DD266115A1 - Verfahren zur isolierung eines regulatorproteins (sigma-faktor) der genexpression in pflanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Regulatorproteins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Pflanzen. Erfindungsgemaess isoliert man aus einem Pflanzenextrakt einen Sigma-Faktor der Transkription durch fraktionierte Trennung mit Hilfe von matrixgebundenem Heparin. Bedingt durch die extrem hohe Affinitaet des pflanzlichen Sigma-Faktors zu Heparin, kann der Sigma-Faktor aus dem 80 000 g-Ueberstand eines Chloroplasten-Schocksaftes (hergestellt durch Behandlung der isolierten Chloroplasten mit einem hypotonischen Puffer) durch Chromatographie an Heparin-Sepharose isoliert werden. Der Sigma-Faktor bindet am Promotor und legt dem Startpunkt der Transkription fest. Mit dem Sigma-Faktor kann ein pflanzenspezifisches In-vitro-Transkriptionssystem aufgebaut werden. Das pflanzliche Regulatorprotein kann in der Gentechnik eingesetzt werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Struktur, Funktion und Steuerung der Zelle wird c/urch den selektiven Abruf der DNS-Information der Gene festgelegt (Genexpression). Das für die Transkription der DNS benötigte System umfaßt die RNS-Poiymerasen und die Regulatorproteine (z.B. Sigma-Faktoren).

In Bakterien werden die zu transkribierenden Gene auf der DNS u.a. mit Hilfe von spezifischen Initiationsfaktoren (Sigma-Faktoren), die die RNS-Polymerase binden, ausgewählt. Die RNS-Polymerase erkennt in Gegenwart des Sigma-Faktors den PromotoiLereich vor dem Strukturgen und bindet mit hoher Affinität daran. In Bacillus subtllls kann man einen entwickluntjsabhengigen Wechsel von Sigma-Faktoren beobachten (R. H. DOI, Arch. Biochem. Biophys. 214,772-781,1982). Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Regulatorprr (eins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Höheren Pflanzen. .

Mit dem erfindungsgemlßen Verfahren wird den Molekularbiologen ein Mittel in die Hand gegeben, die komplizierten Mechanismen der Regu.ation der Genex^ression in Pflanzen zu untersuchen.

Das Verfahren ist einfach und liefert in einem Ein-Schritt-Verfahren einen angereicherten Initiationsfaktor, der für viele Fragestellungen eingesetzt werden kann.

Das Verfahren schafft ΊΙ» Voraussetzung, den pflanzlichen Initiationsfaktor als Partner im homologen Tranukriptionssystem in der Gentechnik einzusetzen.

Durch den Transfer eine t zusätzlichen Sigma-Gens mit vorgeschaltetem regulierbaren Promotorbereich (z. B. durch Licht induzierbar) kann die Stoff produkt ion der Pflanze beeinfluß; werden. Eine Erhöhung des endogenen Spiegels an Sigma-Faktoren hat eine Stimulation der Stoffproduktion zur Folge. Fü' den Gentransfer ist vorerst die Klonierung des Gens des Sigma-Faktors notwendig. Da mit dem urfindungsgemSßen Verfahren ausreichend Protein zur partiellen Sequenzierung gewonnen werden kann, ist mit der Kenntnis der partiellen Sequenz des Sigma-Faktors eine Konstruktion von Gensonden möglich. Nach Isolierung der mRNS aus Pflanzengewebe oder Kulturzellen, nach ihrer Übersetzung in eine cDNS, nach Inserierung dir cDNS in einen Klnnierungsvektor und nach Transformation von E.coil können mit Hilfe der sigmaspe^.ifischen Gensonden die positiven Klone selektioniert werden.

Das Verfahren schafft auch die Voraussetzung für eine mikrobiologische Produktion von Sigma-Faktoren durch die manipulierten Bakterien. Oazu ist jedoch die Konstruktion eines Proteinüberproduzenten anzustreben.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

A. Mikroorganismen

Es sind Verfahren bekannt, Initiationsfaktoren der Transkription (Sigma-Faktoren) aus Mikroorganismen zu isolieren.

Dib Isolierung und Reinigung des Sigma-Faktors der RNS-Polymerase aus E.coil nach DOWE, P.A.et al. (Biochemistry 18, 1344-1351,1979) setzt eine Reinigung des Transkriptionsenzyms (EC 2.7.7.6.) in mehreren Schritten, einschließlich zweier slulenchromatographischer Verfahren, voraus (R. R. BURGESS und J. J. JENDRISAK, Biochemistry 14,4634-4638,1975). Die sich anschließende Abtrennung und Reinigung des Sigma-Faktors umfaßt 3 säulenchromatographische Schritte. Zunächst wird das Holo-Enzym vom Core-Eniym durch schrittweise Elution von einer enzymbeladenen ssDNS-AgaroseSäula>{C. NÜSSLEIN und B. HEYDEN. BBRC 47,282-289,1972) getrennt. Das Holo-Enzym wird nun durch Säulenciiromatographie an Βίο-Rex 70 und DEAE-Zellulose in den Sigma-Faktor und das Core-Enzym gespalten. Die Reinigung des Sigma-Faktors wird durch Gelfiltration an einer Ultragel-AcA 44-SSuIe erreicht.

In Bacillus siibtllls ist die Anwesenheit von verschiedenen Sigma-Faktoren in Abhängigkeit von der Entwicklungsphase den Organismus beobachtet worden. Beispielhaft sei hier ein Verfahren zur Isolierung eines Sigma-Faktors skizziert. Nach Gewinnung einer transkriptionsaktiven, grob goreinigten Fraktion (G. B. SPIEGELMANN et al., J.Biol. Chem. 253,1756-1765, 1978) und nach weiterer Reinigung durch Säulenchromatogrephio an Bio-Gel und DNS-Zellulose kann nach Glyzerin-Gradientenzentrifugation eine RNS-Polymerase, die 100%ig mit dem Sigma-Faktor gesättigt ist, isoliert werden (E. I. HYDE et al., J. [Hol. Chem. 261,16565-16570,1986). Der Sigma-Faktor kann vom Core-Enzym durch Chromatographie an Phosphocellulose bei niedrigen Salzkonzentrationen abgetrennt werden (V.W.WILLIAMSON und R. H. DOI, Mol. Gen. Genet. 161,133-141,1978). Der Sigma-Faktor kann jedoch auch durch Denaturierung des Holo-Enzyms entweder mit SDS und anschließender Gelelektrophorese und nachfolgender Entfernung des SDS (K.WEBER und D.KUTER, J. Biol. Cliem. 246,4504-4509,1971) isoliert werden oder durch Bindung des Holo-Enzyms an Heparin-Sepharose und schrittweise E lution der Untereinheiten unter denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von Harnstoff und unter ansteigender lonenstärke des Puffers (H. STERNBACH et al., Eur. J.Biochem. SO, 51-55,1975).

Aus Sacchiromyces cerevislae sind Transkriptionsfaktoron isoliert und beschrieben worden. Gut charakterisiert ist der Tau-Faktor aus Hefen, der spezifisch an tRNS-Gene bindet und eine Rolle bei der tRNS-Synthese spielt (A. RUET et al., EMBO J 3, 343-350,1984; S. CAMIER et al., EMBO J. 4,491-500,1985). Der Hefeextrakt wird einer Chromatographie an Heparin-Agarose unterzogen. Der Transkriptionsfaktor wird zusammen mit der RNS-Polymerase B (II), jedoch getrennt von der RNS-Polymerase

C, eluiert. Die Reinigung des Faktors erfolgt über Glycerin-Gradientenzentrifugation und Chromatographie an DEAE-Sephadex. Aus der Grünalge Chlamydomonas relnhardli wurde 1976 ein mutmaßlicher Sigma-Faktor isoliert (SJ. SURZYCKI und

D. L. SCHELLENBARGER, PNAS 73,3961-3965,1976). Die Reinigung des Faktors erfolgte über Chromatographie an DEAE-Zellulose und Phosphozellulose-Pll und durch Glyzerin-Gradientenzentrifugation. Es konnte jedoch kein Nachweis der Stimulation der spezifischen Initiation am spezifischen Promotor erbracht werden. In Anwesenheit des Sigma-Faktors wäre eine Reduktion der unspezifischen Transkription zu erwarten.

B. Tiere

Aus tierischen Geweben wurden Transkriptionsfaktoren (TF) isoliert, die wahrscheinlich bei der Initiation der Transkription eine

wesentliche Rolle spielen:

TFIA, TFIB, TFIC und TFID für die Kernpolymerese I (für die Transkription der ribosorna' in Gene) Y. MISHIMA et al., Nucl. Acid Res. 10,6659-6670,1982; R.MEISFELD und N.ARNHEIM, Mol. Cell Biol. 4,221-227,19J4; A.H.CAVANAUGH und E₁A-THOMSON₁J₁BiOLChOm-SeI, 12738-12744,1986), TFIIA, TFIIB, TFIIC und TFIID für die Kernpolymerase It (für die Transkription der mRNS-Gene) (T. MATSUI et al., J. Biol. Chem. 255,

11992-11996,1980),

TFIIIA, TFIIIB und TFIIIC für die Kernpolyrnerase III (für die Transkription der tRNS- und 5S RNS-Gene) (T. SEGALL et al., J. Biol.

Chem. 255 11986-11991,1980).

C. Höhere Pflanzen Die RNS-Polymerase III synthetisiert in intakten Kernen aus Weizenkeimen 4, SS Vorläufer-tRNS und 5 S RNS (T. J. GUILFOYLE et

al., Plant Mol. Biol., 77,95-104,1986). Bei der Isolierung der RNS-Polymerase III gehen die Transkriptionsfaktoren verloren unddamit fällt die exakte In-vltro-Transkription aus.

Ein entsprechendes pflanzliches In-vitro-Transkriptionssystem für die rRNS-Gene und für die mRNS-Gene gibt es ebenfalls noch

nicht.

Transkriptionsfaktoren aus Chloroplasten und Mitochondrion Höherer Pflanzen wurden bisher ebenfalls noch nicht beschrieben. ZM d«t Erfindung

Ziel der Erfindung ist die spezifische Regulation der Transkription pflanzlicher Gene, einschließlich einer gesteuerten Expression von Fremdgenen in '.ransgonischen Pflanzen. Damit soll ein Beitrag zur Ertragssteigerung von Nutzpflanzen geleistet worden.

Darlegung des Wesens der Erfindung Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus Extrakten Höherer Pflanzen bisher unbekannte Initiationsfaktoren der Transkription zu finden und zu reinigen. Erfind'jngsgemäß isoliert man aus einem Pflanzenextrakt ein Regulatorprotein (Sigma-Faktor) durch fraktionierte Trennung mit Hilfe von matrixgebundenem Heparin. Überraschenderweise ist es nicht erforderlich, zuerst das Holo-Enzym (i. e. Core-Enzym mit gebundenem Sigma-Faktor) zu

isolieren, wenn man matrixgebundenes Heparin, insbesondere Heparin-Sepharose, zui Isolierung des Sigma-Faktors aus dom

Pflanzenextrakt einsetzt. Dor Sigma-Faktor besitzt eine extrem hohe Affinität zu Heparin. Die Bindung dos freien Sigma-Faktors

an Heparin kann erst in Anwesenheit denaturierender Agenzien und bei hoher lonenstärke dos Puffers gelöst werden.

Erflndungsgemäß wird das matrixgebundeie Heparin mit dem Pflanzenextrakt behandelt. Danach eluiert man mit einem Mittelsalzpuffer zunächst die RNS-Polymer.ise, wäscht mit viel Starksalzpuffer, oluiert mit einem denaturierenden Starksalzpuffer den Sigtia-Kakior zusammen mit wenigen anderen stark bindenden Proteinen und macht den eluierten Sigma- Faktor durch wiederholte Dialyse wieder funktionsfähig. Als Mittelsalzpuffer wird vorzugsweise oin Tris-Puffer verwendet, der

0,6M (NH₄I₂SO₄ enthält. Geeignete Starksalzpuffer sind beispielsweise Tris-Puffer, Phosphat-Puffer oder Borat-Puffer, die 1M(NH₄)jSO₄,1M NH₄CI bzw. 1 M KCI enthalten. Denaturierende Starksalzpuffer enthalten zusätzlich denaturierende Agenzien, wie

z. B. β M Harnstoff. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Säulenchromatographie oder als Batch-Verfahren durchgeführtwerden.

Die Wahl des Pflenzenmatenals ist entscheidend für die Lösung der gestellten Aufgabe. Vorteilhaft ist es tiispielsweise, wenn

non von jungen, ausgewachsenen Spinatblättern ausgeht.

Will man Initiationsfaktoren des Transkriptionsapparates der Chloroplasten auffinden und isolieren, hat os sich bewährt, die Chloroplasten in intakter Form aus dem pflanzlichen Gewebeverband zu lösen und zu reinigen. Aus 2kg Spinatblättern können

nach einem bereit» beschriebenen Verfahren (S. LERBS et al., EMBO J. 4,1661-1666,1985) ausreichend Chloroplasten für die

Fdktorenprfiperation gewonnen werden. Zur Testung der Faktorenfraktionen ist eine transkriptionsaktive, hochreine RNS- Polymerase aus Spinatchloroplasten geeignet (S.LERBS et al.. Plant Mol. Biol. 2,67-74,1983; S.LERBS et al., EMBO J. 4,1661-

1666,1985). Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise der Sigma-Faktor aus dem 80000g-Überstand des

Chloroplasten-Schocksaftes (hergestellt durch Behandlung der Chloroplasten mit einem hypotonischen Puffer) durch Chromatographie an Heparin-Sepharose stark angereichert werden. Ein wesentlicher Vorteil des orfindungsgemäßer, Verfahrens liegt darin, daß der material- und zeile 'wendige Umwog über die

isolierung und Reinigung des Holo-Enzyms, wie er bei Mikroorganismen üblich ist, eingespart wird.

Die Erfindung eröffnet die Möglichkeit, die Transkription pflanzlicher Gene spezifisch zu regulieren. Fernerhin ist ein Einsatz des Sigma-Faktors zur gesteuerten Expression von Fremdgenen in transgenischen Pflanzen möglich. Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutern, ohne es jedoch einzuschränken. AusfOhrungobelsplble

BslspltM:

Frisch präparierte, gereinigte, Intakte Ghloroplasten aus 2kg Spinstblättern werden in 200ml des hypotonischem Puffers A (5OmMTrIs-HCi, pH7,8,75mM(NH₄)₂SO₄,4mMEDTA,1mMDithiothreitol, 0,5 mMPhenylmethyleulfonyifiuorid, 25% Glycerin) suspendiert. Die Suspension wird dreimal je 15 Minuten mit dem Ultrathurax homogenisiert und 15 Minuten bei 80000 g zentrifugiert. Die Bindung des SOOCOg-Überstandes des Chloroplasten-Schocksaftes an 6ml Heparin-Seor-äiose CI-6B (Pharmacia) erfolgte im Batch-Ve'rahren 30 Minuten. Nach intensivem Waschen mit Puffer A in einer rotierenden Plasteflasche (je 200ml, je 10 Minuten, 5 Wechsel des Waschpuffers) wird die beladene Sepharose in eine Säule gefüllt. Die RNS-Polymerase wird mit Puffer A, der 0,6M (NH₄)ISO₄ enthält, von der Heparin-Sepharose-Säule eluiert und sofort bei -7O⁰C gelagert. Anschließend wird die Heparin-Sepharose-Säule mit 300ml 1M (NH₄)₂SO₄-Puffer über Nacht gewaschen. Der Sigma-Faktor kann zusammen mit wenigen anderen, stark bindenden Proteinen mit 10ml Puffer A, der 1M (NH₄I₂SO₄ und 6M Harnstoff enthält, von der Heparin-Sepharose gelöst werden. Nach intensiver Dialyse gegen 11 Puffer A (dreifacher Wechsel des Bades „ nach jeweils 3 h) kann der Sigma-Faktor im Transkriptionstest eingesetzt werden. Alle Verfahrensschritte werden bei s ^J.-4°C durchgeführt.

Die Analyse der In-vitro-Transkripte des rbcL-Gons aus Spinat — os wurde das 550 bp EcoRI-DNS-Fragment, das mit dem Vektor pUC-18 kloniert ist, als Template verwendet — zeigt, daß der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Sigma-Fak«?' den exakten Startpunkt der Transkription bei -180 bp (E. M. OROZCO et al., Nuc leic Acids Res. 13,1283-1302,1985) festlegt. Die Analyse wurde durch Hybridisierung des isolierten Transkriptes mit dem 5'-"P-markiorten codierenden Strang des EcoRI-Hindlll-DNS-Fragmentes des rbcL-Gen-Plasmids und anschließender Si-Nuklease-Verdauung erbracht.

Claims (10)

1. Verfahren zur isolierung eines Regulatorproteins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem Pflanzenextrakt einen Sigma-Faktor der Transkription durch fraktionierte Trennung mit Hilfe von matrixgebundenem Heparin isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das matrixgebundene Heparin mit dem Pflanzenextrakt behandelt, danach mit einem Mittelse^puffer zunächst die RNS-Polymerase eluiert, anschließend mit viel Starksalzpuffer wäscht, mit einem denaturierenden Starksalzpuffer den Sigma-Faktor zusammen mit wenigen anderen stark bindenden Proteinen eluiert und den eluierten Sigma-Faktor durch wiederholte Dialyse wieder funktionsfähig macht.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als matrixgebundenes Heparin eine Heparin-Sepharose einsetzt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mittelsalzpuffer einen Tris-Puffer verwendet, der 0,6 M (NHJ₂SO₄ enthält.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Starksalzpuffc einen Tris-Puffer, Phosphat-Puffer odp;dorat-Puffer verwendet, der 1 M (NH₄J₂SO₄,1 M NH₄CI bzw. 1M KCI enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als denaturierenden Starksalzpuffer einen Starksalzpuffer einsetzt, der 6 M Harnstoff enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Trennung als Säulenchromatographie durchführt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Trennung als Batch-Verfahren durchführt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pflanzenextrakt einsetzt, der aus Spinatblättern gewonnen wurde.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9. dadurch gekennzeichnet, daß man als

Pflanzenextrakt den Überstand eines Schocksaftes aus intakten, gereinigten Chloroplasten einsetzt.