DD284047A5 - Verfahren zur herstellung einer dna-sequenz, die fuer einen alkohol-oxidose-ii-regulationsbereich einer methylotrophen hefe kodiert - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die fuer einen Alkohol-oxidase-II-Regulationsbereich einer methylotrophen Hefe kodiert. Die DNA-Sequenz leitet sich von Pichia pastoris ab und enthaelt einen Regulationsbereich aus einem zweiten Alkohol-Oxidase-Gen. Ferner wird die Herstellung von neuen DNA-Bausteinen beschrieben, die den Regulationsbereich enthalten, der operativ mit einem heterologen DNA-Strukturgen verknuepft ist.{DNA; methylotrophe Hefe; rekombinante DNA-Technik; Alkoholoxidase-II-Regulationsbereich; Pichia pastoris; AOX2-Strukturgen}

Description

-310 -290 -270

CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT

-250 -230 -210

ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA

-190 -170 -150

aagaagcaaccaaaatcccttattgtccttttctgatcagcatcaaagaatattgtctta

-130 -HO -90

AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT

-70 -50 -30

CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA

-10 AACAAATCAACTGAGAAAA

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz operativ mit einem heterologen Gen verknüpft wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz operativ mit einem heterologen Gen verknüpft wird.

Hierzu 10 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der rokombinanten DNA-Technik.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Mit der Entwicklung der rekombinanten DNA-Technik in den letzten Jahren wurde eine kontrollierte Herstellung einer großen Vielzahl von wertvollen Polypeptiden durch Zellen möglich. Viele eukaryontische Polypeptide, ζ. Β. menschliches Wachstumhormon, Leukozyteninterferone, menschliches Insulin und menschliches Proinsulin werden von verschiedenen Mikroorganismen gebildet. Die weitere Anwendung der zur Verfügung stehenden Techniken ist für die Zukunft zu erwarten, so daß die rekombinante Bildung einer Vielzahl von anderen wertvollen Polypeptidprodukten möglich sein wird. Die grundlegenden Verfahrensweisen auf dem Gebiet der rekombinanten Technik sind dem Fachmann bekannt. Zu den Hauptelementen für die Praxis der rekombinanten DNA-Technik gehören:

(1) Ein len, das für eines oder mehrere der gewünschten Polypeptide kodiert und operativ mit geeigneten, für die Expression in der Wirtszelle erforderlichen Steuersequenzen verknüpft ist (oporativ verknüpft bedeutet eine Nachbarstellung, bei der eine solche Konfiguration der Komponenten gegeben ist, daß sie ihre übliche Funktion ausüben können);

(2) ein Vektor, im allgemeinen ein Plasmid, in den eine Nucleotidsequenz inseriert werden kann (ein Vektor ist irgendein zur Transformation eines Wirts fähiger Baustein mit einem Gehalt an einer Nucleotidsequenz);

(3) ein geeigneter Wirt, in den die gewünschte Nucleotidsequenz transferiert werden kann, wobei der Wirt über den Zellapparat zur Expression der Information, für die die transferierte Nucleotidsequenz kodiert, verfügt.

Ein in der rekombinanten Technik verwendetes Grundelement sind die Plasmide, bei denen es sich um kreisförmige, extrachromosomale, doppelsträngige DNA handelt, die zuerst in Mikroorganismen aufgefunden worden ist. Plasmide kommen pro Zelle in Mehrfachkopien vor. Neben der· natürlich vorkommendet Plasmiden wurden eine Reihe von Plasmiden künstlich hergestellt. D'e Plasmide enthalten die für dio Plasmidreproduktion erforderliche Information, d. h. eine autonome Replikationssequenz und/oder eine Ursprungsstelle der Replikation. In der im Plasmid kodierten Information können eines oder mehrere Mittel zur phänotypischen Auswahl des in die Zellen transformierten Pia imide enthalten sein. Die phänotypif chen oder Markerselektionseigenschaften, wie Resistenz gegenüber Antibiotika, ermöglichen es, Klone der Wirtszelle mit einem Gehalt an dem gewünschten Plasmid aufgrund des bevorzugten Wachstums der Zellen in selektiven Medien zu erkennen und auszuwählen. Vektoren oder Plasmide können spezifisch durch eine oder mehrere Restriktionsendonucleasen oder Restriktionsenzyme gespalten werden, die jeweils eine spezielle Nucleotidsequenz erkennen. Anschließend können ein

Regulationsbereich, der operativ mit einem heterologen Gen, d. h. einem Gen, das nicht natürlich in Kombination mit dem Regulationsbereich auftritt, verknüpft ist, oder andere Nucleotidsequenzen inseriert werden, indem man das gewünschte genetische Material an der Spaltstelle oder an rekonstruierten Enden nebon der Spaltstelle verknüpft. Der Vektor wird sodann in eine Wirtszelle eingeführt, wo dessen Nucleotidsequenz den Wirt zur Durchführung verschiedener Verfahren oder zur Übernahme verschiedener Funktionen veranlassen kann. Einige Beispiele umfassen die Expression von heterologen Polypeptiden oder die verstärkte Expression von homologen oder heterologen Polypeptiden. Das Verfahren der Einführung von Nucleotiden in die Wirtszelle wird Im allgemeinen als Transformation bezeichnet. Große Vektormengen lassen sich erhalten, indem man den Vektor in eine geeignete Wirtszelle einführt, um dessen Kopienanzahl zu erhöhen. Eine allgemein zur Erhöhung der Kopienanzahl des Vektors verwendete Wirtszelle ist E.coli. Die Vektoren werden sodann aus dem ersten Wirt isoliert und in eine zweite Wirtszelle eingeführt, wo dann die gewünschten vektorgesteuerten Aktivitäten erfolgen, beispielsweise die Herstellung eines Polypeptide. Die Herstellung eines Endprodukts aus DNA auf diese Weise wird als Expression bezeichnet. Wird das Gen in geeigneter Weise in den Vektor in bezug auf die Vektorbereiche, die die Transkription und Translation der kodierten Nucleotidsequenz steuern, inseriert, so kann der erhaltene Vektor zur Steuerung der Produktion der Polypeptidsequenz, für das das inserierte Gen kodiert, verwendet werden.

Die Expression wird durch einen Regulationsbereich gesteuert. Bei Regulationsbereichen handelt es sich um heterogene Nucleotidsequenzen, die auf verschiedene Reize reagieren und die Frequenz dor RNA-Transkription beeinflussen. Die Expression kann als Reaktion auf Reize an- oder abgeschaltet werden. Eine in Reaktion auf einen Reiz angeschaltete Expression wird im allgemeinen als Derepression oder Induktion bezeichne,. einige Beispiele für induzierbare Expressionssysteme sind das AOXI-System in Pichia pastoris, die Östrogensysteme in Xenopus laevis und die Metallothioncinsysteme in Affen, Menschen, Hamstern, Mäusen und Ratten. Induzierbare Expressionssysteme unterliegen im allgemeinen einer strengeren Kontrolle als konstitutive Systeme. Diese Systeme eignen sich gut für Genmanipulationszwecke.

In der Praxis können durch Anwendung der rekombinanten DNA-Technik Zellen geschaffen werden, die zur Expression von heterologen Nurleotidsequenzen fähig sind. Heterologe Nucleotidsequenzen sind solche Nucleotidsequenzen, die nicht natürlich im Wirt vorkommen. Beispiele dafür sind neue Kombinationen von natürlich im Wirt auftretenden Regulationsbereichen mit Strukturgenen, die in der Natur nicht mit diesem Regulationsbereich assoziiert sind. Ein weiteres Beispiel ist die Kombination eines Regulationsbereichs mit einem nicht natürlicherweise im Wirt auflötenden Gen. Das heterologe Polypeptid kann als ein Fusionspolypeptid gebildet werden, d. h. als ein heterologes Pol. ,,eptid, das mit einem Teil der Aminosäuresequenz eines homologen oder heterologen Polypeptids verschmolzen ist. Das ursprünglich erhaltene Fusionspolypeptidprodukt wird gelegentlich in einer inaktiven Form gebildet, bis es dann in einer extrazellulären Umgebung gespalten wird.

Wie in EP-A-86114700.7 beschrieben, kodiert das Pichia pastoris-Genom für die zwei funktionellen Alkohol-oxidase-Gene AOX1 undAOX2.

Ziel der Erfindung .

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten DNA-Sequenzen eignen sich zur Expression von heterologen Genen und insbesondere in Situationen, wo ein hoher Expressionsgrad eines Pioteins nachteilig ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Ei findung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Regulationsbereich, dor mit dem AOX 2-Strukturgen assoziiert ist, bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer DNA-Sequenz, die einen Alkohol-oxidase-ll-Regulationsbereich einer methylotrophen Hefe enthält, wobei der Regulationsbereich auf die Anwesenheit von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle für die Wirtszelle reagiert und wobei die Sequenz zwischen der ersten EcoRI-Stelle vom 5'-Ende und dem Startcodon des AOX2-Strukturgens wie in der Restriktionskarte von Fig. 1 (b) gezeigt, enthalten ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man den Regulationsbereich durch Transformation von Pichia pastoris gewinnt.

Die Erfindung beruht auf der Auffindung eines 5'-Regulationsbereichs, der mit dem AOX2-Strukturgen assoziiert ist. Dieser Regulationsbereich ist durch Methane! oder durch Mangelbedingungen in Bezug auf Kohlenstoffquellen induzierbar. Jedoch beträgt der maximale Expressionsgrad des AOX2-Regulationsbereichs nur etwa 5 bis'11 % des Werts des AOX1 Regulationsbereichs. Bezüglich des AOX 1-Gens wird EP-A-8520i tZS.O verwiesen.

Der AOX2-Regulationsbereich kann zi r Expression von heterolcgen Genen verwendet werden und eignet sich insbesondere in Situationen, wo ein hoher Expressionegrad eines Proteins nachteilig ist.

Erfindungsgemäß wurde somit eine DNA-Sequenz, die die Frequenz der Transkription von DNA in RNA reguliert, aufgefunden, isoliert und charakterisiert. Die erfindungsgemäßen neuen DNA-Soquenzen eignen sich zur Bildung von Polypeptidprodukten durch methylotrophe Hefen, wie Pichia pastoris.

Nachstehend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1: eine Restriktionskarte des AOX 1-Gens (a) und des A0X2-Gens (b);

Fig. 2: eine Restriktionskarte von pBR322;

Fig. 3: eine Restriktionskarte von pYJ 8;

Fig.4: eine Restriktionskarte des Plasmids pYM 5;

Fig. 5: eine Restriktionskarte des Plasmids pMR4;

Fig. 6: ein Fließdiagramm der Konstruktion von pMR4;

Fig.7: eine Restriktionskarte des Plasmids pBPf 1;

Fig.8: eine Restriktionskarte des Plasmids pYJ 55;

Fig. 9: ein Fließdiagramm der Konstruktion des Plasmids ρYJ 55; und

Fig. 10: eine Restriktionskarte des Plasmids pSAOH5.

Somit wird erfindungsgemäß eine neue DNA-Sequenz bereitgestellt, die einen Regulationsbereich enthält, der auf mindestens eine der folgenden Bedingungen reagiert: Die Anwesenheit von Methanol in der Wirtsumgebung oder ein Mangel in bezug auf Kohlenstoffquellen, wenn die Wirtszelle auf anderen Substraten als Methanol gezüchtet wird. Der erfindungsgemäße Regulationsbereich eignet sich zur Steuerung der Frequenz der Transkription von RNA, wenn er operativ am 5'-Ende einer DNA-Sequenz, die für die Bildung von mRNA kodiert, verknüpft ist.

Ferner betrifft die Erfindung die Herstellung von Plasmiden und transformierten Organismen mit einem Gehalt an den vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen.

I. Charakterisierung desAlkohol-oxldase-Regulatlonsberelchs

Das vollständige AOX2-Gen ist in der Restriktionskarte von Fig. 1 (b) enthalten. Der AOX2-Regulationsbereich ist zwischen der ersten EcoRI-Stolle vom 5'-Ende und dem Startcodon des AOX2-Strukturgens enthalten, wie in der Restriktionskarte von Fig. 1 (b) gezeigt. Der Bereich der DNA-Sequenz, die für das Alkohol-oxidase Il-Protein kodiert, ist unter der Restruktionskarte mit einem dicken Balken gekonnzeichnet. Eine Restriktionskarte des Alkohol-oxidase I-Gens ist zum Vergleich der beiden Gene in Fig. 1 (a) gezeigt. Es läßt sich keine signifikante Sequenzhomologie außerhalb des Proteinkodierungsbereichs der Gene beobachten.

Der AOX2-Regulationsbereich wurde ferner durch einen lacZ-Fusionsbaustein charakterisiert, wobei sich ergab, daß er für die regulatorische Aktivität nicht mehr als etwa den Bereich von Basenpaar -1500 bis etwa Basenpaar -1 benötigt (vgl. Tabelle I). Die Nucleotidsequenz für ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an dem AOX2-Regulationsbereich ist in Tabelle I angegeben.

Tabelle I AOX2-Regulatlonsberelch und 5'-untranslatlerter Bereich

-1750 -1730 -1710

GGATCTCAAAAACCTAAGTACTTCATTTGAATATAiXCTCTGCACCTAAATTTACACCTAA

-1690 -1670 -1650

CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA

-1630 -1610 -1590

CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC

-1570 -1550 -1530

ÄCGCATAACGTCCCCÄGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT

-1510 -1490 -1470

TTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT

-1450 -1430 -1410

CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT

-1390 -1370 -1350

TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA

-1330 -1310 -1290

gattgtgatcaagaagcagagacaatcaccactaaggttgcacatttgagccagtaggct

-1270 -1250 -1230

cctaatagaggttcgatacttattttgataatacgacatattgtcttacctctgaatgtg

-1210 -1190. -1170

TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG

-1150 -1130 -1110

CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG

-1090 -1070 -1050

CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA

-1030 -1010 -990

AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT

-970 -950 -930

AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT

-910 -890 -870

CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA

-850 -830 -810

cccctcaattttccatccaagggcgatccttacmagttaatatcgaacagcagagacta

-790 -770 -750

agcgagtcatcatcaccacccaacgatggtgmaaactttaagcatagattgatggaggg

-730 -710 -690

TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAMCTATGGGGTAATACATCACATCCGG

-670 -650 -630

AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCMAGCACGTGATGTACCCCGTAMCTGCTCGGA

-610 -590 -570

TIATCGTTGCMTTCATCGTCTTAMCAGTACMGMACTTTATTCATGGGTCATTGGAC

-550 -530 -510

TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCMTGATTTTTTGGGAMGMAGCCGTMGAGGACAGT

-490 -470 -450

TMGCGAMGAGACMGACMCGMCAGCMMGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC

-430 -410 -390

AGTTGGGAGTTTCCMTTGGTTGGTTTTGMTTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT

-370 -350 -330

CTCCTTGCAMCMTGCMGTTGATMGACATCACCTTCCMGATAGGCTATTTTTGTCG

-310 -290 -270

CATAMTTTTTGTCTCGGAGTGAAMCCCCTTTTATGTGMCAGATTACAGMGCGTCCT

-250 -230 -210

ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAMTTMGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATM

-190 -170 -150

MGMGCMCCMAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAMGMTATTGTCTTA

-130 -110 -90

AMCGGGCTTTTMCTACATTGTTCTTACACATTGCAMCCTCTTCCTTCTATTTCGGAT

-70 -50 -30

CMCTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTMCGMGTTTACGACTTACTAMTCCCCACA

-10 MCMATCMCTGAGAAM

Der Regulationsbereich reagiert auf mindestens eine der folgenden Bedingungen: Die Anwesenheit von Methanol als einzige Kohlenstoffquelle für methylotrophe Hefewirte, wie Pichia pastoris, oder Kohlenstoffquellen-Mangelbedingungen für die Wirtsz »Ilen. Ferner stimuliert der AOX2-Regulationsbereich im Vergleich zum AOX1 -Regulationsbereich etwa 5 bis 11 % der Proteinbildung von ß-Galactosidase.

II. Isolation des Alkohol-oxidase Il-Regulationsbereichs aus Pichia pastoris Der AOX2-Regulationsbereich wurde durch Transformation des Pichia-Stammes MC 100-3 (arg4 his4 aox 1Δ: :SARG4 aox2A: :Phls4) isoliert. Dieser Stamm enthält eine mutante Kopie des Pichia HIS4-Gens, die in das AOX2-Gen inseriert ist. MC 100-3 wurde mit pYM 5 transformiert, einem Plasmid, das aus einem 2,7 kb Bg 11l-Fragment mit dem an der BamHI-Stelle von pBR322 inserierten Pichia H!S4-Gen zusammengesetzt ist. DNAs aus mehreren MC 100-3 (pYM5) His⁺-Transformanten wurden durch Southern-Filterhybridisierung einem Screening auf Transformanten unterzogen, die pYM 5 vereinigt mit dem HIS4-Fragment am AOX2-Ort von MC 100-3 enthielten. Die DNA aus einem dieser Stämme wurde sodann mit Hindill verdaut, was zur Freisetzung eines Genomfragments von etwa 12kb mit einem Gehalt an 5,3kb der Sequenz 5' der AOX2 Kpn I-Stelle, 2,7kb von Pichia HIS4-Gen und 4,0kb von pBR322 führte. Die Hindlll-geschnittene DNA wurde verknüpft und in E.coli transformiert. Transformanten wurden aufgrund ihrer Resistenz gegenüber Ampicillin ausgewählt. Ein Plasmid, pMR4, wurde aufgefunden. Eine Restriktionskarte dieses Plasmids ist in Fig.5 gezeigt.

III. Eigenschafton des AOX2-Regulatlonsberelchs

Um die Expression des AOX 2-Regulationsbereichs mit dem von AOX1 zu vergleichen, wurde ein AOX 2-lacZ-Expressionsvektor konstruiert, der eine möglichst große Ähnlichkeit mit pSAOH 5 (in Fig. 10 gezeigt), einem AOX 1-lacZ-Fusionsvektor, aufwies. Das Fließdiagramm zur Konstruktion des AOX 2-lacZ-Vektors, pYJ 55, ist in Fig.9 gezeigt. Vorläufige DNA-Sequenzdaten vom 5'-Ende von AOX2 ergaben, daß AOX2 zwei BamHI-Stellen in Positionen im Strukturgen enthält, die identisch mit den im AOX1-Strukturgen gefundenen Stellen sind. Daher bestand die erste Stufe bei der Konstruktion von pYJ 55 darin, eins 1,8kb Bg 111-BamHI-Fragment, das den AOX2-Regulationsbereich und 45 Basenpaare der aminoterminalen Proteinkodierungssequenz enthält, in dio BamHI-Stelle von pBPf 1 zu inserieren, um pYJ 38 zu erzeugen. Die zweite Stufe bestand darin, pYJ 38 mit BamHI zu schneiden und das gleiche Adaptoroligonucleotid zu inserieren, das zur Konstruktion des AOX1 -lacZ-Vektors (ö'-GATCACCCGGGT-a¹) inseriert worden war. Die Insertion dieses Adaptors zerstörte die BamHI-Stelle von pYJ38 und schuf eine neue Smol-Stelle am Insertionspunkt. Dieses Plasmid, pYJ45, wurde mit Smal verdaut, und das 1,8kb Smal-Fragment mit c )m Gehalt an dem modifizierten AOX2-Promotor wurde in pBPf 1 inseriert, um das Plasmid pYJ 46 zu bilden. Das Plasmid pYJ46 wurde mit EcoRI verdaut, um ein kb-Fragment vom 5'-Ende des A0X2-Fragments in pYJ 46 zu entfernen. Sodann wurde das Plasmid religiert, um das Plasmid pYJ55 zu bilden. Eine Restriktionskarte des Plasmids pYJ 55 ist in Fig.8 gezeigt. Das Plasmid ρYJ55 wurde in GS115 (his4) transformiert, und His⁺-Transformanten wurden einem Screening auf einen stabilen His⁺-Phänotypen unterworfen, was die Anwesenheit eines integrierten Plasmids anzeigte. Genom DNAs aus mehreren stabilen His⁺-Stämmen wurden durch Southern-Filterhybridisierung analysiert, um die Anwesenheit des Plasmids zu bestätigen und dessen Stellung zu bestimmen.

Um die relativen Stärken der AOX1- und AOX2-Promotoren zu ermitteln, wurde die ß-Galactosidasebildung durch pYJ 55 und pSAOH 5 verglichen, indem man diese Plasmide in GS115 transformierte. Die transformierten GS115-Stämme wurden mit GS115(pYJ55) bzw. GS115(pSA0H 5) bezeichnet. Die einzelnen Stämme enthalten das integrierte Plasmid am HIS4-Ort. Zellen der jeweiligen Stämme wurden in Glycerinmedium gezüchtet, auf ein Medium ohne Kohlenstoffquelle übertragen und dort 24 Stunden belassen und sodann auf ein Medium mit Methanol übertragen und weitere 50 Stunden dort belassen. Proben der einzelnen Kulturen wurden am Ende der jeweiligen Züchtungsphasen entnommen. Extrakte wurden hergestellt und auf ß-Galactosidase untersuch». Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Tabelle Il zusammengestellt.

Tabelle Il

Vergleich der ß-Galactosidase-Expresslon von AOX1- und AOX2-lacZ-Fuslonen

	Promotor	ß-Galactosidase	-Aktivität (U/pg) in Kohlenstoffquellen	Methanol11
Stamm	AOX1 AOX 2	Glycerin	Kein Kohlenstoff"	6205 739
GS115(pSAOH5) GS115(pYJ55)	<10 <10	955 109

1 YNB-Medium.

Bei den in Glycerin gezüchteten Zellen ergaben sich weder beim AOX1 -lacZ-Stamm noch beim AOX 2-lacZ-Stamm erhebliche Konzentrationen an ß-Galactosidase. Im Medium ohne Kohlenstoffquelle war das Maß der Aktivität beim A0X2-lacZ-Stamm etwa 1/10 der Aktivität vom AOXI-lacZ-Stamm. Die Zugabe von Methanol zu den A0X2-lacZ-enthaltenden Zellen ergab Konzentrationen an ß-Galactosidase, die etwa 1 /9 des Werts bei den AOX 1-lacZ-Zellen erreichten. Somit werden die AOX1- und A0X2-Geneauf ähnliche Weise reguliert. Das einzige unterscheidende Merkmal ist die erheblich geringere Reaktion des AOX 2-Regulationsbereichs auf Methanol und Mangel an Kohlenstoffquellen.

Obgleich vorstehend die Einführung des AOX2-Regulationsbereich-ß-Galactosidasegen-Fusionsproduktes in eine Wirtshefezelle beschrieben worden ist, erkennt der Fachmann, daß es für die erfindungsgemäße Praxis nicht erforderlich ist, ringförmige Plasmide oder das ß-Galactosidase-Strukturgen zu verwenden. Somit können auch andere Vektoren, die in Hefan erhalten werden können, bei der Verwertung diesos Regulationsbereichs mit anderen heterologen Genen eingesetzt werden. Eine andere Möglichkeit besteht darin, diesen Regulationsbereich, der operativ mit anderen heterologen Genen verknüpft ist, in das Chromosom der Hefewirtszelle unter Verwendung von integrativen Vektoren zu integrieren. Ferner können funktioneile Mutanten des hier beschriebenen AOX2-Regulationsbereichs, die aus einer kürzeren DNA-Sequenz vom 5'-Ende bestehen, ebenfalls zur Regulierung der heterologen Genexpression verwendet werden.

Ausführungsbeispiele

Allgemeine Informationen zu den Beispielen Stämme

Pichla pastoris NRRLY-11430

Pichla pastoris GS115 (his 4) NRRL Y-15 851

Pichia pastoris PPF1 (arg4his4)NRRLY-18017

Pichia pastoris KM7121 (arg4his4aox1A::SARG4

aox2A::PH1S4)NRRLY-18019

E. coil MC 1061 [FaraD 139 A(ara ABD1 C-Ieu) 7679AlacX74 galU

galKrpsLhsdR]

Medien, Puffer und Lösungen 1mTris-Puffer

TE-Puffer

Dehnhardt-Lösung(50x)

20X SSPE

LB (Luria-Bertani)-Medium

YPD-Medium

YNB-Medium .

SCE-Puffer

PEG-Lösung

SOS Formamid-Farbstoff-Gemlsch

Deckgel

Acrylamid-Vorratslösung

Bodengel

Didesoxy:

DNTP-Vorratslösung 10X Klenow-Verdünnungspuffer

10X TMD, pH-Wert 7,5

121,1 g Tris-Base in 800 ml H₂O; Einstellen des pH-Werts auf den gewünschten Wert durch Zugabe von konzentrierter (35 %) wäßriger HCI; Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur vor der endgültigen pH-Einstellung; Verdünnen auf ein Endvolumen von 1 Liter.

.,0 millimolar EDTA in 0,01 m (pH-Wert 7,4) Tris-Puffer

0,15 m NaCI, 15 millimolar Natriumeitrat eingestellt mit NaOH auf pH-Wert 7,0

40 millimolar Essigsäure, 5 millimolar EDTA in 0,02 m (pH-Wert 8,3) Tris-Puffer

5 g Ficoll, 5 g Polyvinylpyrrolidon, 5 g Rinderserumalbumin (BSA; Pentax Fraktion V) mit Wasser

auf ein Gesamtvolumen von 500 ml gebracht

20 millimolar EDTA, 0,16 m NaOH, 0,2 m NaH₂PO₄ · H₂0,3,6 m NaCI eingestellt mit NaOH auf

pH-Wert 7,0

5 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 2,5 g NaCI in 1 Liter Wasser, eingestellt mit NaOH auf

pH-Wert 7,5

1 % Bacto-Hefeextrakt, 2 % Bacto-Pepton, 2 % Dextrose

6,75 g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (DIFCO) in 1 Liter Wasser

1 m Sorbit, 25 millimolar EDTA, 50 millimolar DTT

9.1 g Sorbit, 1,47 g Natriumeitrat, 0,168g ED IA, 50 ml H₂O pH-Weit mit HCI auf 5,8 eingestellt 1 m Sorbit 10 millimolar CaCI₂ steril filtrieren

20 % Polyethylenglykol 3350,10 millimolar CaCI₂,10 millimolar Tris HCI (pH-Wert 7,4)

steril filtrieren

1 m Sorbit, 0,3x YPD-Medium, 10 millimolar CaCI₂

0,1 % Xylol-Cylenol FF, 0,2 % Bromphenolblau, 10 millimolar EDTA, 95 % entionisiertes

Formamid

76,8 g Harnstoff, 24 ml Acrylamid-Stammlösung, 8 ml 10x TBE auf ein Endvolumen von 160 ml

gebracht

38 g Acrylamid, 2 g Bis-(N,N-mothylenbisacrylamid) Zugabe von Wasser auf ein

Gesamtvolumen von 100 ml

14,4 g Harnstoff, 3,0 g Saccharose, 7,5 ml 1Ox TBE, 4,5 ml Acrylamid-Vorratslösung, 0,3 ml

Bromphenolblau-Lösung (0,01 g/ml) Zugabe von Wasser auf ein Gesamtvolumen von 30 ml

0,125 millimolar

0,10 millimolar

0,10millimolar

0,80 millimolar

0,5 millimolar dGTP, 0,5 millimolar dCTP, 0,5 millimolar TTP, 0,5 millimolar dATP

70 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 7,5 200 millimolar NaCI

70 millimolar MgCI₂ 1 millimolar EDTA 0,1 rn Tris HCI, pH 7,5 0,05 m MgCI₂ 0,075 m DTT

Sofern nichts anderes angegeben ist, stellen die vorgenannten Lösungen die eingesetzte Grundkonzentration (1 x) dar. Wenn in den Beispielen unterschiedliche Konzentrationen angewandt werden, so wird dies angegeben, indem der Multiplikationsfaktor für die Grundkonzentration (1 x) angegeben wird.

Regenerattnnsagar

1) Agar-KCI: 9g Bacto-Agar, 13,4g Kaliumchlorid, 240ml H₂O, Autokiavisierung.

2) 10x Glukose: 20g Dextrose, 100ml H₂O, Autokiavisierung.

3) 10x YNB: 6,75g Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren, 100 ml H₂O Autokiavisierung (Zugabe von beliebigen gewünschten Aminosäuren oder Nucleinsäuren bis zu einer Konzentration von 20C^g/ml vor oder nach der Autokiavisierung).

4) Zugabe von 30ml 10x Glukose und 30ml 10x YNB auf 240ml der geschmolzenen Agar- Kl-Lösung. Zugabe von 0,6ml

0,2 mg/ml Biotin und beliebigen anderen gewünschten Aminosäuren oder Nucleinsäuren in einer Konzentration von 20 μg/ .Til. Belassen des geschmolzenen Regenerations.-gars bei 55 bis 60°C.

Wachstum von Pichla pastoris

P.pastoris wurde in YPD (reiches Medium) oder YNB (Minimalmedium) gezüchtet. Je nach Bedarf wurde das YNB-Medium mit einer Kohlensf.offquelle (2% Dextrose, 1 % Glycerin oder 0,5% Methanol) und mit 5OMgAnI Aminosäuren versetzt.

Sequenzierung

Die DNA-Sequenzierung wurde nach dem Didesoxynucleotid-Kettenterminationsverfahren gemäß Sanger et al., PNAi.

(1977), S.5463 durchgeführt.

In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet:

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

TEMED Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylendiamin

DTT Dithiothreit

BSA Rinderserumalbumin

EtBr Ethidiumbromid

Ci Curie

dATP Desoxyadenosintriphosphat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

TTP Thymidlntriphosphat

dCTP Desoxycytidintriphosphat

dXTP „allgemeines" Desoxytriphosphatnucleotid

oligo IdT)₁₂-IB Quelle: Collaborative Research, Inc.

Zymolyase 60000 Quelle: Miles Laboratories

Isolierung dos Alkohol-oxldase Il-Regulatlonsberelchs Beispiel I Paarung von PPF1 X KM7121 und Entwicklung von MC 100-3

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) und KM7121 (arg4 his4 aox1A::SARG4aox2A::PHIS4 (NRRL Y-18019) wurden jeweils von einer frischen YPD-Platte auf ein Röhrchen mit sterilem Wasser überimpft. Etwa 5 x 10⁷ Zellen der jeweiligen Stämme wurden vermischt, zum Aufbrechen der Zellklumpen kurz einer Ultrasch !!!behandlung unterzogen und auf eine GNAP-Agarplatte (5% Dextrose, 2% Pepton, 1 % Hefeextrakt, 0,5% Agar, 2,3% Niihragar) verteilt. Eine unvermischte Kontrollprobe der jeweiligen Stämme (etwa 1x10¹⁸) wurde auf die gleiche Weif e behandelt. Die GNAP-Platten wurden etwa 24 Stunden bei 30°C inkubiert und sodann der Replikaplattierung auf Sporulationsmedium-Agarplatten (0,5% Natriumacetat, 1 % KCI, 2% Agar) unterworfen. Diese Platten wurden etwa 20 Stunden bei 30°C inkubiert und sodann der Replikaplattierung auf Minimalmedium-Agarplatten ohne Kohlenstoffquelle unterworfen. Auf den Minimalplatten wurden die Zellen in der Dampfphase mit Methanol versorgt.

Nach 5 Tagen traten etwa 200 Kolonien auf der Minimalplatte, auf die die gemischten Zellen aufgegeben worden waren, auf. Auf den unvermischten Kontrollplatten entwickelten sich keine Kolonien. Dieses Ergebnis legt es nahe, daß die Arg⁺ His* Mut*- Kolonien auf der gewünschten Platte diploid waren, was auf eine Paarung von PPF1 - und KM 7121-Zellen zurückgeht (Mut* = Methanolverwertung). Die diploide Natur dieser Arg* His* Mut*-Stämme wurde bestätigt, indem man die AOX-Orte von vier dieser Stämme durch Southern-Filterhybridisierung untersuchte. Folgende speziellen Sonden wurden verwendet: pPG 3.0 (NRRL B-18022), eine AOX2-spezifische Sonde; pYJ30 (NRRL B-15890), eine HIS4-spezifische Sonde; und pPG4.0 (NRRL B-15868), eine AOX1 -spezifische Sonde.

Zur Sporulierung der PPF1 X KM7121-Diploide wurde eine Kolonie (MC 100) zuerst aus der Methanolmedium-Diploid-Selektionsplatte gewonnen. Etwa 1 χ 10^β dieser Zellen wurden auf GNAP-Platten ausgestrichen und gemäß den Angaben für das Paarungsverfahren behandelt, mit der Abänderung, daß die Sporulationsplatte 4 Tage bei 3O⁰C inkubiert wurde, um den Zellen eine vollständige Sporulation zu ermöglichen. Die Sporen wurden von den Platten gewonnen, indem man die einzelnen Platten mit 5 ml sterilem Wasser spülte. Die Suspension wurde zweimal mit je 3 ml Phosphatpuffer (0,1 m Na₃PO₄, pH-Wert7,5) gewaschen. Ein Gemisch der Hefelysisenzyrne Glusulase (Endo Laboratories, NY) und Zymolyase (60000 Einheiten/g; Miles Laboratories) und ß-Mercaptoäthanol wurden zur Zerstörung von vegetativen Zellen in Endkonzentrationen von 2% (Vol./Vol.) 0,5mg/ml bzw. 0,1 % zugesetzt. Das Gemisch wurde 5h bei 30⁰C inkubiert.

Das Sporenpräparat wurde sodann zweimal in sterilem Wasser mit einem Gehalt an 0,2% Tween 80 (Voi./Vol.) gewaschen und sodann in Phosphatpuffer resuspendiert. Das Präparat wurde anschließend drei Ultraschallbehandlungszyklen von 20 Sekunden unterworfen, um Sporenklumpen aufzubrechen. Eine Probe des Sporenpräparats wurde sodann verdünnt und auf nichtselektive Masterplatten von Minimalmedium mit 2,0% Glukose und jeweils 50ug/ml Arginin und Histidin ausgestrichen. Diese Platten wurden 48 Stunden bei 30⁰C inkubiert. Anschließend wurden die einzelnen Masterplatten der Replikaplattierung auf folgende Serie von Minimalplatten unterworfen: 1) Glukose, -arg, -his, 2) Glukose, -arg, +his, 3) Glukose, +arg, -his und 4) Glukose, +arg, +his.

Nach 24stündiger Inkubation bei 3O⁰C wurden die Kolonien auf Arg- und His-Phänotypen untersucht. Kolonien mit Arg* His" wurden sodann auf ihr Wachstum auf Methanol untersucht, indem man sie auf YNB-Methanol-Agarplatten ausstrich. Nach etwa 1 Woche bei Raumtemperatur wurden die Platten auf Mut-Phänotypen untersucht. Ein Arg* His" Mur-Stamm wurde als MC 100-3 bezeichnet.

Beispiel Il

Transformation von Pichia pastoris

Hefezellen wurden auf etwa 10ml YPD-Medium überimpft und 12 bis 20 Stunden einer Schüttelkultur bei 3O⁰C unterworfen.

Anschließend wurden die Zellen auf A₆₀O von etwa 0,01 bis 0,1 verdünnt und in YPD-Medium etwa 6 bis 8 Stunden bei 3O⁰C in der logarithmischen Phase gehalten. 100ml YPD-Medium wurde mit 0,5ml dieser Anzuchtkultur bei A₆₀O von etwa 0,1 beimpft und etwa 12 bis 20 Stunden der Schüttelkultur bei 3O⁰C unterworfen. Die Kultur wurde geerntet, wenn der A^o-Wert etwa 0,2 bis 0,3 betrug (nach etwa 16 bis 20 Stunden). Die Ernte erfolgte durch 5minütige Zentrifugation bei 1500 g unter Verwendung einer DAMON IEC DPR-6000-Zentrifuge.

Zur Herstellung von Sphäroplasten wurden die Zellen einmal in 10ml sterilem Wasser (eine Zentrifugation wurde auf die vorstehend beschriebene Weise nach jedem Waschvorgang durchgeführt), einmal in 10 ml frisch hergestelltem SED, einmal in 10ml sterilem 1 m Sorbitgewaschen und in 5ml SCE-Puffer resuspendiert. 5μΙ an 4mg/ml Zymolyase 60000 (Miles Laboratories) wurden zugesetzt, und die Zellen wurden etwa 30 Minuten bei 3O⁰C inkubiert.

Die Sphäroplastenbildung wurde folgendermaßen überwacht. ΙΟΟμΙ-Aliquotanteile der Zellen wurden zu 900μ15% SDS und 9OpHm Sorbit vor und unmittelbar nach der Zugabe der Zymolyase und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Inkubationsdauer gegeben. Die Inkubation wurde zu dem Zeitpunkt abgebrochen, an dem eine Lysis der Zellen in SDS aber nicht in Sorbit erfolgte. Nach der Bildung wurden die Sphäroplasten einmal in 10ml sterilem 1 m Sorbit durch 5- bis 10minütige Zentrifugation bei 1000g und ei.imal in 10ml sterilem CaS durch Zentrifugation gewaschen und in 0,6ml CaS resuspendiert.

Für die tatsächliche Transformation wurden DNA-Proben in Wasser oder TE-Puffer (bis zu 20μΙ Gesamtvolumen) in 12x 75ml sterile Polypropylenröhrchen gegeben. (Bei kleinen Mengen an DNA erfolgt eine maximale Transformation unter Verwendung von etwa 1 μΙ 5mg/ml der Ultraschallbeht .dlung unterworfener E.coli-DNA in den einzelnen Proben). ΙΟΟμΙ Sphäroplasten wurden zu den einzelnen DNA-Proben gegi *en und etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiort. Die Proben wurden jeweils

mit 1ml PEG-Lösung versetzt und etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurden die Pi üben 5 bis 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die Pellets wurden in 150 μΙ SOS resuspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 850 μ! steriles 1 m Sorbit wurde jeweils zugesetzt. Die Proben wurden auf die vorstehend beschriebene Weise ausgestrichen.

10ml Regenerationsagar wurden pro Platte mindestens 30 Minuten vor Fertigstellung der Transformationsproben gegossen, und 10ml-Aliquotanteile an Regenerationsagar wurden auch auf Röhrchen in einem Bad von 45 bis 50°C während uer Zeitdauer verteilt, in der sich die Transformationsproben in SOS befanden. Sodann wurden die Proben zu den Röhrchen gegeben, auf Platten mit einem Gehalt an einer festen Bodenagarschicht gegossen und 3 bis 5 Tage bei 3O⁰C inkubiert. Die Sphäroplaatenquaiität wurde auf folgende Weise zu verschiedenen Zeitpunkten ermittp't. 10 μΙ Probe wurden entfernt und 10Ofach durch Zugabe von 990μ11 m Sorbit verdünnt. 10μΙ der Verdünnung wurden enttarnt, und ein weiteres 990 μΙ Aliquotanteil von 1 m Sorbit wurde zugegeben. 100μΙ der beiden Verdünnungen wurden auf YPD-Agarmedium ausgestrichen, um die Konzentration an nicht der Sphäroplastenbildung unterlegenen Gesamtzellen, die in der Präparation verblieben waren, zu bestimmen. 100μΙ der jeweiligen Verdünnungen wurden zu 10μΙ Regenerationsagar gegeben, der mit 40 |jg/ml an sämtlichen vom Wirt benötigten Aminosäuren supplementiert war, um die gesamten regenerierbaren Sphäroplasten /u bestimmen. Gute Werte für ein Transformationsexperiment waren 1 bis 3 x 10⁷ gesamte regenerierbare Sphäroplasten/ml und etwa 1 χ 10³ Vollzellen/ml.

Beispiel III

Konstruktion vom MC 100-3 (pYM5)

Etwa 10μςρΒΗ322 wurden mit BamHI verdaut und dephosphorylibrt. Etwa 40μςρΥϋ8 (NRRL B-15889), das das PichiaHIS4-Gen enthielt, wurde mit BgI Il verdaut. Ein 2,7 kb-BglIl-Fragment wurde aus einem 0,8% prSparativen Agarosegel isoliert. 300 ng des Fragments und 300ng an BamH l-verdautem pBR322 wurden unter Verwendung von 0,!> Einheiten an T4-DNA-Ligase in 10μΙ Gesamtvolumen von 66 millimolar Tris · HCI, pH-Wert 7,4,6,6 millimole: MgCI₂,10 millimolar DTT und 0,4 millimolar ATP bei 24stündiger Behandlung bei 4°C verknüpft.

Die Ligationsreaktion wurde zur Transformation von E.coli MC 1061 zur Erzielung von Ampicillinresistenz genäß der Beschreibung in Beispiel V verwendet. Die Transformanten wurden durch Restriktionsverdauungen charakte. ,siert. We korrekte Insertgröße und Orientierung wurde durch Agaiosegel-Elektrophorese bestätigt. Dieses Plasmid wurde als pYM 5 bezeichnet. Es wurde aus E. coli unter Anwendung der alkalisc ten Lysis-Plasmidherstellungstechnik gemäß T. Maniatis, E. F. Fritsch und J.Sambroox, (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y, gewonnen.

Etwa 10pgpYM5 wurden vor der Transformation von MC100-3 mit Stu I verdaut. Diese Stufe brachte das Plasmid zur Integration an einer der in MC 100-3 vorhandenen HIS4-Gensequenzen, entweder um nativen HIS4-Ort oder dem modifizierten ÄOX2-Ort.

Die Transformation wurde gemäß den in Beispiel Il beschriebenen Verfahren durchgeführt.

DNAs aus mehreren MC100-3 (pYM5) - His⁺-Transformanten wurden gemäß Beispiel IV isoliert und dem Screening durch Southern-Filterhybridisierung auf Transformaten, die pYM 5 an dem bei AOX 2 befindlichen HIS4-Fragment integriert enthielten, unterworfen. Folgende speziellen Sonden wurden verwendet: pPG3.0 (NRRL B-18022), eine AOX2-spezifische Sonde; und pYJ30 (NRRL B-15890), eine HIS4-spezifische Sonde.

Eigenschaften des Alkohol-oxldase Il-Regulationsberelchs

Beispiel IV Hefe-DNA-Präparation

Hefezellon wurden in 100ml YNB-Medium plus 2% Dextrose bei 3O⁰C gezüchtet, bis sich ein A₆₀O-WeH von 1 bis 2 ergab. Anschließend wurde 5 Minuten bei 2000g unter Verwendung einer Damon IEC DPR-6000-Zentrifuge pelletisiert. Das Pellet wurde einmal in dH₂O, einmal in SED und einmal in 1 m Sorbit gewaschen und sodann in 5ml einer Lösung von 0,1 m Tris · HCI vom pH-Wert 7,0 und 1 m Sorbit resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit 50 bis 100μΙ einer 4μ9/ΓηΙ-1.03υη9 an Zymolyase 60000 (Miles Laboratories) vermischt und 1 Stunde bei 3O⁰C inkubiert. Die erhaltenen Sphäroplasten wurden sodann 5 bis 10 Minuten bei 1000g zentrifugiert und in 5ml Lysis-Puffer (0,1 % SDS, 10 millimolar Tris HCL (pH-Wert 7,4), 5 millimolar EDTA und 50 millimolar NaCI) suspendiert. Proteinaso K (Boehringer Mannheim) und RNase A (Sigma) wurden jeweils zu ΙΟΟμρ/ΓηΙ gegeben, und die Lösung wurde 30 Minuten bei 37⁰C inkubiert. DNA wurde durch mäßiges Mischen der Präparation mit einem gleichen Volumen an Chloroform mit einem Gehalt an Iso.mylalkohol (24:1, Vol./Vol.) deproteinisiert. Die Phasen wurden durch 20minütige Zentrifugation bei 12000g getrennt. Die obere (wäßrige) Phase wurde in ein frisches Röhrchen abgezogen und mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert. Die Phasen wurden auf die vorstehend beschriebene Weise getrennt. Die obere Phase wurde in ein Röhrchen, das das 2- bis 3fache Volumen an kaltem 100% Ethanol enthielt, gebracht. Die Probe wurde sodann vorsichtig vermischt, und DNA wurde durch Aufspulen auf einen Plastikstab gewonnen. Die DNA wurde sofort in 1 ml TE-Puffer gelöst und über Nacht bei 4⁰C gegen das lOOfache Volumen an TE-Puffer dialysiert.

Beispiel V

Konstruktion von pMR4

DNA wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel IV aus einer in Beispiel III erzeugten MC 100-3 (pYM 5) His⁺· Fransformanten isoliert. 10μς dieser Genom-DNA wurden mit Hindill verdaut und verknüpft. Die Verknüpfungsreaktion wuide 24h bei 4°C in 66 millimolarem Tris · HCI, pH-Wert 7,4,6,6 millimolar MgCI₂,10 millimolar DTT, 0,4 millimolar ATP und 0,5 Einheiten an T4-DNA-Ligase durchgeführt.

Das Ligationsgemisch wurde direkt in E.coli MC 1061 -Zellen transformed, die gemäß Maniatis et al. (a. a. O.) für die Transformation kompetent gemacht und transformiert worden waren. Die Selektion auf Amplicillinresisteni wurde durch Züchten der Zellen entweder in LB-Medium oder 2 B-Medium (0,2% NH₄PO₄,1,2% Na₂HPO₄,0,013% MgSO₄ · 7H₂0,0,074% CaCI₂ · 2H₂0,1 μg/ml Thiamin, 0,4% Dextrose, supplementiert mit 50μg/ml Ampicillin, durchgeführt.

Ein 12,0kb-Plasmid, bezeichnet als pMR4, wurde gemäß Maniatis et al. (a.a.O.) gewonnen. Dieses Plasmid enthielt 5,3kb der DNA5' von der AOX2-KpnI-Stelle, 2,7kb des Pichia HIS4-Gens und 4,0kb an pBR322.

Beispiel Vi Konstruktion von pYJ55

Um die Regulction und Expression des AOX2-Promotors zu bestimmen, wurde ein Vektor, der die AOX2 5'-Sequenz verschmolzen mit dem E. coli lacZ-Gen enthielt, konstruiert. 50 μρ pMR/. (Beispiel V) wurden gemäß den Angaben des Herstellers mit BgII' nd BamHI verdaut. Ein 1,8 kb-Bglll-BamHI-Fragment mit einen-! Gehaii nn dem AOX2-Promotor wurde aus einem 0,8% präparr in Agarosegel isoliert. 10pg pBPf 1 (NRRL B-15892) wurden mit BamHI verdaut und unter Verwendung von alkalischer Phosphin se in 50μΙ Reakticnsvolumen dephosphoryliort (1U Enzym 1 Stunde bei 37⁰C in 50 milllmolar Tris HCI, pH-Wert, 9,0,

1 miliimolar MgCI₂,100 mikromolar ZnCI₂,1 miliimolar Spermidin).

300ng des 1,8kb-Fragments und 300ng an pBPf 1 wurden auf folgende Weise mit T4-Ligase verknüpft. Die Ligationsreaktion wurde 1 Stunde bei 23⁰C in einem Reaktionsvolumen von 10μΙ mit einem Gehalt an 66 miliimolar Tris HCI, pH-Wert 7,6,5 miliimolar MgCI₂,5 miliimolar Dithiothreit, 1 miliimolar ATP und 1 Welss-Einheit an T4-Ligase durchgeführt. Der erhaltene Vektor wurde mit pYJ38 bezeichnet.

Eine neue Smal-Restriktionsstelle wurde in pYJ 38 auf folgende Weise geschaffen. Ein Adaptor-Oligonucleotid wurde unter Verwendung eines Applied Bioystems DNA-Synthesegeräts Modell 380 A unter Verwendung der Cyanoäthylphoramidit-Chemie synthetisiert:

5'-GATCACCCGGOT-3'

10μς an P^YJ 33 wurden mit BamHI verdaut und auf die vorstehend angegebene Weise mit alkalischer Phosphatase behandelt. 1 Mg des vorstehenden Adaptors und 0,1 Mg an BamHI-verdautem pYJ 38 wurden unter Verwendung von T4-Ligase auf die vorstehend beschriebene Weise verknüpft. De; modifizierte Vektor wurde mit pYJ45 bezeichnet. Vm 1,8kb-Smal-Fragmentmit einem Gehalt an dem modifizierten AOX2-Promotor wurde durch Verdauen von 50μρ ρYJ 45 mit Smal erhalten. Das Fragment wurde aus einem 0,8%präparativen Agarosegel isoliert. 0,3Mg des Fragments und 0,3 μς an Smal-verdautem pBPf 1 wurden auf die vorstehende Weise zur Schaffung des Vektors pYJ 46 verknüpft. Ein 0,3 kb EcoRI-Fragment wurde vom 5'-Ende des AOX 2-Se jments in pYJ46auf folgende Weise deletiert. 10MgpYJ46 wurden auf die vorstehend beschriebene Weise mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Ein getrennter 50 μρ Aliquotanteil von pYJ 46 wurde ebenfalls mit EcoRI verdaut und ein 1,5 kb-Fragment wurde aus einem 0,8% präparativen Agarosogel isoliert. Jeweils etwa 0,3 Mg an der Phosphatasebehandlung unterworfenem pYJ 46 und der,ι isolierten Fragment wurden auf die vorstehend beschriebene Weise verknüpft und in E. coli transformiert. Ein Plasmid, das die korrekte Struktur aufwies, wurde isoliert und als pYJ 55 bezeichnet.

Beispiel VII Entwicklung des Stamms GS115 (pYJ 55)

Pichia pastoris GS115, ein Histidin-auxotropher Stamm (NRRL Y-15851; his4) wurde gemäß Beispiel Il mit dem Plasmid pYJ 55 (Beispiel Vl) transformiert. Genom-DNAs aus stabilen His⁺-Stämmen wurden durch Southern-Filterhybridisierung analysiert, um die Stellung des Plasmids zu bestimmen. Eine Transformante, bei der pYJ 55 am HIS4-Ort integriert war, wurde als GS115 (pYJ 55) bezeichnet.

Beispiel VIII Vergleich der AOX1- und AOX2-Promotoren

Die Regulation und Expression der AOX1- und AOX2-Promotoren wurden durch Bestimmung der ß-Galactosidaseaktivität der Stämme GS115 (pSAOH 5) und GS115 (pYJ 55) verglichen. 100ml-Kulturen der Stämme wurden jeweils in YNB plus 1 % Glycerinmedium für 24 Stunden bei 3O⁰C gezüchtet, auf YNB-Medium ohne eine Kohlenstoffquelle übertragen und dort 24 Stunden bei 30 °C inkubiert, sodann auf ein YNB-Medium mit 0,5% Methanol übertragen und dort 50 Stunden bei 3O⁰C inkubiert. Proben der einzelnen Kulturen wurden zu folgenden Zeitpunkten entnommen:;!) Nach 24 Stunden im Glycerinmedium, 2) nach 24 Stunden im Medium ohne Kohlenstoff und 3) nach 24 und 50 Stunden im Methanolmedium. Extrakte wurden hergestellt und auf die nachstehend beschriebene Weise auf ihre ß-Galactosidase-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle Il zusamrr engestellt.

Tabelle Il	16,1g	Endkonzentration
ß-Galactosidase-Test	5,5 g	0,06 m
1) Erforderliche Lösung:	0,75 g	0,04 m
Z-Puffer:	0,246 g	0,01 m
Na2HPO4-7H2O	2,7 ml	0,001 m
NaH2PO4		0,05 m
KCI
MgSO4-7H2O
2-Mercaptoethanol

Auffüllen auf 1 Liter; der pH-Wert soll 7 betragen.

O-Nltrophenyl-ß-D-galactosid (ONPG):

Lösen von 400mg ONPG (Sigma N-1127) in 100ml destilliertem Wasser ^ur Bildung einer ONPG-Lösung von 4mg/ml.

2) Zellfreies Proteinextraktpräparat

Die einzelnen Proben wurden einmal in dH₂O und einmal in Lysispuffer gewaschen und in Lysispuffer in einer Konzentration von 15OA«oo/ml resuspendiert. 0,5g Glasporlen wurden zu einer Aliquotprobe von 350 μΙ gegeben. Das Gemisch wurde viermal 60 Sekunden heftig gerührt, wobei jeweils Rührpause.i von 1 Minute auf Eis eingehalten wurden. Die Zellaufschlämmung wurde von den (*!,isperlen entfernt. Die Suspension wurde 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde z'.im Testen auf sin Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Die Menge an Gesamtprotein im je\ -ligen Extrakt wurde gemäß dem Bradford-Testverfahren (Bio-Rad) bestimmt. BSA diente als Proteiristandard.

3) Testverfahren

1 bis 50μΙ zollfreies Proteinextrakt wurden ι u'i ml Z-Puffer gegeben. Das Gemisch wurde sodann heftig gerührt und 5 Minuten bei 3O⁰C inkubiert. Sodann wurde die Umsetzung durch Zugabe von 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) ei (geleitet. C.bml einer 1m Na₃Cu₃-Lösung v/urden zum Stoppen der Reaktion zu einem geeigneten Zeitpunkt (A420 > 1) zugesetzt. Die Absorption bei 420nm wurde sodann shgelesen.

4) Berechnung der ß-Galactosld se-Aktlvitatselnhelten

1U = 1 nMol an pro 1 Minute bei 3O⁰C und einem pH-Wert von 7 gebildetem Orthunitrophenol (ONP). 1 i.Mol ONP weist eine Absorption bei420nm (A420) von 0,0045 bⁿ\1 cm Schichtdicke auf. Daher bodeutet t .1 .Absorptionswert von 1 bei 420nm 222 nMol ONP/ml oder 378nMol 0NP/1,7ml (das Gesamtvolu.nen des zu analysierenden I 'oerstands betrug 1,7 ml). Die in Tabelle Ii angegebenen Einheiten wurden folgendermaßen berechnet:

U= -^f-X 378 t(min)

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstollung einer DNA-Sequenz, die für einen Alkohol-oxidase Il-Regulationsbereich einer methylotrophen Hefe kodiert, sowie von funktioneilen Mutanten davon, wobei der Regulationsbereich auf die Anwesenheit von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle für die Wirtszelle reagiert und wobei die Sequenz zwischen der ersten ExoRI-Stelle vom 5'-Ende und dem Startcodon «ids AOX2-Strukturgens, wie in der Restriktionskarte von Fig. 1 (b) gezeigt, enthalten ist, dadurch gekennzeichnet, daß man den Regi.ationsbereich durch Transformation von Pichia pastoris gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA folgende Sequenz aufweist:

-1490 -1470

TCCATCTTCTACCGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT

-1450 -1430 -1410

CTnATTCTTTTATGA'fTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT

-1390 -1370 -1350

TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA

-1330 -1310 -1290

GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT

-1270 -1250 -1230

CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG

-1210 -1190 -1170

TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAiUMTATAACACTTCGAGTAAGATACC

-1150 -1130 -1110

CCCAATTGAAGGCTACGAUATACCAGACTATC¹ACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAg

-1090 -1070 ' -1050

CAGATCAAATATCCATnATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA

-1030 ' -1010 -990

AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT

-970 -950 -930

AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT

-910 -890 -870

CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA

-850 -830 . -810

CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA

-790 -WO -750

AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG

-730 -710 -690

TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG

-670 · -650 -630

AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA

-610 -590 -570

TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC

-550 -530 -510

TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAG/ 3ACAGT

-490 -470 -450

TAAGCGAAAGAGACAAGACAACCAACAGCAAAACTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC

-430 -410 -390

AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT

-370 -350 -330

ctccttgcaaacaatgcaagttgataagacatcaccttccaagataggctatttttgtcg