resistant to treatment) is documented in Figure 8.

Tabulka 8Table 8

označení designation druh buňky druh cell type dvojnásobná doba (dny)* double time (days) * tvorba kolonií při nízké koncentraci séra ** colony formation at low serum concentration ** míra přežití survival rate ΠΙΤΑ ΠΙΤΑ ledviny opice kidney monkey 1,9 1.9 - - 0,73 ^S 1,20 ⁵ 0.73 ^N 1.20 ⁵ CV-1 CV-1 N H N H 1,21 1,21 - - C-6 C-6 5V4O přemSnéné 5V4O convertible 1,65 1.65 + + £ 4 x ΙΟ”^{6 55} £ 4 x ΙΟ ” ⁶ MEF MEF embryo fibroblast myS myS fibroblast embryo 1,14 1.14 0,60 ⁵ 0.60 ⁵ SV3T3 SV3T3 S74O přemSnSné S74O convertible 0,53 0.53 + + <2 x 10^6§S <2 x 10 ^6§S MEF-K1 MEF-K1 BFV-1 přeméněné BFV-1 converted 0,58 0.58 + + <3 x 10“⁶⁵⁵·<3 x 10 “ ⁶⁵⁵ · MCA-3F MCA-3F keratinocyt keratinocyte 1,5 1.5 - - O,25⁵'O, 25 ^May ' MCJV-3D MCJV-3D Η M Η M 1,45 1.45 - - 0,81^S 0.81 ^N HEL-30 HEL-30 chemicky přemSnéné keratinocyt chemically converted keratinocyte 0,78 0.78 + + <2 x 1O⁵⁵⁵ <2 x 10 ⁵⁵⁵ Ar-PDV Ar-PDV chemicky přeménéná keratinocyt chemically converted keratinocyte 0,65 0.65 ¢3 x 10^ ¢ 3 x 10 ^ HEF HEF fibroblast křeček fibroblast hamster 1,73 1.73 — - 0,67 ⁵ 0,67 ⁵ HEF-BFV HEF-BFV BPV-l přemSnéné BPV-1 convertible 0,48 0.48 + + ( 2 i 1Q~^{6 55} (2 i 1Q ~ ^{6 55} Hela Hela cervix karcinom človžk cervix human carcinoma 1,0 1.0 + + <3xlO-⁶⁵⁵ 0,54 ⁵ § 0,087 0,80 ⁵ <3x10- ⁶⁵⁵ 0.54 ⁵ § 0.087 0.80 ⁵ HEL HEL fibroblast fibroblast 2,35 2.35 - - HTB72 HTB72 maligní melanom malignant melanoma 2,9 2.9 + + MRC-5 MRC-5 fibroblast fibroblast 2,9 2.9 - - SV-8O SV-8O SV-4O přemžnčné fibroblast SV-4O transitional fibroblast + + <4>10-‘^SS 0,73 ⁵ <4> 10 ' ^SS 0.73 ⁵ Wi-38 Wi-38 fibroblast · fibroblast · 2,85 2.85 - -

CS 277793 Β 6CS 277793 Β 6

Tabulka ΒTable Β

Citlivost na léčbu kombinací xanthát/monokarboxylová kyselina a růstové charakteristiky různých druhů buněk.Sensitivity to treatment with xanthate / monocarboxylic acid combinations and growth characteristics of different cell types.

- 4, 2- 4, 2

Buňky byly Inokulovány v hustotě 3,8 x 10 /cm v nádobkách z umělé hmoty nebo Petriho miskách. Bylo přidáno nové tkáňové živné prostředí (základní prostředí podle Eagla doplněné 2,2 g NaHCO-j, 1 % penicilinu a streptomycinu (BME) a 5 % hovězího séra (FBS) s 10 /ug/ml 0609 a 40 yug/ml undekanové kyseliny nebo bez kombinace bylo přidáno 4 hodiny po inokulaci buněk a kultury byly inkubovány v 5% CO2 atmosféře (= pH 7,4 i 0,05) při teplotě 37 °C (kontrolní i léčené kultury byly dvojité). Po uplynutí doby 24 hodin bylo tkáňové živné prostředí doplněno za použití BME doplněné o 10 % FBS. § Buňky byly trypsinovány 24 hodin po odstranění kombinace D609/kyselina undekanová a počet živých buněk byl stanoven pomocí Neubauerova hematocytometru po vybarvení trypanovou modří. Míra přežití je vyjádřena poměrem mezi počtem buněk v neléčených kulturách a léčených kulturách.Cells were inoculated at a density of 3.8 x 10 / cm in plastic or Petri dishes. A new tissue culture medium (Eagle's base medium supplemented with 2.2 g NaHCO-j, 1% penicillin and streptomycin (BME) and 5% bovine serum (FBS) with 10 µg / ml 0609 and 40 yug / ml undecanoic acid) was added. or without combination, 4 hours after cell inoculation was added and cultures were incubated in 5% CO 2 atmosphere (= pH 7.4 and 0.05) at 37 ° C (control and treated cultures were doubled). tissue culture medium supplemented with BME supplemented with 10% FBS § Cells were trypsinized 24 hours after removal of the D609 / undecanoic acid combination and the number of viable cells was determined by Neubauer hematocytometer after trypan blue staining. cultures and treated cultures.

§§ Po 10 dnech inkubace při teplotě 37 °C byly nádoby fixovány po dobu dvou minut ve 2% formaldehydu a vybarveny po dobu 1 minuty 0,5% krystalickou violetí. Počet buněk, které byly naočkovány na mlsky před léčením, ukazuje maximální míru přežití. V žádném případě nebylo možné detegovat přežívající buňky.After 10 days incubation at 37 ° C, the vessels were fixed for 2 minutes in 2% formaldehyde and stained for 1 minute with 0.5% crystalline violet. The number of cells that were inoculated into the pre-treatment milks shows the maximum survival rate. In any case, it was not possible to detect surviving cells.

x V 6 cm Petriho miskách bylo 4 x 10⁵ buněk-naočkováno a inkubováno s BME, 5 % FBS v 5% atmosféře 003. Po jednom a dvou dnech byl ve dvou miskách stanoven pro každou buněčnou linii počet buněk. Dvojitý čas byl extrapolován ze stanovených růstových křivek.x In 6 cm Petri dishes, 4 x 10 ⁵ cells were seeded and incubated with BME, 5% FBS in 5% atmosphere 003. After one and two days, cell numbers were determined in two dishes for each cell line. The double time was extrapolated from the determined growth curves.

Od každého typu buněk bylo očkováno 10^ buněk do 6 cm Petriho misek a inkubováno po dobu dvou týdnů v médiu obsahujícím 1 %, 2 %, 5 % nebo 10 % FBS. Kolonie byly vybarveny krystalovou violetí po předchozí fixaci 1% formaldehydem.From each cell type, 10 µl of cells were seeded into 6 cm Petri dishes and incubated for two weeks in medium containing 1%, 2%, 5% or 10% FBS. Colonies were stained with crystal violet after previous fixation with 1% formaldehyde.

Obr. 6: Léčba Meth-A-nádoru po delší době po transplantaci kombinací 0609/kyselina undekanová. Samice myší Balb-c (stáří 10 až 12 týdnů, hmotnost 20 g) byly očkovány intraperitoneálně 1 x 10⁶ nádorovými buňkami Meth-A. 5 dní po transplantaci bylo 10 zvířat léčeno 50 mg/kg 0609 a 50 mg/kg draselné soli kyseliny undekanové + 25 U inzulin/kg dvakrát denně v izotonické glukóze. Látky byly rozpuštěny v 1 ml/20 g na zvíře. Léčba skončila po 25 inokulacích. Deset zvířat jako kontroly nebylo léčeno. Dvě zvířata z léčené skupiny (prázdné kroužky) přežívala déle než 65 dní.Giant. 6: Treatment of Meth-A-tumor after prolonged transplantation with 0609 / undecanoic acid. Female Balb-c mice (10-12 weeks of age, 20 g weight) were inoculated intraperitoneally with 1 x 10 ⁶ Meth-A tumor cells. 5 days after transplantation, 10 animals were treated with 50 mg / kg 0609 and 50 mg / kg undecanoic acid potassium + 25 U insulin / kg twice daily in isotonic glucose. The substances were dissolved in 1 ml / 20 g per animal. Treatment was discontinued after 25 inoculations. Ten animals were not treated as controls. Two animals from the treatment group (open circles) survived for more than 65 days.

Ve výše uvedených testech byl přidáván inzulín jako nezbytný růstový faktor pro organismus, aby se zvýšila produkce glukózy a buněčný růst, produkce a stabilita.In the above tests, insulin was added as a necessary growth factor for the body to increase glucose production and cell growth, production and stability.

Obr. 8: Citlivost normálních krevních lymfocytů a lymfomů buněk T a B na kombinaci 0609 a kyseliny undekanové. Lymfocyty lidské periferní krve (pBL) byly izolovány odstředěním. Buňky byly inkubovány v prostředí RPMI 1 640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra a 5 yug/ml PHA (=fythamaglutinin). Po 1 dnu byly buňky izolovány odstředěním a přeneseny na mikrotitrační desky (2 x 10⁵ buněk na 1 vpich) a bylo přidáno nové prostředí bez PHA, ale doplněné 10 % IL-2 (=interleukin 2). Byl přidáván 0609 a kyselina undekanová ve stoupající koncentraci tak, jak je uvedeno na obr. Souběžně a stejným způsobem bylo manipulováno se dvěma lymfomy buněk T (Jurkat a K37) a dvěma~lymfomy buněk B (Ráji a P3HR1). Po čtyřech dnech inkubace byl stanoven počet živých buněk v každém vpichu s použitím barvicí metody (trypanová modř). V kulturách buněk Jurkat, Ráji a K37, které byly ošetřeny 5 yug D609 a 40 yug/ml undekanové kyseliny, nebylo možno detegovat živé buňky. Nicméně ošetřené lymfocyty lidské periferní krve (pBL) byly ještě schopné mitotického dělení vzdor tomu, že byly ošetřeny stejně.Giant. 8: Sensitivity of normal blood lymphocytes and T and B cell lymphomas to a combination of 0609 and undecanoic acid. Human peripheral blood lymphocytes (pBL) were isolated by centrifugation. Cells were incubated in RPMI 1640 medium supplemented with 10% bovine fetal serum and 5 µg / ml PHA (= phythamagglutinin). After 1 day, cells were harvested by centrifugation and transferred to microtiter plates (2 x 10 ⁵ cells per injection) and a new medium without PHA but supplemented with 10% IL-2 (= interleukin 2) was added. 0609 and undecanoic acid were added at increasing concentrations as shown in Figure Two T cell lymphomas (Jurkat and K37) and two B cell lymphomas (Raji and P3HR1) were handled concurrently and in the same manner. After four days of incubation, the number of viable cells in each injection was determined using the staining method (trypan blue). Live cells could not be detected in Jurkat, Paradise and K37 cell cultures treated with 5 µg D609 and 40 µg / ml undecanoic acid. However, treated human peripheral blood lymphocytes (pBL) were still capable of mitotic division despite being treated equally.

CS 275793 Β 6CS 275793 Β 6

LátkaSubstance

Antivirová aktivita³ cytotoxicita^{b 3} HSV-1 infikované Rita buňky (MOI = 0,01 pfu/buňka) duplicitně byly léčeny po dobu 23 hodin po době adsorpce 10 yug/ml 0609 a buď 40 /ug/ml Ctného 20 ^u/rnl TNCB v BME, 5 % FBS, 1 % penicilinu a streptomycinu, hodnota pH 7,4. Virální progeny byly hodnoceny plakovým testem a porovnány s výtěžky netečených kultur. Antivirová aktivita je uvedena jako faktor inhibice virálního titru (průměrné hodnoty ze dvou kultur).Antiviral activity ³ cytotoxicity ^{b 3} HSV-1 infected Rita cells (MOI = 0.01 pfu / cell) were duplicated treated for 23 hours after a adsorption time of 10 µg / ml 0609 and either 40 µg / ml with a reading of 20 µl / ml. TNCB in BME, 5% FBS, 1% penicillin and streptomycin, pH 7.4. Viral progeny were evaluated by plaque assay and compared to yields of non-flowing cultures. Antiviral activity is reported as a factor of viral titer inhibition (mean values from two cultures).

^b Neinfikované Rita buňky byly léčeny tak, jak je popsáno v a) a počet buněk byl stanoven výpočtem v Neubauerově počítací komůrce. Poměr mezi netečenými a léčenými kulturami je uveden v tabulce (průměrná hodnota ze dvou kultur). ^b Uninfected Rita cells were treated as described in a) and the number of cells was determined by calculation in a Neubauer counting chamber. The ratio between non-treated and treated cultures is shown in the table (average of two cultures).

Výsledek: Kationtová pomocná látka (TNCB) vykazuje mnohem nižší specifickou antivirovou adjuvantní aktivitu ve srovnání s kyselinou undekanovou (C^).Result: The cationic excipient (TNCB) exhibits a much lower specific antiviral adjuvant activity as compared to undecanoic acid (C ^).

Ačkoliv aktivní antivirové a protinádorově xantháty podle vynálezu, zejména D609, když jsou použity samotné, vykazují svou antivirovou aktivitu účinněji při hodnotě pH 6,8 než při mírně vyšším pH 7,25 až 7,8 jejich kombinace s iontovou pomocnou látkou podle vynálezu jsou efektivními inhibitory růstu virů při fyziologickém pH asi 7,4. Při dalších studiích Rita buněčné kultury byly léčeny l.,den po infekci HSV-1 pomocí 0609 a současně jednou z pomocných látek uvedených v tabulce 9. (Poměr 0609 k pomocné látce 1 : 4 byl zvolen na základě předchozích pokusů). Výtěžek virových progenů byl stanoven plakovým testem a porovnán s výtěžkem z neléčených infikovaných kultur. Kombinovaná léčba D609 a některou z prvých tří pomocných látek uvedených v tabulce 9, vedla k významné inhibici růstu HSV-1 při hodnotě pH 7,4. Zvýšenou antivirovou účinnost nelze přičíst zvýšené cytotoxicitě, protože 62,5 % a 83 % neinfikovaných kontrolních buněk, vystavených stejné léčhě jako kultury infikované, bylo schopno mitotického dělení (tabulka 9). Poslední tři pomocné látky v tabulce vykazují minimální antivirovou účinnost ve srovnání s prvými třemi v tabulce.Although the active antiviral and antitumor xanthates of the invention, especially D609 when used alone, exhibit their antiviral activity more efficiently at a pH of 6.8 than at a slightly higher pH of 7.25 to 7.8, their combinations with the ionic excipient of the invention are effective. viral growth inhibitors at a physiological pH of about 7.4. In further Rita cell culture studies, they were treated on day 1 post HSV-1 infection with 0609 and one of the excipients listed in Table 9. (The ratio of 0609 to excipient 1: 4 was selected based on previous experiments). The yield of viral progeny was determined by plaque assay and compared to that from untreated infected cultures. Combination therapy with D609 and any of the first three excipients listed in Table 9 resulted in significant inhibition of HSV-1 growth at pH 7.4. Increased antiviral efficacy cannot be attributed to increased cytotoxicity, since 62.5% and 83% of uninfected control cells, exposed to the same treatment as the infected cultures, were capable of mitotic division (Table 9). The last three excipients in the table show minimal antiviral activity compared to the first three in the table.

Tabulka 9Table 9

Antivirová účinnost 0609 v kombinaci s různými adjuvans při pH 7,4Antiviral activity 0609 in combination with various adjuvants at pH 7.4

Označení látky Identification of the substance Struktura Structure Faktor Factor inhibice inhibition antivirová účinnost³ antiviral potency ³ cytotoxicita*³ cytotoxicity * ³ undekanová kyselina undecanoic acid ch₃(ch₂)₉coohch ₃ (ch ₂ ) ₉ cooh 5,8 x 10³ 5.8 x 10 ³ 1,6 1.6 desoxycholát sodný sodium desoxycholate ^C23^H39°2^{C00Na C} 23 ^H 39 ° 2 ^C00Na 1,0 x 10³ 1.0 x 10 ³ 1,2 1,2 dodecylsulfát sodný sodium dodecyl sulfate CH₃(CH₂)_n0S0₃NaCH ₃ (CH ₂ ) _n OSO ₃ Na 7,2 x 10³ 7.2 x 10 ³ 1,6 1.6 dodecylfosfát dodecyl phosphate ch₃(ch₂)_uopo₃h₂ ch ₃ (ch ₂ ) _at opo ₃ h ₂ 10,4 10.4 n,d. n, d. dodecylfosfonová kyselina dodecylphosphonic acid ^CH3^(CH2⁾11^PO3^H2 ^CH 3 ^(CH 2 ⁾ 11 ^PO 3 ^H 2 2,8 2.8 1,4 1.4 dodecyltrimethylamonium- dodecyltrimethylammonium- bromid (TNCB) bromide (TNCB) CH₃(CH₂)₁₁N(CH₃)₃+Br-CH ₃ (CH ₂ ) ₁₁ N (CH ₃ ) ₃ + Br- 15 15 Dec 1,6 1.6

CS 275793 8 6 ^a Infikované (HSV-1) Rita buněčné kultury byly léčeny duplicitně po dobu 23 hodin po adsorpci (1 h 10)/ug/0609 a 40 yUg každého detergenčního činidla. Virové progeny byly titrovány duplicitně plakovým testem a srovnány s výtěžky z neléčených kultur. ^And Infected (HSV-1) Rita cell cultures were treated in duplicate for 23 hours after adsorption (1 hr 10) / µg / 0609 and 40 µg of each detergent. Viral progeny were titrated in duplicate by plaque assay and compared with the yields from untreated cultures.

Antivirová aktivita je vyjádřena jako faktor inhibice produkce viru.Antiviral activity is expressed as a factor for inhibiting virus production.

& Neinfikované Rita buňky byly léčeny duplicitně jako vpředu a počet buněk byl stanoven spočtením v Neubauerově počítací komůrce. Je uveden poměrně neléčených a léčených kultur (průměrné hodnoty ze dvou kultur v každém případě).& Uninfected Rita cells were treated in duplicate as before and the cell number was determined by counting in a Neubauer counting chamber. The relatively untreated and treated cultures are reported (average values of the two cultures in each case).

Další důkaz inhibice HTLVIII-viru kombinací DEXA/kyselina undekanováFurther evidence of inhibition of HTLVIII-virus by DEXA / undecanoic acid

K37-bunky (lidský T-buněčný lymfom) byly použity k reprodukci HTLVIII viru. K37-buňky infikované HTLVIII byly léčeny po dobu tří nebo pěti dnů po infekci 10 yug DEXA a 10 ^ug undekanové kyseliny/ml. K37-bunky ještě rostly za těchto podmínek, jak bylo zřejmé z počtu buněk (po vitálním vybarvení) před počátkem a na konci léčby pět dní). Oále stejné množství buněčné mRNA (northa 81or) bylo nalezeno jak v léčených, tak v neléčených buňkách.K37 cells (human T cell lymphoma) were used to reproduce the HTLVIII virus. HTLVIII infected K37 cells were treated for three or five days after infection with 10 µg DEXA and 10 µg undecanoic acid / ml. K37 cells were still growing under these conditions, as was evident from the number of cells (after vital staining) before and at the end of treatment for five days). In addition, the same amount of cellular mRNA (Northern 81or) was found in both treated and untreated cells.

Ve stejnou dobu byla DNA izolována z uvedených léčených i neléčených infikovaných K37-kultur a hybridizována klonovanou autentickou HTLVIII-ONA, která byla značena 32P, a výsledek byl interpretován autoradiograficky. Replikační intermediární sloučeninou HTLVIII viru je superhelikální ONA jako v případě všech.retrovirů. Uvedenou superhelikální DNA (forma I) a i relaxovanou formu II lze pozorovat v neléčených infikovaných kulturách po třech i po pěti dnech ve formě černých skvrn na autoradiogramu. Po štěpení selektivně štěpicím restrikčním enzymem, který otevírá anulárni DNA za vzniku lineární DNA jednotné délky, se získávají po třech a pěti dnech opět typické signály. Nebylo možné detegovat v léčené kultuře po třech nebo pěti dnech ani superhelikální DNA nebo po štěpení lineární DNA. Uvedené výsledky ukazují, že léčba kombinací OEXA/undekanová kyselina inhibuje zcela replikaci HTLVIII.At the same time, DNA was isolated from both treated and untreated infected K37 cultures and hybridized with cloned authentic HTLVIII-ONA, which was labeled with 32P, and the result was interpreted autoradiographically. The replicative intermediate compound of the HTLVIII virus is superhelical ONA as in all retroviruses. Said superhelical DNA (Form I) as well as relaxed Form II can be observed in untreated infected cultures after three or five days as black spots on the autoradiogram. After cleavage with a selectively cleavage restriction enzyme that opens anomalous DNA to produce linear DNA of uniform length, typical signals are recovered after three and five days. It was not possible to detect either superhelical DNA or linear DNA digestion in the treated culture after three or five days. These results show that treatment with the OEXA / undecanoic acid combination completely inhibits HTLVIII replication.

Uvedená inhibice probíhá v K37-buňkách při koncentraci, která neškodí neinfikovaným K37 buňkám. Jenom vzrůst koncentrace vede k selektivní destrukci nejen buněk K37-T-lymfomu, ale i také dalších lidských T- a 8- lymfomových linií, jak lze vidět z obr. 8. Kombinace OEXA/undekanová kyselina ponechává mitogenem stimulované lidské periferní lymfocyty (pBL) nepoškozeny v koncentracích, které jsou selektivně letální pro nádorové buňky.Said inhibition takes place in K37 cells at a concentration that does not harm uninfected K37 cells. Only an increase in concentration leads to selective destruction not only of K37-T-lymphoma cells but also of other human T- and 8- lymphoma lines, as can be seen in Figure 8. The OEXA / undecanoic acid combination leaves mitogen-stimulated human peripheral lymphocytes (pBL) undamaged at concentrations that are selectively lethal to tumor cells.

K tomuto účelu byly periferní krevní lymfocyty izolovány odstředěním přes lymfoprep-gradienty. Buňky byly inkubovány v RPMI 1 640 médiu, ke kterému bylo přidáno 10% fetální hovězí sérum a 5 yug/ml fytamaglutininu (PHA). Po 1 dnu byly buňky peletizovány odstředěním a přeneseny na mikrotitrační desky (2 x 10^ buněk v dutině) do nového média bez PHA, které však obsahovalo 10 % interleukinu-2. DEXA a vzrůstající koncentrace kyseliny undekanové byly přidány jak je uvedeno na obr. 8. Paralelně s tím byla T-buněčné lymfomy (Jurkat a K37), stejně jako B-buněčné lymfomy (Ráji a P3HR1) léčeny stejným způsobem. Po čtyřdenní inkubační době byl stanoven počet živých buněk po vybarveni trypanovou modří.For this purpose, peripheral blood lymphocytes were isolated by centrifugation through lymphoprep-gradients. Cells were incubated in RPMI 1640 medium to which 10% fetal bovine serum and 5 µg / ml phytamagglutinin (PHA) were added. After 1 day, cells were pelleted by centrifugation and transferred to microtiter plates (2 x 10 6 cells in the cavity) in new PHA-free medium, but containing 10% interleukin-2. DEXA and increasing concentrations of undecanoic acid were added as shown in Figure 8. In parallel, T-cell lymphomas (Jurkat and K37) as well as B-cell lymphomas (Paradise and P3HR1) were treated in the same manner. After a four-day incubation period, the number of viable cells was determined after trypan blue staining.

V Jurkat-, Ráji- a K37-kulturách, které byly léčeny 5 ^ug DEXA a 40 yug/ml kyseliny undekanové, nebyly nalezeny žádné živé buňky. Léčené lidské periferní krevní lymfocyty byly však schopné i za těchto podmínek se mitoticky dělit. Specifická inhibice replikace HTLVIII, stejně jako selektivní cytotoxicita se zřetelem na T- a 8- lidské lymfomové nádorové buňky, činí z kombinace DEXA a kyseliny undekanové efektivní činidlo pro chemoterapii AIDS.No living cells were found in Jurkat, Raji and K37 cultures that were treated with 5 µg DEXA and 40 µg / ml undecanoic acid. However, treated human peripheral blood lymphocytes were able to divide mitotically even under these conditions. Specific inhibition of HTLVIII replication, as well as selective cytotoxicity with respect to T- and 8- human lymphoma tumor cells, makes the combination of DEXA and undecanoic acid an effective agent for AIDS chemotherapy.

Je třeba chápat, že vynález není omezen na přesné pracovní detaily, složení, způsoby, pochody nebo provedení ukázaná a popsaná, protože zřejmé modifikace a ekvivalenty budou odborníkovi běžné, a vynález je proto omezen jenom celým rozsahem připojených bodů předmětu vynálezu.It is to be understood that the invention is not limited to the precise working details, compositions, methods, processes or embodiments shown and described, as obvious modifications and equivalents will be common to those skilled in the art, and the invention is therefore limited only by the scope of the appended claims.

Claims (6)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Způsob výroby protivirového a protinádorového prostředku se zlepšenou účinností, na bázi protivirově a protinádorově účinných xanthátů, vyznačující se tím, že se xanthát obecného vzorce IProcess for the production of an antiviral and antitumor composition with improved efficacy, based on antiviral and antitumor active xanthates, characterized in that the xanthate of the general formula I R¹ - 0 - (I) ve kterém r! představuje benzylovou skupinu, cyklohexylovou skupinu, adamantylovou skupinu, bicykloheptylovou skupinu, tricyklodecylovou skupinu, cyklododecylovou skupinu, dodecylovou skupinu nebo 4-isobornylcyklohexylovou skupinu aR ¹ - O - (I) in which r! represents benzyl, cyclohexyl, adamantyl, bicycloheptyl, tricyclodecyl, cyclododecyl, dodecyl or 4-isobornylcyclohexyl and R znamená sodík, draslík nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, při teplotě nepůsobící destruktivně na jednotlivé komponenty smísí s pomocnou látkou vybranou ze skupiny zahrnující alifatické monokarboxylové kyseliny s 9 až 13 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, ethersulfáty, fosfáty nebo fosfonáty mastných alkoholů s B až 18 atomy uhlíku a jejich sodné a draselné soli, a soli deoxycholové kyseliny s alkalickými kovy, v molárnim poměru xanthátů k pomocné látce od 1 : 6 do 1 : 0,25.R is sodium, potassium or a C 1 -C 4 alkyl group, mixed with an excipient selected from the group consisting of C 9 -C 13 aliphatic monocarboxylic acids and their sodium and potassium salts, ether sulfates, phosphates or phosphonates of C 1 -C 18 fatty alcohols and their sodium and potassium salts, and alkali metal deoxycholic acid salts, in a xanthate to excipient molar ratio of from 1: 6 to 1: 0.25. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se jako xanthát obecného vzorce I použije benzylxanthát sodný nebo draselný, cyklohexylxanthát sodný nebo draselný,2. A process according to claim 1, wherein the xanthate of formula I is sodium or potassium benzyl xanthate, sodium or potassium cyclohexyl xanthate, 1- adamantylxanthát sodný nebo draselný,Sodium or potassium adamantylxanthate, 8(9)-tricyklo[5,2,l,0^z’ ]decylxanthát sodný .nebo draselný,8 (9) -tricyclo [5.2.1.0 ^z ]] sodium decylxanthate or potassium, 2- endo- nebo exo-bicyklo[2,2,1^’heptylxanthát sodný nebo draselný, cyklododecylxanthát sodný nebo draselný, n-dodecylxanthát sodný nebo draselný nebo2- sodium or potassium endo- or exo-bicyclo [2.2.1.1 &apos;, heptylxanthate, sodium or potassium cyclododecylxanthate, sodium or potassium n-dodecylxanthate, or 4-. isobornylcyklohexylxanthát sodný nebo draselný.4-. sodium or potassium isobornylcyclohexylxanthate. 3. Způsob podle bodů 1 nebo 2, vyznačující se tim, že se jako pomocná látka použije sodná nebo draselná sůl děkanové kyseliny, undekanové kyseliny, dodekanové kyseliny, deoxycholové kyseliny, dodecylsulfátu nebo dodeoylfosfonové kyseliny.3. A process according to claim 1, wherein the sodium or potassium salt of decanoic acid, undecanoic acid, dodecanoic acid, deoxycholic acid, dodecyl sulfate or dodeoylphosphonic acid is used as the excipient. 4. Způsob podle libovolného z bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se xanthát obecného vzorce I a pomocná látka použijí v molárnim poměru 1 : 3 do 1 : 0,5, zejména od 1 : 1 doProcess according to any one of Claims 1 to 3, characterized in that the xanthate of the formula (I) and the excipient are used in a molar ratio of 1: 3 to 1: 0.5, in particular of 1: 1 to 1: 1. 1 : 2.1: 2. 5. Způsob podle libovolného z bodů 1 až 4, vyznačující- se tím, že se ke směsi přidá promotor růstu.5. A method according to any one of claims 1 to 4, wherein the growth promoter is added to the mixture. 6. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím,, že se jako promotor růstu použije insulin.6. The method of claim 5, wherein the growth promoter is insulin. 3 výkresy3 drawings