DD266115A1 - METHOD OF ISOLATING A REGULATORY PROTEIN (SIGMA FACTOR) OF GENE EXPRESSION IN PLANTS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Regulatorproteins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Pflanzen. Erfindungsgemaess isoliert man aus einem Pflanzenextrakt einen Sigma-Faktor der Transkription durch fraktionierte Trennung mit Hilfe von matrixgebundenem Heparin. Bedingt durch die extrem hohe Affinitaet des pflanzlichen Sigma-Faktors zu Heparin, kann der Sigma-Faktor aus dem 80 000 g-Ueberstand eines Chloroplasten-Schocksaftes (hergestellt durch Behandlung der isolierten Chloroplasten mit einem hypotonischen Puffer) durch Chromatographie an Heparin-Sepharose isoliert werden. Der Sigma-Faktor bindet am Promotor und legt dem Startpunkt der Transkription fest. Mit dem Sigma-Faktor kann ein pflanzenspezifisches In-vitro-Transkriptionssystem aufgebaut werden. Das pflanzliche Regulatorprotein kann in der Gentechnik eingesetzt werden.The invention relates to a method for isolating a regulator protein (sigma factor) of gene expression in plants. According to the invention, a sigma factor of the transcription from a plant extract is isolated by fractional separation with the aid of matrix-bound heparin. Due to the extremely high affinity of the plant sigma factor to heparin, the sigma factor can be isolated from the 80,000 g supernatant of a chloroplast shock juice (prepared by treating the isolated chloroplasts with a hypotonic buffer) by chromatography on heparin-Sepharose , The sigma factor binds to the promoter and determines the starting point of transcription. With the sigma factor, a plant-specific in vitro transcription system can be set up. The plant regulatory protein can be used in genetic engineering.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Struktur, Funktion und Steuerung der Zelle wird c/urch den selektiven Abruf der DNS-Information der Gene festgelegt (Genexpression). Das für die Transkription der DNS benötigte System umfaßt die RNS-Poiymerasen und die Regulatorproteine (z.B. Sigma-Faktoren).The structure, function and control of the cell is determined by the selective retrieval of the DNA information of the genes (gene expression). The system needed for DNA transcription includes RNA polymerases and regulatory proteins (e.g., Sigma factors).

In Bakterien werden die zu transkribierenden Gene auf der DNS u.a. mit Hilfe von spezifischen Initiationsfaktoren (Sigma-Faktoren), die die RNS-Polymerase binden, ausgewählt. Die RNS-Polymerase erkennt in Gegenwart des Sigma-Faktors den PromotoiLereich vor dem Strukturgen und bindet mit hoher Affinität daran. In Bacillus subtllls kann man einen entwickluntjsabhengigen Wechsel von Sigma-Faktoren beobachten (R. H. DOI, Arch. Biochem. Biophys. 214,772-781,1982). Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Regulatorprr (eins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Höheren Pflanzen. .In bacteria, the genes to be transcribed on the DNA i.a. with the help of specific initiation factors (sigma factors) that bind the RNA polymerase. RNA polymerase, in the presence of the sigma factor, recognizes the promotori region in front of the structural gene and binds to it with high affinity. In Bacillus subtllls one can observe a developmental shift of sigma factors (R.H. DOI, Arch. Biochem., Biophys., 214, 772-781, 1982). The invention relates to a method for isolating a Regulatorprr (one (sigma factor) of gene expression in higher plants.

Mit dem erfindungsgemlßen Verfahren wird den Molekularbiologen ein Mittel in die Hand gegeben, die komplizierten Mechanismen der Regu.ation der Genex^ression in Pflanzen zu untersuchen.The method according to the invention provides the molecular biologist with a means to study the complicated mechanisms of regulation of gene expression in plants.

Das Verfahren ist einfach und liefert in einem Ein-Schritt-Verfahren einen angereicherten Initiationsfaktor, der für viele Fragestellungen eingesetzt werden kann.The process is simple and provides an enriched initiation factor in a one-step process that can be used for many problems.

Das Verfahren schafft ΊΙ» Voraussetzung, den pflanzlichen Initiationsfaktor als Partner im homologen Tranukriptionssystem in der Gentechnik einzusetzen.The procedure creates "the prerequisite for using the plant's initiation factor as a partner in the homologous transcription system in genetic engineering.

Durch den Transfer eine t zusätzlichen Sigma-Gens mit vorgeschaltetem regulierbaren Promotorbereich (z. B. durch Licht induzierbar) kann die Stoff produkt ion der Pflanze beeinfluß; werden. Eine Erhöhung des endogenen Spiegels an Sigma-Faktoren hat eine Stimulation der Stoffproduktion zur Folge. Fü' den Gentransfer ist vorerst die Klonierung des Gens des Sigma-Faktors notwendig. Da mit dem urfindungsgemSßen Verfahren ausreichend Protein zur partiellen Sequenzierung gewonnen werden kann, ist mit der Kenntnis der partiellen Sequenz des Sigma-Faktors eine Konstruktion von Gensonden möglich. Nach Isolierung der mRNS aus Pflanzengewebe oder Kulturzellen, nach ihrer Übersetzung in eine cDNS, nach Inserierung dir cDNS in einen Klnnierungsvektor und nach Transformation von E.coil können mit Hilfe der sigmaspe^.ifischen Gensonden die positiven Klone selektioniert werden.The transfer of an additional sigma gene with an upstream regulatable promoter region (for example, that can be induced by light) can influence the substance production of the plant; become. Increasing the endogenous level of sigma factors results in stimulation of the production of the substance. For the gene transfer, the cloning of the gene of the sigma factor is necessary for the time being. Since sufficient protein can be obtained for partial sequencing by the method of the present invention, construction of gene probes is possible with knowledge of the partial sequence of the sigma factor. After isolation of the mRNA from plant tissue or culture cells, after translation into a cDNA, after insertion of cDNA into a cloning vector and after transformation of E. coli, the positive clones can be selected with the aid of the sigma-specific gene probes.

Das Verfahren schafft auch die Voraussetzung für eine mikrobiologische Produktion von Sigma-Faktoren durch die manipulierten Bakterien. Oazu ist jedoch die Konstruktion eines Proteinüberproduzenten anzustreben.The method also provides the prerequisite for microbiological production of sigma factors by the engineered bacteria. However, the construction of a protein overproducer should be sought.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

A. MikroorganismenA. Microorganisms

Es sind Verfahren bekannt, Initiationsfaktoren der Transkription (Sigma-Faktoren) aus Mikroorganismen zu isolieren.Methods are known for isolating initiation factors of transcription (sigma factors) from microorganisms.

Dib Isolierung und Reinigung des Sigma-Faktors der RNS-Polymerase aus E.coil nach DOWE, P.A.et al. (Biochemistry 18, 1344-1351,1979) setzt eine Reinigung des Transkriptionsenzyms (EC 2.7.7.6.) in mehreren Schritten, einschließlich zweier slulenchromatographischer Verfahren, voraus (R. R. BURGESS und J. J. JENDRISAK, Biochemistry 14,4634-4638,1975). Die sich anschließende Abtrennung und Reinigung des Sigma-Faktors umfaßt 3 säulenchromatographische Schritte. Zunächst wird das Holo-Enzym vom Core-Eniym durch schrittweise Elution von einer enzymbeladenen ssDNS-AgaroseSäula>{C. NÜSSLEIN und B. HEYDEN. BBRC 47,282-289,1972) getrennt. Das Holo-Enzym wird nun durch Säulenciiromatographie an Βίο-Rex 70 und DEAE-Zellulose in den Sigma-Faktor und das Core-Enzym gespalten. Die Reinigung des Sigma-Faktors wird durch Gelfiltration an einer Ultragel-AcA 44-SSuIe erreicht.Dib Isolation and purification of the sigma factor of RNA polymerase from E. coil according to DOWE, P.A. et al. (Biochemistry 18, 1344-1351, 1979) requires purification of the transcriptional enzyme (EC 2.7.7.6.) In several steps, including two molecular chromatographic methods (R. R. BURGESS and J. J. JENDRISAK, Biochemistry 14, 464-4638, 1975). Subsequent separation and purification of the sigma factor involves 3 column chromatographic steps. First, the holo-enzyme is removed from the core enyme by the stepwise elution of an enzyme-loaded ssDNA agarose (C. NUSSLIN and B. HEYDEN. BBRC 47,282-289,1972). The holo-enzyme is now cleaved by column chromatography on Βίο-Rex 70 and DEAE-cellulose into the sigma factor and the core enzyme. Purification of the sigma factor is accomplished by gel filtration on an ultragel AcA 44 SSuIe.

In Bacillus siibtllls ist die Anwesenheit von verschiedenen Sigma-Faktoren in Abhängigkeit von der Entwicklungsphase den Organismus beobachtet worden. Beispielhaft sei hier ein Verfahren zur Isolierung eines Sigma-Faktors skizziert. Nach Gewinnung einer transkriptionsaktiven, grob goreinigten Fraktion (G. B. SPIEGELMANN et al., J.Biol. Chem. 253,1756-1765, 1978) und nach weiterer Reinigung durch Säulenchromatogrephio an Bio-Gel und DNS-Zellulose kann nach Glyzerin-Gradientenzentrifugation eine RNS-Polymerase, die 100%ig mit dem Sigma-Faktor gesättigt ist, isoliert werden (E. I. HYDE et al., J. [Hol. Chem. 261,16565-16570,1986). Der Sigma-Faktor kann vom Core-Enzym durch Chromatographie an Phosphocellulose bei niedrigen Salzkonzentrationen abgetrennt werden (V.W.WILLIAMSON und R. H. DOI, Mol. Gen. Genet. 161,133-141,1978). Der Sigma-Faktor kann jedoch auch durch Denaturierung des Holo-Enzyms entweder mit SDS und anschließender Gelelektrophorese und nachfolgender Entfernung des SDS (K.WEBER und D.KUTER, J. Biol. Cliem. 246,4504-4509,1971) isoliert werden oder durch Bindung des Holo-Enzyms an Heparin-Sepharose und schrittweise E lution der Untereinheiten unter denaturierenden Bedingungen in Anwesenheit von Harnstoff und unter ansteigender lonenstärke des Puffers (H. STERNBACH et al., Eur. J.Biochem. SO, 51-55,1975).In Bacillus siibtllls the presence of various sigma factors depending on the developmental phase of the organism has been observed. By way of example, a method for isolating a sigma factor is outlined here. After obtaining a transcription-active, coarsely goreinigten fraction (GB SPIEGELMANN et al., J. Biol. Chem. 253, 1756-1765, 1978) and after further purification by Säulenchromatogrephio on bio-gel and DNA-cellulose after RNA glycerol gradient centrifugation an RNA Polymerase which is 100% saturated with the sigma factor (EI HYDE et al., J. [Hol. Chem. 261, 166565-16570, 1986). The sigma factor can be separated from the core enzyme by chromatography on phosphocellulose at low salt concentrations (VWWILLIAMSON and RH DOI, Mol. Gen. Genet., 161, 133-141, 1978). However, the sigma factor can also be isolated by denaturing the holo-enzyme with either SDS followed by gel electrophoresis followed by removal of SDS (K.WEBER and D.KUTER, J. Biol. Cliem., 246, 4504-4509, 1979) or by binding of the holoenzyme to heparin-sepharose and stepwise elution of the subunits under denaturing conditions in the presence of urea and increasing the ionic strength of the buffer (H. STERNBACH et al., Eur. J.Biochem., SO, 51-55, 1975 ).

Aus Sacchiromyces cerevislae sind Transkriptionsfaktoron isoliert und beschrieben worden. Gut charakterisiert ist der Tau-Faktor aus Hefen, der spezifisch an tRNS-Gene bindet und eine Rolle bei der tRNS-Synthese spielt (A. RUET et al., EMBO J 3, 343-350,1984; S. CAMIER et al., EMBO J. 4,491-500,1985). Der Hefeextrakt wird einer Chromatographie an Heparin-Agarose unterzogen. Der Transkriptionsfaktor wird zusammen mit der RNS-Polymerase B (II), jedoch getrennt von der RNS-PolymeraseFrom Sacchiromyces cerevisiae transcription factoron has been isolated and described. Well characterized is the yeast tau factor, which binds specifically to tRNAs genes and plays a role in tRNA synthesis (RUET et al., EMBO J 3, 343-350, 1984, S. CAMIER et al. , EMBO J. 4,491-500, 1985). The yeast extract is subjected to chromatography on heparin agarose. The transcription factor is shared with RNA polymerase B (II), but separate from the RNA polymerase

C, eluiert. Die Reinigung des Faktors erfolgt über Glycerin-Gradientenzentrifugation und Chromatographie an DEAE-Sephadex. Aus der Grünalge Chlamydomonas relnhardli wurde 1976 ein mutmaßlicher Sigma-Faktor isoliert (SJ. SURZYCKI undC, eluted. The factor is purified by glycerol gradient centrifugation and chromatography on DEAE-Sephadex. From the green alga Chlamydomonas relnhardli a putative sigma factor was isolated in 1976 (SJ SURZYCKI and

D. L. SCHELLENBARGER, PNAS 73,3961-3965,1976). Die Reinigung des Faktors erfolgte über Chromatographie an DEAE-Zellulose und Phosphozellulose-Pll und durch Glyzerin-Gradientenzentrifugation. Es konnte jedoch kein Nachweis der Stimulation der spezifischen Initiation am spezifischen Promotor erbracht werden. In Anwesenheit des Sigma-Faktors wäre eine Reduktion der unspezifischen Transkription zu erwarten.D.L. SCHELLENBARGER, PNAS 73, 3961-3965, 1976). The factor was purified by chromatography on DEAE cellulose and phosphocellulose Pll and by glycerol gradient centrifugation. However, no evidence of specific initiation stimulation at the specific promoter could be provided. In the presence of the sigma factor, a reduction in non-specific transcription could be expected.

B. TiereB. animals

Aus tierischen Geweben wurden Transkriptionsfaktoren (TF) isoliert, die wahrscheinlich bei der Initiation der Transkription eineFrom animal tissues, transcription factors (TF) were isolated, probably at the initiation of transcription

wesentliche Rolle spielen:play essential role:

TFIA, TFIB, TFIC und TFID für die Kernpolymerese I (für die Transkription der ribosorna' in Gene) Y. MISHIMA et al., Nucl. AcidTFIA, TFIB, TFIC and TFID for core polymerase I (for ribosome transcription into genes) Y. MISHIMA et al., Nucl. acid Res. 10,6659-6670,1982; R.MEISFELD und N.ARNHEIM, Mol. Cell Biol. 4,221-227,19J4; A.H.CAVANAUGH undRes. 10,6659-6670,1982; R. MEISFELD and N. ARNHEIM, Mol. Cell Biol. 4,221-227, 19J4; A.H.CAVANAUGH and E₁A-THOMSON₁J₁BiOLChOm-SeI, 12738-12744,1986),E ₁ A-THOMSON ₁ J ₁ BiolChOm-SeI, 12738-12744, 1986), TFIIA, TFIIB, TFIIC und TFIID für die Kernpolymerase It (für die Transkription der mRNS-Gene) (T. MATSUI et al., J. Biol. Chem. 255,TFIIA, TFIIB, TFIIC and TFIID for the core polymerase It (for the transcription of the mRNA genes) (T.Matsui et al., J. Biol. Chem. 255,

11992-11996,1980),11992-11996.1980)

TFIIIA, TFIIIB und TFIIIC für die Kernpolyrnerase III (für die Transkription der tRNS- und 5S RNS-Gene) (T. SEGALL et al., J. Biol.TFIIIA, TFIIIB and TFIIIC for Nuclear Polyrnerase III (for the transcription of the tRNA and 5S RNA genes) (T. SEGALL et al., J. Biol.

Chem. 255 11986-11991,1980).Chem. 255 11986-11991, 1980).

C. Höhere PflanzenC. Higher plants Die RNS-Polymerase III synthetisiert in intakten Kernen aus Weizenkeimen 4, SS Vorläufer-tRNS und 5 S RNS (T. J. GUILFOYLE etRNA polymerase III synthesizes in intact nuclei from wheat germ 4, SS precursor tRNA and 5S RNA (T.J. GUILFOYLE et

al., Plant Mol. Biol., 77,95-104,1986). Bei der Isolierung der RNS-Polymerase III gehen die Transkriptionsfaktoren verloren unddamit fällt die exakte In-vltro-Transkription aus.al., Plant Mol. Biol., 77, 95-104, 1986). In the isolation of the RNA polymerase III, the transcription factors are lost and thus the exact in-vivo transcription is eliminated.

Ein entsprechendes pflanzliches In-vitro-Transkriptionssystem für die rRNS-Gene und für die mRNS-Gene gibt es ebenfalls nochThere is also a corresponding in vitro in vitro transcription system for the rRNA genes and for the mRNA genes

nicht.Not.

Transkriptionsfaktoren aus Chloroplasten und Mitochondrion Höherer Pflanzen wurden bisher ebenfalls noch nicht beschrieben.Transcription factors from chloroplasts and mitochondrion of higher plants have not yet been described. ZM d«t ErfindungZM is not invention

Ziel der Erfindung ist die spezifische Regulation der Transkription pflanzlicher Gene, einschließlich einer gesteuerten Expression von Fremdgenen in '.ransgonischen Pflanzen. Damit soll ein Beitrag zur Ertragssteigerung von Nutzpflanzen geleistet worden.The aim of the invention is the specific regulation of the transcription of plant genes, including a controlled expression of foreign genes in transgenic plants. This is intended to contribute to increasing the yield of crops.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus Extrakten Höherer Pflanzen bisher unbekannte Initiationsfaktoren derThe invention is based on the object from extracts of higher plants previously unknown initiation factors of Transkription zu finden und zu reinigen.To find and clean transcription. Erfind'jngsgemäß isoliert man aus einem Pflanzenextrakt ein Regulatorprotein (Sigma-Faktor) durch fraktionierte Trennung mitAccording to the invention, a regulator protein (Sigma factor) is isolated from a plant extract by fractional separation Hilfe von matrixgebundenem Heparin.Help of matrix-bound heparin. Überraschenderweise ist es nicht erforderlich, zuerst das Holo-Enzym (i. e. Core-Enzym mit gebundenem Sigma-Faktor) zuSurprisingly, it is not necessary to first use the holo-enzyme (i. E., Sigma factor bound enzyme)

isolieren, wenn man matrixgebundenes Heparin, insbesondere Heparin-Sepharose, zui Isolierung des Sigma-Faktors aus domisolate, when matrix-bound heparin, in particular heparin-Sepharose, zui isolation of the sigma factor from dom

Pflanzenextrakt einsetzt. Dor Sigma-Faktor besitzt eine extrem hohe Affinität zu Heparin. Die Bindung dos freien Sigma-FaktorsPlant extract is used. Dor Sigma Factor has an extremely high affinity for heparin. The binding of the free sigma factor

an Heparin kann erst in Anwesenheit denaturierender Agenzien und bei hoher lonenstärke dos Puffers gelöst werden.Heparin can be dissolved only in the presence of denaturing agents and at high ionic strength of the buffer.

Erflndungsgemäß wird das matrixgebundeie Heparin mit dem Pflanzenextrakt behandelt. Danach eluiert man mit einemAccording to the invention, the matrix-bound heparin is treated with the plant extract. Then you elute with a Mittelsalzpuffer zunächst die RNS-Polymer.ise, wäscht mit viel Starksalzpuffer, oluiert mit einem denaturierendenMedium salt buffer first, the RNA Polymer.ise, washed with a lot of Starksalzpuffer, oluiert with a denaturing Starksalzpuffer den Sigtia-Kakior zusammen mit wenigen anderen stark bindenden Proteinen und macht den eluierten Sigma-Starksalzpuffer the Sigtia Kakior together with a few other strong binding proteins and makes the eluted sigma Faktor durch wiederholte Dialyse wieder funktionsfähig. Als Mittelsalzpuffer wird vorzugsweise oin Tris-Puffer verwendet, derFactor reusable through repeated dialysis. The middle salt buffer used is preferably tris buffer, which

0,6M (NH₄I₂SO₄ enthält. Geeignete Starksalzpuffer sind beispielsweise Tris-Puffer, Phosphat-Puffer oder Borat-Puffer, die 1M(NH₄)jSO₄,1M NH₄CI bzw. 1 M KCI enthalten. Denaturierende Starksalzpuffer enthalten zusätzlich denaturierende Agenzien, wieContaining 0.6M (NH ₄ I ₂ SO _4. Suitable high salt buffers are for example Tris-buffer, phosphate buffer or borate buffer, 1M (NH ₄₎ JSO _4, 1M NH ₄ Cl and 1 M KCI included. Denaturing high salt buffer additionally contain denaturing agents, such as

z. B. β M Harnstoff. Das erfindungsgemäße Verfahren kann als Säulenchromatographie oder als Batch-Verfahren durchgeführtwerden.z. B. β M urea. The process according to the invention can be carried out as a column chromatography or as a batch process.

Die Wahl des Pflenzenmatenals ist entscheidend für die Lösung der gestellten Aufgabe. Vorteilhaft ist es tiispielsweise, wennThe choice of Pflänzmaten is crucial for the solution of the task. It is advantageous, for example, if

non von jungen, ausgewachsenen Spinatblättern ausgeht.does not emanate from young, full-grown spinach leaves.

Will man Initiationsfaktoren des Transkriptionsapparates der Chloroplasten auffinden und isolieren, hat os sich bewährt, dieIf one wants to find and isolate initiation factors of the transcription apparatus of the chloroplasts, it has been proven that the Chloroplasten in intakter Form aus dem pflanzlichen Gewebeverband zu lösen und zu reinigen. Aus 2kg Spinatblättern könnenDissolve and clean chloroplasts in intact form from the plant tissue. From 2kg of spinach leaves can

nach einem bereit» beschriebenen Verfahren (S. LERBS et al., EMBO J. 4,1661-1666,1985) ausreichend Chloroplasten für dieaccording to a ready described procedure (S. LERBS et al., EMBO J. 4,1661-1666,1985) sufficient chloroplasts for

Fdktorenprfiperation gewonnen werden. Zur Testung der Faktorenfraktionen ist eine transkriptionsaktive, hochreine RNS-Fdktorenprfiperation be recovered. To test the factor fractions, a transcriptionally active, high-purity RNA Polymerase aus Spinatchloroplasten geeignet (S.LERBS et al.. Plant Mol. Biol. 2,67-74,1983; S.LERBS et al., EMBO J. 4,1661-Polymerase from spinach chloroplast suitable (S.LERBS et al .. Plant Mol. Biol., 2.67-74, 1983; S.LERBS et al., EMBO J. 4, 1661-

1666,1985). Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann beispielsweise der Sigma-Faktor aus dem 80000g-Überstand des1666.1985). By the method according to the invention, for example, the sigma factor from the 80000g supernatant of

Chloroplasten-Schocksaftes (hergestellt durch Behandlung der Chloroplasten mit einem hypotonischen Puffer) durchChloroplast shock juice (made by treating the chloroplasts with a hypotonic buffer) Chromatographie an Heparin-Sepharose stark angereichert werden.Chromatography to heparin-Sepharose be greatly enriched. Ein wesentlicher Vorteil des orfindungsgemäßer, Verfahrens liegt darin, daß der material- und zeile 'wendige Umwog über dieAn essential advantage of the method according to the invention lies in the fact that the material-and-line umwog over the

isolierung und Reinigung des Holo-Enzyms, wie er bei Mikroorganismen üblich ist, eingespart wird.Isolation and purification of the holo-enzyme, as is common in microorganisms, is saved.

Die Erfindung eröffnet die Möglichkeit, die Transkription pflanzlicher Gene spezifisch zu regulieren. Fernerhin ist ein Einsatz desThe invention opens the possibility to specifically regulate the transcription of plant genes. Furthermore, an insert of the Sigma-Faktors zur gesteuerten Expression von Fremdgenen in transgenischen Pflanzen möglich.Sigma factor for the controlled expression of foreign genes in transgenic plants possible. Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutern, ohne es jedoch einzuschränken.The following exemplary embodiments are intended to explain the method according to the invention in more detail, but without restricting it. AusfOhrungobelsplbleAusfOhrungobelsplble

BslspltM:BslspltM:

Frisch präparierte, gereinigte, Intakte Ghloroplasten aus 2kg Spinstblättern werden in 200ml des hypotonischem Puffers A (5OmMTrIs-HCi, pH7,8,75mM(NH₄)₂SO₄,4mMEDTA,1mMDithiothreitol, 0,5 mMPhenylmethyleulfonyifiuorid, 25% Glycerin) suspendiert. Die Suspension wird dreimal je 15 Minuten mit dem Ultrathurax homogenisiert und 15 Minuten bei 80000 g zentrifugiert. Die Bindung des SOOCOg-Überstandes des Chloroplasten-Schocksaftes an 6ml Heparin-Seor-äiose CI-6B (Pharmacia) erfolgte im Batch-Ve'rahren 30 Minuten. Nach intensivem Waschen mit Puffer A in einer rotierenden Plasteflasche (je 200ml, je 10 Minuten, 5 Wechsel des Waschpuffers) wird die beladene Sepharose in eine Säule gefüllt. Die RNS-Polymerase wird mit Puffer A, der 0,6M (NH₄)ISO₄ enthält, von der Heparin-Sepharose-Säule eluiert und sofort bei -7O⁰C gelagert. Anschließend wird die Heparin-Sepharose-Säule mit 300ml 1M (NH₄)₂SO₄-Puffer über Nacht gewaschen. Der Sigma-Faktor kann zusammen mit wenigen anderen, stark bindenden Proteinen mit 10ml Puffer A, der 1M (NH₄I₂SO₄ und 6M Harnstoff enthält, von der Heparin-Sepharose gelöst werden. Nach intensiver Dialyse gegen 11 Puffer A (dreifacher Wechsel des Bades „ nach jeweils 3 h) kann der Sigma-Faktor im Transkriptionstest eingesetzt werden. Alle Verfahrensschritte werden bei s ^J.-4°C durchgeführt.Freshly prepared, purified, intact ghloroplasts from 2 kg spin leaves are suspended in 200 ml of hypotonic buffer A (50 mM tri-HCl, pH 7.8.75 mM (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , ₄ mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mM phenylmethyleulfonyi fluoride, 25% glycerol). The suspension is homogenized three times for 15 minutes with the Ultrathurax and centrifuged for 15 minutes at 80,000 g. Binding of the SOOCOg supernatant of the chloroplast shock-fluid to 6 ml of heparin seoriose CI-6B (Pharmacia) was carried out in batch fermentation for 30 minutes. After intensive washing with buffer A in a rotating plastic bottle (200 ml each, 10 minutes, 5 changes of washing buffer), the loaded Sepharose is filled into a column. The RNA polymerase is contains with buffer A containing 0.6 M (NH ₄₎ ISO _4, eluted from the Heparin-Sepharose column and stored immediately at -7O ⁰ C. Subsequently, the heparin-Sepharose column is washed with 300 ml of 1M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ buffer overnight. The sigma factor can be released from the heparin-Sepharose together with a few other, strongly binding proteins with 10 ml of buffer A containing 1M (NH ₄ I ₂ SO ₄ and 6M urea, after intensive dialysis against 11 buffers A (3 changes of the bath "after every 3 h), the sigma factor can be used in the transcription test All process steps are carried out at s ^J -4 ° C.

Die Analyse der In-vitro-Transkripte des rbcL-Gons aus Spinat — os wurde das 550 bp EcoRI-DNS-Fragment, das mit dem Vektor pUC-18 kloniert ist, als Template verwendet — zeigt, daß der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Sigma-Fak«?' den exakten Startpunkt der Transkription bei -180 bp (E. M. OROZCO et al., Nuc leic Acids Res. 13,1283-1302,1985) festlegt. Die Analyse wurde durch Hybridisierung des isolierten Transkriptes mit dem 5'-"P-markiorten codierenden Strang des EcoRI-Hindlll-DNS-Fragmentes des rbcL-Gen-Plasmids und anschließender Si-Nuklease-Verdauung erbracht.The analysis of the in vitro transcripts of the rbcL-Gons from spinach - os was the 550 bp EcoRI DNA fragment, which is cloned with the vector pUC -18, used as a template - shows that the sigma prepared by the method according to the invention -Fak "? ' defines the exact starting point of transcription at -180 bp (E.M. OROZCO et al., Nuclear Acids Res. 13, 13283-1302, 1985). The analysis was performed by hybridizing the isolated transcript with the 5 '' '' P-labeled coding strand of the EcoRI-HindIII DNA fragment of the rbcL gene plasmid, followed by Si nuclease digestion.

Claims (10)

1. Verfahren zur isolierung eines Regulatorproteins (Sigma-Faktor) der Genexpression in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einem Pflanzenextrakt einen Sigma-Faktor der Transkription durch fraktionierte Trennung mit Hilfe von matrixgebundenem Heparin isoliert.1. A method for isolating a regulator protein (Sigma factor) gene expression in plants, characterized in that one isolated from a plant extract a sigma factor of transcription by fractional separation using matrix-bound heparin. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das matrixgebundene Heparin mit dem Pflanzenextrakt behandelt, danach mit einem Mittelse^puffer zunächst die RNS-Polymerase eluiert, anschließend mit viel Starksalzpuffer wäscht, mit einem denaturierenden Starksalzpuffer den Sigma-Faktor zusammen mit wenigen anderen stark bindenden Proteinen eluiert und den eluierten Sigma-Faktor durch wiederholte Dialyse wieder funktionsfähig macht.2. The method according to claim 1, characterized in that the matrix-bound heparin is treated with the plant extract, then eluted with a Mittelse ^ buffer first the RNA polymerase, then washed with a lot of Starksalzpuffer, with a denaturing Starksalzpuffer the sigma factor together with a few elutes other strong binding proteins and renders the eluted sigma factor functional again through repeated dialysis. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als matrixgebundenes Heparin eine Heparin-Sepharose einsetzt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one uses heparin-Sepharose as matrix-bound heparin. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mittelsalzpuffer einen Tris-Puffer verwendet, der 0,6 M (NHJ₂SO₄ enthält.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the medium salt buffer used is a Tris buffer containing 0.6 M (NHJ ₂ SO ₄ . 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Starksalzpuffc einen Tris-Puffer, Phosphat-Puffer odp;dorat-Puffer verwendet, der 1 M (NH₄J₂SO₄,1 M NH₄CI bzw. 1M KCI enthält.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that one uses as Starksalzpuffc a Tris buffer, phosphate buffer odp; dorat buffer, the 1 M (NH ₄ J ₂ SO ₄ , 1 M NH ₄ CI or Contains 1M KCI. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als denaturierenden Starksalzpuffer einen Starksalzpuffer einsetzt, der 6 M Harnstoff enthält.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that is used as denaturing Starksalzpuffer a Starksalzpuffer containing 6 M urea. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Trennung als Säulenchromatographie durchführt.7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that one carries out the fractional separation as a column chromatography. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Trennung als Batch-Verfahren durchführt.8. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that one carries out the fractional separation as a batch process. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Pflanzenextrakt einsetzt, der aus Spinatblättern gewonnen wurde.9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that one uses a plant extract, which was obtained from spinach leaves. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9. dadurch gekennzeichnet, daß man als10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that as Pflanzenextrakt den Überstand eines Schocksaftes aus intakten, gereinigten Chloroplasten einsetzt.Plant extract uses the supernatant of a shock juice from intact, purified chloroplasts.