DK175822B1 - Renset DNA-sekvens, som koder for en gæralkoholoxidase II-genregulatorregion - Google Patents

Description

• i DK 175822 B1

Den foreliggende opfindelse angår en renset DNA-sek-vens, som koder for en gær-alkoholoxidase Il-gen-regulator-region

Opfindelsen vedrører generelt manipulering af genetisk 5 materiale, især regulering af hyppigheden for transcription af RNA fra DNA.

Efterhånden som den rekombinante DNA-bioteknologi har udviklet sig i de senere år, er en reguleret produktion af celler af en enorm mængde forskellige nyttige polypeptider 10 blevet mulig. Mange eucaryotiske polypeptider, f.eks. menneskeligt væksthormon, leucocyt-interferoner, humant insulin og humant proinsulin, er blevet produceret af forskellige mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse af de metoder, man allerede råder over, forventes i fremtiden at føre til 15 rekombinant produktion af en række forskellige andre nyttige polypeptidprodukter.

De grundlæggende metoder, der anvendes inden for den rekombinante teknologi, er kendt af fagfolk på området. De elementer, der helst skal være til stede for udøvelsen af 20 rekombinant DNA-bioteknologi, omfatter, men er ikke begrænset til: (1) et gen, der koder for et eller flere ønskede polypeptider, operationsmæssigt forbundet (’Operationsmæssigt forbundet" refererer til sidestilling, hvor komponenterne 25 er udformet, så at de kan udføre deres sædvanlige funktion) med passende kontrolsekvenser, der er nødvendige for ekspression i værtscellen; (2) en vektor, i reglen et plasmid, hvori en nucleo-tidsekvens kan indsættes. En vektor er en hvilken som helst 30 konstruktion, der indeholder en nucleotidsekvens, og som kan transformere en vært; (3) en passende vært, hvori den ønskede nucleotidsekvens kan overføres, og hvor værten også har det cellulære apparat, der kan udtrykke den information, som den overførte 35 nucleotidsekvens koder for.

Et grundelement, der anvendes inden for rekombinant DK 175822 B1 2 i teknologi, er plasmidet, som er cirkulær ekstrachromosomal ; dobbeltstrenget DNA, der først blev fundet i mikroorganismer, j Plasmider har vist sig at forekomme i flere kopier pr. celle.

Foruden naturligt forekommende plasmider er der blevet frem-5 stillet en række forskellige menneskeskabte plasmider. Inkluderet i plasmidet er information, der er nødvendig for plasmidreproduktion, dvs. en autonom replikerende sekvens og/eller et replikationsudgangspunkt. Et eller flere midler til phænotypisk af udvælge plasmidet i transformerede celler 10 kan også være inkluderet i de informationer, der er indkodet i plasmidet. De phænotypiske markørudvælgelseskarakteristika, såsom resistens over for antibiotica, gør, at kloner af værtscellen, der indeholer det pågældende plasmid, kan genkendes og udvælges ved præferencedyrkning af cellerne i 15 selektive medier. Vektorer eller plasmider kan spaltes specifikt af én eller flere restriktionsendonucleaser eller restriktionsenzymer, der hver genkender en specifik nucleo-1 tidsekvens. Derefter kan man indsætte en regulatorregion, der er operationsmæssigt forbundet med et heterologt gen, 20 dvs. et gen, der ikke forekommer naturligt kombineret med regulatorregionen, eller andre nucleotidsekvenser ved ope-j rationsmæssigt at forbinde det ønskede genetiske materiale ' i spaltningsstedet eller i rekonstruerede ender ved siden af spaltningsstedet.

25 Derpå indføres vektoren i en værtscelle, hvor dens nucleotidsekvens kan dirigere værten til at udføre forskellige processer eller funktioner. Nogle få eksempler omfatter ekspression af heterologe polypeptider eller over-ekspression , af homologe eller heterologe polypeptider. Processen med i 30 nucleotidindførelsen i værtscellen kaldes i reglen transformation. Man kan få store mængder af vektoren ved at indføre vektoren i en passende vært for at forøge dens kopiantal.

En værtscelle, der almindeligvis anvendes til at forøge vektorens kopiantal, er E.coli. Derpå isoleres vektorerne 35 fra den første vært og indføres i en anden værtscelle, hvor de ønskede vektor-dirigerede aktiviteter vil forekomme, 3 DK 175822 B1 f.eks. produktionen af et polypeptid. Produktionen af et slutprodukt ud fra DNA på denne måde omtales som ekspression.

Når genet er korrekt indsat i vektoren med hensyn til de dele af vektoren, som styrer transcription og translation 5 af den indkodede nucleotidsekvens, kan den opnåede vektor anvendes til at styre produktionen af polypeptidsekvensen, som det indsatte gen koder for.

Ekspression kontrolleres af en regulatorregion. Regulatorregioner er heterogene nucleotidsekvenser, som rea-10 gerer på forskellige stimuli og påvirker hyppigheden af RNA-transcript ion. Ekspression kan afbrydes eller igangsættes som reaktion på stimuli. Ekspression, der igangsættes som reaktion på en stimulus, omtales som reglen som derepression eller induktion. Nogle få eksempler på inducerbare ekspres-15 sionssystemer er AOX1-systemet i Pichia pastoris, de østrogene systemer i Xenopus laevis, og de metallothioneine systemer hos aber, mennesker, hamstere, mus og rotter. Inducerbare ekspressionssystemer er i reglen under strengere kontrol end konstitutive systemer. Disse systemer er vel-20 egnede til genetiske manipulationer.

I praksis kan anvendelsen af rekombinant DNA-biotek-nologi skabe celler, der kan udtrykke heterologe nucleotidsekvenser. Heterologe nucleotidsekvenser er nucleotidsekvenser, som ikke forekommer naturligt i værten. Eksempler 25 herpå kunne være nye kombinationer af regulatorregioner, der forekommer naturligt i værten, sammen med strukturelle gener, der ikke er naturligt associeret med denne regulatorregion. Et andet eksempel ville være kombinationen af en regulatorregion med et gen, der ikke forekommer naturligt i 30 værten. Det heterologe polypeptid kan produceres som et fusionspolypeptid, dvs. et heterologt polypeptid, der er fusioneret med en del af aminosyresekvensen i et homologt eller heterologt polypeptid. Det fusionspolypeptidprodukt, der opnås til at begynde med, produceres undertiden i en 35 inaktiv form, indtil det fusionerede polypeptid spaltes i et ekstracellulært miljø.

i DK 175822 B1 4

Som tidligere anført i Europa-patentansøgning nr.

86 114.700,7, koder Pichia pastoris-genomet for to funktionelle alkoholoxidase-gener AOX1 og AOX2.

Det har nu vist sig, at en 51 -regulatorregion as-5 socieret med det strukturelle AOX2-gen kan induceres ved hjælp af methanol eller ved carbonkilde-udsultning. Imidlertid er maksimumsekspressionsniveauet fra AOX2-regulatorregionen kun ca. 5-11% af AOX1-regulatorregionens (AOX1-genet er omtalt i Europa-patentansøgning nr. 85.201.235,0).

10 AOX2-regulatorregionen kan anvendes til at udtrykke heterologe gener og er særlig værdifuld, når ekspression på et højt niveau af et protein er uheldig.

Ifølge den foreliggende opfindelse er der nu isoleret og karakteriseret en DNA-sekvens, som regulerer hyppigheden 15 af transcriptionen af DNA til RNA. De hidtil ukendte DNA-sekvenser ifølge opfindelsen er anvendelige til fremstilling af polypeptidprodukter ved hjælp af methylotrophe gærarter, såsom Pichia pastoris.

Opfindelsen angår således en renset DNA-sekvens, som 20 er ejendommelig ved, at den koder for en sekvens, som støder op til 5'-enden af methylotroph gær-alkoholoxidase Il-gen, hvorved sekvensen reagerer på tilstedeværelsen af methanol som eneste carbonkilde for værtscellen, og at sekvensen indeholdes mellem startcodonet for et strukturelt AOX2-gen 25 og det første EcoRI-sted af 5'-enden som vist i restriktionskortet i fig. 1(b), og funktionelle mutanter i den beskrevne regulatorregion af AOX2, som omfatter en DNA-sekvens afkortet ved 5'-enden.

Opfindelsen angår også en renset DNA-sekvens, der 30 koder for en gær-alkoholoxidase II-regulatorregion, som er ejendommelig ved, at DNA-sekvensen er som anført i krav 2.

Opfindelsen vil blive beskrevet ved hjælp af tegningen, på hvilken fig. 1 er et restriktionskort over AOXl-(a) og A0X2-35 (b)-generne, fig. 2 er et restriktionskort over pBR322, 5 DK 175822 B1 fig. 3 er et restriktionskort over pYJ8, i fig. 4 er et restriktionskort over plasmid pYM5, fig. 5 er et restriktionskort over plasmid pMR4, fig. 6 er et skema over konstruktionen af pMR4, 5 fig. 7 er et restriktionskort over plasmid pBPfl, fig. 8 er et restriktionskort over plasmid pYJ55, fig. 9 er et skema over konstruktionen af plasmid pYJ55, og fig. 10 er et restriktionskort over plasmid pSAOH5.

10 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en hidtil ukendt dna-sekvens, der indeholder en regulatorregion, som reagerer på mindst én af følgende betingelser.: tilstedeværelsen af methanol i værtsmiljøet eller carbonkil-deudsultning, når værtscellen dyrkes på andre substrater 15 end methanol. Regulatorregionen kan regulere hyppigheden af RNA-transcriptionen, når den bindes operationsmæssigt i 5'-enden af en DNA-sekvens, som koder for produktionen af mRNA. Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende.

20 Karakterisering af alkoholoxidase-regulatorregionen

Det fuldstændige A0X2-gen findes i restriktionskortet j i fig. 1(b). AOX2-regulatorregionen ses mellem det første

EcoRI-sted fra 5'-enden og det strukturelle A0X2-gens start-codon, som det fremgår af restriktionskortet i fig. 1(b). Den 25 del af DNA-sekvensen, der koder for alkoholoxidase-II-proteinet, er angivet ved en tyk streg under restriktionskortet.

Til sammenligning af de to gener findes der et restriktionskort over alkoholoxidase I-genet, fig. 1(a). Der iagttages ingen signifikant sekvenshomologi uden for genernes protein-30 kodende del.

AOX2-Regulatorregionen er yderligere karakteriseret af en lacZ-fusionskonstruktion, der kun behøver at være fra basepar ca. -1500 til basepar ca. -1 for at have regulatoraktivitet (som vist i tabel I) . Nucleotidsekvensen for et 35 DNA-fragment, der indeholder AOX2-regulatorregionen, ses i tabel I, nedenfor.

DK 175822 B1 6

TABEL I

AOX2-regulatorregion og 5’-utranslateret region -1750 -1730 -1710 5 ggatctcaaaaacctaagtacttcatttgaatataactctgcacctaaatttacacctaa -1690 -1670 -1650 CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA -1630 -1610 -1590 CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC 10 -1570 -1550 -1530 ACGCATAACGTCCCCAGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT -1510 -1490 -1470 TTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT -1450 -1430 -1410 15 CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT -1390 -1370 -1350 TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA -1330 -1310 -1290 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT 20 -1270 -1250 -1230 CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG -1210 -1190 -1170 TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG -1150 -1130 -1110 25 cccaattgaaggctacgagataccagactatcactagtagaactttgacatctgctaaag -1090 -1070 -1050 cagatcaaatatccatttatccagaatcaattaccttcctttagcttgtcgaaggcatga -1030 -1010 -990 aaaagctacatgaaaatccccatccttgaagttttgtcagcttaaaggactccatttcct 30 -970 -950 -930 i

; AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT

-910 -890 -870 CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA -850 -830 -810

3 5 CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA

7 ! i DK 175822 B1 -790 -770 -750 AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG -730 -710 -690 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG 5 -670 -650 -630 AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA -610 -590 -570 TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC -550 -530 -510 10 TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT -490 -470 -450 TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC -430 -410 -390 AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT 15 -370 -350 -330 CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG -310 -290 -270 CATAAATTTTTGTCTGGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT -250 -230 -210 2 0 ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA -190 -170 -150 AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA -130 -110 -90 AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT 25 -70 -50 -30

CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA

-10

AACAAATCAACTGAGAAAA

8 DK 175822 B1 ! A0X2-Regulatorregionen reagerer på mindst én af føl gende betingelser: tilstedeværelsen af methanol som eneste carbonkilde for methylotrophe gærværter, såsom Pichia pastoris, eller carbonkildeudsultning af værtscellerne. Desuden 5 stimulerer A0X2-regulatorregionen ca. 5-11% af β-galactosi-dases proteinproduktion i forhold til AOXl-regulatorregionen.

II. Isolering af alkoholoxidase II-requlatorreqionen fra Pichia pastoris 10 A0X2-Regulatorregionen isoleres ved at transformere

Pichia stamme MC100-3 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A:Phis4).

Denne stamme indeholder en mutant kopi af Pichia HIS4-genet i indsat i A0X2-genet. MC100-3 transformeres med pYM5, et plasmid sammensat af et 2,7 kb stort Bglll-fragment indehol-15 dende Pichia HIS4-genet indsat i pBR322's BamHI-sted. DNAer fra flere MC100-3 (pYM5) His+-transformanter screenes ved Southern-filterhybridisering for transformanter, som indeholder pYM5 integreret med dette HIS4-fragment anbragt i MClOO-3's A0X2-sted. DNA1 en fra én af disse stammer fordøjes 20 derpå med HindiII, hvilket resulterer i frigørelsen af et genomt fragment på ca. 12 kb, der indeholder 5,3 kb af sekvensen 5' for AOX2 Κρη I-stedet, 2,7 kb af Pichia HIS4-genet og 4,0 kb af pBR322. Med Hindlll skåret DNA ligeres og transformeres ind i E.coli. Transformanter udvælges ved 25 hjælp af ampicillinresistens. Der udvindes et plasmid, pMR4, og et restriktionskort over dette plasmid ses i fig. 5.

Ill AOX2-regulatorregionens egenskaber

For at sammenligne AOX2-regulatorregionens ekspression 30 med AOXl1 s konstrueres en AOX2-lac2-ekspressionsvektor, som så meget som muligt ligner pSA0H5 (vist i fig. 10), en AOX1-lacZ-fusionsvektor. Skemaet for konstruktion af AOX2-lacZ-vektoren, pYJ55, ses i fig. 9. Foreløbige DNA-sekvensdata fra A0X2’s 5'-ende afslører, at AOX2 indeholder to BamHl-35 steder i stillinger i det strukturelle gen, der er identiske med dem, der findes i strukturelt AOXl-gen. Det første trin 9 DK 175822 B1 i konstruktionen af pYJ55 er derfor at indsætte et 1,8 kb stort BglII-BamHI-fragment, som indeholder A0X2-regulatorregionen og 45 basepar af den amino-terminale proteinkodende sekvens, i BamHI-stedet i pBPfl for at danne pYJ38. Det 5 andet trin er at skære pYJ38 med BamHI og indsætte det samme adaptor-oligonucleotid, som blev indsat til konstruktion af A0X1-lacZ-vektoren (51-GATCACCCGGGT-3'). Indsættelsen af denne adaptor ødelægger pYJ38's BamHI-sted og danner et nyt Smal-sted i indsættelsespunktet. Dette plasmid, pYJ45, for-10 døjes med Smal, og det 1,8 kb store Smal-fragment, der indeholder den modificerede A0X2-promotor, indsættes i pBPfl for at skabe plasmid pYJ46. Plasmid pYJ46 fordøjes med EcoRI for at fjerne et 0,3 kb stort fragment på 5’-enden af AOX2-fragmentet i pYJ46. Plasmidet religeres for at skabe plasmid 15 pYJ55. I fig. 8 ses et restriktionskort over plasmid pYJ55.

Plasmid pYJ55 transformeres ind i GS115 (his4), og His+-transformanter screenes for en stabil His+-phænotype, hvilket viser tilstedeværelsen' af et integreret plasmid. Genome DNA'er fra flere stabile His+-stammer analyseres ved 20 hjælp af Southern-filterhybridisering for at bekræfte tilstedeværelsen og fastslå plasmidets lokalisering.

For at få et skøn over AOX1- og AOX2-promotorernes relative styrke sammenlignes β-galactosidase produceret af pYJ55 og pSOH5 ved at transformere disse plasmider ind i 25 GS115. De transformerede GS115- stammer betegnes hhv. GS115- (pYJ55) og GS115(pSAOHS). Hver stamme indeholder plasmid integreret i HIS4-stedet. Celler af hver stamme dyrkes i glycerolmedium, flyttes til et medium uden carbonkilde i 24 timer og flyttes derpå til et medium med methanol i yder-30 ligere 50 timer. Prøver af hver kultur fjernes, når vækstfasen er sluttet, og der fremstilles ekstrakter, der afprøves for β-galactosidase. Resultaterne af disse prøver ses i tabel II.

35 10 DK 175822 B1

TABEL· II

Sammenligning af β-galactosidase-ekspression fra AOX1- og AOX2-lacZ-fusioner β-Galactosidaseaktivitet 5 (enh./ttg) i carbonkilde

Stamme Promotor Glycerol Intet carbon1 Methanol— GS115(pSAOHS) A0X1 <10 955 6.205 GS115(pYJ55) AOX2 <10 109 739 10 1) YNB-medium

Signifikante β-galactosidase-niveauer ses ikke i 15 glycerol-dyrkede celler af hverken AOXl-lacZ- eller AOX2-lacZ-stammen. I mediet uden carbonkilde er aktivitetsniveauet i A0X2-lacZ-stammen ca. 1/10 af det, der iagttages for AOX1-lacZ-stammen. Tilsætningen af methanol til de AOX2-lacZ-holdige celler resulterer i β-galactosidase-niveauer, som 20 når op på ca. 1/9 af AOXl-lacZ-cellernes. AOX1- og A0X2-generne reguleres således på lignende måde. Det eneste afvigende træk er AOX2-regulatorregionens signifikant lavere respons på methanol og carbonkildeudsultning.

Selv om indførelsen af AOX2-regulatorregion^-galac-25 tosidasegen-fusionen ind i en gærværtscelle er beskrevet her, vil fagfolk forstå, at det ikke er nødvendigt for udøvelsen af den foreliggende opfindelse at benytte cirkulære plasmider eller strukturelt β-galactosidase-gen. Der kan således anvendes andre vektorer, der kan opretholdes i gær-30 arter, ved udnyttelsen af denne regulatorregion med andre heterologe gener. Alternativt kan denne regulatorregion, der er operationsmæssigt bundet til andre heterologe gener, integreres i værtsgærcellens chromosom ved hjælp af integrative vektorer. Yderligere kan funktionelle mutanter af AOX2-35 regulatorregionen, som her beskrevet, bestående af kortere DNA-sekvenser fra 5'-enden, også anvendes til at regulere heterolog genekspression.

11 DK 175822 B1

Eksempler

Almene oplysninger vedrørende eksemplerne.

Stammer 5 Pichia pastoris NRLL Y-11430

Pichia pastoris GS115 {his4) NRRL Y-15851 Pichia pastoris PPF1 {arg4 his4) NRRL Y-18017 Pichia pastoris KM7121 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A::PH1S4) NRRL Y-18019 og 10 E. coli MC1061 [F-araD139 Δ(ara ABDlC-leu) 7679AlacX74 galU galK rpsL hsdR).

Medier, puffere og opløsninger 1 M Tris-puffer 121,1 g Tris-base i 800 ml H20; pH justeres 15 til den ønskede værdi ved tilsætning af koncentreret (35%) vandig HC1; opløsningen afkøles til stuetemperatur før endelig pH-justering; fortynd til slutvolumen på 1 liter.

20 TE-puffer 1,0 mM EDTA i 0,01 M Tris-puffer (pH 7,4).

SSC 0,15 M NaCl og 15 mM natriumcitrat justeres til pH 7,0 med NaOH.

TAE 40 mM eddikesyre og 5 mM EDTA i 0,02 M

Tris-puffer (pH 8,3).

25 Denhardt1 s op- 5 g Ficoll, 5 g polyvinylpyrrolidon og 5 g løsning (50x) okseserumalbumin (BSA; Pentax Fraction V) bringes op på et samlet volumen på 500 ml med vand.

20 x SSPE 20 mM EDTA, 0,16 M NaOH, 0,2 M NaH2P04· 30 H20 og 3,6 M NaCl. justeres til pH 7,0 med

NaOH.

LB (Luria-Berta- 5 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gærekstrakt og

ni)-medium 2,5 g NaCl i 1 liter vand justeres til pH

7,5 3 5 med NaOH.

YPD-medium 1% Bacto-gærekstrakt, 2% Bacto-pepton og 2% 12 DK 175822 B1 dekstrose.

YNB-medium 6,75 g gær-nitrogenbase uden aminosyrer (DIFCO) i 1 liter vand.

SED 1 M sorbitol, 25 mM EDTA og 50 mM DTT.

5 SCE-puffer 9,1 g sorbitol, 1,47 g natriumcitrat, 0,168 g EDTA og 50 ml H2O justeres til pH 5,8 med HCl.

CaS 1 M sorbitol og 10 mM CaCl2 filtersterilise res .

10 PEG-opløsning 20% polyethylenglycol-3350, 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) filtersteriliseres.

SOS 1 M sorbitol, 0,3 x YPD-medium og 10 mM

CaCl2 .

Formamid-farve- 0,1% xylencylenol FF, 0,2% bromphenolblåt, 15 blanding 10 mM EDTA og 95% afioniseret formamid.

Topgel 76,8 g urinstof, 14 ml acylamidgrundopløs- ning og 8 ml 10 x TBE bringes til et slut-volumen på 160 ml.

Acrylamid-grund- 38 g acrylamid og 2 g bis(N,N-methylenbisa-20 opløsning crylamid); der tilsættes vand til et samlet volumen på 100 ml.

Bundgel 14,4 g urinstof, 3,0 g saccharose, 7,5 ml 10 x TBE, 4,5 ml acrylamidgrundopløsning og 0,3 ml bromphenolblåtopløsning (0,01 g/ml); 25 der tilsættes vand til et samlet volumen på 30 ml.

dideoxy:

dd ATP 0,125 mM

dd CTP 0,10 mM

30 dd GT? 0,10 mM

dd TT? 0,80 mM

DNTP-grundopløs- 0,5 mM dGTP

ninger 0,5 mM dCTP

0,5 mM TTP

35 0,5 mM dATP

10 x Klenow for- 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 70 mM

13 DK 175822 B1 tyndingspuffer MgCl2 og 1 mM EDTA.

10 x TMD, pH 7,5 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,05 mM MgCl2 i og 0,075 M DTT.

Medmindre andet er anført, repræsenterer de ovennævnte 5 opløsninger den anvendte grundkoncentration (1 x) . Når der i eksemplerne er anvendt forskellige koncentrationsniveauer, er dette anført ved at referere til opløsningen som et multiplum af grund-(1 x)-koncentrationen.

10 Reoenerat ionsaaar 1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g kaliumchlorid og 240 ml H20, autoklaveres.

2) 10 x glucose: 20 g dekstrose og 100 ml H20, autoklaveres .

15 3) 10 x YNB: 6,75 g gærnitrogenbase uden aminosyrer og 100 ml H20 autoklaveres. (Tilsæt eventuel ønsket aminosyre eller nucleinsyre op til en koncentration på 200 Mg/ml før eller efter autoklavering).

4) Tilsæt 3 0 ml 10 x glucose og 30 ml 10 x YNB til 20 240 ml af den smeltede Agar-KCl-opløsning. Tilsæt 0,6 ml 0,2 mg/ml biotin og eventuel anden ønsket aminosyre eller nucleinsyre til en koncentration på 20 ^g/ml. Hold den smeltede regenerationsagar på 55-60°C.

25 Dyrkning af Pichia pastoris P,pastoris dyrkes i YPD-(rig) eller YNB-(minimal)-medium. Efter behov suppleres YNB-medium med carbonkilde (2% dekstrose, 1% glycerol eller 0,5% methanol) og med 50 pg/ml aminosyre.

30

Sekvensbestemmelse DNA-sekvensbestemmelse sker ved hjælp af dideoxynu-cleotid-kædetermineringsmetoden som beskrevet af Sanger m. f1., PNAS 74, 5463 (1977).

35 I eksempler anvendes følge forkortelser: EDTA ethylendiamintetraeddikesyre 14 DK 175822 B1 TEMED N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin DTT dithiothreitol BSA okseserumalbumin

EtBr ethidiumbromid 5 Ci Curie dATP deoxyadenosin-triphosphat dGTP deoxyguanosin-triphosphat TTP thymidin-triphosphat dCTP deoxycytidin-triphosphat 10 dXTP "generisk" deoxy-triphosphat-nucleotid oligo(dT)12-18 Kilde: Collaborative Research Inc.

Xymolase 60.000 Kilde: Miles Laboratories.

Isolering af alkoholoxidase-11-reouleringsregionen 15 Eksempel 1

Tilpasning af PPF1 X KM7121 og udvikling af MC100-3

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017) og KM7121 (arg4 his4 aoxlÅ : : SAR.G4 aox2A::PHIS4 (NRRL Y-18019) inokuleres hver fra en frisk YPD-plade i et glas med sterilt 20 vand. Der blandes ca. 5 x 107 celler af hver stamme, lydbølgebehandles i kort tid for at itubryde celleklumper og udbredes på en GNAP-agarplade (5% dekstrose, 2% pepton, 1% gærekstrakt, 0,5% agar og 2,3% næringsagar). En ublandet kontrolprøve af hver stamme (ca. 1 x 10® celler) behandles på 25 samme måde. GNAP-pladerne inkuberes ved 30°C i ca. 24 timer i I og replica-udstryges derefter på sporedannelsesmedium-agar- plader (0,5% Na-acetat, 1% KC1 og 2% agar). Disse plader inkuberes i ca. 20 timer ved 30°C og replica-udstryges derpå på minimal-medium-agarplader uden carbonkilde. Methanol i 30 dampfase tilføres til cellerne på minimalpladerne.

Efter 5 dage er ca. 200 kolonier fremkommet på minimalpladen med de blandede celler. Ingen kolonier udvikler sig på noget tidspunkt på de ublandede kontrolplader, et resultat, der tyder på, at Arg+ His+ Mut+-kolonierne på den j 35 blandede plade er diploide som følge af tilpasningerne af PPF1- og KM7l21-cellerne (Mut+ = methanoludnyttelse). Disse 15 DK 175822 B1

Arg+ His+ Mut+-stammers diploide natur bekræftes ved undersøgelse af AOX-stederne for fire af disse stammer ved hjælp af Southern-filterhybridisering. De særlige sonder, der anvendes, er: pPG3,0 (NRRL B-18022) , en A0X2-specifik sonde,· 5 pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4-specifik sonde; og pPG4,0 (NRRL B-15868), en AOXl-specifik sonde.

For at danne sporer af de PPF1 x KM7l21-diploide udvindes først en koloni (MC100) fra den diploide methanol-medium-udvælgelsesplade. Ca 1 x 106 af disse celler udbredes 10 på GNAP-plader og behandles som beskrevet for tilpasningsproceduren med undtagelse af, at den sporedannende plade inkuberes i fire dag ved 30°C, så at cellerne får lejlighed til komplet sporedannelse. Sporerne udvindes . fra pladerne ved at skylle hver plade med 5 ml sterilt vand. Suspensionen 15 vaskes to gange med 3 ml phosphatpuffer (0,1 M Na3P04, pH 7,5). En blanding af lytiske gærenzymer Glusulase {Endo Laboratories, NY) og Zymolase (60.000 enh./g, Miles Laboratories) og β-mercaptoethanol tilsættes til slutkoncentratio-ner på hhv. 2% (vo/vo) , 0,5 mg/ml og 0,1% for at ødelægge 20 vegetative celler. Blandingen inkuberes i 5 timer ved 30°C.

Sporepræparationen vaskes derpå to gange i sterilt vand indeholdende 0,2% Tween 80 (vo/vo) og resuspenderes i phosphatpuffer. Præparationen lydbølgebehandles derpå i tre 20-sek.-cycler for at itubryde sporeklumper. En prøve af 25 sporepræparationen fortyndes derpå og bredes ud på ikke-selektive masterplader med minimalt medium med 2,0% glucose og 50 jug/ml af såvel arginin som histidin. Disse inkuberes i 48 timer ved 30°C. Hver masterplade replica-udstryges derpå på følgende serier minimalplader: 1) glucose, -arg, 30 -his, 2) glucose, -arg, +his, 3) glucose, +arg, -his og 4) glucose, +arg, +his.

Efter inkubation i 24 timer ved 30°C undersøges kolonierne for Arg- og His-phænotyper. Kolonier, der er Arg+

His" afprøves derpå for vækst på methanol ved udstrygning 35 på YNB-methanolagarplader. Efter ca. 1 uge ved stuetemperatur undersøges pladerne for Mut-phænotype. Én Arg+ His- Mut-- 16 DK 175822 B1 stamme betegnes MC100-3.

Eksempel 2 5 Transformation af Pichia pastoris Gærceller inokuleres i ca. 10 ml YPD-medium og ry stedyrkes ved 30°C i 12-20 timer. Cellerne fortyndes derpå til Agoø ca. 0,01-0,1 og holdes i log-fase i YPD-medium ved 30°C i ca. 6-8 timer. 100 ml YPD-medium inokuleres med 0,5 10 ml af podekulturen ved A60o ca. O-1 °9 rystedyrkes ved 30oC i ca. 12-20 timer. Derpå høstes kulturen, når Ag00 er ca. 0,2-0,3 (efter ca. 16-20 timer) ved centrifugering ved brug af en Damon IEC DPR-6000-centrifuge ved 1500 x G i 5 min.

15 Ved fremstilling af sfæroblaster vaskes cellerne én gang i 10 ml sterilt vand {centrifugering foretages efter hver vask som beskrevet ovenfor) , én gang i 10 ml frisk fremstillet SED og én gang i 10 ml steril 1M sorbitol og resuspenderes i 5 ml SCE-puffer. S μΐ 4 mg/ml Zymolase 60.000 20 (Miles Laboratories) tilsættes, og cellerne inkuberes ved 30°C i ca. 30 min.

Sfæroblast-dannelsen overvåges på følgende måde. 100 μΐ alikvoter celler sættes til 900 μΐ 5% SDS og 900 μΐ 1M sorbitol før og lige efter tilsætning af Zymolase og på 25 forskellige tidspunkter i løbet af inkubationstiden. Inkubationen afbrydes på det tidspunkt, hvor cellerne lyses i SDS, men ikke sorbitol. Når sfæroblasterne er dannet, vaskes de én gang i 10 ml steril 1M sorbitol ved centrifugering ved 1000 x G i 5-10 min., vaskes én gang i 10 ml steril CaS 30 ved centrifugering og resuspenderes i 0,6 ml CaS.

Til selve transformeringen sættes DNA-prøver i vand eller TE-puffer (op til et totalt volumen på 20 μΐ) til 12 x 75 mm sterile polypropylenglas. (Ved små mængder DNA sker maksimal transformation ved hjælp af ca. 1 //1 5 mg/ml lyd-35 bølgebehandlet E. coli-DNA i hver prøve) . Der sættes 100 ml sfæroblaster til hver DNA-prøve, som inkuberes ved stuetempe- i 17 DK 175822 B1 ratur i ca. 20 min. 1 ml PEG-opløsning sættes til hver prøve, der inkuberes ved stuetemperatur i ca. 15 min. Prøverne centrifugeres ved 1000 x G i 5-10 min., og overfasen kasseres. Pelleterne resuspenderes i 150 μΐ SOS og inkuberes 5 ved stuetemperatur i 30 min. 850 μΐ steril 1M sorbitol sættes til hver, og prøverne udstryges som beskrevet nedenfor.

10 ml regenerationsagar pr. plade påhældes mindst 20 min., før transformationsprøver er parat. 10 ml alikvoter regenerationsagar fordeles ligeledes i glassene i et 45-10 50°C varmt bad i løbet af den tid, hvor transformationsprø verne er i SOS. Derpå sættes prøver til glassene, hældes på plader, der indeholder det faste agarbundlag, og inkuberes ved 30°C i 3-5 dage.

i Sfæroblast-kvaliteten på forskellige tidspunkter ! 15 bestemmes på følgende måde. 10 μΐ prøve udtages og fortyndes I 10 x ved tilsætning til 990 μΐ 1M sorbitol. 10 μΐ af fortyn dingen udtages, og der tilsættes yderligere en 990 μΐ alikvot 1M sorbitol. 100 μΐ af begge fortyndinger pladeudstryges på YPD-agarmedium for at bestemme koncentrationen af hele cel-20 ler, der ikke har dannet sfæroblaster, og som er tilbage i præparationen. 100 μΐ af hver fortynding sættes til 10 ml regenerationsagar, som er blevet suppleret med 40 μg/ml af alle aminosyrer, der kræves af værten, for at bestemme de samlede regenererbare sfæroblaster. Gode værdier for et 25 transformationsforsøg er 1-3 x 10^ regenererbare sfæroblader ialt/ml og ca. 1 x 103 hele celler/ml.

Eksempel 3

Konstruktion af MC100-3 (pYM5) 30 Ca. 10 μg pBR322 fordøjes med BamHI og dephosphory- leres. Ca. 50 μg pYJ8 (NRRL B-15889), som indeholder Pichia HIS4-genet, fordøjes med Bglll. Et 2,7 Kb stort Bglll-frag-ment isoleres fra en 0,8% præparativ agarosegel. 300 ng af fragmentet og 300 ng med BamHI fordøjet pBR322 ligeres ved 35 hjælp af 0,5 enh. T4 DNA-ligase i ialt 10 μΐ volumen 66 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,4 mM ATP i 18 DK 175822 B1 24 timer ved 4°C.

Ligeringsreaktionsblandingen anvendes til at transformere E.coli MC1061 til ampicillinresistens som beskrevet i eksempel 5. Transformanter karakteriseres ved restrik-5 tionsfordøj eiser, og det indsattes korrekte størrelse og orientering verificeres ved hjælp af agarose-gelelektropho-rese. Dette plasmid kaldes pYM5 og udvindes fra E.coli ved hjælp af alkalisk lyseplasmidpræparationsteknik som beskrevet af Maniatis m.fl. [T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambroox, 10 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)].

i

Ca. 10 /zg pYM5 fordøjes med Stul før transformation af MC100-3. Dette trin dirigerer plasmidet til at integrere i én af de HIS4-gensekvenser, der forekommer i MC100-3, 15 enten det oprindelige HIS4-sted eller det modificerede AOX2-sted. Transformation foretages som beskrevet i eksempel 2.

DNAer fra flere MC100-3(pYM5)-His+-transformanter isoleres ifølge eksempel 4 og screenes ved Southern filter-hybridisering for transformanter, som indeholder pYM5 in-20 tegreret i HIS4-fragmentet, der findes i AOX2. De særlige sonder, der anvendes, er pPG 3,0 {NRRL B-18022) , en AOX2-specifik sonde; og pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4-specifik sonde.

i i 25 Alkoholoxidase-II-regulerinqsreqionens egenskaber I Eksempel 4 • Gær-DNA-præparation i Gærceller dyrkes i 100 ml YNB-medium plus 2% dekstrose ved 30°C, indtil A60o er li9 1-2, og pelleteres derpå ved 30 hjælp af en Damon IEC DPR-6000-centrifuge ved 2000 x G i 5 min. Pel leten vaskes én gang i d^O, én gang i SED og én gang i 1 M sorbitol og resuspenderes derpå i 5 ml opløsning af 0,1 M Tris-HCl, pH 7,0, og 1 M sorbitol. Derpå blandes cellerne med 50-100 μΐ af en 4 mg/ml opløsning af Zymolase 35 60.000 (Miles Laboratories) og inkuberes ved 30°C i én time.

De opnåede sfæroblaster centrifugeres ved 1000 x G i 5-10 DK 175822 B1 | 19 ! min. og suspenderes i 5 ml lysepuffer [0,1% SDS, 10 mM Tris·- HCl (pH 7,4) , 5 mM EDTA og 50 mM NaCl] . Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) sættes hver til 100 /zg/ml, og opløsningen inkuberes ved 37°C i 30 min. DNA de-5 proteiniseres ved forsigtigt at blande præparationen med et lige så stort volumen chloroform, der indeholder isoamylal-kohol (24:4, vo/vo), og faserne adskilles ved centrifugering ved 12.000 x G i 20 min. Den øverste (vandige) fase fjernes over i et frisk glas og ekstraheres med et lige så stort 10 volumen phenol/chloroform/isoamylalkohol. Faserne adskilles som før, og den øverste fase anbringes i et glas, der indeholder 2-3 voluminer kold 100% ethanol. Prøven blandes forsigtigt, og DNA opsamles ved opspoling på en plaststang.

! DNAen opløses straks i 1 ml TE-puffer og dialyseres natten 15 over ved 4°C mod 100 voluminer TE-puffer.

Eksempel 5

Konstruktion af pMR4 DNA isoleres ifølge metoden i eksempel 4 fra en MC100-20 3(pYM5) His+-transformant, dannet i eksempel 3. 10 μg af

denne genome DNA fordøjes med HindiII og ligeres. Ligerings-reaktionen udføres ved 4°C i 24 timer i 66 mM Tris-HCl, pH

7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP og 0,5 enh. T4 DNA-ligase.

25 Ligeringsblandingen transformeres direkte ind i ; E.coli MC1061-celler, som er blevet gjort kompetente til ! transformation og transformeret som beskrevet af Maniatis m.fl. (1982). Udvælgelse for ampicillinresistens foretages ved at dyrke cellerne i enten LB-medium eller 2B-medium 30 (0,2% NH4PO4, 1,2% Na2HP04, 0,013% MgS04-7H20, 0,074% CaCl2- - j 2H20, 1 Mg/ml thiamin og 0,4% dekstrose) suppleret med 50 μ9/πι1 ampicillin.

Ifølge Maniatis m.fl. (1982) udvindes der et 12,0 Kb stort plasmid betegnet pMR4. Dette plasmid indeholder 5,3 35 Kb DNA 5' for AOX2 KpnI-stedet, 2,7 Kb af Pichia HIS4-genet og 4,0 Kb pBR322.

20 DK 175822 B1

Eksempel 6

Konstruktion af PYJ55

For at konstatere reguleringen og ekspressionen af A0X2-promotoren konstrueres en vektor, der indeholder A0X2 5 5'-sekvensen fusioneret til E.coli LacZ-genet. 50 μg pMR4 (eksempel 5) fordøjes med Bglll og BamHI ifølge producentens anvisninger. Et 1,8 Kb stort BglII-BamHI-fragment indeholdende AOX2-promotoren isoleres fra en 0,8% præparativ aga-rosegel. 10 ^g pBPfl (NRRL B-15892) fordøjes med BamHI og 10 dephosphoryleres ved hjælp af alkalisk phosphatase i et reaktionsvolumen på 50 μΐ (1 enh. enzym ved 37°C i én time i 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 1 mM MgCl2, 100 μΜ ZnCl2 og 1 mM spermidin).

300 ng af det 1,8 Kb store fragment og 300 ng pBPfl 15 ligeres med T4 ligase på følgende måde. Ligeringsreaktionen udføres ved 23°C i én time i et reaktionsvolumen på 10 μΐ indeholdende 66 mM Tris-HCl, pH 7,6, 5 mM MgCl2, 5 mM dithio-' threitol, 1 mM ATP og 1 Weiss-enh. T4 ligase. Den opnåede vektor betegnes pYJ38.

20 Et nyt Smal-restriktionssted dannes i pYJ38 på føl gende måde. Et adaptor-oligonucleotid syntetiseres ved hjælp af en Applied Biosystems DNA Synthesizer, model 380 A, ved hjælp af cyanoethylphosphoramidit-kemi: 51 - GATCACCCGGGT - 3' 25 10 μg pYJ38 fordøjes med BamHI og behandles med al kalisk phosphatase som ovenfor. 1 μg af ovennævnte adaptor og 0,1 μg med BamHI fordøjet pYJ38 ligeres ved hjælp af T4 ligase som beskrevet ovenfor. Den modificerede vektor betegnes pYJ4 5. Der fås et 1,8 Kb stort Smal - fragment, der in-30 deholder den modificerede AOX2-promotor, ved at fordøje 50 μg pYJ45 med Smal. Fragmentet isoleres fra en 0,8% præparativ agarosegel. 0,3 μg af fragmentet og 0,3 μg af med Smal fordøjet pBPfl ligeres som ovenfor til dannelse af vektoren pYJ46. Et 0,3 Kb stort EcoRI-fragment fjernes fra AOX2-seg-35 mentets 5'-ende i pYJ46 på følgende måde. 10 μg pYJ46 fordøjes med EcoRI og behandles med alkalisk phosphatase som 21 DK 175822 B1 r beskrevet ovenfor. En separat alikvot på 50 /xg pYJ46 fordøjes ligeledes med EcoRI, og et 1,5 Kb stort fragment isoleres fra en 0,8% præparativ agarosegel. Ca. 0,3 /xg af både phos-phataseret pYJ46 og det isolerede fragment ligeres og trans-5 formeres ind i E.coli som beskrevet ovenfor. Der isoleres et plasmid, som har den korrekte struktur, og det betegnes pYJ55.

Eksempel 7 10 Udvikling af stammen GS115 (pYJ55)

Pichia pastoris GS115, en histidin-auxotroph (NRRL Y-15851; his4), transformeres med plasmid pYJ55 (eksempel 6) ; som beskrevet i eksempel 2. Genome DNAer fra stabile His+- stammer analyseres ved Southern filterhybridisering for at 15 konstatere lokaliseringen af plasmidet. Én transformant; ! der inderholder pYJ55 integreret i HIS4-stedet, betegnes i GS115(pYJ55).

Eksempel 8 20 Sammenligning af AOX1- og A0X2-promotorer

Regulering og ekspression af AOX1- og AOX2-promotorerne er blevet sammenlignet ved at måle β-galactosidaseak-tiviteten hos stammerne GS115(pSAOH5) og GS115(pYJ55). 100 ml kulturer af hver stamme dyrkes i YNB plus 1% glycerol-25 medium i 24 timer ved 30°C, flyttes til YNB-medium uden carbonkilde i 24 timer ved 30°C og flyttes derpå til et YNB-medium med 0,5% methanol i 50 timer ved 30°C. Prøver af !' hver kultur flyttes på følgende tidspunkter: 1) efter 24 timer i glycerolmedium, 2) efter 24 timer i medium uden 30 carbon og 3) efter 24 og 50 timer i methanolmedium. Ekstrakterne fremstilles og afprøves for β-galactosidaseaktivitet som beskrevet nedenfor. Resultaterne af disse prøver er vist i tabel II.

22 DK 175822 B1 S-Galactosidaseprøve 1) Nødvendig opløsning: Z-Puffer Slutkoncentration

Na2HP04-7H20 16,1 g 0,06 M

5 NaH2P04 5,5 g 0,04 M

KC1 0,75 g 0,01 M

MgS04-7H20 0,246 g 0,001 M

2-mercaptoethanol 2,7 ml 0,05 M

Der fyldes op til 1 liter, pH skal være 7.

10 Q-Nitrophenyl-il-D-oalactosid (ONPG) 400 mg ONPG (Sigma N-1127) opløses i 100 ml destilleret vand, så at der fås en 4 mg/ml ONPG-opløsning.

2) Cellefri proteinekstraktpræparation: 15 Hver prøve vaskes én gang i dH20 og én gang i lyse puffer og resuspenderes i lysepuffer ved en koncentration på 150 Agoo/rol· 0,5 g glasperler tilsættes til en 350 μΐ alikvot af prøven, og blandingen omhvirvles fire gange å 60 sek. med 1 min. mellemrum på is. Celleopslæmningen fjernes 20 fra glasperlerne, og suspensionen centrifugeres i 5 min. på en mikrocentrifuge. Overfasen overføres til et polypropylen-mikrocentrifugeglas til afprøvning. Mængden af totalt protein i hver ekstrakt bestemmes ved hjælp af Bradford analysemetode (Bio-Rad)- BSA fungerer som proteinstandard.

25 3) Analysemetode: 1-50 μΐ cellefri proteinekstrakt sættes til 1 ml Z-puffer. Derpå omhvirvles blandingen og inkuberes i 5 min. ved 30°C. Reaktionen igangsættes ved tilsætning af 0,2 ml ONPG (4 mg/ml). 0,5 ml af en 1 M Na2C02-opløsning tilsættes 30 for at afbryde reaktionen på et passende tidspunkt (A420 <1). Absorbansen ved 420 nm aflæses derpå.

4. Beregning af β-galactosidase-aktivitetsenheder 1 enh. = 1 nmol orthonitrophenol (ONP) , der dannes pr. min. ved 30°C og pH 7. 1 nmol ONP har en absorbans ved 35 420 nm (A42q) på 0,0045 med 1 cm vejlængde. En absorbans på 1 ved 420 nm svarer til 222 nmol ONP/ml elle 378 nmol ONP/1,7 i 23 DK 175822 B1 i ml (det samlede volumen overfase, der analyseres, er 1,7 ml). Enhederne, der er anført i tabel II, er beregnet på følgende måde: i a420 ! 5 enh. = - X 378 ! t (min) i /

Claims (4)

24 DK 175822 B1

1. Renset DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den koder for en sekvens, som støder op til 5'-enden af methylotroph gær-alkoholoxidase II-gen, hvorved sekvensen 5 reagerer på tilstedeværelsen af methanol som eneste carbon-kilde for værtscellen, og at sekvensen indeholdes mellem startcodonet for et strukturelt A0X2-gen og det første EcoRI-sted af 5'-enden som vist i restriktionskortet i fig. 1(b), I og funktionelle mutanter i den beskrevne regulatorregion af i

10 AOX2, som omfatter en DNA-sekvens afkortet ved 5'-enden.

2. TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG -1150 -1130 -1110 CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG -1090 -1070 -1050 CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA 30 -1030 -1010 -990 AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT -970 -950 -930 AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT -910 -890 -870

2. Renset DNA-sekvens, der koder for en gær-alkoholoxidase II-regulatorregion, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen er: -1490 -1470

15 TCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT -1450 -1430 -1410 CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT -1390 -1370 -1350 i TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA 20 -1330 -1310 -1290 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT -1270 -1250 -1230 CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG -1210 -1190 -1170

3. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sekvensen er operationsmæssigt forbundet med et heterologt gen.

3. CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA -850 -830 -810 25 DK 175822 B1 CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA -790 -770 -750 AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG -730 -710 -690

5 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG -670 -650 -630 AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA -610 -590 -570 TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC 10 -550 -530 -510 TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT -490 -470 -450 TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC -430 -410 -390

15 AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT -370 -350 -330 CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG -310 -290 -270 cataaatttttgtctcggagtgaaaaccccttttatgtgaacagattacagaagcgtcct 20 -250 -230 -210 acccttcaccggttgagatggggagaaaattaagcgatgaggagacgattattggtataa -190 -170 -150 aagaagcaaccaaaatcccttattgtccttttctgatcagcatcaaagaatattgtctta -130 -110 -90 2. aaacgggcttttaactacattgttcttacacattgcaaacctcttccttctatttcggat -70 -50 -30 caactgtattgactacattgatcttttttaacgaagtttacgacttactaaatccccaca -10 aacaaatcaactgagaaaa 30 og en funktionel mutant af DNA-sekvensen afkortet ved 5'-enden. 26 DK 175822 B1

4. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendetegnet 5 ved, at sekvensen er operationsmæssigt forbundet med et heterologt gen. 10 15 20 25 30 35