DE69031080T2 - Verfahren zur herstellung von katalytischer rns in bakterien - Google Patents

Verfahren zur herstellung von katalytischer rns in bakterien

Info

Publication number
DE69031080T2
DE69031080T2 DE69031080T DE69031080T DE69031080T2 DE 69031080 T2 DE69031080 T2 DE 69031080T2 DE 69031080 T DE69031080 T DE 69031080T DE 69031080 T DE69031080 T DE 69031080T DE 69031080 T2 DE69031080 T2 DE 69031080T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
rna
ribozyme
coli
ribozymes
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69031080T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69031080D1 (de
Inventor
John Rossi
Nerida Taylor
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
City of Hope
Original Assignee
City of Hope
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by City of Hope filed Critical City of Hope
Application granted granted Critical
Publication of DE69031080D1 publication Critical patent/DE69031080D1/de
Publication of DE69031080T2 publication Critical patent/DE69031080T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B64—AIRCRAFT; AVIATION; COSMONAUTICS
    • B64D—EQUIPMENT FOR FITTING IN OR TO AIRCRAFT; FLIGHT SUITS; PARACHUTES; ARRANGEMENT OR MOUNTING OF POWER PLANTS OR PROPULSION TRANSMISSIONS IN AIRCRAFT
    • B64D13/00—Arrangements or adaptations of air-treatment apparatus for aircraft crew or passengers, or freight space, or structural parts of the aircraft
    • B64D13/06—Arrangements or adaptations of air-treatment apparatus for aircraft crew or passengers, or freight space, or structural parts of the aircraft the air being conditioned
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F25—REFRIGERATION OR COOLING; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS; MANUFACTURE OR STORAGE OF ICE; LIQUEFACTION SOLIDIFICATION OF GASES
    • F25B—REFRIGERATION MACHINES, PLANTS OR SYSTEMS; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS
    • F25B11/00—Compression machines, plants or systems, using turbines, e.g. gas turbines
    • F25B11/02—Compression machines, plants or systems, using turbines, e.g. gas turbines as expanders
    • F25B11/04—Compression machines, plants or systems, using turbines, e.g. gas turbines as expanders centrifugal type
    • F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
    • F25—REFRIGERATION OR COOLING; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS; MANUFACTURE OR STORAGE OF ICE; LIQUEFACTION SOLIDIFICATION OF GASES
    • F25B—REFRIGERATION MACHINES, PLANTS OR SYSTEMS; COMBINED HEATING AND REFRIGERATION SYSTEMS; HEAT PUMP SYSTEMS
    • F25B9/00—Compression machines, plants or systems, in which the refrigerant is air or other gas of low boiling point
    • F25B9/002—Compression machines, plants or systems, in which the refrigerant is air or other gas of low boiling point characterised by the refrigerant
    • F25B9/004—Compression machines, plants or systems, in which the refrigerant is air or other gas of low boiling point characterised by the refrigerant the refrigerant being air
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/121—Hammerhead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Aviation & Aerospace Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von katalytischer RNA (Ribozyme) in Zellen, einschließlich Säugetier- und Bakterienzellen. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Gene, welche ein Ribozym encodiert, Säugetier- und Bakterienzellen mit solchen in sich transformierten Genen und Expressionsprodukte solcher Bakterien enthalten des Ribozym. Die Erfindung beinhaltet auch die in vitro- und therapeutische Verwendung solcher Expressionsprodukte.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Form der Genexpressionsbeeinträchtigung durch RNA-RNA-Duplexbildung ist als "antisense"-Inhibierung bezeichnet worden. Die Ausnutzung der antisense-Genregulierung könnte zu einer potenten antiviralen Therapie führen. Eine schwerwie gende Beschränkung des Antisense-Verfahrens, insbesondere in seiner Anwendung auf die antivirale Aktivität, ist, daß es stöchiometrisch ist und große molare Überschüsse an Antisense- gegenüber Target- RNA erfordert, um wirksam zu sein.
  • In den vergangenen Jahren haben die Entdeckungen der Ribozyme, e.g. RNA mit enzymatischen Aktivitäten, zu der Entwicklung von antisensen Molekülen geführt, welche nicht nur RNA-RNA-Hybride bilden, sondern katalytisch die kovalenten Phosphodiesterbindungen spalten und große Anzahlen von Substratmolekülen umsetzen. Ribozyme können jetzt praktisch auf jedes RNA-Transkript gezielt werden und eine wirksame Spaltung kann leicht in vitro erreicht werden. Vergleiche Kirn, S.H., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 8788- 8792 (987); Haseloff, J., et al., Nature 234: 585-591(1988); veröffentlichte PCT-Annieldung WO/89/05852; Cech, T.R. JAMA 260: 3030-3034 (1988); veröffentlichte PCT-Anmeldung WO/88/04300; Jeffries, A.G., et al., Nucleic Acids Research 17:1371-1377 (1989).
  • Das US-Patent 5,144,109 beschreibt stabile, katalytisch wirksame Ribozyme, die inter alia nützlich zum Spalten von HIV-1-RNA oder jeder anderen viralen oder endogenen zellulären RNA in vitro und in vivo, mit solchen Ribozymen transformierte Säugetierzellen, für eine Vervollständigung solcher Transformation nützliche Vektoren und die Verwendung solcher Ribozyme für die menschliche Therapie sind, un abhängig davon, ob sie synthetisch hergestellt oder durch solche transformierte Zellen exprimiert werden. Vergleiche Chang, et al, Clinical Biotechnology 2: 23-31(1990), welche hiermit unter Bezugnahme eingearbeitet ist.
  • Die EP-A-0 287 775 beschreibt, wie synthetisch hergestellte gegen eine spezifische Sequenz gerichtete Ribozyme eine Spalteigenschaft zeigen, sogar in einem Medium, welches Protein enthält. Diese Anmeldung beschreibt eine genetische Einheit, welche die für die Transkription durch Polymerase III und ein für die RNA inhibierende RNA kodierende DNA notwendige Transkriptionseinheiten enthält, welche in einer solchen Weise angeordnet sind, daß die inhibierende RNA ein Teil eines Polymerase-III-Transkripts ist. Ein besonders geeignetes durch Polymerase-III transkripiertes Trägergen ist tRNA.
  • Abstract D428 aus dem Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 14A, 1990, Januar 13-28, beschreibt die Entwicklung eines "Hammerkopf"-Ribozyms, um Moleküle, die spezifisch HIV-1-RNAs spalten, zu entwickeln. Diese Ribozyme sind in Hela-CD4&spplus;-Zellen unter Verwendung eines Expressionsvektors transfektiert worden, welcher das Ribozym unter der Kontrolle des menschlichen β-Actinpromotors hat. Die Struktur solcher "Hammerkopf"- Ribozyme ist im Abstract G328 im Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 138, 1989, 21.Januar bis 11. Februar berücksichtigt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Herstellung großer Mengen spezifisch gerichteter Ribozyme für die therapeutische Verwendung ist problematisch. Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren für die Herstellung jedes Ribozyms durch Expression eines stabilen E. Coli- RNA-Moleküls in großer Menge bereit, in welches katalytische RNA eingeführt worden ist. Jede stabile E. Coli-RNA kann verwendet werden.
  • Somit betrifft die Erfindung einen ein prokaryotisches Promotorsystem und ein mit einem stabilen E. Coli-RNA-Gen fusioniertes Ribozym enthaltenden Vektor, welcher von etwa 50 bis 200 Nukleotide aufweist. Das Ribozym ist vorzugsweise an ein E. Coli-4,5 S-RNA-Gen fusioniert. Das Ribozym ist vorzugsweise ein Anti-HIV-1-gag-Ribozym.
  • In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird E. Coli durch einen Tac-Promotor transformiert, der in sich eine 4,5 S-RNA mit einer eingeführten katalytischen RNA-Sequenz aufweist. Hohe Expressionsniveaus solcher Fusions-RNA können durch Variieren der Wachstumstemperatur unter Verwendung von E. Coli-Mutanten oder anderen Bakterien erreicht werden, welche Defekte bei gewissen enzymatischen Aktivitäten aufweisen, wie RNAse III, Induzierung der Expression mit Isopropylthio-β-galaktopyranosid (IPTG) in einem geeigneten Wirt, Herstellung eines Satzes von Nestdeletionen innerhalb des 4,5 S- oder einem ähnlichen Gen, um unerwünschte Faltung zu eliminieren und durch andere molekularbiologische Standardverfahren.
  • Die Erfindung beinhaltet auch synthetische Gene, welche katalytische RNA encodieren, mit solchen Genen transformierte Mikroorganismen, die Expressionsprodukte solcher Gene enthaltende katalytische RNA und die in vitro- und therapeutische Verwendung solcher Expressionsprodukte.
    • Beschreibung der Figuren
  • Figur 1 zeigt einen Tac-Promotor und einen E. Coli-4,5 S-RNA-Gen enthaltenden Vektor.
  • Figur 2 zeigt den in Figur 1 gezeigten Vektor mit der das Ribozym enthaltenden Transkriptionseinheit.
  • Figur 3 ist eine Northem-Analyse, die die Expression eines mit 4,5 S-RNA (Spuren a und b) und 4,5 S-RNA allein (Spur c) fusionierten Anti-HIV-1-gag-Ribozyms zeigt.
  • Figur 4 zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel eines sauren Phenolextrakts durch E. Coli-Transformanten gemäß der Erfindung überproduzierten kleiner RNAs.
  • Figur 5 zeigt ein präparatives Gel einschließlich mit Ethidiumbromid gefärbter RNA gemäß Figur 4. Die Pfeilspitze zeigt auf die Fusionsribozyme.
  • Figur 6 ist eine Kompositdarstellung der RNA-Faltung des in dem 4,5 S-Transkript eingebetteten Ribozyms.
  • Figur 7 zeigt eine Gelelektrophorese-Analyse, die die in vitro-Spaltreaktionen unter Verwendung der durch die 4,5 S-- Fusionsribozyme produzierten E. Coli-Transformanten veranschaulicht.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bis heute war der bevorzugte Weg zur Herstellung von Ribozymen für in vitro-Studien oder Zufuhr zu Zellen in Kultur die Massenherstellung durch in vitro-Transkriptionsreaktion. Die Erfindung beseitigt die Notwendigkeit für die in vitro-Transkription, wodurch die Kosten der Herstellung großer Mengen an Ribozym stark reduziert werden.
  • In ihren allgemeineren Ausführungsformen stellt die Erfindung ein neues Verfahren für die Massenherstellung eines jeden Ribozyms durch die Expression eines stabilen E.Coli-RNA- Moleküls bereit, in welchem eine Ribozymsequenz eingeführt worden ist.
  • Die stabile RNA kann jede RNA und die Einfügung kann jedes Ribozym sein. Insbesondere ist das RNA-Molekül klein und enthält von etwa 50 bis 200 Nukleotide und vorzugsweise 4,5 S-RNA von E.Coli.
  • Unter anderem kann jedes der in dem US-Patent Nr. 5,144,109 (Anmeldungs nummer 369,489) oder Amneldungsnummer 401,613 (fallengelassen) beschrie bene Ribozym verwendet werden. Ein stark prokaryotisches Promotorsystem wird ausgewählt, um die Überproduktion des RNA-Ribozym-Fusionsprodukts zu ermöglichen bzw. zu erleichtern. Die stabile RNA, Ribozym und Promotor enthaltenden Vektoren werden in selektierte Bakterien transformiert, um solche Fusionsprodukte in großer Menge zu erzeugen.
  • Im allgemeinen sind übereinstimmende Sequenzpromotoren für die Durchführung dieser Erfindung nützlich. Das Tac-Promotor-System wird bevorzugt. Das thermisch induzierbare Lambda-pL-Promotor-System kann ebenfalls verwendet werden.
  • Eine stabile E. Coli-RNA, ein eingefügtes Ribozym und ein geeignetes prokaryotisches Promotorsystem und einen Transkriptionsterminator in Kombination aufweisende Vektoren sind eine wichtige Komponente der Erfindung. Solche Vektoren werden in an sich bekannter Weise konstruiert und in Bakterien transformiert.
    • Beispiel I
  • Das 4,5 S-RNA-Gen von E. Coli ist im Stand der Technik beschrieben. Vergleiche Brosius, J., et al., Biological Chemistry 260:3539-3541(1985). Dieses Gen beinhaltet eine MluI- Restriktionsstelle. Das Anti-HIV-1-gag-Ribozymgen mit der Sequenz
  • wird in die MluI-Stelle des 4,5 S-RNA-Moleküls eingefügt, um die in Figur 2 gezeigte Konstruktion auf die folgende Weise herzustellen:
  • Das Plasmid pKK243-1 wurde an der einzigen MluI-Restriktionsstelle in der 4,5 S-Gen- Sequenz geschnitten. Die durch diese Spaltung erzeugten versetzten Enden wurden durch Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und mit Kälberdarm-Phophatase dephosphoryliert. Zwei synthetische DNA-Oligomere mit 10 Basen komplementärer Sequenzen an ihren 3'- Enden, GAGHAM
  • wurden in ein doppelsträngiges Fragment mit Taq-Polymerase durch Zusammenmischen in äquimolaren Mengen in einer 50 µl Reaktion polymerisiert, die ca. 0,5 µg eines jeden Oligos, 25 µmol von jedem dNTP, Taq-Polymerasepuffer (Cetus-Perkin-Elmer) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthielt.
  • Eine Serie von 10 Amplifikationszyklen wurde unter Verwendung von 94C-1 min, 37C-1 min und 72C-2 min durchgeführt. Das polymerisierte Fragment wurde phosphoryliert, mit pKK243-1-Vektor ligiert und in den E. Coli-Stamm MC 1061 durch Standard-Calciumchloridverfahren transformiert. Die Transformanten wurden auf die Ribozymeinfügung durchgetestet und die Einfügung enthaltende Clone auf die Expression unter Verwendung einer Northern-Gel-Analyse (vergleiche Figur 3) überprüft. Niedermolekulargewichtige RNA wurde aus positiven Clonen durch das nachfolgende Verfahren geerntet. Die Zellen wurden in kaltem 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2; suspendiert und zweimal mit 0,3 M NaOAc auf pH 5,5 gebrachtem saurem Phenol extrahiert und mit 3,5 Volumen Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und in sterilem Wasser resuspendiert. Aliquots dieser RNA wurden auf einem 6 % Acrylamid-Gel (20:1 Acrylamid:Bis) bei 40 mA in TBE- Puffer laufen gelassen, auf Zeta -Probe-Nylonfilter durch Elektroblotten bei 90 mA über Nacht transferiert und mit radioaktiv markierten gag-Ribozymen spezifischer Probe GAGHAM 2 hybridisiert. Diese Northern-Analyse zeigte sowohl Precursor (Spur c) und Endprodukte (Spuren a und b, Figur 3). Der Clon mit der höchsten Expression wurde für die weitere Untersuchung ausgewählt. Sowohl der Precursor als auch das bearbeitete Produkt wurden in "L"-Brühe bei 37ºC kultiviert und auf Ribozym-Aktivität überprüft, nachdem sie durch Diffusion-Elution über Nacht aus dem Acrylamid-Gel in 0,3 M NaOAC, pH 5,5, 0,1% SDS gereinigt wurden. Im Anschluß an die Elution wurde die RNA zweimal mit Phenol, einmal mit Dichlormethan extrahiert, mit Ethanol präzipitiert, durch Zentrifugation pelletiert und mit 70% Ethanol gewaschen. Die RNA wurde in Wasser vor der Verwendung gelöst. Die RNA-Fragmente wurden auf in vitro-Spaltungsaktivität durch die von Chang et al., supra beschriebenen Verfahren getestet.
  • Figur 4 zeigt ein mit Ethidiumbromid gefärbtes Gel eines sauren Phenolextrakts kleiner RNA, durch welche 4,5 S (linke Spur) und 4,5 S mit einer 8pb-Insertion an der MluI-Stelle (rechte Spur), welche durch solche Transformanten überproduziert wurden. Die Pfeile zeigen die mit Ethidiumbromid gefärbten Produkte (4,5 S-) (4,5 S- und 8pb-Insertion), die sich von weniger als 1 ml der Zellkultur ableiteten.
  • Figur 5 zeigt einen präparativen sauren Phenolextrakt der RNA von etwa 250 ml der Zelle. Der Pfeil zeigt auf das 4,5 S-gag-Ribozym-Fusionstranskript. Dieses Transkript wurde aus dem Gel ausgeschnitten und zeigte katalytische Funktion (vergleiche Figur 7).

Claims (8)

1. Ein ein prokaryotisches Promotorsystem und ein zu einem stabilen E.Coli-RNA-Gen fusioniertes Ribozym enthaltender Vektor, welcher von etwa 50 bis 200 Nucleotide aufweist.
2. Vektor nach Anspruch 1, worin das Ribozym an E.Coli-4,55-RNA-Gen fusioniert ist.
3. Vektor nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin das Promotorsystem aus einem Tac- Promotor und einem lambda-pl-Promotor ausgewählt ist.
4. Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Ribozym ein Anti-HIV- 1-gag-Ribozym ist.
5. Vektor nach Anspruch 4, in welchem das Anti-HIV-1-gag-Ribozym durch ein Gen mit der Sequenz
codiert ist.
6: Eine mit einem Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 transformierte Zelle.
7. Zelle nach Anspruch 6, welche eine bakterielle Zelle ist.
8. Zelle nach Anspruch 7, welche eine E.Coli-Zelle oder eine Mutante davon ist.
DE69031080T 1989-08-31 1990-10-19 Verfahren zur herstellung von katalytischer rns in bakterien Expired - Fee Related DE69031080T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US40161389A 1989-08-31 1989-08-31
CA002071854A CA2071854A1 (en) 1989-08-31 1990-10-19 Method for the production of catalytic rna in bacteria
PCT/US1990/006032 WO1992006988A1 (en) 1989-08-31 1990-10-19 Method for the production of catalytic rna in bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69031080D1 DE69031080D1 (de) 1997-08-21
DE69031080T2 true DE69031080T2 (de) 1998-02-26

Family

ID=25675253

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19904091533 Withdrawn DE4091533T (de) 1989-08-31 1990-06-05
DE69031080T Expired - Fee Related DE69031080T2 (de) 1989-08-31 1990-10-19 Verfahren zur herstellung von katalytischer rns in bakterien

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19904091533 Withdrawn DE4091533T (de) 1989-08-31 1990-06-05

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0506666B1 (de)
JP (1) JPH05502580A (de)
AU (1) AU649975B2 (de)
CA (1) CA2071854A1 (de)
DE (2) DE4091533T (de)
WO (1) WO1992006988A1 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5942395A (en) * 1997-05-09 1999-08-24 Universite De Montreal Hybrid ribozymes and methods of use
US7919583B2 (en) 2005-08-08 2011-04-05 Discovery Genomics, Inc. Integration-site directed vector systems
US8309791B2 (en) 2008-07-16 2012-11-13 Recombinectics, Inc. Method for producing a transgenic pig using a hyper-methylated transposon

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5116742A (en) * 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
DE3852539T3 (de) * 1987-12-15 2005-08-04 Gene Shears Pty. Ltd. Ribozyme.
CA1340323C (en) * 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
DK0387775T3 (da) * 1989-03-16 1996-11-04 Boehringer Ingelheim Int Genetisk enhed til inhibering af funktionen af RNA
AU637800B2 (en) * 1989-08-31 1993-06-10 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
DE3929741A1 (de) * 1989-09-07 1991-03-28 Hoechst Ag Rna mit endoribonucleaseaktivitaet gegen mrna von reifungsgenen, ihre herstellung und ihre verwendung in pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
AU6616090A (en) 1992-05-20
EP0506666B1 (de) 1997-07-16
EP0506666A4 (en) 1993-07-14
DE4091533T (de) 1992-01-30
WO1992006988A1 (en) 1992-04-30
CA2071854A1 (en) 1992-04-20
EP0506666A1 (de) 1992-10-07
AU649975B2 (en) 1994-06-09
DE69031080D1 (de) 1997-08-21
JPH05502580A (ja) 1993-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19631919C2 (de) Anti-Sinn-RNA mit Sekundärstruktur
DE3486053T3 (de) Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS.
EP1798285B1 (de) Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US5272262A (en) Method for the production of catalytic RNA in bacteria
DE69918820T2 (de) Dna hochdurchsatzvektor für sequenzierung
EP0519463B1 (de) Synthetische katalytische Oligonukleotide
DE3111405C2 (de)
DE69933653T2 (de) Zur Hemmung der Expression des CCR5-Rezeptors befähigte Ribozyme
DE68915282T2 (de) Expressionskassette für pflanzen.
CH661939A5 (de) Verfahren zum konstruieren von sich replizierenden clonierenden vektoren und deren verwendung zur mikrobiellen expression von quasi-synthetischen genen.
DE4013144A1 (de) Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide
EP0460673A1 (de) Rekombinantes Restriktionsenzym Sau3AI kodierendes DNS
DE3485834T2 (de) Verfahren zum bestimmen von nukleinsaeuresequenzen.
EP0115613B1 (de) DNA-Sequenzen, deren Herstellung, diese Sequenzen enthaltende Plasmide und deren Verwendung zur Synthese eukaryotischer Genprodukte in Prokaryoten
DE3751100T2 (de) Erhöhte Produktion von Proteinen in Bakterien durch Verwendung einer neuen Ribosombindungsstelle.
US7960536B2 (en) Synthetic cell-or tissue-specific transcriptional regulatory regions
DE69031080T2 (de) Verfahren zur herstellung von katalytischer rns in bakterien
Benfante et al. Sequence-directed curvature of repetitive AluI DNA in constitutive heterochromatin of Artemia franciscana
DE3788592T2 (de) Plasmidvektor zur Expression im Bazillus, dessen Umwendung für die Klonierung des menschlichen Wachstumshormongens und Verfahren zur Produktion des Hormons.
DE69733540T2 (de) Plasmid
DE3850456T2 (de) Klonierung des isoamylaseenzym kodierenden Gens und seine Verwendung zur Herstellung dieses Enzyms.
EP0299303B1 (de) Eukaryotische Expressionsvektoren mit multimeren Enhancer-Subelementen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung
DE3103714A1 (de) Dns-rekombinationsverfahren zur herstellung eines dem menschlichen interferon aehnlichen proteins
AT396249B (de) Verfahren zur expression von genen in hefe und dna-fragmente und diese dna-fragmente enthaltende plasmide zur verwendung bei diesem verfahren
DE69303685T2 (de) Verfahren zur Expression von Rezeptoren des menschlichen Nervensystems in der Hefe Schizosaccharomyces Pombe

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: HANSMANN & VOGESER, 81369 MUENCHEN

8339 Ceased/non-payment of the annual fee