DE3280479T2

DE3280479T2 - Rekombinante DNS-Mittel und Verfahren

Info

Publication number: DE3280479T2
Application number: DE3280479T
Authority: DE
Inventors: Bernadette Lavetsky Ashland Massachusetts 01721 Alford; Jen-I Bedford Massachusetts 01730 Mao; Donald Taylor Waltham Massachusetts 02154 Moir; Alison Lincoln Massachusetts 01773 Taunton-Rigby; Gerald Francis Waltham Massachusetts 02154 Vovis
Original assignee: Collaborative Research Inc
Current assignee: Chr Hansen AS
Priority date: 1981-01-16
Filing date: 1982-01-08
Publication date: 1999-03-11
Anticipated expiration: 2002-01-09
Also published as: ATE172493T1; BR8200191A; DE3280479D1; IE820069L; AU560340B2; EP0057350B1; GB2091271B; AU7945682A; FI84080C; JPS57141287A; EP0057350A3; CA1341300C; NO820090L; ES8401132A1; GB2091271A; ES508813A0; FI820075L; FI84080B; DK15182A; JPH0716419B2

Description

Das enzymatische Protein Rennin ist seit langem als geeignet zur Gerinnung (Koagulierung) von Milch-Kasein bei der Käseherstellung bekannt. Wegen seiner spezifischen proteolytischen Aktivität wird es auch im Zusammenhang mit der Käsereifung verwendet. In der Vergangenheit wurde es in der gewerblichen Herstellung aus Lab erhalten. Milchernährte Kälber können geschlachtet werden, und der von seinem Futterinhalt befreite Labmagen kann entfernt werden. Dann wird ein kompliziertes Verfahren angewendet, worin die Mägen getrocknet, gesalzen und gefroren werden. In Fabrikstellen werden die Mägen gewaschen, von Salz befreit und behandelt, um Oberflächenfett zu entfernen. Dann werden sie auf Gestellen ausgebreitet und getrocknet. Die getrockneten Mägen werden häufig kühl gelagert und dann zerkleinert und in große Bottiche gefüllt, wobei eine Salzsollösung durch die Häute zirkuliert, bis die Extraktion von Rennin vollständig ist. Das obige Verfahren zur Herstellung von Rennin ist kostspielig und bereitet viele Schwierigkeiten bei der Herstellung von großen Mengen, die für die gewerbliche Verwendung in verschiedenen Anwendungen in der ganzen Welt benötigt werden.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, lebende Zellen zu erhalten, welche in der Lage sind, in Kultur Rennin zur Massenproduktion herzustellen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, lebende Zellen zu erhalten, die in der Lage sind, in Kultur Prorennin zur Massenproduktion herzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, lebende Zellen zu erhalten, die in der Lage sind, in Kultur Pre-Prorennin zur Mengenproduktion herzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, gemäß den obigen Aufgaben Rennin, Prorennin oder Pre-Prorennin bereitzustellen, das aus lebenden Zellen stammt, wobei die lebenden Zellen genetisches Material enthalten, das von rekombinantem DNA-Material stammt.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, spezialisierte Rennin- Gene, Pre-Prorennin-Gene und Prorennin-Gene bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von Rennin, Prorennin oder Pre-Prorennin unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist es, Signalsequenzen bereitzustellen, die mit dem geeigneten Wirt zum Transport von ausgewählten Aminosäuresequenzen wie etwa ausgewählten Enzymen oder Proteinmaterial in den periplasmatischen Raum, andere Zellgebiete oder extrazellulär zu verwenden.
Noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von bestimmten modifizierten Zellen zur Verwendung bei der Herstellung von Polypeptiden, welche Rennin- oder Milchgerinnungsaktivität aufweisen.
Der Gegenstand der Erfindung ist wie in den Ansprüchen 1 bis 23 beansprucht.
Gemäß der Erfindung enthalten transformierbare lebende Zellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, genetisches Material, das von rekombinantem DNA-Material stammt, und sind in der Lage, Rinder-Rennin oder Rinder-Pre-Prorennin oder Rinder- Prorennin zu exprimieren.
Die Expression von Pre-Prorennin in einer Wirtszelle kann durch die Herstellung einer DNA-Sequenz erhalten werden, die für Pre-Prorennin codiert. Diese Sequenz ist an ihrem 5'-Ende mit einem Transkriptionspromotor und einer Ribosom-Bindestelle verknüpft, und der Abstand zwischen dem Beginn der DNA, die für Pre-Prorennin codiert, und dem Abschnitt der DNA, der den Promotor und die Bindestelle enthält, wird variiert. Die DNA wird dann in Wirtszellen transformiert. Die Wirtszellen werden kloniert und diejenigen mit einem hohen Grad der Expression von Pre-Prorennin werden ausgewählt.
In einem Verfahren zum Erhalten einer Expression von Prorennin oder Rennin in Wirtszellen wird eine DNA-Sequenz ausgewählt, die für Pre- Prorennin codiert und ein 5'-Ende besitzt. Es wird ein Teil des 5'-Endes entfernt, wobei dieser Teil für das Prorennin- oder Rennin- VoRIäuferpolypeptid codiert. Der Rest, der die Prorennin- oder Rennin- Codierungssequenz enthält, wird an ein synthetisches DNA-Stück ligiert, welches an dem 3'-Ende des Stücks ein Translationsinitiationscodon enthält. Dann wird wie zuvor verfahren, in dem ein Transkriptionspromotor und eine Ribosombindestelle mit der Sequenz verknüpft wird und der Abstand zwischen dem Beginn der DNA, die für Prorennin oder Rennin codiert, und dem Abschnitt der DNA, der den Promotor und die Ribosombindestelle enthält, variiert wird. Dieses Material wird in Wirtszellen transformiert, es wird eine Klonierung durchgeführt, und Selektion derjenigen Zellen, die wie oben gewünscht und ausgewählt Prorennin oder Rennin exprimieren, wird durchgeführt.
Escherichia coli, die durch ein hier beschriebenes Verfahren hergestellt werden, sind beispielhaft durch die Kultur dargestellt, die in der American Type Culture Collection in 12301 Park Warren Drive, Rockville, Maryland 20852 hinteRIegt und mit Zugangsnummer 31929 gekennzeichnet ist, wobei es sich um den Stamm CGE24 handelt, der von dem E. coli-Stamm BNN45 abstammt.
Hefemikroorganismen, die durch das hier beschriebene Verfahren hergestellt werden, sind beispielhaft durch Kulturen veranschaulicht, die in der American Type Culture Collection in 12301 Park Warren Drive, Rockville, Maryland 20852 hinteRIegt sind und mit der Zugangsnummer 20623 gekennzeichnet sind, wobei es sich um den Stamm CGY116 handelt, der von dem Saccharomyces cerevisiae-Stamm CGY80 abstammt.
Pre-Prorennin, Prorennin und Rennin können jeweils durch die Isolierung von Pre-Prorennin-DNA-Material erhalten werden. Das Pre-Prorennin ist ein VoRIäufer von Prorennin. Indem Teile der Pre-Prorennin-DNA entfernt werden, konnte genetisches Material erhalten werden, welches für Prorennin oder für Rennin codiert.
Pre-Prorennin-, Prorennin- oder Rennin-Gene gemäß dieser Erfindung umfassen alle Nukleotidsequenzen, die für die Aminosäuresequenz von jeweils Pre-Prorennin, Prorennin oder Rennin codieren, und schließen jedwede intervenierenden Nukleotidsequenzen aus, welche in der genomischen DNA vorhanden sind, die jeweils für Pre-Prorennin, Prorennin oder Rennin codiert, und sind mit Vektoren verknüpft, welche in geeigneten Wirtszellen replizieren, die nicht E. coli sind.
Die Zellen sind in der Lage, rekombinantes DNA-Material zu exprimieren, um das gewünschte enzymatische Protein herzustellen. Hefen, Pilze und Bakterien, die nicht E. coli sind, können erfindungsgemäß verwendet werden. Diese Zellen werden so ausgewählt, daß sie in der Lage sind, große Mengen an enzymatischem Protein bei annehmbaren gewerblichen Kultivierungsbedingungen herzustellen.
Das Enzym Rennin (EC 3.4.23.4), auf welches in dieser Anmeldung Bezug genommen wird, ist auch als Chymosin bekannt. Es ist das wichtigste proteolytische Protein, das sich im Magen des noch nicht wiederkäuenden Kalbes befindet, und ist für das Gerinnen von Milch verantwortlich. Rennin wird gewerblich für die Käseherstellung verwendet. Prorennin ist eine VoRIäuferform von Rennin mit 42 zusätzlichen Aminosäuren am Amino- Terminus, wie beschrieben durch B. Foltmann et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 74 2321-2324 (1977). Pre-Prorennin, das in dieser Anmeldung zum ersten Mal beschrieben wird, ist eine VoRIäuferform von Prorennin und hat eine Anzahl von zusätzlichen Aminosäuren (bevorzugt 16 Aminosäuren) am Amino-Terminus des Prorenninmoleküls. Diese zusätzlichen Aminosäuren sind wahrscheinlich für die Sekretion des Enzyms aus den Magenzellen wichtig. B. Foltmann und andere haben gezeigt, daß gereinigtes Rennin ein Gemisch aus zwei Formen A und B ist (B. Foltmann et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 2321-2324 (1977) und J. Biol. Chem. 254, 8447-8456 (1979)). Beide Formen sind aktiv, und Sequenzierungsdaten lassen erkennen, daß der einzige Unterschied wahrscheinlich in einem Aspartatrest an Position #290 in Rennin A und einem Glycinrest an dieser Position in Rennin B besteht. Das in den Beispielen dieser Erfindung hergestellte Rennin ist Rennin A; es können jedoch dieselben Verfahren und/oder einfache Umwandlungen die Herstellung von Rennin B ermöglichen. In ähnlicher Weise können die Pre- und Proformen in einer A- oder B-Form auftreten.
Zum Zweck dieser Erfindung wird das Prorennin-Gen als jedwede Sequenz von Nukleotiden definiert, welche für das Prorennin-Molekül codiert, wobei dessen Aminosäuresequenz in der Literatur beschrieben ist (B. Foltmann, V. B. Pedersen, H. Jacobsen, D. Kauffman und G. Wybrandt, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 2321-2324 (1977)).
Das Pre-Prorennin-Gen umfaßt die Sequenz von Nukleotiden, die für Prorennin codiert, umfaßt aber auch 48 zusätzliche Nukleotide am 5'-Ende, welche für das Amino-Terminus-VoRIäuferpolypeptid codieren, das sich auf dem Pre-Prorennin-Enyzm befindet.
Das Rennin-Gen wird definiert als jedwede Sequenz von Nukleotiden, welche für das Prorennin-Molekül codiert, wobei die ersten 126 Nukleotide ausgenommen sind, die für den Proenzym-Teil von Prorennin codieren.
Die lebenden Zellen werden zunächst unter Verwendung einer Vielzahl an bekannten DNA-Techniken hergestellt, wobei von Materialien ausgegangen wird, die aus dem Labmagen des Kalbes erhalten wurden.
Das erhaltene Rennin, Pre-Prorennin und Prorennin kann zur Verwendung bei der Käseherstellung oder zur Milchgerinnung (-verdickung) verwendet werden, um Käse zu erhalten, und gegebenenfalls in weiteren gewerblichen Anwendungen verwendet werden, um zum Erhalt von Käse Milch zu verdicken. Durch Kultivierungstechniken können große Mengen hergestellt werden. Somit ist man in der Lage, große Mengen an Materialien bei annehmbaren Produktionsgeschwindigkeiten und Kosten herzustellen. Das genetische rekombinante DNA-Material ist im wesentlichen identisch mit dem Renninteil des Kälber-Pre-Prorennin-Gens, wenn Rennin hergestellt werden soll, im wesentlichen identisch mit dem Kälber-Pre-Prorennin-Gen, wenn Pre-Prorennin hergestellt werden soll, und im wesentlichen identisch mit dem Prorennin-Teil des Kälber-Pre-Prorennin-Gens, wenn Prorennin hergestellt werden soll. Die Unterschiede im rekombinanten DNA-Material liegen hauptsächlich darin, daß die Moleküle keine Introns enthalten, die im Kälbergen vorhanden sein können.
Jedwede Spezies von Bakterien, welche für die Arbeit mit rekombinanter DNA als sicher gilt, kann verwendet werden, umfassend z. B. Escherichia coli, verschiedene Spezies von Bacillus, wie etwa Bacillus subtilis, verschiedene Lactobacillus-Spezies, und verschiedene Micrococcus-Spezies, wie etwa Micrococcus fragilis. Weitere Zellen, wie etwa Pilze, Hefen oder Säugerzellen können ebenfalls als Wirtszellen verwendet werden. In jedem Fall enthält die genetische Information der resultierenden Zellen neues genetisches Material, das von rekombinantem DNA-Material abstammt. Dieses Material ist oft in Form eines Plasmids enthalten, welches in der Lage ist, in der Wirtszelle zu replizieren und welches darin insertiertes genetisches Material von einer Donorzelle an irgendeinem Anfangsstadium aufweist. Sobald das rekombinante DNA-Molekül gebildet und in die Wirtszelle eingebracht worden ist, wächst diese Wirtszelle und vermehrt sich im wesentlichen auf normale Art und Weise. Die Produktion des enzymatischen Proteins, für welches das rekombinante DNA-Material codiert, welches Rennin, Pre-Prorennin oder Prorennin sein kann, geschieht gemäß dieser Erfindung.
Die Wirtszellen, in die das gewünschte rekombinante DNA-Material eingebracht wird, sind bevorzugt solche, die von E. coli K-12 abstammen. Die Expression von Pre-Prorennin, Prorennin und Rennin in E. coli-Zellen, Vektoren, die ein Gen dafür umfassen und die in E. coli replizieren, und allgemein E. coli, die mit einem solchen Vektor transformiert sind, sind jedoch nicht Gegenstand der Erfindung. Geeignete Derivate von E. coli K-12 sind wie folgt:
HB101, H. W. Boyer & D. Poulland-Dussoix (1969) J. Mol. Biol. 41 459-472,
C600, M. Mandel & A. Higa J. Mol. Biol. 52 159-162 (1970), und Derivate von C600 wie etwa:
MV1 und MV12, V. Hershfield, H. W. Boyer, C. Yanofsky, M. A. Lovett & D. R. Helinski (1974) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3459, LB392, S. M. Tilghman, D. C. Tiemeier, F. Polsky, M. H. Edgell, J. G. Seidman, A. Leder, L. W. Enquist, B. Norman & P. Leder (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4406-4410, JM 101, J. Messing (1979) Recombinant DNA Technical Bulletin 2 43-48, W3110 und Derivative, K. L. Korn & C. Yanofsky (1976) J. Mol. Biol. 103, 395-409.
Die Zellen können durch herkömmliche Kultivierungsmethoden gezüchtet werden. Kulturmedien für E. coli können z. B. sein:

Reichhaltiges Medium:

LB pro Liter
10 g Bacto-Trypton (Difco Laboratories, Detroit)
5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco Laboratories, Detroit)
10 g NaCl
2 g Glucose
TY pro Liter
10 g Bacto-Trypton (Difco Laboratories, Detroit)
1 g Bacto-Hefe (Difco Laboratories, Detroit)
8 g NaCl
1 g Glucose

Minimal-Medium:

M9 pro Liter
NaHPO&sub4; 6 g
KH&sub2;PO&sub4; 3 g
NaCl 0,5 g
NH&sub4;Cl 1 g
CaCl&sub2; 11 mg
MgSO&sub4;7H&sub2;O 0,2 g
BI(Thiamin-HCl) 5 mg
Aminosäuren, wie vom Stamm benötigt (je 40 mg)
Glucose 2 g
Die Kulturen können in Suspension gezüchtet werden, auf Agarmedium platiert werden, oder es können Standard-Gewebe- und Zellkulturtechniken verwendet werden.
Die verwendeten Kulturmedien können jedwedes der Standard-Kulturmedien für die Kultivierung der bestimmten Zellen sein. Zum Beispiel ist TY-Medium für E. coli LE392 (E. coli C600 r&supmin;km&spplus;kSupE, SupF, gal&supmin; oder BNN45 (E. coli hsdR&supmin;, hsdM&spplus;, SupE, SupF, Bl&supmin; met&supmin;) (Advanced Bacterial Genetics, R. W. Davis, D. Botstein, J. R. Roth, Cold Spring Harbor Laboratory [1980] S. 7) bevorzugt, wobei die Zellen anfangs mit einer Konzentration von 1% bis 4 % angeimpft werden.
Bei Standardtechniken werden die E. coli bis zu einer Dichte von 10 bis 30 · 10¹² Zellen/Liter gezüchtet und das gewünschte enzymatische Protein hergestellt.
Es können verschiedene, für die Kultivierung von Zellen bekannte Medien verwendet werden, diese sind nicht Teil der voRIiegenden Erfindung. In ähnlicher Weise kann eine Vielfalt an Kultivierungsmethoden, Techniken und Bedingungen verwendet werden. Während die Zellen bevorzugt bei Temperaturen von 30ºC bis 40ºC kultiviert werden, können z. B. auch Temperaturen außerhalb dieses Bereiches verwendet werden.
Der Ausgangspunkt zum Erhalten von Zellen der voRIiegenden Erfindung ist die Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, um gewünschtes genetisches Material zu erhalten und dieses in die Wirtszelle einzubringen, wonach die Wirtszelle kloniert wird.
Bevorzugt wird das Rennin-Gen, Pre-Prorennin-Gen oder Prorennin-Gen, welches man letztendlich in einen Organismus klonieren möchte, durch einen ersten Schritt isoliert, indem man messenger-RNA des Pre-Prorennin- Gens aus einer Gewebequelle erhält. Im Fall des Kalbes wird diese durch die Isolierung aus dem Kälber-Labmagen erhalten. Die messenger-RNA kann mit Hilfe der Methode von Deeley et al (R. G. Deeley, J. I. Gordon, A. T. H. Burns, K. P. Mullinix, M. Bina-Stein, R. F. Goldberger J. Biol. Chem. 252, 8310- 8319 ([1977]) isoliert werden, und Poly-A-bereicherte RNA kann durch Chromatographie auf Oligo-(dT)-Cellulose durch das Verfahren von R. C. Desrosiers, K. H. Friderici & F. M. Rottman Biochemistry 14, 4367-4374 (1975) erhalten werden.
Die messenger-RNA wird dann durch herkömmliche Verfahren in doppelsträngige DNA umgewandelt. Zunächst wird die Komplementärsequenz der DNA durch herkömmliche rekombinante DNA- Methoden aus der messenger-RNA hergestellt, wie durch Verwendung von Reverser Transkriptase von AMV. Es können z. B. die Methoden von A. Efstratiadis, F. C. Kafatos, A. M. Maxam und T. Maniatis, Cell 7, 279-288 (1976), R. Higuchi, G. V. Paddock, R. Wall und W. Salser, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 3146-3150 (1976), D. L. Kacian und J. C. Myers, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 2191-2195 (1976), M. P. Wickens, G. N. Buell und R. T. Schimke, J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 (1978), G. M. Wahl, R. A. Padgett und G. R. Stack, J. Biol. Chem., 254, 8679-8689 (1979) verwendet werden, um die "copy-DNA" (cDNA) zu erhalten. Der RNA-Anteil kann verworfen werden, indem die Stränge wie im Stand der Technik bekannt unter Verwendung irgendeiner der obigen Methode oder durch Hitzedenaturierung gemäß dem Verfahren von Wickens et al (1978) aufgebrochen werden.
Anschließend können Enzyme, wie etwa E. coli DNA Polymerase 1 oder AMV-Reverse Transkriptase verwendet werden, um unter Verwendung von Verfahren der obigen Publikationen und von J. I. Gordon, A. T. H. Burns, J. L. Christmann & R. G. Deeley, J. Biol. Chem. 253, 8629-8639 (1978) die cDNA in doppelsträngige DNA umzuwandeln.
Drittens können synthetische Linker an beide Enden der doppelsträngigen DNA angeknüpft werden, wie z. B. durch die Verwendung von synthetischen Hind III- oder Eco R1-Oligonukleotidlinkern unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, wie sie z. B. bei R. H. Scheller, T. L. Thomas, A. S. Lee, W. H. Klein, W. D. Niles, R. J. Britten und E. H. Davidson, Science 196, 197-200 (1977), T. H. Fraser und B. J. Bruce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5936-5940 (1978), A. Ullrich, J. Shine, J. Chirgwin, R. Pictet, E. Tischer, W. J. Rutter & H. M. Goodman, Science 196. 1313-1319 (1977), J. Shine, P. H. Seeburg, J. A. Martial, J. D. Baxter & H. M. Goodman, Nature 270, 494-499 (1977), oder P. H. Seeburg, J. Shine, J. A. Martial, J. D. Baxter & H. M. Goodman, Nature 270, 486-494(1977) beschrieben sind.
In einem vierten Schritt wird das DNA-Molekül in das Chromosom integriert oder mit einem Vektor verknüpft, welcher ein Plasmid, Virus oder Cosmid sein kann, wie aus dem Stand der Technik bekannt. Solche Vektoren umfassen:
pBR322 (F. Bolivar, R. L. Rodriguez, P. J. Greene, M. C. Betlach, H. L. Heyneker, H. W. Boyer, J. H. Crosa, S. Falkow, 1977 Gene 2, 95- 119),
pMB9 (R. L. Rodriguez, F. Bolivara, H. M. Goodman, H. W. Boyer, M. C. Betlach in "Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression" (D. P. NieRIich, W. J. Rutter, C. F. Fox, Hrsg.) 471 Academic Press New York 1976),
pSC101 (S. N. Cohen, A. C. Y. Chang, H. W. Boyer, R. B. Helling 1973 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 3240)
λ gtWES (D. Tiemeier, L. Enquist, P. Leder Nature 263, 526-527) (1976)
λ Charonphagen (F. R. Blattner et al. Science 196, 161-169) (1977),
f1 8229 (J. D. Boeke Molec. Gen. Genetics 181, 288-291) (1981),
pJC75-58 (J. Collins, Methods in Enzymology 68 309-326) (1979)
Dieser Schritt wird wieder außerhalb der endgültigen Wirtszelle durchgeführt. Geeignete Techniken für dieses Verfahren sind im Zusammenhang mit den Linkern in den obigen Literaturstellen beschrieben, sowie in den folgenden Publikationen: V. Hershfield, H. W. Boyer, C. Yanofsky, M. A. Lovett & P. R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3455-3459 (1974), N. E. Murray & K. Murray, Nature 251, 476-482 (1974), F. R. Blattner et al., Science 196. 161-169 (1977).
In einem fünften Schritt kann das rekombinante DNA-Molekül in das Cytoplasma der Wirtszellinie eingeführt werden unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, wie den bei M. Mandel & A. Higa (1970) J. Mol. Biol. 53, 159-162, P. C. Wensink, D. J. Finnegan, J. E. Donelson & D. S. Hogness, Cell 3, 315-325 (1974), S. N. Cohen, A. C. Y. Chang und L. Hsu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69. 2110-2114 (1972), H. M. Goodman und R. J. MacDonald, Methods in Enzymology 68, 75-90 (1979), E. M. Lederberg und S. N. Cohen, J. Bact. 119, 1072-1074 (1974) beschriebenen.
Die Erkennung des korrekten Klons kann durch das Verfahren der Hybridisierungsselektion erreicht werden oder durch die Verwendung von synthetischen Oligonukleotidsonden, (T. Taniguchi, Y. Fujii, Kuriyama und M. Muramatsu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77. 4003-4006 (1980), R. P. Ricciardi, J. S. Miller & B. E. Roberts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4927- 4931 (1979), D. L. Montgomery, B. D. Hall, S. Gillam und M. Smith, Cell 14, 673-680 [1978]).
Die frisch modifizierte Wirtszelle wird dann kloniert und Expression des erwünschten Materials erhalten. Zum Beispiel eRIaubt es die Technik von Guarente et al. unter Verwendung des Lactose-Operon-Promotors, (1980) (L. Guarente, G. Lauer, T. M. Roberts & M. Ptashne, Cell 20, 543-553 [1980], L. Guarente, T. M. Roberts & M. Ptashne, Science 209, 1428-1430 [1980]), Expression von Fremd-DNA zu erhalten und zu optimieren. Es können andere im Stand der Technik bekannte Promotoren zum Erhalt von Expression verwendet werden, solange der Promotor in der gewünschten Bakterien-, Hefe- oder sonstigen Wirtszelle aktiv ist. Solche Promotoren umfassen das Tryptophan-Operon von E. coli oder Beta-Lactamase- Promotoren und Uracil-3- oder Invertase-Promotoren von S. cerevisiae.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung von Pre-Prorennin A, Prorennin A oder Rennin A auf rekombinante Weise noch genauer. Die Expression von jeweils Pre-Prorennin, Prorennin und Rennin in E. coli Zellen, Vektoren, welche ein entsprechendes Gen umfassen und welche in E. coli- Zellen replizieren, sowie mit einem solchen Vektor transformierte E. coli- Zellen sind nicht Teil der Erfindung, mit der Ausnahme von Plasmid pCGE21, wie in Anspruch 9 beansprucht, und den E. coli-Zellen, wie in den Ansprüchen 8 und 10 beansprucht.

1. Isolierung der RNA

Magengewebe von Milch-ernährten Kälbern wurde frisch vom dortigen Schlachthofbezogen; die Schleimhaut des Labmagens wurde von der Magenwand abgeschnitten und in Trockeneis gefroren. 21 g des Schleimhautgewebes wurde in 200 ml kaltem Puffer (10ºC), bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8M Guanidin-HCl und 1 mM Dithiothreitol, mit Hilfe eines Mischers zerkleinert. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugieren in einem Sorvall SA-600 Rotor bei 10.000 U/min für 12 Minuten entfernt. Zu den 200 ml Überstand aus dieser Zentrifugation wurden 100 ml eiskaltes absolutes Ethanol hinzugegeben. Nach 1,5 Stunden bei -20ºC wurde das Fällungsprodukt durch Zentrifugieren bei 3000 U/min für 30 Minuten bei -10ºC pelletiert. Das Pellet wurde in 40 ml eiskaltem Puffer (EGAD), bestehend aus 20 mM EDTA, pH 7, 20 mM NaOAc, pH 7, 8M Guanidin, HCl und 1 mM Dithiothreitol, aufgelöst.
Zwanzig Milliliter kaltes absolutes Ethanol wurden hinzugegeben und die Lösung für 45 Minuten -20ºC ausgesetzt. Das Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren bei 3000 U/min für 20 Minuten bei -10ºC pelletiert. Das Pellet wurde in 40 ml kaltem EGAD-Puffer wieder aufgelöst und die Fällung mit 20 ml kaltem Ethanol, Zentrifugieren und Wiederauflösen des Pellets in EGAD-Puffer wurde zwei weitere Male wiederholt. Schließlich wurde das Pellet in 16 ml 20 mM EDTA, pH 7 aufgelöst und dreimal mit Chloroform:Isobutanol (4 : 1) extrahiert. Anschließend wurde die zweifache Menge 4,5M NaOAc, pH 5,2 zu der wäßrigen Schicht hinzugegeben, und die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC aufbewahrt. Das RNA- Fällungsprodukt wurde durch Zentrifugieren bei 10.000 U/min für 25 Minuten bei -10ºC gesammelt und in 30 ml Wasser aufgelöst. Die Ausbeute war 45 mg RNA. Die RNA wurde durch Zugabe von 1 ml 2M NaOAc, pH 5 und 75 ml absolutem Ethanol gefällt, gefolgt von Inkubieren bei -20ºC über Nacht. Die RNA wurde durch Zentrifugieren (10.000 U/min. 10 Minuten, -10ºC) pelletiert und in 20 ml Wasser aufgelöst, für 10 Minuten auf 60ºC erwärmt, schnell auf Eis abgekühlt und mit 21 ml 2x konzentriertem Bindepuffer (20mM Tris.HCl, pH 7,5, 2mM EDTA, pH 7, 0,4 % SDS und 0,24M NaCl) verdünnt. Die RNA wurde auf eine 4 ml Oligo-dT- Cellulose-Säule aufgebracht, die Säule wurde mit 45 ml 1x konzentriertem Bindepuffer gespült, und anschließend wurde die Poly-A enthaltende RNA durch Waschen der Säule mit Bindepuffer, der kein NaCl enthielt, eluiert. Ungefähr 1 mg Poly-A enthaltende RNA wurde erhalten. Ein Teil der Poly-A enthaltenden RNA wurde in vitro in einem Kaninchen-Reticulocyten-Lysat- System translatiert (H. R. B. Pelham und R. J. Jackson [1976] Eur. J. Biochem. 67, 247-256). Die Proteinprodukte wurden auf einem 10%-igen Polyacrylamidgel analysiert. Es wurde eine einzige Hauptproteinbande beobachtet, welche mit Rennin-Antiserum gefällt wurde, was zeigte, daß Rennin-mRNA in der Poly-A enthaltenden RNA vorhanden ist.

2. Herstellung von doppelsträngiger Copy-DNA (cDNA)

Ungefähr 8,7 ug cDNA wurden aus 20 ug Poly-A enthaltender RNA aus dem Kälbermagen durch Inkubieren für 1 Stunde bei 42ºC in 50 mM Tris.HCl, pH 8,3, 100 mM KCl, 8mM MgCl&sub2;, 0,4 mM Dithiothreitol, jeweils 1 mM Desoxynukleosid-triphosphat, 20 ug/ml Oligo(-dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;, enthaltend 100 Einheiten Reverse Transkriptase, und 1 Ci/mmol α³²P-dCTP, synthetisiert. Nach dem Erwärmen des Reaktionsgemisches auf 100ºC für 3 Minuten, Abkühlen auf Eis für 3 Minuten und Entfernen des gefällten Proteins durch Zentrifugieren wurden zur Hälfte des Überstandmaterials Hepes.KOH, pH 6,9 zu 100 mM, MgCl&sub2; zu 5 mM, Dithiothreitol zu 0,5 mM, Desoxynukleosid-triphosphate zu 0,125 mM hinzugegeben. Inkubieren dieses Gemisches mit 300 Einheiten von DNA-Polymerase I aus E. coli für 2 Stunden bei 16ºC ergab 8,6 ug doppelsträngige cDNA. Die DNA wurde Phenol-extrahiert und von nicht eingebauten Triphosphaten durch Chromatographie auf Sephadex G-100 (12 ml Säule, 0,7 cm · 30 cm, eluiert mit 20 mM Tris.HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA) getrennt und über Nacht bei -20ºC durch die Zugabe von 1/10 der Menge 2M NaOAc, pH 5 und der 2,5-fachen Menge kaltem Ethanol gefällt. Die doppelsträngige cDNA (4,6 ug) wurde dann mit 1000 Einheiten S1-Nuklease bei 37ºC für 1 Stunde in Puffer S (0,3 M NaCl, 30 mM NaOAc, pH 4,6, 3 mM ZnSO&sub4;) behandelt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von EDTA zu 10 mM und Tris.HCl, pH 8,3 zu 200 mM beendet, und das Gemisch wurde auf eine Biogel A-150 m Säule (0,7 cm · 33 cm) gebracht, äquilibriert und mit 10 mM Tris.HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA und 250 mM NaCl eluiert. Die Peak- Fraktionen (jeweils 0,5 ml) von DNA mit hohem Molekulargewicht wurden zusammengenommen und durch die Zugabe von 1/10 der Menge 2M NaOAC, pH 5 und der 2,5-fachen Menge kaltem absolutem Ethanol Ethanol gefällt.

3. Verknüpfung mit HindIII-Linkern

Die mit S1 behandelte doppelsträngige cDNA (1,7 ug) wurde in Puffer T (25 mM Tris.HCl, pH 8, 6,6 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM EDTA, 5 mM 2- Mercaptoethanol und jeweils 0,5 mM Desoxynukleosid-triphosphat) zusammen mit 2 Einheiten von T&sub4;-DNA-Polymerase bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Das Material wurde Phenol-extrahiert und Etherextrahiert und durch Zugabe von 1/10 der Menge 2M NaOAc, pH 5 und der 2,5-fachen Menge Ethanol Ethanol-gefällt. Diese doppelsträngige cDNA mit stumpfen Enden wurde anschließend in 66 mM Tris.HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM ATP zusammen mit 300 umol ³²P-markiertem synthetischen HindIII-Linker (100-facher Überschuß über cDNA-Enden) sowie 9 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase für stumpfe Enden bei 12 Grad über Nacht inkubiert.
Die Reaktionslösung wurde auf 10 mM EDTA, pH 8, eingestellt und auf einer Biogel A-150 m Säule (0,7 cm · 20 cm) fraktioniert. Die Fraktionen (jeweils 0,25 ml) mit DNA von hohem Molekulargewicht wurden zusammengenommen und Ethanol-gefällt. Dieses Material wurde mit HindIII- Restriktionsendonuklease (9 Einheiten) in 5,6 mM Tris.HCl, pH 7,6, 5,6 mM MgCl&sub2; bei 37ºC für 45 Minuten behandelt, anschließend Phenol extrahiert, Ether-extrahiert und Ethanol-gefällt durch Zugabe von 1/10 der Menge 1 M NaOHc, pH 5 und der 2,5-fachen Menge absolutem Ethanol. Diese doppelsträngige cDNA mit kohäsiven HindIII-Termini wurde dann mit doppelsträngiger DNA CGF4 aus dem f1-Phagen ligiert, welche mit HindIII- Restriktionsendonuklease geöffnet worden war, und zweimal mit intestinaler Phosphatase vom Kalb nach dem Verfahren von H. Goodman und R. J. MacDonald (H. M. Goodman und R. J. MacDonald [1979] Methods in Enzymology 68, 75-91) behandelt, um die terminalen Phosphate zu entfernen (Anmerkung: Um den Phagen GF4 herzustellen wurde der f1- Phage 8229 (J. D. Boecke [1981] Mol. Gen. Genet. 181, 288-291) mit EcoRI-Endonuklease geschnitten, durch T&sub4;-DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und mit synthetischen HindIII-Oligonukleotidlinkern von Collaborative Research, Inc. aus Waltham, Massachusetts ligiert). Die Ligationsreaktionslösung enthielt 66 mM Tris.HCl, pH 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3 pg doppelsträngige cDNA, 0,2 ug CGF4- DNA, 0,5 mM ATP und 300 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase für kohäsive Enden. Die Ligation wurde für 29 Stunden bei 16ºC durchgeführt.

4. Transfektion von E. coli BNN45 mit rekombinanter CGF4-DNA

Der E. coli-Stamm CGE6 (BNN45; hsdR&supmin;, hsdM&spplus;, sup E, sup F, Bl&supmin;, met&supmin;) wurde in Trypton-Bouillon bei 37ºC unter Schütteln kultiviert und bei OD&sub7;&sub0;&sub0; = 0,5 durch Zentrifugieren bei 7000 U/min für 10 Minuten bei 4ºC geerntet. Die Zellen wurden in eiskaltem 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert (die Hälfte der ursprünglichen Kulturmenge) und bei 0ºC für 30 Minuten stehengelassen. Die Suspension wurde dann bei 7000 U/min für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und in 1/20 der ursprünglichen Kulturmenge an eiskaltem 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Nachdem sie bei 0ºC für 60 Minuten stehengelassen worden waren, wurden die Zellen für die Transfektion verwendet. Jeweils ein halber Mikroliter der 20 ul Ligationsreaktionslösung wurde zu acht Reaktionsgefäßen hinzugegeben, die 50 ul steriles 50 mM Tris.HCl, pH 7,6 enthielten. 1/10 Milliliter der mit CaCl&sub2; behandelten Zellen wurde zu jedem Reaktionsgefäß hinzugefügt, und die Gemische für 30 Minuten auf Eis stehengelassen. Nach dem Erwärmen auf 37ºC für zwei Minuten, wurden 0,2 ml einer Übernacht-Kultur von CGE5 (JM101:J. Messing [1979], F'tra D36 pro AB lac IZ M15 auf einem (lac pro) SupEthi&supmin; Hintergrund) und 3 ml 0,7% Soft-Agar hinzugegeben, und das Gemisch wurde auf 8 Tryptonagarplatten gegossen. Inkubieren bei 37ºC über Nacht ergab ungefähr 250 Plaques pro Platte.

5. Identifizierung eines rekombinanten CGF4, der die Rennin- Codierungsfrequenz enthält

Die Plaques wurden auf Nitrocellulose übertragen und mit Sonden behandelt, wie beschrieben durch Benton & Davis (W. D. Benton und R. W. Davis [1977] Science 196, 180-182) unter Verwendung von ³²P-markierter cDNA aus Poly-A-enthaltender RNA aus dem Kälbermagen unter Verwendung von α³²P-dCTP und Reverser Transkriptase (T. P. St. John und R. W. Davis [1979] Cell 16, 443-452). Ungefähr 80 rekombinante Phagen, welche intensiv mit der markierten cDNA hybridisieren, wurden von den Platten gepickt und in TY-Medium bei 4ºC gelagert. Proben der intakten Phagen wurden durch Übernachtwachstum auf CGE5-Zellen amplifiziert, durch Zentrifugieren geerntet und einer Elektrophorese in einem 2%-igen Agarosegel, enthaltend 0,37 M Tris.Glycin, pH 9,5, ausgesetzt und nach Behandlung mit 0,2 N NaOH für eine Stunde und Neutralisierung in 0,5M Tris.HCl, pH 7,4 mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Mig ation ist umgekehrt proportional zum Log der Größe der Phagen-DNA und eRIaubte die Selektion von acht Phagen, welche insertierte DNA von einer Größe von 1000 bis 2000 Basenpaaren enthielten. Doppelsträngige RFI-DNA wurde aus diesen acht Phagen mit Hilfe der Methode von Moses et al. (P. B. Moses, J. D. Boeke, K. Horiuchi & N. D. Zinder [1980], Virology 104, 267) hergestellt. Diese DNA wurde mit HindIII geschnitten und die resultierenden Fragmente auf einem Agarosegel analysiert um zu bestätigen, daß sich das Insert an der HindIII-Stelle befand und die vorhergesehene Größe hatte. Schließlich wurde die DNA aus vier der rekombinanten Phagen (ungefähr 5 bis 10 ug von jedem) und DNA aus dem Vektor CGF4 mit HindIII geschnitten und die Fragmente nach Denaturierung durch Kochen für 45 Sekunden und Frieren in Trockeneis/Ethanol auf Nitrocellulose gebunden, indem die DNA in Wasser auf kleine Stücke mit 20 · SSC vorbehandelter Nitrocellulose aufgebracht und getrocknet wurde. Nach dem Backen unter Vakuum bei 75 ºC für 1,5 Stunden wurde die auf Nitrocellulose gebundene DNA einem Hybrid-Selektionsverfahren unterzogen, wie beschrieben durch Miller et al. (J. S. Miller, R. P. Ricciardi, B. E. Roberts, B. M. Paterson & M. B. Mathews [1980], J. Mol. Biol. 142, 455-488) unter Verwendung von 2 ug Poly-Aangereicherter RNA aus dem Kälbermagen für jede Hybridisierung. Die eluierte RNA wurde in einem Reticulocyten-Lysatsystem mit Markieren mit 355-Methionin durch das Verfahren von Pelham und Jackson (H. R. B. Pelham & R. J. Jackson [1976] Eur. J. Biochem. 67, 247-256)translatiert, und die resultierenden Proteinprodukte wurden auf einem 10%-igen 0,1% SDS enthaltenden Polyacrylamidgel gemäß Laemmli (U. Laemmli [1970], Nature 227, 680-685)analysiert. Die Ergebnisse der Gelanalyse zeigten, daß alle vier der getesteten Phagen-DNAs mit der Rennin-mRNA hybridisieren, da alle vier eine RNA-Spezies auswählten, welche nach Translation in einem Reticulocyten-Lysat aus dem Kaninchen ein Proteinprodukt ergeben, welches in Bezug auf Größe und immunologische Kriterien mit dem Pre- Prorennin identisch ist. Zwei der vier, 293-207, welche ein Insert von ungefähr 1400 Basenpaaren (bp) aufweist und 293-118/37, welche ein Insert von ungefähr 1250 bp aufweist, wurden zur weiteren Analyse ausgewählt. Die DNA-Inserts wurden durch das Verfahren von Maxam und Gilbert (A. M. Maxam und W. Gilbert [1980] Methods in Enzymology 68, 499-560) sequenziert. Die DNA-Sequenz für das Pre-Prorennin-A-Gen (siehe Tafel 1) reicht von Nukleotid 205 bis 1350. Die Nukleotidsequenzen 1-204 und 1351 bis 1460 sind mit dem Pre-Prorennin verknüpft, können aber gegebenfalls entfernt werden, und sind für das Gen in Expression nicht essentiell. Geeignete Teile des DNA-Materials von Tafel 1 können durch bekannte Techniken abgetrennt und verwendet werden. Tafel 1
Diese Tafel vereinigt Information von sowohl 293-207 als auch 293- 118/37: Der rekombinante Phage 293-207 enthält ein Insert mit der Sequenz, die in Tafel 1 gezeigt ist von Nukleotid #1 bis mindestens Nukleotid #1360, außer den Nukleotiden 848-961, welche deletiert sind, während Phage 293-118/37 ein Insert mit der Sequenz von Nukleotid #229 bis Nukleotid #1460 enthält. Wie durch die Sequenzierungsergebnisse gezeigt wird, geschieht die Initiierung der Rennin-Synthese bei einem Methionin-Codon (Nukleotide 205-207) und resultiert in einem Pre- Prorennin-Molekül mit 16 zusätzlichen Aminosäuren im Vergleich mit isoliertem Prorennin (die Prorennin-B-Aminosäuresequenz wurde von B. Foltmann et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 2321-2324 (1977) und B. Foltmann et al. J. Biol. Chem. 254, 8447-8456 (1979) veröffentlicht; die Nukleotidsequenzierungsdaten von Tafel 1 sind der erste Hinweis auf die Existenz von Pre-Prorennin). Zusammen tragen die zwei rekombinanten f1- Phagen 293-207 und 293-118/37 die DNA-Sequenz für das gesamte Pre- Prorennin-A-Molekül. Der Prorennin-Teil des Pre-Prorennin-A unterscheidet sich von Prorennin-B durch Aminosäure #290 (Aspartat in Rennin-A und Glycin in Rennin-B, wie beschrieben in Foltmann et al [siehe oben]; die Numerierung der Aminosäurepositionen ist die von Foltmann). An Aminosäureposition #204 ist ein Asparagincodon gezeigt, während Foltmann ein Aspartat an dieser Position angab; dies kann jedoch ein Aminosäuresequenzierungsfehler sein, da die Amide von Aspartat und Glutamat schwer von ihren Säureformen zu unterscheiden sind, während die Codone bei der Nukleotidsequenzierung einfach auseinanderzuhalten sind.
Das in Phage 293-118/37 dargestellte klonierte Rennin-Gen wurde verwendet, um die Eigenschaften der Rinder-Genomkopie oder -Kopien des Rennin-Gens zu untersuchen. Diese Experimente wurden durchgeführt, indem klonierte Rennin-DNA, die mit 32P durch das Verfahren der Nick- Translation (P. W. J. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes und P. Berg [1977], J. Mol. Biol. 113, 237-251) markiert war, mit Rinder-DNA hybridisiert wurde, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten worden war, durch ein Agarosegel aufgetrennt wurde und auf eine Nitrocellulosemembran überführt wurde gemäß dem Verfahren von Southern (E. M. Southern [1975], J. Mol. Biol. 98, 503-517). Die Ergebnisse zeigen, daß die Restriktionsendonuklease-Spaltung der Rinder-DNA mit Enzymen, wie etwa SacI und BgII, die nicht die klonierte Pre-Prorennin-cDNA-Sequenz schneiden, trotzdem häufig mehr als eine DNA-Bande ergibt, die mit der Rennin-Sequenz hybridisiert. Dies legt nahe, (a) daß die genomische Kopie der Rennin-Information zusätzliche DNA enthält, vermutlich intervenierende Sequenzen, welche Restriktionsenzymstellen enthalten, die sich nicht in Rennin-cDNA finden, oder (b) daß mehr als ein Rennin-Gen im Genom existiert und einige Restriktionsenzyme zwischen den Kopien schneiden. Diese letztere Möglichkeit wurde eliminiert durch Hybridisieren von genomischer Rinder-DNA, die durch Restriktion geschnitten worden war, mit ³²P-markierten Sonden, die von den 5'- und 3'-Enden der klonierten Rennin-cDNA stammten. Diese Ergebnisse, z. B. unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI, stehen im Einklang mit einer einzigen genomischen Kopie der Rennin-Codierungsinformation. Dies bedeutet, daß die von B. Foltmann et al beobachteten A- und B-Formen (J. Biol. Chem. 254, 8447-8456 [1979]) höchstwahrscheinlich die Produkte von zwei verschiedenen Alleen des Rennin-Gens sind. Darüber hinaus enthält die genomische Kopie des Rinder-Rennin-Gens intervenierende Sequenzen, und in dieser Hinsicht ist die genomische Kopie von unserem klonierten cDNA-Gen unterschiedlich, welches mit der Messenger-RNA für Pre-Prorennin identisch ist.

6. Expression von Pre-Prorennin in E. coli

Ein Plasmid, pCGE5, das so konstruiert war, um das Erhalten von Expression von Pre-Prorennin in E. coli zu ermöglichen, wurde durch Ligation von drei aus Agarosegel isolierten Segmenten von DNA hergestellt. Das Plasmid pBR322 (4,5 ug) wurde mit Restriktionsendonukleasen HindIII (N. E. Biolabs, 6 Einheiten) und PstI (N. E. Biolabs, 3 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend 50 mM NaCl, 7 mM Tris.Hcl, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol geschnitten. Doppelsträngiger RFI-DNA aus dem rekombinanten Phagen 293-207 (4 ug) wurde mit der Restriktionsendonuklease Kpn I (N. E. Biolabs, 10 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer K (6 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl, pH 7,5 6 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2- Mercaptoethanol) geschnitten. Ungefähr 4,5 pg DNA aus Plasmid pLG400 (L. Quarente, G. Lauer, T. Roberts, M. Ptashne, Cell, 543-553, 1980) wurde mit HindlIl (N. E. Biolabs, 6 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H (60 mM NaCl, 7 mM Tris.HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2;) geschnitten. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die geschnittene DNA aus 293-207 und pLG400 getrennt mit T&sub4;-DNA-Polymerase behandelt (P-L Biochemicals, 10 Einheiten), für 30 Minuten bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer T (25 mM Tris.HCl, pH 8, 6, 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA und jeweils 0,5 mM Desoxynukleotidtriphosphate), um an den Restriktionsschnittstellen stumpfe Enden zu erzeugen. Nach Phenol- Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die pLG400 DNA weiterhin mit Pst I (N. E. Biolabs, 3 Einheiten) für 2 Stunden bei 37ºC in 50 ul Puffer P (50 mM NaCl, 7 mM Tris.HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol) geschnitten, während die 293-207 DNA mit HindIII (N. E. Biolabs, 6 Einheiten) für zwei Stunden bei 37ºC in 50 ul Puffer H geschnitten wurde. Jeder der drei Ansätze Restriktions-geschnittener DNA wurde Phenol-extrahiert, Ether-extrahiert und Ethanol-gefällt und in 30 ul H&sub2;O wieder aufgelöst und auf ein präparatives horizontales 1%-iges Agarosegel aufgebracht. Nach Elektrophorese für 3-4 Stunden bei 70 bis 80 Volt in 40 mM Tris.Acetat, pH 7,2 wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und unter langewelligem ultraviolettem Licht untersucht. Die 500 Basenpaar-(bp)-Bande von 293-207, die 6000 bp-Bande von pLG400 und die 800 bp-Bande von pBR322 wurden herausgeschnitten und die DNA durch Frieren und Auftauen der Gelstückchen extrahiert (Thuring et al., Anal. Biochem., 66, 213 [1975]). Alle drei DNA-Segmente wurden Ethanol gefällt und in H&sub2;O wieder aufgelöst. Ungefähr 0,15 umol jedes Stückes wurde über Nacht bei 14ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L (66 mM Tris.HCl, pH 7,5, 67,7 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 0,75 mM ATP) und T4 DNA-Ligase (N. E. Biolabs, 600 Einheiten) zusammenligiert. Transformationskompetente Zeilen des E. coli-Stammes CGE6 wurden exakt wie in Abschnitt 4 beschrieben hergestellt, und 5 ul der ligierten DNA in 50 ul 50 mM Tris.HCl, pH 7,6 wurde mit 100 ul der Zellen für eine Stunde bei 0ºC vermischt, bei 37ºC für zwei Minuten wärmebehandelt und 10-fach mit frischer Tryptonbouillon verdünnt. Nach Inkubieren für eine Stunde bei 37ºC unter Schütteln wurden die Zellen auf Tryptonplatten, die Ampicillin (20 ug/ml) enthielten, platiert. Es wurden Ampicillin-resistente Kolonien gepickt, und die Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsenzymverdau präpariert und analysiert. Unter diesen Kriterien trugen mehrere Stämme das erwünschte Plasmid pCGE5, Tafel 2. Tafel 2
Die DNA-Sequenz-Analyse ergab, daß die Verbindung zwischen 293-207- DNA und pLG400-DNA wie erwartet war, und somit ist das 5'-Ende des Pre-Prorennins im selben Leseraster mit dem 3'-Ende der I"Z-Fusion von Quarente et al. fusioniert. Plasmid-DNA wurde durch Standardmethoden (D. B. Clewell und D. R. Helinski, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 [1969]) aus einem Stamm hergestellt, der pCGE5 enthielt.
Ein DNA-Fragment, das den Lactose-Operon-Promotor und -Ribosombindestelle trug, wurde aus dem Plasmid pGL101 (L. Quarente, G. Lauer, T. Roberts und M. Ptashne, Cell 20, 543-553 [1981]) durch Schneiden von 10 ug der DNA mit Pvull (N. E. Biolabs, 7,5 Einheiten) und Pst I (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für zwei Stunden bei 37ºC in 100 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, isoliert. Das 850 bp-Segment wurde aus einem praparativen Agarosegel durch Ausschneiden der Bande und Frieren/Auftauen, wie oben beschrieben, isoliert.
Plasmid-pCGE5-DNA (40 ug) wurde mit HindIII (CRI, 70 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 150 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H (siehe oben) geschnitten. Diese DNA wurde anschließend mit der Exonuklease Bal 31 (N. E. Biolabs, 5 Einheiten) für 10 Minuten bei 30ºC in 200 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer B (0,6 M NaCl, 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2;, 20 mM Tris.HCl, pH 8 und 1 mM EDTA) verdaut (siehe Tafel 3). Tafel 3
Analyse durch Gelelektrophorese zeigte, daß die Behandlung mit Bal31 eine ausreichende Anzahl von Nukleotiden entfernte, um einen Satz von Fragmenten zu ergeben, die 5'-Enden nahe dem ATG-Initiationscodon für Pre-Prorennin besaßen. Die DNA wurde unter Verwendung von T&sub4;-DNA- Polymerase wie oben beschrieben mit stumpfen Enden versehen, und dann wurde die DNA (1 ug) teilweise mit Pst I (N. E. Biolabs, 0,06 Einheiten) für 5 Minuten bei 37ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, verdaut. Anschließend wurde diese DNA mit dem 850 bp-DNA-Fragment, welches den Lactose-Operon-Promotor und -Ribosombindestelle enthielt, (0,2 ug) in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend T&sub4;-DNA-Ligase (CRI, 300 Einheiten) in Puffer L zusammenligiert. Transformationskompetente Zellen des E. coli- Stammes CGE7 (NK5031, suIII&spplus;, Iac M5265, nalr, F&supmin;, Bl&supmin;) wurden exakt wie oben beschrieben für Stamm CGE6 hergestellt, und 100 ul der Zellen in Suspension wurden mit 5 ul des Reaktionsgemisches transformiert, inkubiert, hitzegeschockt und zur phenotypischen Expression von Ampicillinresistenz exakt wie oben beschrieben für CGE6-Transformation mit pCGE5 kultiviert. Die Zellen wurden auf MacConkey-Lactose plus Ampicillin (20 ug/ml) Medium platiert. Dunkelrote Kolonien, die β- Galactosidase exprimierten, wurden gepickt und auf β- Galactosidaseaktivität getestet (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics New York, Cold Spring Harbor Laboratory 1972). Die Plasmid-DNA wurde aus zwölf dieser Transformanten isoliert und durch Restriktionsenzymverdau und Agarose- oder Polyacrylamidgel-Elektrophorese analysiert. Ein Stamm, CGE20, trägt den Lactose-Operon-Promotor ungefähr 40 Nukleotide von dem ATG-Initiationscodon der Pre-Prorennin-I"Z-Fusion auf Plasmid pCGE17 (siehe Tafel 4) und produziert mittlere Mengen an β-Galactosidase (ungefähr 1/3 der Menge eines voll-induzierten Lactose&spplus;-Stammes, wie etwa CGE6). Tafel 4
Um ein Plasmid herzustellen, welches das gesamte Pre-Prorennin-Gen mit dem Lactose-Promotor und -Ribosombindestelle fusioniert aufweist, wurde pCGE17-DNA (4 ug) mit BgI II (N. E. Biolabs, 6 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 90 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, geschnitten. Dann wurde Tris.HCl, pH 7,5 zu 100 mM hinzugegeben, und die DNA wurde weiter mit EcoRI (Boehringer/Mannheim, 40 Einheiten) für eine zusätzliche Stunde bei 37ºC geschnitten. Anschließend wurde pBR322-DNA (5 ug) mit Pvu II (N. E. Biolabs, 5 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 45 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, geschnitten, gefolgt von der Zugabe von Tris.HCl, pH 7,5 zu 100 mM und Zugabe von EcoRI (Boehringer/Mannheim, 40 Einheiten) bei weiterer Inkubation bei 37ºC für eine Stunde. Schließlich wurde rekombinanter f1-Phage 293-118/37 RFI- DNA (6 ug) mit Hind III (N. E. Biolabs, 6 Einheiten) für eine Stunde bei 37 ºC in 50 pl Reaktionslösung, enthaltend Puffer H, geschnitten. Nach Phenol-Extration und Ethanol-Fällung wurde die geschnittene DNA mit T&sub4;- DNA-Polymerase (P-L Biochemicals, 10 Einheiten) bei Raumtemperatur für 30 Minuten in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer T, behandelt, um die Hind III-Stelle stumpf zu machen. Dann wurde die wieder aufgelöste Phenol-extrahierte und Ethanol-gefällte DNA mit BgI II (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 30 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, geschnitten. Die drei Restriktions-geschnittenen DNA-Spezies wurden auf ein präparatives horizontales Agarosegel aufgebracht, und das 370 bp pGCE17-Stück, das 2300 bp pBR322-Stück und das 1000 bp 293- 118/37-Stück wurden ausgeschnitten und durch Frieren und Auftauen des Agarose-Stückes eluiert. Nach Ethanol-Fällung wurde die DNA wieder in Wasser aufgelöst, und ungefähr 0,2 umol jedes Stückes wurden für sechs Stunden bei 14ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L und T&sub4;- DNA-Ligase (N. E. Biolabs, 300 Einheiten) zusammenligiert. Der CGE6- Stamm von E. coli wurde mit der ligierten DNA wie oben beschrieben transformiert, und Ampicillin-resistente Kolonien wurden gepickt. Die Analyse der Plasmid-DNA durch Restriktionsenzymspaltung zeigte, daß Stamm CGE24 das Plasmid pCGE21 enthielt (siehe Tafel 5), welches die gesamte Pre-Prorennin-Sequenz mit dem Lactose-Operon-Promotor und - Ribosombindestelle fusioniert enthält. Tafel 5
Zwei Arten der Analyse zeigen, daß dieser Stamm ein authentisches Kälber- Pre-Prorennin synthetisiert. Erstens hemmen Rohextrakte der Zellen die Bindung von jodiertem Rennin an Anti-Rennin-Serum in einem Radioimmun- Assay, der gemäß der Methode von Peak et al (G. J. Peak, J. Morris und M. J. Buckman [1979] "Growth Hormones" in Methods of Hormone Radioimmunoassay, Seiten 223-244 [B. M. Jaffe & H. R. Behrman, Hrsg.] Academic Press, New York) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt wurde: jodiertes Rennin wird in 50 mM Natriumphosphat, pH 6, 0,15 M NaCl, 1% BSA aufbewahrt; RIA-Puffer ist 0,05 M Tris.HCl, pH 8, 0,5% humanes Serumalbumin und 0,1% Natriumnitrit; Inkubation findet bei 4ºC für 18 Stunden statt. Der Grad der Hemmung zeigt, daß ungefähr 0,8 ug Pre-Prorennin in jedem Milliliter Extrakt vorhanden sind (oder ungefähr 4 ug von Pre-Prorennin pro Liter Zellkultur). Zweitens wurden Zellen für 30 Minuten in der mitteleren exponentiellen Phase mit ³&sup5;S-Methionin pulsmarkiert, lysiert und mit Anti-Rennin-Serum immunpräzipitiert (wie beschrieben in J. S. Emtage et al Nature 283 171-175 [1980]). Wenn die Immunpräzipitate auf einen 10%-igen SDS enthaltenden Polyacrylamidgel (U. K. Laemmli & M. Favre, J. Mol Biol. 80 575-599 [1973]) analysiert und autoradioagraphiert wurden, wurde eine Bande beobachtet, die ungefähr die Größe von Pre-Prorennin hatte. Zusätzlich wurde eine Bande der Größe von Rennin ebenfalls beobachtet, was nahelegte, daß die Bakterien das Pre- Prorennin in Rennin prozessieren könnten, oder es könnte eine zweite Initiation der Translation innerhalb der Pre-Prorennin-Sequenz auftreten. Keine der Banden war in Immunpräzipitaten des VoRIäuferstammes CGE6 enthalten, welcher kein Plasmid enthält. Diese Ergebnisse zeigen, daß Pre- Prorennin in E. coli-Zellen hergestellt wird, welche das Plasmid pCGE21 enthalten, und daß der Grad der Produktion ungefähr 600 Moleküle pro Zelle beträgt. Höhere Grade der Produktion werden unter Verwendung desselben Schemas möglich sein, indem Fusionen des Lactose-Operon- Promotors näher zum Initiationscodon von Pre-Prorennin hin erhalten werden.
Extrakte des Stammes CGE24 wurden ebenfalls für Aktivität im Standard- Milchgerinnungs-Assay von B. Foltmann (Methods in Enzymolociv [1970] 19, 421-436) getestet. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß dieser E. coli- Stamm ungefähr 100 Moleküle pro Zelle aktives Rennin herstellt oder ein aktives Fragment von Rennin, welches in der Lage ist, Milch gerinnen zu lassen, während ein Extrakt aus Stamm CGE6, welcher keine Rennin-DNA- Sequenzen enthält, nicht in der Lage ist, Milch gerinnen zu lassen. Der das Plasmid pCGE21 tragende Stamm CGE24 ist in der American Type Culture Collection (ATCC) Zugangsnr. 31929 hinteRIegt.
Stamm CGE24 ist E. coli-Stamm BNN45 (hsdR&supmin; hsdM&spplus;, supE44, supF, Bl&supmin;, met&supmin;) (Advanced Bacterial Genetics, R. W. Davis, D. Botstein, J. R. Roth, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1980, Seite 7), welcher das Plasmid pCGE21 enthält, das durch das nachstehende Diagramm definiert ist. Das Plasmid enthält einen Teil vom Plasmid pBR322 (Nukleotide 2067 bis 4360, siehe J. G. Sutcliffe [1979] Cold Spring Harbor Symposium 43, 77-90) und ein 95 Basenpaar-Fragment, welches durch EcoRI- und Pvull-Stellen abgegrenzt wird vom Plasmid pGL101 (L. Guarente, G. Lauer, T. M. Roberts und M. Ptashne [1980] Cell 20, 543- 553), fusioniert mit ungefähr 1300 Nukleotiden, weiche für das Pre- Prorennin-Molekül codieren (aus rekombinantem f1-Phagen 293-207 und 293-118/37). Die Orientierung ist dergestalt, daß der Lactose-Operon- Promotor die Expression des Pre-Prorennin-Proteins in E. coli steuert. Tafel 6

7. Expression von Methionin-Prorennin in E. coli

Das Pre-Prorennin-Gen enthält drei Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuklease Hhal (erkennt GCGC [siehe Tafel 1]), eine von welchen die "Pre"-Signalsequenz entfernt und die Sequenz für Prorennin minus dem ersten Nukleotid (G) für das Alananincodon übrig läßt.
Demgemäß haben wir dieses partielle Hhal-Verdauprodukt isoliert, welches ein fast intaktes Prorennin-Gen darstellt. 18 ug doppelsträngiger RFI-DNA aus rekombinantem Phagen 293-118/37 wurde mit 12 Einheiten Restriktionsendonuklease HindIII (N. E. Biolabs) in 50 ul Puffer H für eine Stunde bei 37ºC geschnitten. Das ungefähr 123 bp-lange Insert, daß die Rennin-DNA enthält, wurde durch Extraktion der DNA aus der entsprechenden Bande auf einem 1%-igen Agarosegel durch die Frieren/Auftauen-Methode isoliert. Ungefähr 1,5 ug dieser DNA wurde einer partiellen Hhal-Spaltung unterzogen bei Inkubation bei 37ºC für 5 Minuten mit 0,25 Einheiten Hhal (N. E. Biolabs) in 30 ul Puffer P. DNA, welche dem ungeschnittenen plus dem einfach geschnittenen Stück, dem ungefähr 25 Nukleotide vom Beginn von 293-1 18/37 fehlen, entspricht, wurde von einer Bande auf einem 2%-igen Agarosegel isoliert. Plasmid pBR322-DNA (10 ug) wurde mit Restriktionsendonuklease HindIII (N. E. Biolabs, 9 Einheiten) 100 ul Puffer H für eine Stunde bei 37ºC geschnitten. Die DNA wurde Phenol-extrahiert und Ethanol-gefällt. Ungefähr 0,5 umol jeder DNA (d. h. des partiell mit Hhal geschnittenen 293-118/37 und des mit HindIII geschnittenen pBR322) wurden zusammengebracht, in 28 ul Wasser wieder aufgelöst und durch Behandlung mit DNA-Polymerase I (Boehringer/Mannheim, 9 Einheiten) in 40 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer D (60 mM Tris.HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP und jeweils 0,2 mM Desoxynukleotidtriphosphate) für 10 Minuten bei 10ºC mit stumpfen Enden versehen. Ein synthetisches Oligonukleotid, welches eine Xbal Restriktionsendonukleasensequenz plus ein ATGG (d. h. CCATCTAGATGG) enthielt, wurde durch die Triestermethode hergestellt (K. Itakura et al. J. Biol. Chem., 250, 4592 [1975] von Collaborative Research, Inc.) und 5 ug wurden mit α³²-P-ATP unter Verwendung von 6 Einheiten T&sub4;- Polynukleotid-Kinase (P-L Biochemicals) in 25 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer Y (70 mM Tris.HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2- Mercaptoethanol und 2 nmol ATP) kinasebehandelt. Dieses 5'-markierte Oligonukleotid wurde zu 40 ul stumpfendiger Reaktionslösung zusammen mit zusätzlichen Pufferkomponenten hinzugegeben, um die Konzentration konstant zu halten, plus 600 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs). Die Reaktionslösung wurde bei 14ºC über Nacht inkubiert und dann mit der fünffachen Menge einer Lösung von 180 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 5 mM Tris.HCl, pH 8 verdünnt. Nach Erwärmenaufi 65ºC für 5 Minuten für die DNA mit 45 Einheiten Xbal-Restriktionsendonuklease behandelt (15 Einheiten wurden jede Stunde hinzugegeben bei insgesamt 3 Stunden Verdau). Schließlich wurden die Oligonukleotidmonomere von der großen DNA durch Gelfiltration über eine Bio-Gel-A-5 m-Säule (0,68 · 36 cm, siehe oben) abgetrennt. Die ausgeschlossene DNA wurde zusammengenommen, Ethanol-gefällt in 12 ul Wasser wieder aufgelöst und in einer Ligationsreaktionslösung, enthaltend Puffer L plus 300 Einheiten T&sub4;-DNA- Ligase (N. E. Biolabs) bei 14ºC über Nacht inkubiert. 5 ul dieser Ligationsreaktionslösung wurden verwendet, um kompetente Zellen von Stamm CGE6 wie oben beschrieben zu transformieren. Die transformierten Zellen wurden auf Tryptonplatten platiert, die 20 ug/ml Ampicillin enthielten, und Ampicillin-resistente Kolonien wurden gepickt und auf Tetracyclinempfindlichkeit untersucht. Analyse von Plasmid-DNA durch Restriktionsenzymverdau (Xbal plus KpnI) und Polyacrylamidgelelektrophorese zeigten, daß ein Stamm das erwünschte Plasmid pCGE181 trug (d. h., es ergibt ein 250 bp langes Xbal-KpnI- Fragment).
Ungefähr 5 ug der pCGE-181-DNA wird für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer X (150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl, pH 7,9, 6 mM MgCl&sub2;) mit Xbal (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) geschnitten. Nach Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung wird. die DNA durch Behandlung mit T&sub4;-DNA-Polymerase (P-L Biochemicals, 10 Einheiten) für 30 Minuten bei 37 ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer T mit stumpfen Enden versehen. Wieder wird die DNA Phenol-extrahiert und Ethanol-gefällt. Vektor DNA wird hergestellt, indem 5 ug Plasmid pGL101 DNA (L. Guarente et al Cell 20, 543-553 [1980]) mit Pvull (N. E. Biolabs, 5 Einheiten) in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, geschnitten werden. Dann, nach der Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung, wird die wieder aufgelöste DNA mit 0,06 Einheiten intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer/Mannheim) für 30 Minuten bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer C, behandelt. Der mit Pvull geschnittene Vektor (0,2 umol) und das mit Xbal geschnittene Prorennin- DNA-Stück (0,2 umol) werden über Nacht bei 14ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L, zusammenligiert.
Transformationskompetente Zellen des Stammes CGE6 werden wie oben beschrieben hergestellt und mit 5 ul der Ligationsreaktionslösung transformiert. Die resultierenden Zellen werden auf Trypton-Agarplatten mit 20 ug/ml Ampicillin plattiert. Ampicillin-resistente Kolonien werden gepickt und die Plasmid-DNA isoliert und analysiert durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegel-Elektrophorese. Es wird ein Stamm gefunden, welcher die Prorennin-DNA, ligiert an den Lactose-Operon-Promotor und - Ribosombindestelle, aufweist, so daß ein Prorennin-Protein in vivo hergestellt wird (d. h. das mit Prorennin-Sequenz verknüpfte ATG- Initiationscodon befindet sich neun Nukleotide von der Lactose-Operon- Ribosombindestelle entfernt). Wir werden die Menge an synthetisiertem Prorennin bestimmen, indem ein Lysat von Zellen, welche das Plasmid enthalten, einem Radioimmungssay unterzogen werden unter Verwendung von jodiertem, natüRIichem gereinigten Rennin und Anti-Rennin-Serum. Die Größe des Prorennin-Produktes wird durch Elektrophorese der Immunopräzipitate von ³&sup5;S-Methionin-markierten Zellextrakten auf SDS- enthaltenden Polyacrylamidgelen bestimmt werden.

8a. Expression von Methionin-Valin-Rennin in E. coli

Um DNA zu erhalten, welche nur die Rennin-Codierungssequenz enthält, wurde RFI-DNA aus dem rekombinanten Phagen 293-207 mit der Nuklease Bal31 wieder aufgespalten und in einen f1-Phagenvektor ligiert. Die Ligationsprodukte wurden kloniert, und eine Genbank der wieder aufgespaltenen Rennin-DNA hergestellt. Insbesondere wurden 8 ug der 293-207-Phagen-RFI-DNA mit 6 Einheiten HindIII (N. E. Biolabs) in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H, für eine Stunde bei 37ºC geschnitten. Nach Phenol- und Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA wieder in 20 ul Wasser aufgelöst und mit 1,25 Einheiten Bal31 (N. E. Biolabs) in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer B, für 30 Minuten bei 30ºC behandelt. Die Reaktion wurde durch Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung beendet. Die mit Bal31 wieder aufgespaltenen DNA- Fragmente im Größenbereich von 500 bis 1000 bp wurden aus einem 1,5 %-igen Agarosegel durch die Frieren/Auftauen-Technik isoliert, auf die oben hingewiesen wurde. Die wieder aufgespaltene DNA wurde mit stumpfen Enden versehen durch Behandlung mit DNA-Polymerase-I (Boehringer/Mannheim, 9 Einheiten) in 40 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer D, für 10 Minuten bei 10ºC. Synthetische Oligonukleotidlinker (insbesondere HindIII 8-mer CAAGCTTG; 5,0 ug von Collaborative Research, Inc.) wurden zusammen mit ³²P-ATP unter Verwendung von 6 Einheiten T&sub4;-Polynukleotidkinase (P-L Biochemicals) in 25 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer Y, kinase-behandelt. Dieses markierte Oligonukleotid wurde zu den 40 ul stumpfe-Enden-Reaktionslösung hinzugegeben zusammen mit zusätzlichen Pufferkomponenten, um die Konzentration konstant zu halten, plus 600 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs). Die Reaktionslösung wurde bei 14ºC über Nacht inkubiert. Anschließend wurde die Reaktionslösung mit 250 ul einer Lösung aus 60 mM NaCl plus 7 mM MgCl&sub2; 5-fach verdünnt und auf 65ºC für 5 Minuten erwärmt. Nach dem Abkühlen des Reaktionsgemisches wurden insgesamt 45 Einheiten HindIII Restriktionsendonuklease (N. E. Biolabs) hinzugegeben, jeweils 15 Einheiten pro Stunde bei insgesamt drei Zugaben und drei Stunden Inkubation bei 37ºC. Die Oligonukleotid-Linkermonomere wurden aus dem Gemisch durch Eluieren über eine Biogel-A-5 m Säule (0,68 · 36 cm, Bio Rad) in Säulenpuffer (10 mM Tris. HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) entfernt. Der ausgeschlossene Peak wurde Ethanol-gefällt, und die DNA (ungefähr 0,5 umol) wurde zu einer 20 ul Ligationsreaktionslösung, enthaltend Puffer L, 600 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) und ungefähr 0,5 umol CGF4 RFI Phagen-DNA (Collaborative Genetics Inc.) hinzugegeben, welche letztere mit HindIII geschnitten worden war und mit Phosphatase wie oben beschrieben behandelt worden war. Nach der Ligation bei 14ºC für 18 Stunden wurden 4 ul einer 40-fachen Verdünnung des Reaktionsgemisches in 50 mM Tris.HCl, pH 7,6 verwendet, um kompetente Zellen des Stammes CGE6 zu transfizieren. Die Transfektion und Platierung für Plaques wurde exakt wie im obigen Abschnitt 4 beschrieben durchgeführt. Ungefähr 500 Plaques wurden pro Platte erhalten; die Sondenuntersuchung nach der Methode von Benton und Davis (Science 196, 180-182 [1977]) unter Verwendung von Nick-translatierter Pre-Prorennin-DNA, die sich auf Plasmid pBR322 befand (Verfahren von P. W. J. Rigby et al [1977] J. Mol. Biol. 113, 237-251), zeigte, daß ungefähr 15% der Plaques Rennin-DNA aufwiesen. Ungefähr 250 von diesen wurden gepickt und in Trypton-Bouillon bei 4ºC gelagert. Analyse der DNA aus mehreren dieser rekombinanten Phagen durch Restriktionsenzymverdau und Agarosegel-Elektrophorese zeigt, daß mehrere Phagen mit Bal31 wieder aufgespaltene Pre-Prorennin-DNA enthalten, dergestalt, daß das 5'-Ende der insertierten Sequenz sich nahe am Anfang der Rennin-Codierungssequenz befindet (d. h. Nukleotid 379 in der in Tafel 1 gezeigten Sequenz).
Einzelsträngige rekombinante f1-Phagen-DNA wird von diesen Phagen wie folgt isoliert. Zunächst wird eine Stammplatte von Phagen hergestellt, indem 0,4 ml einer Übernacht-Kultur von CGE5 mit 50 ul Phagen infiziert wurden, welche von einer Plaque gepickt wurden. Dies wird in eine 150 mm Trypton-Agarplatte in 7 ml 0,7%-igem Soft-Agar gegossen. Die Phagen werden nach Wachstum über Nacht eluiert, indem 12 ml Trypton- Bouillon zu der Platte hinzugegeben werden und für 2 Stunden inkubiert wird. 3 ml dieser Bouillon wird dann mit 0,6 ml einer Polyethylenglykol/NaCl-Lösung gefällt (25% PEG und 2,5 M NaCl) und bei 4ºC für eine Stunde gelagert (K. R. Yamamoto et al, Virology 40, 734-744 [1970]). Nach Zentrifugieren werden die Phagen in 0,3 ml Puffer TEN (10 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM NaCl, 0,5 mM ETDA) resuspendiert. Dann werden die Phagen mit 30 ul einer PEG/NaCl-Lösung gefällt, für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert und zentrifugiert. Die Phagen werden in 50 ul Puffer TEN resuspendiert, und 5,5 ul 1%-iges SDS wird zu jedem Reaktionsgefäß hinzugegeben. Nach Inkubation bei 55ºC für 10 Minuten werden 200 ul TEN hinzugegeben und die Lösungen Phenol-extrahiert, Ether-extrahiert und Ethanol-gefällt. Die Sequenz der in den rekombinanten f1-Phagen insertierten DNA kann durch das Verfahren von Sanger bestimmt werden (F. Sanger et al J. Mol. Biol. 143, 161-178 [1980]) unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotidprimers (ein "universal primer" [Universal-Primer] mit der Sequenz TTGACGGGGAAAG, Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts). Aus der Sammlung von Inserts, die mit Bal31 wieder aufgespalten wurden und in f1 kloniert wurden, wird sich mindestens ein Phage finden, der (293-207-101) genannt wird, welcher den HindIII-Linker an das 5'-Ende von Rennin bei Nukleotid 379 fusioniert hat (d. h. bei dem Codon für Glycin, welches die N-terminale Aminosäure von reifem Rennin ist). Die RFI-DNA (5 ug) des Phagen 293- 207-101 wird mit HindIII (4 Einheiten, N. E. Biolabs) für eine Stunde bei 37 ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H, verdaut. Nach Phenol- Extraktion und Ethanol-Fällung wird die DNA wieder in 20 ul Wasser aufgelöst und mit 10 Einheiten S1-Nuklease (Boehringer/Mannheim) bei 37 ºC für 10 Minuten in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer S (siehe Abschnitt 2 oben) behandelt. Diese DNA wird wiederum Phenol-extrahiert und Ethanol-gefällt. Anschließend werden synthetische Oligonukleotid- Linker (mit der Sequenz CCATCTAGATGG, 5 ug, Collaborative Research, Inc.) mit α-³²P-ATP unter Verwendung von 6 Einheiten T&sub4;-Polynukleotid- Kinase (P-L- Biochemicals) in 25 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer Y, Kinase-behandelt. Dieses kinase-behandelte Oligonukleotid wird an das HindIII-gebundene Insert ligiert, welches mit S1 behandelt worden war (wie oben beschrieben) und aus einem Agarosegel durch die Frieren/Auftauen- Methode isoliert worden war. Das Ligationsgemisch enthält ungefähr 0,8 pmol HindIII-gebundene S1-behandelte Rennin-DNA, 100 umol Kinasebehandelten synthetischen Linker und 600 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) in 20 ul Puffer L. Die Inkubation wird bei 14ºC für 18 Stunden durchgeführt. Die Reaktionslösung wird 6-fach verdünnt mit 100 Pl einer Lösung aus 180 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 5 mM Tris.HCl, pH 8. Nach Erwärmen auf 65ºC für 5 Minuten werden 45 Einheiten der Restriktionsendonuklease Xbal (N. E. Biolabs) in drei Zugaben von jeweils 15 Einheiten während einer dreistündigen Inkubation bei 37ºC hinzugegeben. Oligonukleotid-Monomere sollten von der großen DNA durch Gelfiltration über eine Biogel-A-5 m Säule (0,68 · 36 cm) in Säulenpuffer (siehe oben) abgetrennt werden. Die ausgeschlossene DNA wird Ethanol-gefällt und einer T&sub4;-DNA-Polymerase-Behandlung (P-L Biochemicals, 10 Einheiten) in 50 ul Puffer T unterzogen, um die mit Xbal geschnittenen Enden stumpf zu machen. Nach Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung wird die DNA einem Verdau mit EcoRI (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für 1 Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer R (100 mM Tris.HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl&sub2;) unterzogen. Das Rennin-Fragment (ungefähr 350 bp) kann aus einem 2%-igen Agarosegel isoliert werden. DNA aus Phage 293- 118/37 RFI (5 ul) wird mit HindIII (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H, geschnitten. Nach Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung sollte die DNA bei 37ºC für 30 Minuten mit T&sub4;-DNA-Polymerase (P-L Biochemicals, 10 Einheiten) in 50 ul Puffer T mit stumpfen Enden versehen werden. Anschließend wird nach einer weiteren Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung die DNA mit EcoRI (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer R, geschnitten. Dieses EcoRI-HindIII (stumpf) DNA-Fragment aus Phage 293-1 18/37 (ungefähr 660 bp) wird aus einem 2%-igen Agarosegel isoliert. Plasmid-DNA (5 ug) des Plasmids pGL101 wird Pvull (N. E. Biolabs, 4 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Puffer P geschnitten, und anschließend wird die DNA Phenolextrahiert und Ethanol-gefällt. Nach der Behandlung mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (0,1 Einheit, Boehringer/Mannheim) in 50 ul Puffer C wird die DNA wiederum Phenol-extrahiert und Ethanol-gefällt. Eine Ligationsreaktion wird bei 14ºC für 18 Stunden unter Verwendung von 0,2 umol der mit Linkern versehenen Rennin-DNA (Nukleotid 379-731), 0,2 umol Rennin-DNA aus Phage 239-118/37 (Nukleotid 732-1456) und 0,2 umol mit Pvull gespaltenes pGL101 in 20 ul Puffer L unter Verwendung von 300 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) durchgeführt. 5 Mikroliter der Reaktionslösung können verwendet werden, um 100 ul mit Ca&spplus;&spplus;- behandelte CGE4-Zellen (wie oben beschrieben) zu transformieren.
Restriktionsendonukleasenanalyse von Plasmid-DNA aus mehreren Ampicillin-resistenten Kolonien, die von Trypton-Platten mit 20 ug/ml Ampicillin gepickt worden waren, zeigen eine Kolonie mit einem Plasmid, pGE188, welches die Rennin-Sequenz in der richtigen Orientierung enthält, um von dem Lactose-Operon-Promotor exprimiert zu werden.
Wir werden die Menge an synthetisiertem Rennin bestimmen, indem ein Lysat von Zellen, welche das Plasmid enthalten, unter Verwendung von jodiertem natüRIichem gereinigten Rennin und Anti-Rennin-Serum einem Radioimmun-Assay unterzogen wird. Die Größe des Rennin-Produktes wird durch Elektrophorese von Immunopräzipitaten von ³&sup5;S-Methionin-markierten Zellextrakten auf SDS-enthaltenden Polyacrylamidgelen bestimmt werden.
Zusätzlich wird die Menge an in E. coli Zellextrakten vorhandene Menge an aktivem Rennin gemessen werden unter Verwendung einer modifizierten Mikro-Version des Standard-Milchgerinnungs-Assays (B. Foltmann Methods in Enzymology 19, Seiten 421-436 [1970]).

8b. Exoression von Methionin-Rennin-A in E. coli

Ein Plasmid, das die Nukleotidsequenz des Rennin-A-Gens mit einem unmittelbar voranstehenden ATG-Initiationscodon und unter der Kontrolle des lac-Operon-Promotors enthält, kann wie unten beschrieben konstruiert werden. Diese Konstruktion erfordert die Herstellung von drei getrennten Plasmiden, welche in einer schrittweisen Rekombination verwendet werden, um das endgültige Produkt zu liefern.
Das erste herzustellende Plasmid ist eines, welches das ATG- Initiationscodon unmittelbar vor den ersten ungefähr 350 Nukleotiden des Rennin-Gens enthält. Doppelsträngige f1-Phagen-DNA von 293-118/37 (200 ug) wurde mit der Restriktionsendonuklease PstI (N. E. Biolabs, 20 Einheiten) für 150 Minuten bei 37ºC in 100 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer P, verdaut. 11 Mikroliter 100 mM Tris.HCl, pH 7,5 und 4 ul EcoRI (Boehringer/Mannehim, 80 Einheiten/ul) wurden hinzugegeben, und der Verdau wurde bei 37ºC für 60 zusätzliche Minuten fortgesetzt. Die Restriktion wurde durch die Zugabe von 1/10 der Menge an 200 mM EDTA beendet, und DNA-Restriktionsfragmente wurden durch Agarosegel- Elektrophorese in einem 0,6%-igen Agarosegel, enthaltend 40 mM Tris.Acetat, pH 8,3, aufgetrennt. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) gefärbt, und derjenige Teil, welcher die erwünschte 400 bp-Bande enthielt, wurde unter langweiligem ultravioletten Licht sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Die DNA wurde von dem Gel durch die Frieren-Auftauen- Methode getrennt und Ethanol-gefällt. Die DNA wurde wieder in Wasser gelöst und mit der Restriktionsendonuklease Mpsl (N. E. Biolabs, 30 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend 7 0 mM Tris.HCl, pH, 7,4, 10 mM MgCl&sub2;, 6 mM KCl und 1 mM Dithioreitol, verdaut. Diese Reaktion ergab ein Fragment, welches die Sequenz
5'C GGC TTC GGG GAG....
CG AAG CCC CTC....5'
nahe dem Beginn des Rennin-Gens enthielt (das erste Codon der Rennin- Gen-Sequenz ist mit Überstrich versehen und stellt die Nukleotide 379-381 in Tafel 1 dar). Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol- Fällung wurden dieses Fragment und zwei kleine Fragmente, die durch Mspl-Verdau hergestellt wurden, mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA- Polymerase I (Boehringer/Mannheim, 3 Einheiten) für 15 Minuten bei 37ºC in 42 ul Reaktionslösung, enthaltend 0,05 mM Desoxyadenosin- Triphosphat, 6,6 mM Tris.HCl, pH 7,5, 6, 6 mM NaCl, 6,6 mM MgCl&sub2; und 6,6 mM Dithiothreitol, behandelt. Diese Reaktion trennte zwei Nukleotide von der obigen Sequenz ab, um
5' C GGC TTC GGG GAG....
AAG CCC CTC ....5'
zu ergeben.
Nach Phenol-Extraktion und Ether-Extraktion wurde des Desoxyadenosintriphosphat von der Spezies mit höherem Molekulargewicht abgetrennt durch die Zugabe von 0,5 ul 200 mM Spermin, Inkubation auf Eis für 15 Minuten, Zentrifugation für 10 Minuten in einer Mikrozentrifuge bei 4ºC und Zentrifugation des resultierenden Pellets für zweimal 5 Minuten jeweils bei 4ºC und in Gegenwart von 75%-igem Ethanol. Das Spermin wurde durch die Zugabe von 1 ml 75%-igem Ethanol, 0,3 M Natriumacetat und 10 mM Magnesiumacetat zu dem Pellet entfernt, gefolgt von einer einstündigen Inkubation auf Eis und Zentrifugation wie soeben beschrieben.
Eine zweite Behandlung der DNA mit dem Klenow-Fragment von der E. coli DNA-Polymerase I wurde wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß 0,05 mM Desoxycytidintriphosphat anstelle des 0,05 mM Desoxyadenosintriphosphats der vorigen Reaktion verwendet wurden. Dieses Verfahren lieferte ein Fragment mit der Sequenz
5' C GGC TTC GGG GAG....
CCC CTC ....5'
nache dem Anfang des Rennin-Gens. Nach Phenol-Extraktion, Ether- Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA wieder in Wasser gelöst und mit S1-Nuklease (Boehringer/Mannheim, 100 Einheiten) für 30 Minuten bei Raumtemperatur in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer S, behandelt. Dieses Enzym entfernte die 5'-einsträngige DNA von dem Fragment unter Zurücklassen der Sequenz
5' GGG GAG....
CCC CTC ....5'
Somit liegt der Anfang der Rennin-Sequenz am 5'-Ende des DNA- Fragments. Ein synthetisches Oligonukleotid mit einer Clal-Restriktionsstelle und endend mit den Nukleotiden ATG (d. h. CATCGATG, Collaborative Research, Inc., 5 ug) wurde mit α³²P-ATP unter Verwendung von T&sub4;- Polynukleotid-Kinase (P-L Biochemicals, 3 Einheiten) für 30 Minuten bei 37 ºC in 25 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer Y, Kinase-behandelt. Dieser Kinase-behandelte Linker (ungefähr 200 umol) wurden an das behandelte DNA-Fragment (ungefähr 5 umol) durch Inkubation mit T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs, 900 Einheiten) bei 15ºC über Nacht in Puffer L, ligiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf 65ºC für 5 Minuten beendet. Vier Mikroliter eines 10 · Clal-Puffers (1 · = 10 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM MgCl&sub2;) und 10 ul Restriktionsendonuklease Clal (Boehringer/Mannheim, 27 Einheiten) wurden hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei 37 ºC für 1 Stunde inkubiert. Vier Mikroliter wurden zur Analyse auf einem Polyacrylamidgel entnommen, gefolgt von der Zugabe von 1 ul 10 · Clal- Puffer, 10 ul Clal-Enzym und 3 ul Wasser. Dies Gemisch wurde für eine weitere Stunde inkubiert. Die behandelte DNA, die die erwünschten Rennin- Sequenzen enthielt, wurde durch Auftrennung auf einem 2%-igen Agarosegel, enthaltend 40 mM Tris.Acetat-Puffer, pH 8,3, isoliert. Die DNA wurde durch langweilige ultraviolette Strahlung sichtbar gemacht und aus dem Gel durch die Frieren/Auftauen-Methode, wie oben beschrieben, entfernt. Dieses Fragment war dann für die Insertion in den entsprechenden Vektor bereit.
Die Herstellung der Vektor-DNA begann mit dem Verdau von 3,3 ug pBR322-DNA mit 5,4 Einheiten Clal-Endonuklease (Boehringer/Mannheim) für eine Stunde bei 37ºC in 30 ul Reaktionslösung, enthaltend Clal-Puffer. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die Vektor-DNA mit 0,06 Einheiten intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer/Mannheim) bei 37ºC für 15 Minuten in Puffer C behandelt. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde ungefähr 1 umol Vektor-DNA mit ungefähr 2 umol Rennin-Fragment- DNA, wie oben hergestellt, gemischt. Diese zwei DNA-Stücke wurden zusammenligiert in 29 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L und T&sub4;-DNA- Ligase (N. E. Biolabs, 450 Einheiten). Transformationskompetente Zellen des E. coli-Stammes CGE43 (F- (lac-pro)XIII, auch bekannt als Stamm LG90) wurden wie in Abschnitt 4 beschrieben hergestellt und mit der ligierten DNA transformiert. Ampicillin-resistente Kolonien, die auf Platten selektiert wurden, wurden gepickt, und die Plasmid-DNA wurde durch Restriktionsenzym-Verdau analysiert. Es ist notwendig, Teile dieser Plasmide zu sequenzieren, um sicherzustellen, daß die richtige Konstruktion, welche die Linkersequenz CATCGATG angrenzend an den Anfang der Rennin-Gensequenz
GGG GAG....
erhalten worden war. Das Plasmid mit der erwünschten korrekten Sequenz, welches pCGE301 genannt wird, wird dann in Verbindung mit den oben beschriebenen anderen zwei Plasmiden verwendet, um ein endgültiges Plasmid zu ergeben, welches die Expression von Methionin-Rennin in E. coli steuert.
Die Herstellung des zweiten der drei Plasmide erforderte für diese Konstruktion die Subklonierung des Rennin-enthaltenden HindIII-Fragments der doppelsträngigen DNA des rekombinanten Phagen 293-118/37.
Drei Mikrogramm doppelsträngiger f1-Phagen-DNA von 293-118/37 wurden mit der Restriktionsendonuklease HindIII (N. E. Biolabs, 3 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 10 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H plus 7 mM 2-Mercaptoethanol, verdaut. Vier Mikroliter HincII (N. E. Biolabs, 3 Einheiten) wurden hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 37ºC für eine weitere Stunde inkubiert. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol- Fällung wurden ungefähr 1,5 ug dieser DNA mit ungefähr 1 ug pBR322- DNA (vorher mit HindIII und intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb wie vorher beschrieben behandelt) gemischt. Diese zwei DNA-Fragmente wurden über Nacht bei 16ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L und T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs, 600 Einheiten) zusammenligiert. Fünf Mikroliter dieses Gemisches wurde verwendet, um Zellen des E. coli- Stammes CGE6 zu transformieren, und Ampicillin-resistente Kolonien wurden wie oben beschrieben isoliert. Restriktionsenzymspaltung und Agarosegel-Elektrophorese zeigten, daß das resultierende Plasmid pCGE302 aus der Prorennin-Gensequenz aus dem Phagen 293-118/37 besteht, welches in die HindIII-Stelle von pBR322 insertiert ist.
Die Herstellung der dritten Komponente, die für die Konstruktion des Rennin-produzierenden Plasmids nötig war, erforderte den Verdau von 2 ug pGL101 (L. Guarente, G. Lauer, T. M. Roberts und M. Ptashne [1980] siehe oben) DNA mit Restriktionsendonuklease Pvull (N. E. Biolabs, 5 Einheiten) für eine Stunde bei 37ºC in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer H plus 10 mM 2-Mercaptoethanol. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA mit einem Kinasebehandelten synthetischen Oligonukleotid (CATCGATG, Collaborative Research, Inc., ungefähr 200 umol) gemischt und mit T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs, 900 Einheiten) bei 16ºC über Nacht in 30 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L, ligiert. Die Reaktion wurde durch Behandlung bei 65ºC für 5 Minuten beendet. Fünf Mikroliter dieses Gemisches wurden verwendet, um CaCl&sub2;- behandelte Zellen des E. coli-Stammes CGE43 zu transformieren. Plasmid DNA wurde aus mehreren Transformanten hergestellt und Restriktionsenzym-Verdau und Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um das erwünschte Plasmid pCGE303 zu identifizieren, welches mit dem Plasmid pGL101 identisch ist, außer, daß die Pvull-Stelle in eine Clal-Stelle umgewandelt wurde.
Die Konstruktion des endgültigen Plasmids, das die ATG-Rennin-Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des lac-Operon-Promotors enthält, beinhaltet die in vitro-Rekombination der soeben beschriebenen drei Plasmide und ist unten theoretisch ausgeführt. Plasmid pCGE301 wird mit den Restriktionsendonukleasen KpnI und HindIII verdaut, und die resultierenden Fragmente werden mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt. Plasmid pCGE302 wird mit den Restriktionsendonukleasen KpnI, HindIII und BgIII verdaut. Die aus diesen zwei Verfahren hergestellten Fragmente werden dann gemischt und ligiert. Diese DNA wird zur Transformation des E. coli-Stammes CGE43 verwendet. Das Ampicillin-resistente Hauptplasmidprodukt wird pCGE304 sein, enthaltend ATG verknüpft mit der gesamten Rennin-Codierungssequenz.
Das Plasmid pCGE303 wird dann mit den Restriktionsendonukleasen PstI und Clal verdaut und mit intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb behandelt. Plasmid pCGE304 wird ebenfalls mit PstI und Clal verdaut. Die aus diesen zwei Verfahren resultierenden DNA-Fragmente werden zusammengemischt, ligiert und verwendet, um den Stamm CGE43 zu transformieren. Die aus den transformierten Zellen stammenden Ampicillinresistenten Plasmide werden nach Größe, Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenz analysiert, um das erwünschte Plasmid pCGE305 zu finden, welches die ATG-Rennin-Sequenz unter der transkriptionellen Kontrolle des lac-Operon-Promotors aufweist. Dieses Plasmid steuert, wenn es in E. coli vorhanden ist, die Synthese von Methionin-Rennin.

9. Verfahren zum Erhalten von Expression von Pre-Prorennin. Prorennin und Rennin in Saccharomyces cerevisiae

Diese drei Spezies, Pre-Prorennin, Methionin-Prorennin und Methionin-Valin- Rennin können in S. cerevisiae unter Verwendung der Promotor- und anderen transkriptionellen und translationellen Kontrollregionen aus dem Uracil-3-Gen von S. cerevisiae exprimiert werden. Das Hefe-Uracil-3-Gen wurde in ein Plasmid eingebracht (ein Shuttle-Vektor, welcher in Hefe oder E. coli selektiert und gehalten werden kann) in einer solchen Form, daß eine verkürzte Version des β-Galactosidase- oder lac-Z-Gens (es fehlen 22 bp von seinem 5'-Ende) an das 3'-Ende eines Fragmentes des Ura-3-Gens (es fehlen ungefähr 900 bp von seinem 3'-Ende) fusioniert ist. Dies ist die Klasse III-Deletion '35, die von M. Rose, M. J. Casadaban und D. B. Botstein in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 2460-2464 (1981) berichtet wird. Auf diesem Plasmid wird die Expression der β-Galactosidaseaktivität in Hefe von den Uracil-3-Gen-Kontrollregionen gesteuert. Wir werden diese Deletion #35 verwenden, um Expression von Pre-Prorennin, Methionen-Prorennin und Methionin-Valin-Rennin in S. Cerevisiase wie folgt zu erzielen.
Zuerst wird eine vollständigere Deletion der Uracil-3-Codierungssequenz erhalten durch Aufspalten von DNA aus der #35-Deletion mit der Restriktionsendonuklease BamHI, welche am ura3-lacZ-Übergang schneidet. Diese DNA wird wieder aufgespalten mit der Nuklease Bal31, so daß im Durchschnitt 200 bp entfernt werden. Anschließend werden synthetische BamHI-Oligonukleotid-Linker (CRI) an die Enden ligiert, und die DNA wird zusammenligiert, so daß eine Population von Plasmiden existiert, welche BamHI-Stellen in verschiedenen Abständen von der Uracil-Kontrollregion aufweisen. Gelelektrophorese der restriktionsgeschnittenen isolierten Plasmid-DNA zeigt ein Plasmid pCGS210, welches sehr wenig ura3- Codierungssequenz enthält. Sequenzierung von der BamHI-Stelle durch das Verfahren von Maxam und Gilbert bestätigt dies. DNA aus einem solchen geeigneten mit Bal wiederaufgespaltenem klonierten Plasmid wird isoliert. Diese DNA enthält selektierbare Markierungen von E. coli (Ampicillin- Resistenz) und Hefe (Leu2-Prototropie), Replikationsursprünge von E.coli und Hefe, wobei all diese vom Plasmid pRB45 (M. Rose, M. J. Casadaban, D. Botstein, siehe oben) stammen, und die ura3-Kontrollregion mit weniger als 50 Nukleotiden von ura3-Codierungsmaterial. Insbesondere eins dieser Plasmide, welches wir pCGS210 nennen, enthält nur 10 bis 20 Nukleotide ura3-Codierungsmaterial, wie durch DNA-Sequenzierung durch das Verfahren von Maxam und Gilbert bestimmt.
DNA, welche für das 5'-Ende des Pre-Prorennins, Prorennins und Rennins codiert, wird wie folgt erhalten. DNA, welche für das Pre-Prorennin-Gen mit dem ATG-Translations-Initiationscodon und weniger als 20 Nukleotiden an der 5'-Seite des ATG wird aus der oben in Abschnitt 8 beschriebenen mit Bal31-wieder aufgespaltenen Rennin-DNA-f1-Phagenbank erhalten, indem jene Phagen durch Restriktionsenzyme gekoppelt mit Gelelektrophorese untersucht werden, sowie durch Sequenzieren durch die Sanger-Methode (F. Sanger et al.. J. Mol. Biol. 143, 161-178 [1981]). DNA, die für Prorennin codiert, wird aus dem oben in Abschnitt 7 beschriebenen Plasmid pCGE181 erhalten. DNA, welche für Rennin codiert, mit dem ATG-Codon für Translations-Initiation plus einem GTG-Valin-Codon (Phage 293-207- 101) wird aus der Rennin-DNA-f1-Phagenbank erhalten, wie oben in Abschnitt 8a beschrieben, oder DNA, welche für Methionin-Rennin codiert, wird aus dem oben in Abschnitt 8b beschriebenen Plasmid pCGE304 erhalten.
Um Expression in Hefe von jedem dieser DNA-Stücke zu erhalten, können die folgenden Experimente durchgeführt werden. Die DNA, die für Pre- Prorennin, Met-Prorennin, Met-val-Rennin oder Met-Rennin codiert, wird wie oben beschrieben aus dem entsprechenden Phagen oder Plasmid ausgeschnitten. Das Stück wird weiter mit SmA geschnitten, und das erwünschte Fragment, welches für eine Form von Rennin codiert, wird durch Gelelektrophorese isoliert. In ähnlicher Weise wird ein BamHI (stumpfe Enden)-SaII-Stück einer DNA, welche für das 'ZYA-Segment aus E. coli codiert (das Gen für fi-Galactosidase, welchem 22 bp von seinem 5'- Ende fehlen, plus die Gene für Lactose-Permease und Lactose- Transacetylase), aus pRB45 isoliert (M. Rose, M. J. Casadaban und D. Botstein [1981], siehe oben). Anschließend wird das oben beschriebene Plasmid pCGS210 an seiner einzigen BamHI-Stelle geschnitten und wieder mit Bal31-Nuklease für kurze Abstände aufgespalten (z. B. unter Verwendung der Bedingungen von L. Guarente, G. Lauer, M. Ptashne [1980] siehe oben), um ein Stück zu ergeben, welches genug DNA veRIoren hat, um alle übriggebliebenen ura3-Codierungssequenzen zu entfernen, jedoch nicht die Kontrollsequenzen. Diese DNA wird ebenfalls mit SaII geschnitten, und das größte Fragment wird Gel-isoliert. Eine trimolekulare Ligationsreaktion wird unter Verwendung dieses Vektor-Fragmentes plus dem BamHI (stumpfe Enden) SaII-Stück aus pRB45 plus entweder der Pre- Prorennin, Met-Prorennin- oder Met-val-Rennin-DNA, welche mit SmaI geschnitten und Gel-isoliert worden war, durchgeführt. Ein Teil dieser Ligationsreaktionslösung wird zum Transformieren von E. coli-Stamm CGE4 verwendet, und auf MacConkey-Lactose-Platten plus Ampicillin werden rote Kolonien gepickt. Die Isolierung und Restriktionsenzymanalyse der Plasmid-DNA bestätigt die Struktur der erwünschten Plasmide.
Transformation in den Hefestamm CGY 80 (siehe unten), Selektieren für Leucin-Prototrophy und Untersuchen auf blaue Farbe auf Minimal-Plus-Uracil (Überschuß, oder (imitierende Mengen)-Plus-Leucin-Plus-X-Gal (5-Brom-4- chlor-3-indolyl-β-D-galactosid, Bachem, Calif.)-Medium zeigt an, daß das Plasmid die Translation des entsprechenden Rennin-β-Galactosidase- Fusionsproteins unter Uracil-Kontrolle steuert. Schließlich wird der für β- Galactosidase codierende Teil des erwünschten Plasmids entfernt, in dem das Plasmid mit BgIII und SaII geschnitten wird, und das größte Fragment gel-isoliert wird. Dieses Stück wird an das BgIII- HindIII (welche mit synthetischen Oligonukleotid-Linkern, CRI) in eine SaII-Stelle umgewandelt wurde)-Fragment aus Phage 293-118/37 ligiert, um das vollständige Pre- Prorennin-, Prorennin- oder Rennin-Gen wiederherzustellen. Diese Plasmide steuern die Translation von Pre-Prorennin-, Met-Prorennin, Met-Val-Rennin oder Met-Rennin in der Hefe S. cerevisiae.

10. Expression eines Prorennin-Fusionsproteins in Hefe

Aufgrund der leichten Verfügbarkeit des Plasmids pRB71 (M. Rose und D. Botstein, eingereicht zur Veröffentlichung), welches der oben beschriebenen Deletion #35 von ura3 ähnelt (und in M. Rose, M. J. Casadaban und D. Botstein, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci USA 78, 2460-2464), außer, daß 11 Nukleotide des ura3-Codierungsmaterials vor der Bam I-Stelle und dem Lactose-Operon-ZYA-Genmaterial zurückbleiben, haben wir ein Plasmid pCGS28 konstruiert, welches das Gen für Prorennin mit den 11 Nukleotiden des ura3-Codierungsmaterials fusioniert aufweist, so daß ein Fusionsprotein in S. cerevisiae synthetisiert wird. Dieses Fusionsprotein besteht aus dem natüRIichen Prorennin-Molekül, außer daß die ersten vier Aminosäuren von Prorennin durch Methionin-Serin-Lysin-Alanin ersetzt wurden. Aktivierung zur Herstellung von Rennin resultiert in dem VeRIust der ersten 42 Aminosäuren von Prorennin, somit sollten diese ersten vier Aminosäuren keinen Einfluß auf das endgültige Rennin-Produkt haben. Die Einzelheiten dieser Plasmid-Konstruktion sind unten beschrieben.
Um eine effiziente Expression von Prorennin in Hefe zu erhalten, wurde die ura3-Genpromotorregion verwendet. Diese DNA-Sequenz ist kloniert worden und ist auf einem Plasmid erhältlich (M. Rose, M. J. Casadaban und D. Botstein, 1981 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78. 2460-2464). Das Plasmid pRB71, erhalten von M. Rose, enthält die ura3-Promotorregion plus elf Nukleotide des uracil3-Gens an ein Fragment des lacZ-Gens fusioniert, welchem die ersten 22 Nukleotide fehlen. Die Verbindung zwischen den beiden unvollständigen Genen ist eine BamHI-Restriktionsendonuklease- Stelle. Dieses Plasmid enthält auch das EcoRI-A-Fragment aus dem 2-um- Plasmid der Hefe, dem leu2-Gen der Hefe und dem Replikationsursprung plus dem Ampicillin-Resistenzgen aus pBR322, wie beschrieben von M. Rose et al (siehe oben). Somit kann dieses Plasmid vermehrt werden, und sein Vorhandensein kann entweder in E. coli oder in S. cerevisiae selektiert werden.
Um Expression eines Prorennin-Fusionsproteins in Hefe zu erhalten (d. h. fusioniert mit den ersten 11 Nukleotiden des ura3-Gens und unter der Kontrolle des ura3-Promotors), wurden zwei grundlegende Plasmidkonstruktionen hergestellt. Die erste ist eine ura3-Prorennin-lacZ- Fusion, welche, wenn sie sich in Hefe befindet, ein aktives β-Galactosidase- Fusionsprotein liefert, was zeigt, daß der ura3-Promotor die Transkription der erwünschten fusionierten Gene steuert. Die zweite ersetzt den lacZ-Teil durch den Rest des Prorennins und führt zu Hefezellen, welche ein Prorenninmolekül herstellen, welches vier Aminosäuren aufweist, die durch das ura3-Gen gekennzeichnet sind.
Bei der ersten Konstruktion wurde der 5'-Teil des Prorennin-Gens in die IBamHI-Stelle von pRB71 insertiert, so daß ura3, Prorennin und lacZ alle in der im selben Translations-Leseraster voRIiegen. Dies wurde wie folgt erreicht. Doppelsträngige DNA des rekombinanten f1-Phagen 293-118/37 (12 ug), welches das gesamte Prorennin-Gen aufweist, wurde mit 7 Einheiten der SmaI-Restriktionsendonuklease (N. E. Biolabs) für 2 Stunden bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend 20 mM KCl, 6 mM Tris.HCl, pH 8, 6 mM MgCl&sub2; und 6 mM 2-Mercaptoethanol, geschnitten. Die DNA wurde Phenol-extrahiert, Ether-extrahiert und Ethanol-gefällt. Anschließend wurden 250 umol eines synthetischen BamHI-Oligonukleotid-Linkers (CRI, CCGGATCCGG), welcher am 5'-Ende mit Hilfe von T&sub4;-Polynukleotid-Kinase wie oben in Abschnitt 7 beschrieben, phosphoryliert worden war, bei 14ºC über Nacht an die mit BamHI geschnitte Phagen-DNA in 40 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer D und 900 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) ligiert. Nach der Ligation wurde die Reaktionslösung mit der fünffachen Menge Puffer, enthaltend 180 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2; und 5 mM Tris.HCl, pH 8, verdünnt, für 5 Minuten auf 65ºC erwärmt, auf Eis gekühlt und einem Verdau für 3 Stunden mit 15 Einheiten BamHI- Endonuklease unterworfen, wobei die Endonuklease jede Stunde zugegeben wurde. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA wieder in Wasser gelöst und in einem 2%-igen Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. DNA wurde aus derjenigen Bande eluiert, welche dem ungefähr 440 bp BamHI-SmaI (mit BamHI-Linkern) Fragment entspricht, in dem das gefrorene Gelstück zerkleinert wird und die Restflüssigkeit gesammelt wird (Frieren-Auftauen-Methode). Das DNA- Fragment wurde Ethanol-gefällt und in 6 ul Wasser wieder aufgelöst. Ungefähr 5 ug DNA des Plasmids pBR71 wurde mit 20 Einheiten BamHI- Endonuklease (N. E. Biolabs) für 2 Stunden bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer X plus 6 mM 2-Mercaptoethanol, verdaut. Nach Phenol-Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA in 20 ul Wasser wieder aufgelöst und mit 0,1 Einheiten intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer/Mannheim) für 30 Minuten bei 37ºC in 50 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer C, behandelt. Die Phenol-extrahierte, Ethanol-gefällte DNA wurde in 6 ul Wasser wieder aufgelöst und zu einer Ligationsreaktionslösung, enthaltend 6 ul des BamHI-SmaI (mit BamHI-Linkern) Fragments, hinzugegeben, und die Ligation wurde mit 600 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) bei 14 ºC über Nacht in 20 pl Puffer L durchgeführt. Zellen des E. coli-Stammes CGE6 wurden mit der ligierten DNA transformiert, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden wie oben beschrieben erhalten. Ungefähr 200 Transformanten wurden durch die Kolonie-Hybridisierungsmethode von M. Grunstein und D. S. Hogness (1975, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 72, 3961- 3965) unter Verwendung von α-³²P-markierter, Nick-translatierter rekombinanter Phagen-DNA 293-207 getestet. Fast 20% der Transformanten enthielten unter diesen Kriterien Rennin-Sequenzen. Plasmid-DNA wurde aus zehn der Transformanten hergestellt, und die Orientierung des Inserts wurde durch das Muster der durch PstI- Endonuklease-Verdau hergestellten Fragmente bestimmt. Eins der Plasmide, pCGS16, welches das Prorennin-Fragment in der richtigen Orientierung enthielt, wurde verwendet, um S. cerevisiae-Stamm CGY80 zu transformieren (MATa, leu2-3, leu2-112, his3, trol-289, ura3-52), gemäß dem Verfahren von A. Hinnen, J. B. Hicks und G. Fink (1978, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 1929-1933). Hefe-Transformanten, welche aufgrund des Vorhandenseins des leu2-Gens auf dem Plasmid ohne die Zugabe von Leucin wachsen konnten, wurden auf Minimal-Medium-Platten, welche das chromogene Substrat X-gal enthielten (exakt wie bei M. Rose et al. beschrieben, siehe oben) ausgestrichen und mit Uracil, Tryptophan und Histidin angereichert. Alle der untersuchten Transformanten ergaben blaue Kolonien auf dem X-gal-Minimalmedium, was zeigte, daß β-Galactosidase produziert wurde. Dies bedeutet, daß das ura3-Prorennin-lacZ- Fusionsprotein hergestellt wird und daß der translationale Leserahmen für jedes der drei Proteinfragmente derselbe ist.
Dieses Ergebnis legte nahe, daß ein ähnliches Plasmid die Expression eines ura3-Prorennin-Fusionsproteins steuern könnte, wenn die β-Galactosidase- Sequenzen durch den Rest des Prorennin-Gens ersetzt werden. Demgemäß wurden 8 ug des Plasmids pCGS16 mit 5 Einheiten der Restriktionsendonuklease BgIII (N. E. Biolabs) für 1 Stunde bei 37ºC in 80 ul Puffer P verdaut. Anschließend wurden 10 ul 1 M NaCl und 6 ul Wasser zu der Reaktionslösung hinzugegeben, und die DNA wurde weiter mit 16 Einheiten SaII-Endonuklease für 1 Stunde bei 37ºC verdaut. Nach Phenol- Extraktion, Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA mit 0,06 Einheiten intestinaler alkalischer Phosphatase vom Kalb (Boehringer/Mannheim) für 15 Minuten bei 37ºC in 50 ul, enthaltend Puffer C behandelt. Die Reaktion wurde durch Phenol-Extraktion der DNA und Ethanol-Fällung beendet.
Inzwischen wurden ungefähr 15 ug doppelsträngiger DNA des rekombinanten f1-Phagen 293-118/37 mit 12 Einheiten HindIII (N. E. Biolabs) für 2 Stunden bei 37ºC in 100 ul Puffer H gespalten. Nach Phenol- und Ether-Extraktion und Ethanol-Fällung wurde die DNA (6 ug) mit stumpfen Enden versehen durch Behandlung mit 10 Einheiten DNA- Polymerase aus E. coli (Boehringer/Mannheim) für 10 Minuten bei 10ºC in 40 ul Puffer D. Anschließend wurden 250 umol synthetischer SaII- Oligonukleotid-Linker (CRI, GGTCGACC), welcher mit T&sub4;-Polynukleotid- Kinase wie oben beschrieben poshophoryliert worden war, zusammen mit ausreichenden Pufferkomponenten hinzugegeben, um die Konzentration aller Komponenten konstant zu halten. Die Linker wurden durch Inkubation mit 900 Einheiten T&sub4;-DNA-Ligase (N. E. Biolabs) bei 14ºC über Nacht an die DNA ligiert. Anschließend wurde die 5-fache Menge Puffer, bestehend aus 10 mM Tris.HCl, pH 8, 10 mM MgCl&sub2; und 180 mM NaCl, hinzugegeben, die Lösung wurde für 5 Minuten auf 65ºC erwärmt, auf Eis gekühlt und dann für 5 Stunden bei 37ºC unter stündlicher Zugabe von 20 Einheiten der Restriktionsendonuklease SaII (N. E. Biolabs) inkubiert. Nachdem die DNA Phenol-extrahiert, Ether-extrahiert und Ethanol-gefällt worden war, wurde sie in 20 ul Wasser wieder aufgelöst und mit 5 Einheiten BgIII (N. E. Biolabs) für 1 Stunde bei 37ºC in einer 30 ul Menge, enthaltend Puffer P, verdaut. Dann wurde die Reaktionslösung mit 1/10 der Menge an 200 mM EDTA beendet und auf ein 2%-iges Agarosegel gegeben. Die Bande, welche dem ungefähr 1000 bp langen BgIII-HindIII (mit SaII-Linkern versehen) Fragment entspricht, wurde ausgeschnitten, und die DNA wurde durch die oben beschriebene Frieren-Auftauen-Methode rückgewonnen.
Die Ethanol-gefällte pCGS16-DNA, welche mit BgIII und SaII-Endonuklease gespalten worden war, wurde in 13 Pl Wasser wieder aufgelöst zusammen mit dem Gel-isolierten BgIII-HindIII (mit SaII-Linkern versehen) DNA- Fragment von 293-118/37, und die zwei Stücke wurden zusammenligiert in 20 ul Reaktionslösung, enthaltend Puffer L und 600 Einheiten T&sub4;-DNA- Ligase (N. E. Biolabs). Zellen des Stammes CGE6 wurden mit CaCl&sub2; behandelt und mit der ligierten DNA transformiert, wie oben beschrieben. Plasmid-DNA wurde aus fünf verschiedenen Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert und einem Verdau mit BamHI oder PstI plus SaII unterzogen. Die Positionen der Banden auf einem 2%-igen Agarosegel zeigten an, daß die gesamte Prorennin-Sequenz in Plasmid pCGS28 vorhanden ist.
Entsprechend wurde der Hefestamm CGY80 mit der Plasmid-DNA nach der Methode von A. Hinnen, J. B. Hicks und G. Fink (1978, siehe oben) transformiert und Leucin-Prototrophen wurden selektiert. Ein solcher Transformant, CGY116, wurde bis zur exponentiellen Phase in Minimalmedium, enthaltend die geeigneten Aminosäurezusätze, kultiviert, mit 100 uCi ³&sup5;S-L-Methionin für eine halbe Generation bei 30º markiert und durch Schütteln mit Glaskügelchen (250 bis 300 um) für 3 Minuten lysiert. Der Extrakt wurde durch Zentrifugieren klarifiziert und mit Rennin-Antiserum immunopräzipitiert. Das Immunopräzipitat wurde in SDS-Probenpuffer gelöst und eine Elektrophorese in einem 10%-igen Acrylamidgel, enthaltend 0,1 % SDS nach der Methode von U. K. Laemmli und M. Favre (siehe oben) unterzogen. Autoradiographie offenbarte, daß der Stamm CGY116, der das Plasmid pCGS28 enthält, die Synthese eines Proteins steuert, welches mit dem Rennin-Antiserum reagiert und von einer Größe ist, die man für Prorennin erwartet. Darüber hinaus eliminiert überschüssiges, nicht markiertes Rennin, welches während der Immunopräzipitation vorhanden ist, die radioaktive Bande, die sonst in der Prorennin-Position vorhanden ist. Daher stellt der Stamm CGY116 von S. cerevisiae Kälber-Prorennin her, welches mit vier Aminosäuren aus dem ura3-Gen der Hefe anstelle der ersten vier Aminosäuren von Prorennin fusioniert ist. Aktivierung des ura3- Prorennin-Fusionsproteins durch Standardverfahren, die durch B. Foltman (Methods in Enzymology 19, 421-436, 1970) beschrieben sind, sollten aktives Rennin liefern, welches mit dem authentischen Kälber-Rennin-A identisch ist, da das "Pro"-Zymogenpeptid (einschließlich der vier "fremden" Aminosäuren in diesem Fall) während der Aktivierung abgespalten wird.
Stamm CGY116, welcher das Plasmid pCGS28 enthält, ist in der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer 20623 hinteRIegt.
Stamm CGY116 ist der S. cerevisiae-Stamm CGY80 (MATa, leu2-3, leu2- 112, ura3-52, his3 , trp1-289, enthaltend das Plasmid pGS28, welches wie folgt definiert ist (und siehe Tafel 7, unten). Das Plasmid enthält den größten Teil von Plasmid pBR322 (J. G. Sutcliffe [1979] Cold Spring Harbor Symposium 43, 77-90), das EcoRI-A-Fragment des Hefe-2 um-Plasmids (J. L. HaRIey und J. E. Sonelson [1980] Nature 286, 860-865), das SaII-Xhol- Fragment von chromosomaler Hefe-DNA, die das LEU2-Gen enthält (A. Hinnen, J. Hicks und G. R. Fink [1978] Proc. Nat. Acad. Sci USA, 75 1929- 1933), ein Fragment der chromosomalen Hefe-DNA, welche aus einem Teil des ura3-Gens besteht (von HI bis zu einer Stelle, die 11 Nukleotide 3' zur Initiation der Translation liegt, wie in pRB71 plus dem Prorennin-A-Gen aus der BamHI-Stelle be Nukleotid #267 bis zum Ende des Gens. Tafel 7
Wieder bezugnehmend auf Tafel 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenz von Pre-Prorennin A wie dargestellt, die Nukleotidsequenzen für mehrere der Materialien dieser Erfindung. Diese Materialien können aus der gezeigten Nukleotidsequenz durch herkömmliche Verfahren ausgeschnitten werden. In ähnlicher Weise kann die Pre- Prorennin-A-Form in die Prorennin-B-Form umgewandelt werden, indem ein Glycinrest an Position Nummer 290 anstelle des Aspartatrests an dieser Position gesetzt wird. Nützliche Produkte, die man wie in Tafel 1 gezeigt aus dem Pre-Prorennin-A erhält, umfassen die folgenden Nukleotidsequenzen, welche Teil des rekombinanten DNA-Materials sind:
1. Ein Gen, das für ein Polypeptid codiert, welches Rennin-Aktivität zeigt, mit einer Nukleotidsequenz wie in Tafel 1 dargestellt von Nummer 379 bis 1350 und unten wiederholt.
2. Ein Gen, das für ein Polypeptid codiert, welches Pre-Prorennin- Aktivität zeigt und eine Nukleotidsequenz aufweist, wie in Tafel 1 dargestellt von Nummer 205-1350 und unten wiederholt.
3. Ein Gen, das für ein Polypeptid codiert, welches Prorennin- Aktivität zeigt und eine Nukleotidsequenz aufweist, wie in Tafel 1 dargestellt von Nummer 253-1350 und unten wiederholt.
4. Eine Pre-Prorennin-Signalsequenz, die für 16 Aminosäuren codiert, umfassend ein ATG-Initiatorcodon, umfassend Nukleotide 205-252 von Tafel 1. Diese Sequenz steuert die Sekretion von Pre-Prorennin aus Magenzellen, welche es synthetisieren, und somit wird sie, wenn sie mit anderen klonierten Genen verknüpft ist, als geeignet angesehen, um die Sekretion ihrer Proteinprodukte aus den Wirtszellen in den periplasmatischen Raum oder in das Kulturmedium zu steuern. Zusätzlich können diese zusätzlichen Nukleotide, die nicht für eine Renninaktivität erfordeRIich sind, wenn sie in Aminosäuren translatiert werden, bei der Stabilisierung des Enzyms gegen proteolytischen Verdau eine Rolle spielen, während es sich in der Zelle befindet. Dies könnte für die Stabilisierung der klonierten Genprodukte in verschiedenen Wirtszellen und in Lagergegenständen von allgemeinem Nutzen sein.
5. Eine "Pro"- oder Zymogensequenz der Nukleotide Nummer 253- 378 in Tafel 1, welches eine Sequenz von 126 Nukleotiden ist, die für 42 Aminosäuren codieren, welche den Zymogenteil des Prorennin-Moleküls bilden. Diese Sequenz bildet das inaktive Zymogen von Rennin und wird entfernt, um aktives Rennin zu bilden. Das inaktive Zymogen kann eine lange Lebensdauer haben. Es könnte ebenfalls das Rennin-Molekül stabilisieren und somit zur Stabilisierung von Genprodukten und anderen klonierten Genen von allgemeinem Nutzen sein.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "genetisches Material", das von rekombinantem DNA-Material stammt, das genetische Material der Wirtszellen, welche mit rekombinanter DNA transformiert und kloniert worden sind, um Zellen zu erhalten, welche die genetische Information für das erwünschte Produkt enthalten. Rekombinantes DNA-Material wird in seinem normalen Sinn verwendet, um DNA zu bezeichnen, die von zwei oder mehr verschiedenen Quellen abstammt, welche zusammengefügt oder zusammengespleißt wurden, um ein einziges Molekül zu bilden, umfaßt aber auch synthetisierte DNA, die beispielsweise durch chemische Synthese erhalten wurde. NatüRIich können die Rekombinationsverfahren, die zur Isolierung und zur ERIangung des ursprünglichen rekombinanten DNA- Materials verwendet werden, auch Wirtszellen ergeben, welche dann kloniert und kultiviert werden, ohne die Notwendigkeit zur Wiederverwendung von genetischen Rekombinationsverfahren. In einem solchen Fall sagt man, daß die klonierten Zellen von Zellen abstammen, welche ursprünglich mit rekombinanten DNA-Methoden behandelt wurden, und sie werden als Zellen angesehen, die genetisches Material enthalten, welches von rekombinantem DNA-Material stammt.
Wie oben beschrieben, werden rekombinante DNA-Moleküle gebildet, umfassend Gene, die für mindestens ein Polypeptid codieren, welches Milchgerinnungsaktivität aufweist, oder zur Herstellung von solchen Polypeptiden geeignet ist.
Obwohl spezielle Prorennin-, Pre-Prorennin- und Rennin-Gene speziell in Fig. 1 dargestellt sind, sollte klargestellt werden, daß diese Ausdrücke, wie hierin verwendet, funktionelle Äquivalente davon umfassen, die irgendwelche Änderungen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen aufweisen oder Änderungen, welche die Milchgerinnungs- oder katalytische Aktivität des endgültigen Rennin-Produkts nicht signifikant beeinflussen. Somit wird unter dem breiten Ausdruck "Rennin", wie in Rennin, Pre- Prorennin und Prorennin verwendet, jedwede Sequenz von Aminosäuren verstanden, welche Säugermilch gerinnen läßt, wie etwa Rinder- oder Ziegenmilch, und kann somit ausgewählte Fragmente von Rennin umfassen, wie bereits im Stand der Technik sequenziert. Das Rennin, Pre-Prorennin und Prorennin kann nicht-funktionelle Aminosäuresequenzen aufweisen, die damit verknüpft sind, welche durch herkömmliche Verfahren entfernt werden können, um die erwünschte Aktivität des Polypeptids zu verstärken.
Wie oben erwähnt, existiert Kälberrennin in zwei allelischen Formen A und B, welche sich an der Aminosäuresequenzposition 290 und möglicherweise an der Position 204 unterscheiden. Obwohl das Klonieren und Exprimieren von Rennin A hier beschrieben ist, kann ein Gen für Rennin B einfach aus dem A-Form-Gen durch einfache unten beschriebene Techniken hergestellt werden. Die Expression von Rennin B kann in einer identischen Weise zu derjenigen erhalten werden, die hier für die A-Form beschrieben ist. Um ein Gen für Rennin B zu bilden, könnten Oligonukleotide hergestellt werden, welche diese Regionen, welche zu ändern sind und die erwünschten Änderungen umfassen, chemisch synthetisiert werden. Zum Beispiel würden zwei 20-mer Oligonukleotide, eins mit einer mit den Nukleotiden 847-866 (Tafel 1) identischen Sequenz, außer daß Nukleotid 856 von A nach G geändert wurde, und eins mit einer den Nukleotiden 1099 bis 1118 (Tafel 1) identischen Sequenz, außer daß Nukleotid 1109 von A nach G geändert wurde, synthetisiert und verwendet werden, um die Synthese des zweiten DNA-Stranges von der doppelsträngigen DNA von f1-Phage 293- 118/37 zu primer-iniziieren, welche nach statistischer Verteilung genickt und in Einzelstränge umgewandelt wurde mit Endonuklease III nach dem Verfahren von R. B. Wallace et al (Science [1980] 209, 1396-1400). Die resultierende doppelsträngige zirkuläre DNA würde mit T&sub4;-DNA-Polymerase ligiert und verwendet werden, um einen geeigneten E. coli-Stamm zu transformieren. Ein Gemisch von Phagen wird resultieren, wobei einige das Gen für Rennin A und einige das modifizierte Rennin A-Gen enthalten, welches die eine oder die andere der zwei spezifischen Änderungen enthält. DNA-Sequenzierung des relevanten Restriktionsfragmentes wird die Selektion von Phagen eRIauben, welche jeweils die erwünschten Änderungen enthalten, und ein vollständiges Rennin-B-Gen kann durch Zusammenspleißen der zwei [Fragmente] bei einer geeigneten Restriktionsstelle hergestellt werden. Wenn das in Rennin B umzuwandelnde Rennin A sich von Rennin B nur an der Position 290 unterscheidet, dann braucht nur das synthetische Oligonukleotid verwendet zu werden, welches die Region 1099 bis 1118 umfaßt, und die Sequenz für 847-866 wird nicht verwendet.
Obwohl die Verfahren dieser Erfindung beschreiben, daß von RNA-Material ausgegangen wird, ist es auch möglich, mit der Isolierung des aus der genomischen DNA stammenden Gens zu beginnen. In diesem Fall würden die intervenierenden Sequenzen zuerst ausgespleißt werden, oder es würde ein geeigneter Wirtsorganismus verwendet werden, welcher in der Lage ist, die RNA zu prozessieren, um die intervenierenden Sequenzen zu entfernen. Es ist ebenfalls möglich, damit zu beginnen, die geeignete RNA oder DNA oder Teile davon chemisch zu synthetisieren, und dann hier beschriebene Verfahren anzuwenden, um schließlich die Expression entweder von Rennin, Pre-Prorennin und/oder Prorennin zu erhalten. Darüber hinaus können klonierte Gene für milchgerinnende Proteine von anderen Organismen, wie etwa Schafe, Ziegen, Schweine oder Wasserbüffel, mit den hier beschriebenen Verfahren hergestellt werden, welche Rennin-artige Enzyme ergeben.

Claims

1. Transformierbare lebende Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und. Bakterien, die nicht E. coli sind, welche genetisches Material enthält, das von rekombinantem DNA- Material stammt, und welche in der Lage ist, Rinder-Pre-Pro-Rennin zu exprimieren.

2. Rekombinantes Rinder-Pre-Pro-Rennin-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Pre-Pro-Rennin kodiert, wobei irgendwelche intervenierenden, auf der genomischen für Pre-Pro-Rennin kodierenden DNA vorhandenen Nukleotidsequenzen ausgenommen sind, wobei das Gen operativ mit einem Vektor verknüpft ist, der sich in einer geeigneten Wirtszelle repliziert, welche nicht E. coli ist.

3. Pre-Pro-Rennin-Nukleotidsequenz wie folgt, beginnend mit dem 5'- Ende und endend mit dem 3'-Ende:

4. Transformierbare lebende Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, welche genetisches Material enthält, das von rekombinantem DNA- Material stammt, und welche in der Lage ist, Rinder-Pro-Rennin zu exprimieren.

5. Rekombinantes Rinder-Pro-Rennin-Gen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Pro-Rennin kodiert, wobei irgendwelche intervenierenden, auf der genomischen für Pro-Rennin kodierenden DNA vorhandenen Nukleotidsequenzen ausgenommen sind, wobei das Gen operativ mit einem Vektor verknüpft ist, der sich in einer geeigneten Wirtszelle repliziert, welche nicht E. coli ist.

6. Pro-Rennin-Nukleotidsequenz wie folgt, beginnend mit dem 5'-Ende und endend mit dem 3'-Ende:

7. Rennin-Nukleotidsequenz wie folgt, beginnend mit dem 5'-Ende und endend mit dem 3'-Ende:

8. E. coli, wie in der American Type Culture Collection, Zugangsnummer 31929 hinteRIegt.

9. Plasmid pCGE 21, wie in E. coli der American Type Culture Collection, Zugangsnummer 31929 befindlich.

10. E. coli, transformiert mit dem Plasmid, das in dem in der ATCC unter Nr. 31929 hinteRIegten Stamm enthalten ist.

11. Saccharomyces cerevisiae, American Type Culture Collection, Zugangsnummer 20623.

12. Plasmid pCGS 28, wie in Saccharomyces cerevisiae, American Type Culture Collection, Zugangsnummer 20623 befindlich.

13. Saccharomyces cerevisiae, transformiert mit dem Plasmid, das in dem in der ATCC unter Nr. 20623 hinteRIegten Stamm enthalten ist.

14. Verfahren zum Exprimieren eines Gens, das für Rinder-Pre-Pro-Rennin kodiert, wobei das Verfahren umfaßt: Auswählen des Gens, welches die Nukleotidsequenz nach Anspruch 3 oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt; Auswählen einer Genpromotornukleotidsequenz; Verknüpfen der Genpromotornukleotidsequenz mit dem 5'-Ende des Gens, um rekombinantes DNA-Material zu bilden; und Einbringen des rekombinanten DNA-Materials in eine transformierbare Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, um Expression des Gens zu erhalten.

15. Verfahren zum Exprimieren eines Gens, das für Rinder-Pro-Rennin kodiert, wobei das Verfahren umfaßt: Auswählen des Gens, welches die Nukleotidsequenz nach Anspruch 6 oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt; Auswählen einer Genpromotornukleotidsequenz; Verknüpfen der Genpromotornukleotidsequenz mit dem 5'-Ende des Gens, um rekombinantes DNA-Material zu bilden; und Einbringen des rekombinanten DNA-Materials in eine transformierbare Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, um Expression des Gens zu erhaltenen.

16. Verfahren zum Exprimieren eines Gens, das für Rinder-Rennin kodiert, wobei das Verfahren umfaßt: Auswählen des Gens, welches die Nukleotidsequenz nach Anspruch 7 oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt; Auswählen einer Genpromotornukleotidsequenz; Verknüpfen der Genpromotornukleotidsequenz mit dem 5'-Ende des Gens, um rekombinantes DNA-Material zu bilden; und Einbringen des rekombinanten DNA-Materials in eine transformierbare Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, um Expression des Gens zu erhalten.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, worin das Gen an seinem 5'-Ende ein ATG-Translationsinitiationskodon aufweist, wobei der Promotor ein Transkriptionspromotor ist, und wobei weiterhin vor dem Einbringen in die Zelle eine Translationsinitiator- Nukleotidsequenz bereitgestellt wird.

118. Verfahren nach Anspruch 17, worin der Translationsinitiator eine Ribosom-Bindestelle ist.

19. Verfahren zur Herstellung von Pre-Pro-Rennin oder Pro-Rennin, umfassend Kultivieren einer transformierten lebenden Zelle in einem geeigneten Nährmedium, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, welche genetisches Material enthält, welches von rekombinantem DNA- Material stammt und für die Sequenz von Rinder-Pre-Pro-Rennin oder Rinder-Pro-Rennin kodiert.

20. Verfahren zum Gewinnen von Rinder-Rennin, wobei das Verfahren umfaßt: Aktivieren von Rinder-Pre-Pro-Rennin oder Rinder-Pro-Rennin, das nach Anspruch 19 hergestellt wurde, in einer an sich bekannten Weise, um Rinder-Rennin zu ergeben.

21. Transformierbare lebende Zelle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pilzen, Hefen und Bakterien, die nicht E. coli sind, welche genetisches Material enthält, das von rekombinantem DNA- Material stammt, und welche in der Lage ist, Rinder-Rennin zu exprimieren.

22. Rekombinantes Rinder-Renningen, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz von Rennin kodiert, wobei irgendwelche intervenierenden, auf der genomischen für Rennin kodierenden DNA vorhandenen Nukleotidsequenzen ausgenommen sind, wobei das Gen operativ mit einem Vektor verknüpft ist, der sich in einer geeigneten Wirtszelle repliziert, welche nicht E. coli ist.

23. Pre-Pro-Rennin mit der folgenden Aminosäuresequenz.