DE69030449T2

DE69030449T2 - Verfahren und kit zur reinigung von nukleinsäure

Info

Publication number: DE69030449T2
Application number: DE69030449T
Authority: DE
Inventors: Lisa Klein; Melissa Reardon
Original assignee: Boehringer Mannheim Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1989-11-13
Filing date: 1990-07-31
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2010-08-01
Also published as: EP0508985A1; DE69033304D1; EP0747387A2; DE69030449D1; EP0508985A4; US4997932A; ES2100887T3; EP0747388A1; WO1991007422A1; ATE151433T1; EP0747387A3; EP0747388B1; EP0508985B1; DE69033304T2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Nucleinsäuren, etwa DNA und RNA und deren Mischungen aus einer Probe, sowie Kits, die zur Durchführung einer solchen Reinigung brauchbar sind.

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Nucleinsäuren, d.h., DNA und RNA, sind als sogenannter "genetischer Bauplan" aller Zellarten wohlbekannt. Ob Prokaryonten oder Eukaryonten, die Zellen brauchen DNA und RNA für die Herstellung verschiedener Proteine, die für die Lebensfähigkeit erforderlich sind.
Bei einem Großteil der gegenwärtig in den biologischen Wissenschaften durchgeführten Arbeiten ist die Bearbeitung reiner Nucleinsäuren erforderlich. Ob Transformation, Transfektion, Northern- und Southern-Blot, Polymerase- Kettenreaktion etc., bei allen bedarf es einer leicht zugänglichen Quelle für gereinigtes Nucffieinsäure-Material. Außerdem werden gereinigte Nucleinsäuren bei Anwendungen wie etwa "DNA-Fingerabdrücken" in den gerichtsmedizinischen Wissenschaften, sogenannten "RFLP"-Analysen und anderen Anwendungen eingesetzt, bei denen gereinigte DNA oder RNA erforderlich ist.
Nucleinsäuren liegen in den Zellen nicht in freier Form vor, vielmehr stehen sie in vivo in Wechselwirkung mit verschiedenen Molekülen und Organellen und bilden z.B. Nucleoprotein-Komplexe. In biologischen Materialien liegt Nucleinsäure-Material vor, das in Proteinhüllen eingekapseit oder mit Membranen assoziiert ist. Siehe diesbezüglich Rodriquez und Tait, Recombinant DNA Techniques, An Introduction (Benjamin Cummings, 1983), S. 37-38.
Bei den Standardverfahren zur Isolierung von DNA muß die Probe (Gewebe oder Zelle) mit Hilfe verschiedener Methoden lysiert werden, wobei verschiedene Enzyme wie etwa Proteinase K beteiligt sind. Diese Verfahren ergeben eine Mischung aus DNA und Makromolekülen, die getrennt werden müssen. Bei einem klassischen Verfahren zur DNA-Reinigung bedient man sich eines Extraktionsreagens, das organische Lösungsmittel wie etwa Phenol und Chloroform wahlweise mit Isoamylalkohol enthält. Siehe diesbezüglich Murmur, J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961); Gross-Bellard et al., Eur. J. Biochem. 36, 32-38 (1973); Blin et al., Nucl. Acid. Res. 3, 2303-2308 (1976). Bei diesen Verfahren werden die Nucleinsäuren in die wäßrige Phase eines organischen/nichtorganischen (d.h., Wasser) Zweiphasensystems abgetrennt. Da die wäßrige Schicht eine geringere Dichte als der organische Teil des Reagens aufweist, steigt sie in einer Mischung nach oben, wo sie abgetrennt oder extrahiert werden kann.
Zwar ist dies eine standardmäßige Verfahrensweise, doch sind teure Reagenzien und Gerätschaften sowie reichlich Zeit zur Durchführung erforderlich. Zudem sind Phenol und Chloroform gesundheitsschädlich bei der Anwendung, verursachen Verätzungen bei Kontakt mit der Haut und den Schleimhäuten, erfordern umständliche Sicherheitseinrichtungen wie etwa Abzüge zur Vermeidung des Einatmens und stehen im Verdacht, potentielle Karzinogene zu sein. Zudem ist die Verunreinigung der wäßrigen DNA-haltigen Schicht durch das organische Lösungsmittel (Phenol) ein allgegenwärtiges Problem. Durch diese Verunreinigung wird die DNA ohne zusätzliche Reinigungsverfahren für die weitere Bearbeitung unbrauchbar. Wenn sich der Forschende dieses Problems bewußt ist, ergibt sich für ihn die Notwendigkeit, größte Sorgfalt walten zu lassen, insbesondere im Hinblick auf die Grenzfläche zwischen der organischen und nichtorganischen Schicht. Dies kann zu geringeren Ausbeuten an Nucleinsäuren und zusätzlichen Verarbeitungsschritten wie etwa einer vlnachextraktionlv (d.h., Extraktion des verbleibenden, zumeist organischen Materials mit weiteren wäßrigen Lösungsmitteln) führen, was auch häufig der Fall ist.
Die Patentliteratur beschreibt die Anwendung von Techniken wie etwa solchen, die vorstehend im Zusammenhang mit anderen Erfindungen in der Biochemie beschrieben sind. Zum Beispiel lehrt das US-Patent Nr. 4 623 627 die Gewinnung doppelsträngiger DNA unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Phenol/Chloroform-Methode.
Ein weiteres Verfahren, das zur Abtrennung von DNA eingesetzt wird, ist die Ultrazentrifugation mit einem Cäsiumchiond-Gradienten; siehe Glisin et al., Biochemistry 13, 2633-2637 (1974). Bei dieser Methode wird eine DNA-Lösung mit einer Cäsiumchlorid-Lösung oder einer Mischung aus Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid gemischt. Die Mischung wird dann zentrifugiert, wobei sich ein Gradient steigender Salzkonzentrationen ergibt. Die DNA-Moleküle bilden Banden an Positionen innerhalb des Gradienten, die ihrer Schwebedichte entsprechen.
Bei dieser Methode ist jedoch der Einsatz einer Ultrazentrifuge und teurer Chemikalien sowie sehr viel Zeit erforderlich. Zwar ist es ein interessanter, aber nicht der optimale Ansatz, wie aus der Anzahl der Schriften hervorgeht, in denen Varianten dieser allgemeinen Technik gelehrt werden. Siehe z.B. Meese et al., Gene Anal. Tech. 4, 45-49 (1986), wo Guanidin HCl in Kombination mit der Cäsiumchlorid-Gradiententechnik eingesetzt wird.
Eine zweite Gruppe von Verfahrensweisen, die insgesamt als "Säulenreinigung" bezeichnet werden könnten, steht der vorliegenden Erfindung schon näher. Bei der Säulenreinigung wird die Nucleinsäure-haltige Probe auf eine Festphasenmatrix aufgetragen. Beispielsweise beschreiben Shoyab et al., Meth. Enzymol. 68, 199-206 (1979), die Reinigung genomischer DNA mit Hilfe einer Hydroxylapatit- Säulenchromatographie. Das US-Patent Nr. 4 649 119 lehrt, daß Hydroxylapatit als Träger zur Gewinnung von Plasmiden aus Corynebacterium-Bakterien verwendet werden kann.
Ein weiterer Typ einer Säulenreinigung wird bei Potter et al., Cancer Lett. 26, 335-341 (1985), gelehrt. Bei diesem Verfahren wird eine Matrix aus Diethylaminoethyl(DEAE)- Sepharose verwendet, die im folgenden als "DEAE-Matrix" bezeichnet wird.
Bei einer DEAE-Matrix liegt ein positiv geladenes Ion (N&spplus;), das covalent an die Matrix gebunden ist, zusammen mit einem beweglichen Gegenion (Cl&supmin;) vor. Unter geeigneten Bedingungen stehen diese beweglichen Gegenionen für den Austausch mit anderen negativ geladenen Ionen wie etwa Proteinen und Nucleinsäure-Molekülen zur Verfügung. DEAE- Matrices sind bei Säulentrennungen recht üblich, wie bei Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories), S. 130 und 164, gelehrt wird.
Der erste Schritt bei der Ionenaustausch-Säulentrennung ist das Auftragen der Probe auf die Säule. Bei den üblichen Verfahrensweisen wird der Forschende angewiesen, die Probe ohne Störung des Matrixbetts aufzutragen. Darauffolgt ein Spülschritt, im allgemeinen unter Anwendung eines Puffers mit wenig Salz. Potter et al., siehe oben, verlangen das Spülen der probehaltigen Säule mit einem Puffer aus 10 mM Tris, 1 mM EDTA und 0,1 M NaCl. Varianten finden sich z.B. in der europäischen Patentanmeldung 270 017 an Molecular Biosystems, Inc., welches das Spülen mit einer Salzstärke von 0,2 bis 0,5 M lehrt.
Durch den in diesen Zitaten beschriebenen Schritt werden Verunreinigungen abgetrennt, die in der aufgetragenen Probe vorhanden sind. Die Salzkonzentratlon wird niedrig gehalten (d.h., es wird ein Puffer geringer Ionenstärke verwendet), da die Ionen in der Salzlösung mit der an der Säule gebundenen DNA konkurrieren.
Nach dem Spülschritt, bei dem die Verunreinigungen eluiert werden, wird die DNA z.B. mittels Elution aus der Säule aufgefangen. Dabei wird eine höhere Salzkonzentration benötigt, da genau der beim Spülschritt vermiedene Effekt nunmehr erwünscht ist. Daher erfolgt bei Potter, siehe oben, die Elution mit 1,0 M NaCl, während bei der vorstehend erwähnten europäischen Patentanmeldung je nach Beschaffenheit der Nucleinsäure und der verwendeten Säule irgendwo von 0,5 M bis 1,0 M eluiert wird. Wünschenswerterweise wird die Menge an eingesetztem Elutionspuffer so gering wie möglich gehalten. In der Praxis jedoch steht diese Absicht im Widerspruch mit der Erfordernis, eine größere Menge an Puffer einzusetzen, um alle oder soviele der Nucleinsäuren wie möglich zu eluieren.
Andere Zitate lehren unterschiedliche Konzentrationen an Elutionsreagenzien. Das US-Patent Nr. 4 389 396 an d'Hinterland z.B. lehrt eine Gradientenelution unter Verwendung von 0,0 bis 0,5 M NaCl. Das US-Patent Nr. 4 649 119 an Sinskey lehrt eine Elution unter Verwendung von 1,0 M Kaliumphosphat. Tatsächlich ist die konzentrierteste Elutionslösung, die gegenwärtig in der Fachwelt anzutreffen ist, 1,0 M.
EP-A-0 268 946 offenbart ein Verfahren zur Trennung langkettiger Nucleinsäuren durch Einführen einer Probe, welche die Nucleinsäuren enthält, in eine Kassette, die eine poröse, durch Filter begrenzte Matrix enthält, Extrahierenlassen der Nucleinsäuren in die Matrix und Ablassen der verbleibenden Flüssigkeit durch einen Auslaß, Ausspülen anderer Substanzen aus der Matrix mit einer Spüllösung niedriger Ionenstärke und anschließend Eluieren der langkettigen Nucleinsäuren mit einer Lösung hoher Ionenstärke.
Die vorstehend erörterten Ionenaustausch-Reinigungsmethoden halten durchweg an der Lehre in der Fachwelt fest, bei der man angewiesen wird, das Aufbringen auf die Matrix- Oberfläche ohne Zerstörung der Matrix-Oberfläche vorzunehmen.
Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß nach dem Erzeugen einer gleichförmig gemischten Aufschlämmung nach dem Auftragen der Probe die Nucleinsäuren in der gesamten Matrix gleichförmig vermischt sind, was zu einer effektiven Wechselwirkung zwischen den Nucleinsäure-Molekülen und der Ionenaustausch-Matrix führt. Dies wiederum führt zu einer effektiven Gewinnung gereinigter, hochmolekularer Nucleinsäuren.
Auch wurde gefunden, daß es möglich ist, durch Einbeziehen eines wahlfreien "Vorbeschickungsschritts", bei dem vor dem Eluieren der Nucleinsäure eine hochkonzentrierte Lösung eines ionischen Salzes auf die Ionenaustausch-Matrix aufgetragen wird, die Nucleinsäure in einem kleineren Volumen Elutionspuffer zu gewinnen. Auch dies ist ein Ergebnis, das aus dem Stand der Technik nicht zu erwarten wäre.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung einer Probe reiner Nucleinsäure dar. Bei dem Verfahren wird eine Nucleinsäure-haltige Probe, etwa lysierte Prokaryontenoder Eukaryonten-Zellen, Eukaryonten-Gewebe etc. oder eine "rohe" oder "halbgereinigte" Probe mit Nucleinsäuren auf einen anionischen Austauscherträger aufgetragen. Die Probe wird in einer Weise auf die Säule aufgetragen, daß eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf derselben gewährleistet ist. Daran anschließend wird eine verdünnte Lösung eines ionischen Salzes auf die Säule gegeben, wodurch Verunreinigungen aus derselben entfernt werden. Diese Spüllösung wird dann z.B. durch Elution entfernt. Durch Zugabe eines definierten Volumens einer konzentrierten Lösung eines ionischen Salzes kann die Säule "vorbeschickt" werden. Bei Zugabe der Vorbeschickungslösung in definiertem Volumen wird die Nucleinsäure überraschenderweise nicht aus der Säule eluiert; stattdessen wird es möglich, die Nucleinsäure in konzentrierterer Form zu gewinnen, da der anschließend aufgegebene Elutionspuffer mit einem geringeren Volumen als normalerweise erforderlich zugesetzt werden kann.
Entweder sofort nach dem Spülschritt oder nach dem wahlweisen Vorbeschickungsschritt wird ein Elutionspuffer oder eine solche Lösung aufgetragen. Dadurch wird die gereinigte Nucleinsäure von der Säule oder der Matrix entfernt. Die Nucleinsäure wird anschließend aufgefangen.
Beim Auftragen der Spül-, Vorbeschickungs- und Elutionsreagenzien wird das Säulenbett (d.h., die DEAE-Matrix) im Gegensatz zur gleichmäßigen Verteilung der Nucleinsäure- Probe im gesamten Säulenbett nicht gestört.
Die wie hierin beschriebene Erfindung ist ein Verfahren, das sich zur Reinigung von Nucleinsäuren jeglicher Art, darunter Prokaryonten- und Eukaryonten-DNA wie etwa genomische DNA sowie Gesamt-RNA, universell anpassen läßt. Zu den vorstehend beschriebenen Vorteilen kommt hinzu, daß bei dieser Methode in einem einfachen Verfahren keine organischen Lösungsmittel verwendet werden. Sie ist daher sicherer, zeitlich effizienter und einfacher als die gegenwärtig in der Fachwelt angewandten Methoden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die wie hierin beschriebene Erfindung ist hilfreich bei der Trennung von Nucleinsäuren aus einer Probe, wobei es gleichgültig ist, wo die Probe herrührt.
Stammen die Nucleinsäuren aus Prokaryonten- und Eukaryonten-Zellen, so ist, wie man weiß, vor dem Auftragen der Probe auf die Säule oder den Träger eine Lyse erforderlich. Die Einzelheiten dieser Vorbereitungsschritte werden nachstehend für verschiedene Zelltypen erläutert. Zu den Zell- und Gewebetypen, die für die Reinigung von Nucleinsäuren verwendet werden können, gehören sämtliche Stämme von E. coli, Hefe, murines Myelom und menschliche Buffy-Coat-Zellen. Beispiele für feste Gewebe sind Rattenhepatom und homologe Lebergewebe. Es können auch Mäuseschwänze und andere Gewebetypen verwendet werden.
Die lysierte Probe wird auf einen Anionenaustauscher-Träger oder eine solche Säule aufgetragen, der bzw. die mit einer Probe einer Lösung niedriger Ionenstärke äquilibriert wurde, die nachstehend erläutert wird. Bei dem Anionenaustauscher-Träger handelt es sich um ein Material, das den Austausch eines beweglichen negativen Ions durch negativ geladene Nucleinsäuren ermöglicht. In der Fachwelt sind zahlreiche anionische Austauschermaterialien bekannt. Bevorzugt sind DEAE-Sepharose-Träger.
Nach der Äquilibrierung wird die vorbereitete Probe auf die Matrix, die Säule oder den Träger in einer Weise aufgetragen, daß überall eine gleichmäßige Verteilung der Probe ermöglicht wird. Dies wird erreicht durch eine fortschreitende Störung der Matrix, unter Bildung einer gleichförmigen Aufschlämmung aus Probe und Matrix. Dadurch wird eine gleichmäßige Verteilung der Probe über das Säulenbett erzielt. Dies läßt sich mit Hilfe verschiedener Verfahren durchführen, die dem versierten Fachmann zur Verfügung stehen.
Zwar kann die Probe ohne Lösungsmittel aufgetragen werden, doch wird besonders bevorzugt, sie vor dem Aufgeben auf die Säule zu verdünnen. Das Verdünnen erfolgt mit der vorstehend erwähnten Lösung niedriger Ionenstärke. Die Probe kann nahezu beliebig verdünnt werden, wobei praktische Erwägungen wie etwa das Fassungsvermögen der Säule bestimmen, welcher Verdünnungsgrad angemessen ist. Jede zweckmäßige Verdünnung ist machbar, doch ist es vorzuziehen, die Probe in einem Verhältnis irgendwo von etwa 1:1 bis etwa 1:3 (Probe/Verdünnungsmittel) zu verdünnen.
Nachdem die Probe auf die Säule aufgetragen ist und über einen Zeitraum verbleibt, der ausreicht, um den Austausch von Nucleinsäure und gebundenen Ionen zu ermöglichen, vorzugsweise etwa 10 Minuten, was allerdings variieren kann, werden die Verunreinigungen aus der Säule oder der Matrix gespült. In der folgenden Beschreibung des Spülschritts kann die Abtrennung der Spüllösung mittels Zentrifugation, Schwerkraft oder anderer Arten der Abtrennung erfolgen.
Nach dem Auftragen der Probe wird der Säule eine Spüllösung zugegeben. Das Auftragen der Spüllösung erfolgt ohne Störung des Matrixbetts. Diese Lösung ist eine verdünnte Lösung eines ionischen Salzes. "Verdünnt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M. "Salz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein ionisches Salz, vorzugsweise NaCl. Die Erfindung schließt auch andere Salze ein, beispielsweise LiCl, K&sub3;PO&sub4;, NaF oder Kl. Ziel ist die Bereitstellung eines Anions, das mit dem mit der Matrix assoziierten Gegenion konkurriert.
Was die Konzentration anbelangt, so beträgt die bevorzugte Konzentration der Spüllösung etwa 0,3 M.
Nach dem Abtrennen der Spüllösung wird entweder ein Elutionspuffer aufgetragen oder es erfolgt ein Vorbeschickungsschritt. Bei diesem Vorbeschickungsschritt wird eine Menge einer konzentrierten Salzlösung auf die Säule ohne Störung der Matrix aufgetragen. "Konzentriert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konzentration, die höher ist als die Konzentration der verdünnten Lösung des ionischen Salzes und vorzugsweise etwa 0,75 M bis etwa 2,25 M beträgt. Die verschiedenen verwendbaren Salze sind die gleichen, die für die Spüllösung brauchbar sind. Die bevorzugte Konzentration der Vorbeschickungslösung beträgt etwa 1,75 M. Das Volumen der verwendeten Vorbeschickungslösung ist kritisch und kann im Bereich von etwa 1/3 bis etwa 2/3 des Volumens des Matrixbetts liegen. Das Volumen des Matrixsäulenbetts ist ein leicht zu bestimmender Wert, und die Methoden für dessen Bestimmung müssen hier nicht erörtert werden.
Überraschenderweise wird durch diesen Vorbeschickungsschritt die Nucleinsäure nicht von der Säule eluiert, vielmehr ermöglicht er die anschließende Elution von an der Säule gebundenen Nucleinsäuren in einer kleineren Menge Elutionspuffer.
Nach dem Spülschritt oder nach dem Vorbeschickungsschritt, sofern letzterer angewandt wird, wird der Säule, der Matrix oder dem Träger ein Elutionspuffer zugesetzt. Bei dem Elutionspuffer handelt es sich um eine konzentrierte Lösung eines ionischen Salzes, wie vorstehend beschrieben. Wiederum beträgt die bevorzugte Konzentration 1,75 M, und das bevorzugte Salz ist NaCl. Der Elutionspuffer wird auf die Matrix ohne Störung derselben aufgetragen. Bei Anwendung eines Vorbeschickungsschritts ist das zur Abtrennung der gesamten DNA benötigte Volumen an Elutionspuffer geringer als das ohne diesen Schritt erforderliche. Eine minimale Menge an Elutionspuffer gleich etwa 4/3 des Säulenbett-Volumens ist alles was erforderlich ist, wenn ein Vorbeschickungsschritt angewandt wird. Hat das Säulenbett beispielsweise ein Volumen von 1,5 ml, so sind 0,5 ml Vorbeschickungslösung und 2,0 ml Elutionspuffer ausreichend. Nach Abtrennung z.B. durch Elution enthält der Elutionspuffer die Nucleinsäuren. Die Nucleinsäure kann dann je nach den Anforderungen der speziellen Untersuchung ausgefällt oder anderweitig behandelt werden.
Das Vorstehende ist eine verallgemeinerte Vorschrift für die Durchführung der Erfindung. Die folgenden Beispiele werden gebracht, um die bevorzugten Ausführungsformen der vorstehend gegebenen verallgemeinerten Vorschrift zu lehren. Sie sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken und sollten auch nicht so verstanden werden.

Beispiel 1: Probenvorbereitung

Die folgenden Beispiele befassen sich mit der Reinigung von DNA aus unterschiedlichen Zell- und Gewebeproben. Man erkennt, daß die Verfahrensweise für die Probenvorbereitung und Lyse je nach den verschiedenen Probenquellen variiert. Sobald jedoch das Zell-Lysat erhalten wurde, wird es ungeachtet der Herkunft durch sämtliche verbleibenden Stufen der DNA-Reinigung gleich behandelt.

A. Bakterien-Zellen

Bis zu 10¹&sup0; Zellen können in diesem Arbeitsgang vorbereitet werden, wenn ein Matrixbett-Volumen gleich 1,5 ml verwendet wird. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 4ºC mit 12 000xG zentrifugiert. Dies ergibt ein Klümpchen und einen Überstand. Der Überstand wird verworfen, und das Klümpchen wird mit kaltem, sterilem H&sub2;O gewaschen.
Das Klümpchen wird zusammen mit 60 µl RNase A (10 mg/ml) und 160 µl Lysozym (50 mg/ml) in 2 ml Lysierlösung (0,5 M Guanidin HCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 10% Betain und 2% Triton-X) wieder suspendiert. Man mischt durch Umdrehen und inkubiert 30 Minuten lang bei 37ºC.
Das hierin verwendete Lysierreagens ist neu. Es läßt sich für den Einsatz mit sowohl prokaryontischen als auch eukaryontischen Proben anpassen, was atypisch ist. Das Lysierreagens ist eine Zusammensetzung, umfassend etwa 1 bis etwa 15 mM Tris , etwa 0,1 bis etwa 2 mM EDTA, etwa 1% bis etwa 20% (Gew./Vol.) eines amphoteren Tensids wie etwa Betain, etwa 0,1 bis etwa 5% (Vol./Vol.) eines neutralen Tensids wie etwa Triton-X und etwa 0,5 bis etwa 5 M Guanidin HCl. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform umfaßt etwa 10 mM Tris, etwa 1 mM EDTA, etwa 10% (Gew./Vol.) Betain, etwa 2% Triton-X und etwa 0,5 M Guanidin HCl. Das Lysierreagens kann die Form einer "Eintopf"-Zusammensetzung oder die Form eines Kits aufweisen, in dem getrennte Behälter für jedes der genannten Elemente vorliegen sowie ein Behelf zum Aufnehmen derselben wie etwa ein Kasten. Der versierte Fachmann wird bemerken, daß keine anionischen Lösungsmittel im Reagens vorhanden sind. Im allgemeinen ist dies bei Zell-Lysierreagenzien, beispielhaft dargestellt z.B. durch SDS, erforderlich.
Dann wird eine Menge vom 100 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben, und es wird durch Umdrehen gemischt, wonach 30 Minuten lang bei 55-60ºC inkubiert wird.
Die Probe wird dann mit dem 3fachen Volumen Spüllösung (10 mM Tris, 1 mM EDTA und 0,3 M NaCl) verdünnt.
Die Probe ist nun fertig für das Auftragen auf die Säule.

B. Säugerzellen

Man folgt der gleichen Vorschrift wie bei den Bakterien- Zellen, außer daß die Zeilen vor dem Lysieren mit 1% PBS gewaschen werden und die Probe nicht mit Lysozym versetzt wird. Bei einem Matrixbett-Volumen gleich 1,5 ml können bis zu 10&sup9; Zellen eingesetzt werden.

C. Festes Gewebe

Eine 100 mg-Probe festen Gewebes wird zum Einfrieren in flüssigen Stickstoff überführt. Das gefrorene Produkt wird dann in einem vorgekühlten Mörser fein vermahlen. Dieses Pulver wird dann zusammen mit 60 µl RNASE A (10 mg/ml) in 2 ml Lysierlösung wie vorstehend beschrieben gelöst. Man mischt durch behutsames Umdrehen und inkubiert 30 Minuten lang bei 37ºC. Durch Umdrehen wird dann mit 100 µl Proteinase K (20 mg/ml) gemischt, und es wird 3 Stunden lang bei 55-60ºC inkubiert. Die Probe wird dann wie vorstehend beschrieben durch direkte Zugabe von 4 ml Spüllösung auf das 3fache verdünnt.

D. Buffy-Coat-Probe

Bis zu 30 ml Vollblut werden in Gegenwart eines Antikoagulans aufgezogen. Aus dem Voliblut wird mit Hilfe eines Ficoll -Gradienten unter Anwendung der üblichen Techniken, die in der Fachwelt bekannt und anerkannt sind, eine Buffy- Coat-Probe hergestellt. Die geklärten Buffy-Coat-Zellen werden in ein konisches Röhrchen mit Schraubverschluß überführt.
Die Buffy-Coats werden in 2 ml des obigen Lysierpuffers wieder suspendiert, und es werden 60 µl RNase A (10 mg/ml) zugegeben. Man mischt durch behutsames Umdrehen und inkubiert 30 Minuten lang bei 37ºC. Es werden 100 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt. Man mischt durch Umdrehen und inkubiert 30 Minuten lang bei 55-60ºC. Man verdünnt auf das 3fache durch direkte Zugabe von 4 ml Spüllösung.

E. Mausschwanz

Ein 1,5 cm-Stück eines frischen Mausschwanzes wird in ein vorgekühltes Eppendorf-Röhrchen gegeben und auf Eis gelegt. Die Haare werden abgesengt, und der Schwanz wird in 95% Ethanol eingetaucht. Der Schwanz wird abgewischt und gut zerkleinert. Wie oben wird die Probe in 2 ml Lysierpuffer wieder suspendiert, 100 µl Proteinase K (20 mg/ml) werden zugesetzt, und unter ständigem Schütteln wird bei 55-60ºC über Nacht inkubiert. Nach dieser Inkubation sollte die Mischung wie ein bräunlicher Schlamm aussehen. Es werden 60 µl RNase A (10 mg/ml) zugegeben. Man mischt durch Umdrehen und inkubiert 30 Minuten lang bei 55-60ºC. Durch direkte Zugabe von 4 ml Spüllösung wird auf das 3fache verdünnt. Zur Sedimentierung großer Teilchen wird kurz zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig abpipettiert und auf die Säule aufgetragen.

Beispiel 2: Äquilibrierung der Säule

Während des Lysiervorgangs wird die Reinigungssäule äquillbriert. Auf die Säule werden 6 ml der wie vorstehend beschriebenen Spüllösung auf die Matrix-Oberfläche aufgetragen. Die Spüllösung wird mittels Schwerkraft eluiert und wird verworfen. Vor Zugabe der Probe wird das untere Ende der Säule mit einer Kappe fest verschlossen.

Beispiel 3: Reinigungsvorgang

Mit einer sterilen 10 ml-Pipette werden 6 ml Probe, hergestellt z.B. wie im vorstehenden Beispiel, auf das Säulenbett aufgetragen, das wie in Beispiel 2 äquilibriert wurde. Die Matrix-Oberfläche wird zunehmend gestört, wodurch sich eine gleichförmig gemischte Aufschlämmung bildet.
Bei der besten gegenwärtig bekannten Methode zur Bildung der Lysat/Matrix-Aufschlämmung wird die Auslaufspitze einer das Lysat enthaltenden Pipette so gehalten, daß sie gerade noch keinen Kontakt zur Oberfläche der Matrix hat. Das Lysat wird dann abgelassen, so daß es in langsamem Strom aus der Spitze fließt, welcher die Oberfläche der Matrix stört, so daß sich die Teilchen der Matrix mit dem Lysat vermischen, unter Bildung einer trüben Dispersion. Die Spitze der Pipette wird zunehmend in die Matrix abgesenkt, während der Strom aufrechterhalten wird, so daß vom oberen zum unteren Ende der Säule hin ständig eine trübe Dispersion von Matrix-Teilchen im Lysat erzeugt wird, woraus sich eine im wesentlichen gleichmäßig gemischte Lysat/Matrix-Aufschlämmung ergibt.
Dies ist zwar die bevorzugte Methode, doch können auch andere, weniger zweckmäßige Methoden des Mischen angewandt werden, die im Umfang der Erfindung liegen. Beispielsweise kann das Mischen auch durch Umdrehen erfolgen, obwohl diese Methode dazu führen kann, daß Matrix-Teilchen an der gesamten Innenseite der Säule haften. Auch werden die Scherkräfte auf die DNA in ungünstiger Weise erhöht, so daß ein Fragmentierungsrisiko für die DNA besteht. Auch Rühren läßt sich anwenden, ist aber weniger günstig, da es die Unversehrtheit des Matrix-Materials beeinträchtigt. Dann läßt man dieses Säulenbett 10 Minuten lang absetzen.
Die Kappe am unteren Ende wird entfernt, und die Säule läuft durch die Schwerkraft aus. Um Druck anzulegen, kann eine 10 ml-Spritze verwendet werden, doch sollte die Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min nicht übersteigen.
Die Säulenmatrix wird dann durch Zugabe von etwa 3 ml der vorstehend beschriebenen Spüllösung gespült. Diese Spüllösung wird mittels Schwerkraft eluiert. Alternativ wird die Säule zum Eluieren der Spüllösung mit geringer Geschwindigkeit 1 Minute lang mit 41 g in einem Schwenkbecherrotor zentrifugiert.
Die Spüllösung wird dann aufgefangen und verworfen.
Anschließend werden 0,5 ml Vorbeschickungslösung wie beschrieben auf das Matrixbett aufgetragen und mittels Schwerkraft oder durch Zentrifugieren eluiert.
Die Vorbeschickungslösung wird dann aufgefangen und verworfen.
Die Säule wird dann vorsichtig in ein neues Auffangröhrchen gestellt, wo 2 ml Elutionslösung aufgetragen werden. Wiederum kann entweder die Schwerkraft oder das Zentrifugieren angewandt werden. Das Eluat enthält die gereinigte DNA, die wie vorstehend angegeben weiterbehandelt werden kann.

Beispiel 4

Zur Gewinnung von Nucleinsäuren aus Prokaryonten-Zellen wurde die in den Beispielen 1-3 beschriebene Vorschrift befolgt.
Eine Probe des E. coli-Stammes MM294 (10¹&sup0; Zellen) wurde 5 Minuten lang bei 4ºC mit 12 000xg zentrifugiert, wobei sich ein Klümpchen und ein Überstand ergab. Der Überstand wurde verworfen, und das Klümpchen wurde mit kaltem, sterilem H&sub2;O gewaschen.
Das Klümpchen wurde mit 60 µl RNase A (10 mg/ml) und 160 µl Lysozym (50 mg/ml) in 2 ml der in Beispiel 1 beschriebenen Lysierlösung wieder suspendiert. Die resultierende Kombination wurde durch Umdrehen gemischt und 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden 100 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugegeben.
Nach der Inkubation wurde die Probe mit Spüllösung wie in Beispiel 1 beschrieben (10 mM Tris, 0,1 M EDTA und 0,3 M NaCl) auf das 3fache verdünnt.
Während der Lyse der Probe wurde die Reinigungssäule äquilibriert. Verwendet wurde bei diesem Beispiel eine Säule mit DEAE-Sepharose "Fast Flow" (Pharmacia; Ausschlußgrenze für globuläre Proteine: 4.106 Dalton; Trockenkorndurchmesser 45-165 µm; Ionenkapazität 100-160 mmol/g; pH-Stabilität 2- 14) in einer Kassette, die mit einem Einlaß und einem Auslaß ausgestattet war. Die Säulenäquilibrierung wurde unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Die Reinigung erfolgte dann in Anlehnung an die in Beispiel 3 beschriebene Vorschrift. Die 6 ml an lysierter Probe wurden auf das DEAE-Sepharose-Bett aufgetragen, wobei die Matrix zunehmend gestört wurde und sich eine gleichmäßig gemischte Aufschlämmung bildete. Dieser Schritt ist wichtig und unterscheidet sich von den üblichen und bekannten Vorschriften, bei denen der Anwender die Matrix- Oberfläche nicht stören soll.
Die Matrix setzte sich 10 Minuten lang. Dann wurde der Auslaß geöffnet, was zum Ablaufen durch Schwerkraft führte. Auch hier gelten für das Anlegen eines Drucks zur Sicherung einer beständigen Fließgeschwindigkeit die Maßgaben von Beispiel 3.
Die Matrix wurde dann durch Auftragen von 3 ml Spüllösung (10 mM Tris, 0,1 M EDTA und 0,3 M NaCl) gespült, wonach zum Eluieren der Spüllösung mit geringer Geschwindigkeit 1 Minute lang mit 41xg in einem Schwenkbecherrotor zentrifugiert wurde. Alternativ kann die Spüllösung mittels Schwerkraft entfernt werden.
Als nächstes wurden ungefähr 0,5 ml Vorbeschickungslösung (1,75 M NaCl) vorsichtig auf die Säule aufgetragen, ohne das Matrixbett zu stören. Zur Elution der Vorbeschickungslösung wurde der gleiche Zentrifugationsschritt wie bei der Elution der Spüllösung angewandt. Auch hier kann man sich der Schwerkraft bedienen.
Der Vorbeschickungsschritt erleichtert die Elution der Nudeinsäuren. Überraschenderweise führt der Vorbeschickungsschritt selbst nicht zum Abgang von Nucleinsäuren aus der Säule, sondern ermöglicht die Elution der Nucleinsäuren unter Verwendung von weitaus weniger Elutionsiösung als bislang für möglich gehalten wurde. Im Ergebnis führt dies zu einer konzentrierteren Nucleinsäure-Probe beim Elutionsschritt, der nun beschrieben wird.
Eine 2 ml-Probe Elutionsreagens (10 mM Tris, 1 mM EDTA und 1,75 M NaCl) wurde auf die Säule gegeben, wonach wie vorstehend beschrieben zentrifugiert wurde. Die Anwendung eines solch kleinen Volumens Elutionspuffer ist außergewöhnlich und wird durch den Vorbeschickungsschritt ermöglicht. Der Elutionspuffer wurde zusammen mit der gereinigten DNA mittels der vorstehend beschriebenen Zentrifugation abgetrennt. Alternativ kann man sich der Schwerkraft bedienen.
Mit Hilfe der verschiedenen, in der Fachwelt bekannten Restriktionsendonudeasen wurde dann die DNA analysiert. Die verdaute DNA wurde einer Elektrophorese auf Agarose unterzogen und mit einer Probe λ-Phage/HindIII-DNA-Molekulargewichtsmarkern verglichen.

Beispiel 5

Eukaryontische Nucleinsäuren aus einer Probe Rattenhepatom 3924A wurden in Anlehnung an die Beispiel 4 angewandte Vorschrift gereinigt, außer daß keine RNase verwendet wurde.
Die resultierenden gereinigten Nucleinsäuren enthalten somit RNA und DNA.
In den beiden Beispielen 4 und 5 wurde die säulengereinigte DNA mit Hilfe verschiedener Restriktionsendonucleasen verdaut, die unterschiedliche Salzkonzentrationen benötigen. Die Verdauungsmuster zeigten diskrete Banden.
Bei der Kontroll-DNA handelte es sich um intakte hochmolekulare DNA. Das Molekulargewicht der unverdauten säulengereinigten Kontroll-DNA, bestimmt mit Hilfe der Pulsfeld- Gelelektrophorese, lag im Bereich zwischen 50 und 200 kb. Das 260/280-Verhältnis dieser säulengereinigten DNA lag im Bereich zwischen 1,8 und 2,0.
Die vorstehenden Beispiele erläutern die Anwendung der Erfindung und ihre Anwendbarkeit auf die Reinigung von Gesamt-Nucleinsäuren sowie DNA. Der versierte Fachmann wird erkennen, daß gewünschtenfalls durch Ersatz von RNase durch Dnase die Abtrennung entweder von RNA oder DNA ermöglicht wird.
Die Beispiele zeigen die Anwendbarkeit der Erfindung auf sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Proben. Zu den verwendbaren Probentypen gehören Blut, Serum, Stuhl, Urin und andere biologische Flüssigkeiten. Es können verschiedene Zelltypen, darunter Bakterien, Buffy Coats (weiße Blutzellen), Tumorzellen, Hybridome etc. behandelt werden, um eine Nucleinsäure daraus zu reinigen. Mit routinemäßigen Anpassungen der Vorschriften lassen sich auch rohe Nucleinsäure-Proben reinigen, um reine "Unterproben" der gewünschten DNA zu erhalten. Techniken wie etwa die Polymerase-Kettenreaktion, die RFLP-Analyse, Sequenzierung, Klonierung, Gewinnung von DNA zur Herstellung von Nucleinsäure-Sonden und so weiter lassen sich an die hierin beschriebene Arbeitsweise anpassen. Zu den weiteren Anwendungen zählen die Pulsfeld-Gelelektrophorese sowie Nachweismethoden wie etwa das Southern und Northern Blotting.
Die Wahl des für die Matrix verwendeten Anionenaustauscher- Materials kann unterschiedlich ausfallen, wobei der kritische Faktor der ist, daß es ein Material sein muß, das den Austausch eines negativen Ions wie etwa Chlorid durch ein negativ geladenes Nucleinsäure-Molekül erleichtert. Im allgemeinen werden die sogenannten "schwachen" Austauscher bevorzugt. Diese "schwachen" anionischen Austauscher werden über einen begrenzten pH-Bereich (im allgemeinen von etwa 6 bis etwa 9) ionisiert. Wenn es machbar ist, kann auch ein sogenannter "starker" Anionenaustauscher verwendet werden. In der Fachwelt sind zahlreiche Beispiele für beide bekannt und diese müssen hier nicht beschrieben werden.
Neben dem vorstehend beschriebenen Verfahren umfaßt die Erfindung auch ein Reagenzien-Kit, das zum Abtrennen von Nudeinsäuren aus einer Probe brauchbar ist. Das Kit enthält wenigstens jeweils eine separate Probe des anionischen Austauschermaterials, der verdünnten Salzlösung, die als Spülpuffer dient, und der konzentrierten Salzlösung, die als Elutionspuffer und gegebenenfalls auch als Vorbeschickungslösung dient. Gegebenenfalls kann das Kit ein Reagenziensystem enthalten, das zur Freisetzung von Nucleinsäuren aus einer Zeliprobe brauchbar ist; z.B. umfassen diese Reagenziensysteme verschiedene Stoffe wie etwa Lysozym, RNase, Proteinase K und so weiter. Derartigen Systemen kann auch ein Reagens für die Zell-Lyse beigegeben werden. Ist dies der Fall, so kann das neue, hierin beschriebene Reagens verwendet werden.
Es sollte klar sein, daß die Beschreibung und die Beispiele zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen und andere Ausführungsformen im Geist und Umfang der Erfindung sich für versierte Fachleute von selbst ergeben.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung einer reinen Probe einer Nucleinsäure, umfassend:

(a) das Aufbringen einer Nucleinsäure-haltigen Probe auf ein anionisches Austauschermaterial in einer Säule;

(b) das Mischen der Probe mit dem anionischen Austauschermaterial, um aus diesen eine gleichförmige Aufschlämmung zu bilden;

(c) das Aufbringen einer verdünnten Lösung eines ionischen Salzes, die keine organischen Lösungsmittel enthält, auf das anionische Austauschermaterial, wobei die verdünnte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M aufweist;

(d) das Abtrennen der verdünnten Lösung des ionischen Salzes vom anionischen Austauschermaterial; und

(e) das Eluieren der Nucleinsäure aus dem anionischen Austauschermaterial durch Aufbringen einer konzentrierten Lösung eines ionischen Salzes, die keine organischen Lösungsmittel enthält, auf dasselbe, wobei die konzentrierte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 0,75 M bis etwa 2,25 M aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend das Aquilibrieren des anionischen Austauschermaterials mit der verdünnten Lösung des ionischen Salzes bevor die Probe auf dasselbe aufgebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verdünnte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 0,3 M aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die konzentrierte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 1,75 M aufweist.

54 Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren umfassend das Verdünnen der Probe mit einer Menge der verdünnten Lösung des ionischen Salzes, die gleich dem bis etwa dem 3fachen Volumen der Probe ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das anionische Austauschermaterial DEAE-Sepharose ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ionische Salz NaCl ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verdünnte Lösung und die konzentrierte Lösung des ionischen Salzes durch die Schwerkraft abgetrennt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die verdünnte Lösung und die konzentrierte Lösung des ionischen Salzes durch Zentrifugieren abgetrennt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Aufbringen einer Vorbeschickungslösung auf das anionische Austauschermaterial nach der Abtrennung der verdünnten Lösung des ionischen Salzes und vor dem Eluieren der Nucleinsäuren aus demselben, wobei die Vorbeschickungslösung eine konzentrierte Lösung eines ionischen Salzes mit einer Konzentration von etwa 0,75 M bis etwa 2,25 M umfaßt und in einer Menge im Bereich von etwa 1/3 bis etwa 2/3 des Volumens des anionischen Austauscher materials aufgebracht wird, und das Abtrennen der Vorbeschickungslösung.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Eluieren das Auftragen der konzentrierten Lösung des ionischen Salzes in einer Menge umfaßt, die wenigstens 4/3 des Volumens des anionischen Austauschermaterials beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Vorbeschickungslösung eine Konzentration von etwa 1,75 M aufweist.

13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Vorbeschickungslösung eine konzentrierte NaCl-Lösung ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleinsäure DNA ist.

15. Kit, das brauchbar ist bei einem Verfahren zur Gewinnung einer reinen Probe einer Nucleinsäure gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend einen jeweils separaten Teil

(i) eines anionischen Austauschermaterials,

(ii) einer verdünnten Lösung eines ionischen Salzes, die keine organischen Lösungsmittel enthält, mit einer Konzentration von etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M,

(iii) einer konzentrierten Lösung eines ionischen Salzes, die keine organischen Lösungsmittel enthält, mit einer Konzentration von etwa 0,75 M bis etwa 2,25 M, und

(iv) ein Behältnis, um (i), (ii) und (iii) aufzunehmen.

16. Kit nach Anspruch 15, des weiteren umfassend ein Reagenziensystem zum Lysieren einer zellhaltigen Probe.

17. Kit nach Anspruch 16, des weiteren umfassend Lysozym und Proteinase K.

18. Kit nach Anspruch 15, wobei das anionische Austauschermedium DEAE-Sepharose ist.

19. Kit nach Anspruch 15, wobei die verdünnte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 0,3 M aufweist.

20. Kit nach Anspruch 15, wobei die konzentrierte Lösung des ionischen Salzes eine Konzentration von etwa 1,75 M aufweist.

21. Kit nach Anspruch 15, wobei das ionische Salz sowohl für die verdünnte als auch die konzentrierte Lösung NaCl ist.

22. Kit nach Anspruch 16, wobei die Lysierlösung etwa 1 bis etwa 15 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, etwa 0,1 bis etwa 2 mM EDTA, etwa 1 bis etwa 20% Gew./Vol. eines amphoteren Tensids, etwa 0,1 bis etwa 5% Vol./Vol. eines neutralen Tensids und etwa 0,5 bis etwa 5 M Guanidin HCl umfaßt.

23. Kit nach Anspruch 22, wobei das amphotere Tensid Betain ist und das neutrale Tensid Octylphenoxypolyethoxyethanol ist.

24. Kit nach Anspruch 23, wobei die Lysierlösung etwa 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, etwa 1 mM EDTA, etwa 10% Gew./Vol. Betain, etwa 2% Vol./Vol. Octylphenoxypolyethoxyethanol und etwa 0,5 M Guanidin HCl umfaßt.

25. Zusammensetzung, die zum Lysieren einer zellhaltigen Probe bei einem Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14 brauchbar ist, umfassend etwa 1 bis etwa 15 mM Tris, etwa 0,1 bis etwa 2 mM EDTA, etwa 1 bis etwa 20% Gew./Vol. eines amphoteren Tensids, etwa 0,1 bis etwa 5% Vol./Vol. eines neutralen Tensids und etwa 0,5 bis etwa 5 M Guanidin HCl.

26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das amphotere Tensid Betain ist und das neutrale Tensid Triton X ist.

27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die Lysierlösung etwa 10 InM Tris, etwa 1 mM EDTA, etwa 10% Gew./Vol. Betain, etwa 2% Vol./Vol. Triton X und etwa 0,5 M Guanidin HCl umfaßt.