DD263662A3

DD263662A3 - Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen

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Publication number: DD263662A3
Authority: DD
Publication date: 1989-01-11

Abstract

Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methanol oder Glucose als einzige Kohlenstoffquelle unter Anwesenheit eines wässrigen Nährmediums, dadurch gekennzeichnet, dass der Bakterienstamm Methylobacter acidophilus n. sp. (IMET B 346) verwendet wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle unter Anwesenheit eines wäßrigen Nährmediums.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es sind Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf der Basis von (^-Verbindungen, insbesondere von Methanol, bekannt. Diese Verfahren werden bei Verwendung von Bakterien als Organismenmaterial in Gegenwart von Luftsauerstoff innerhalb eines Temperaturbereiches von 28⁰C bis 42°C, bei pH-Werten von 5,0 bis 8,5 sowie unter Anwendung von normalem oder erhöhtem Druck durchgeführt. Ein geeignetes Verfahren wird wie foigt beschrieben:

Man erzeugt eine Biomasse durch Kultivieren von Bakterien des Stammes MP4 (NCIß 10592) der Gattung Pseudomonas methylotropha in einem kohlenstoff begrenzten kontinuierlichen Kultivierungsprozeß bei einer Temperatur von 40°C. Die Kultur wird belüftet und gerührt, und den pH Wert steuert man automatisch bei 6,8. Das Schäumen wird durch automatisch programmierte Zusätze von Silikonöl gesteuert. Im einzelnen wird wie folgt verfahien: Es wird eine Impfkultur bereitet, indem man 10cm³ steriler Mineralsalzlösung zu einerSchrägkultur des Mikroorganismus hinzufügt, welcher auf Methanol, Mineralsalz-Agar in Schrägagarröhrchen wächst. (Ls wurde eine Suspension der Zellen bereitet, und die gesamte Suspension verwendet man zum Animpfen eines 11 Erlenmeyer-Kolbens, welcher 200cm³ der gleichen Methanol-Mineralsalzsubstanz (0,5%, Gewicht/ Volumen, Methanol) enthält. Den pH-Wert dieses Mediums stellt man vor dem Animpfari auf 6,8 ein. Dann inkubiert mar. dl jse Kultur 24 Stunden auf einer Schüttelmaschine bei einer Temperatur von 37 ⁰C. Mit dieser Saatkultur wird anschließend eine Fermentiervorrichtung angeimpft, wolche 21 Medium nachfolgender Zusammensetzung enthält:

Methanol	10,0	g/i
(NH₄I₂SO₄	1,15	g/i
H₃PO₄	0,0066	molar
MgSO₄-7 H₂O	0,42	g/i
FeSO₄-7 H₂O	5,0	mg/l
CuSO₄-5 H₂O	0,1	mg/l
H₃BO₃	0,07	mg/l
MnSO₄ 7 H₂O	0,5	mg/l
ZnSO₄-7 H₂O	0,5	mg/l
Na₂MoO₄	0,1	mg/l
CaCI₂-2 H₂O	13,2	mg/l
CoCI₂-6 H₂O	0,1	mg/l

Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 6,8 eingestellt, indem man ein 1:1 Gemisch von 4-n KOH:4-n NaOH hinzusetzt. Nach dem Animpfen des Mediums mit der Saatkultur wird die Kultur in der Fermentiervorrichtung bewegt und belüftet, wobei man die Temperatur der Kultur automatisch auf 4O⁰C und den pH-Wert der Kultur automatisch auf 6,8 einregelt.

Die Kultur läßt man als ansatzmäßige Kultur etwa 36 Stunden wachsen. In dieser Zeit ist das Methanol im Medium vom Mikroorganismus vollständig ausgenutzt, und die Konzentration des Methanols im Medium ist nahezu Null. Zu dieser Zeit beginnt man mit der kontinuierlichen Kultivierung, indem man damit beginnt, der Kultur kontinuierlich Medium zuzuführen.

Dazu wird wiederum die gleiche Zusammensetzung des Mediums verwendet. Das Medium wird in zwei Teilen der Kultur zugeführt. Der eine Teil weist die Mineralsalze auf, und der andere ist Methanol in 50%iger wäßriger Lösung. Die Zufuhrgeschwindigkeit den Mediums ist so, daß die Verdünnungsrate 0,1 h"¹ beträgt. Die Kultur läßt man dann für etwj 24 Stunden wachsen, so daß sie ein stabiles, kohlenstoffbegrenztes stetiges Stadium erzielen kann. Die Zellen werden dann kontinuierlich gewonnen und getrocknet. Das Trockengewicht der Zellen im stetigen Zustand beträgt 4,1 g/l, und die Zellausbeute in bezug auf Methanol beträgt 0,41 g getrockneter Zellen je g ausgenutzten Methanols.

Die getrockneten Zellen besitzen einen Rohproteingehalt von 68Gew.-%.

Dieses Verfahren, wie auch alle anderen bisher hekannten Verfahren, weist den Nachteil auf, dal? bei pH-Werten im Bereich von 5,0 bis 8,5 gearbeitet werden muß.

Die Notwendigkeit eines pH-Wertes in der Nähe des Neutralpunktes bringt frr die Prozeßführung aber entscheidende Nachteile mit sich. Diese bestehen in der Ausfällung der als Nährstoffe notwendigen Mineralsalze. Dadurch entstehen in den Reaktoren Salzablagerungen die zu Verkrustungen fünren. Als Folge davon ergeben sich Störungen in der Gasversorgung durch Verstopfung de'r Belüftungseinrichtungen, Störungen im Kühlwasserkreislauf durch eine Senkung der Wärmeableitung und im

Ablauf durch Zusetzen der Rohre. Gleichzeitig kann die Reaktorleistung bezüglich des Sauerstoffüberganges nicht voll ausgenutzt v/erden, da die zum Wachstum des Organismen notwendigen Mineralsalze als anorganische Niederschläge dem Prozeß entzogen werden.

Eine Erhöhung der zugeführten Mineralsalzmengon führt zu keiner Lösung des Problems und belastet zusätzlich die Ökonomie der Verfahren.

Ein weiterer Nachteil des Verfahrens besteht darin, daß die verwendeten Bakterien der Gattung Pseudomonas und auch der Gattung Hyphomicrobium in beträchtlichem Umfang Schleimstoffe in das Medium absondern.

Diese Nebenreaktion, die organismenspezifisch sein kann bzw. durch bestimmte Milieueinflüsse nusgolöst oder verstärkt wird, nimmt u. U. ein solches Ausmaß an, daß ein technischer Prozeß abgebrochen werden muß. Die Reaktionsprodukte Biomasse und wäßriges Fermentationsmedium zeigen dann ein gallertartiges Verhalten und sind nicht mehr fließfähig. Dadurch wird eine Aufarbeitung der Produkte weitgehend erschwert bzw. unmöglich. Gleichzeitig sinkt die Leistung des Reaktors bezüglich seiner Stoffübergangsgeschwindigkeit, und die Ausbeute an Mikroorganismen nimmt ab.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, ν /elches gestattet, in pH-Bereichen <6 zu arbeiten sowie die Bildung von Schleimstoffen im Medium verhindert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen geeigenten Bakterienstamm zu ermittein und einzusetzen. Überraschenderweise gelang es, durch Selektionsversuche aus Anreicherungskulturen einen Mikroorganismus zu isolieren, der in der Lage ist, bei pH-Werten von 2,0 bis 6,0, vorzugsweise bei 3,6 auf Methanol aktiv zu wachsen, ohne dabei Schleimstoffe zu produzieren. Der Mikroorganismus wurde als neue Art von Methylobacter acidophilus η. sp. beschrieben. Erfindungsgemäß verfährt man so, daß man o^:ne als Reinkultur unter sterilen Bedingungen im Schüttelkolben vorgezüchtete Bakterienkultur von Methylobacter acidophilus t.. sp. in einem Laborfermentor überimpft, so daß die Biomassse-Konzentration im Fermentor bei etwa 1 g/l liegt. Der wäßrige Fermentorinhalt enthält die für das Wachstum einer bestimmten Zellmasse erforderlichen Salze und hat einen pH-Wert von 3,6. Nach einer diskontinuierlichen Phase wird auf den kontinuierlichen Betrieb umgestellt, sobald eine bestimmte Zellkonzentration erreicht worden ist. Die Dosierung der Nährsalze wird so bemessen, daß im Fermentor stets eine Übereinstimmung zwischen Nährsalzangebot und Nährsalzbedarf besteht. Die Fermentation erfolgt vorzugsweise bei Temperaturen von 3O⁰C bis 34⁰C und kann sowohl bei Normaldruck als auch bei Drücken von 2 bis 10at durchgeführt, werden. Unter den genannten Bedingungen ist die Gefahr einer Infektion durch Fromdorganismen auch unter sterilen Bedingungen sehr niedrig. Die Abtrennung der Biomasse aus den Fermentorabläufen geschieht mit Hilfe der üblichen Trennverfahren.

Der Produktiorisstamm Methylobacter acidophilus η. sp. wird folgendermaßen beschrieben:

Bei Methylobacter acidophilus handelt es sich um eine neubeschriebene Art der Gattung Methylobacter. Von Methylobacter chroococcum und Methylobacter bovis unterscheidet sich die Art in der Beweglichkeit, der Koloniefarbe und der Pigmentbildung, von Methylobacter capsulatus und Methylobacter vinelandii durch Größe und Zellmorphologie, von allen vier Arten durch ein sehr gutes Wachstum auf Methanol bzw. Glucose als einziger C-Quelle, durch das Optimum für das Wachstum bei niedrigem pH-Wert und den Bedarf an 0,1 % Hefeextrakt im Medium in Reinkultur.

Morphologie: große, dicke Stäubchen, mehr oder weniger abgerundet, zuweilen zwei oder mehrere kettenförmig zusarr menhängend, beweglich, polar begeißelt (1 bis 3 Geißeln), gram-negativ.

Größe: 0.9 bis 1,2 pm χ 3,6μπ\ daneben kürzere Stäbchen mitO,9 χ 1,8μιη und kokkoide Formen (0,9 χ 0,9pm). Koloniemorphologie: runde, leicht erhabene, glattrandige, weiß-gelbliche Kolonien von feucht-schmieriger Konsistenz, Größe

nach 48Std. 0,5 bis 1 mm

Wachstum auf Mineralsalzmedien mit 0,1 % Hefeextrakt: sehr gutes Wachstum auf Methanol bei pH = 3,6 bis 4,0, kein Wachstum auf dem gleichen Medium bei gleicher C-Quelle bei pH = 6,9; ähnliches Verhalten beim Wachstum auf Glucose,

mäßiges Wachstum bei pH = 4,0 auf Sacharose, Fructose und Glycerin, sehr geringes Wachstum bei pH = 4,0 auf Arabinose, Xylose, Mannose, Maltose, Lactose, Adonit, Duicit, Mannit, Inosit, Na-Lactat,

kein Wachstum bei pH = 4,0 auf Raffinose, Rhamnose, Na-S'jccinat, Na-Malat, Na-Fumarat, Na-Oxalat, Pepton, Bouillon, Gelatine.

Phyiologie: Nitratreduktiort: negativ,

H₂S-Bildung: negativ,

Indolnachweis: negativ,

Urease: negativ,

Harnstoffspaltung: negativ,

Bersiekow-Reihe: Vergärung von Glucose und Arabinose unter Säurebildung.

Der Bakterienstamm wurde im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie in Jena (DDR) unter der Nummer IMET B346 hinterlegt.

Durch die Verwendung dieses Bakterienstammes bei der Kultivierung von Mikroorganismen auf der Basis von C,-Verbindungen als einziger Kohlenstoffquelle ist es erstmalig gelungen, das Fermentationsverfahren in pH-Bereichen von 2 bis 6 durchführen zu können. Ein weiterer wesentlicher Vorteil besteht darin, daß der eingesetzte Bakterienstamm Methylobacter acidophilus η. sp. unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Schleimstoffe absondert. In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.

Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1:

Der Stamm Methylobacter acidophilus wird in einen Rührkessetformentor mit einem Arbeitsvolumen von 5I eingeimpft, so daß

die aktuelle Biomasse-Konzentration im Ferrnentor bei etwa 1 g/l liegt. Das Fermentationsmedium enthält die für den Zuwachs

von 10g BTS/I erforderlichen Mengen an Mineralsalzen und einen geringen Anteil Hefeextrakt, es hat folgende

Zusammensetzung:

Methanol	15g/l	H₃BO₃	14,0 mg/
NH₄CI	4,0 g/l	FeCI₂-7H₂O	8,4 mg/1
K₂HPO₄	1,2 g/l	CaCI₂-6H₂O	14,4 mg/1
MgSO₄ ·7Η,0	0,8 g/l	Na₂MoO₄ -2H₂O	1,8 mg/1
CuSO₄-5H₂O	4,8 mg/1	ZnCI₂-7H₂O	1,7 mg/1
CoSO₄-5H₂O	1,2 mg/1	Hefeextrakt	0,1 %
MnSO₄-4H₂O	9,6 mg/1:

Die Züchtung wird zunächst diskontinuierlich unter Rühren und ständiger Belüftung mit 1001 Luft/l Fermentorinhalt bei einer ι

Temperatur von 32⁰C und bei Normaldruck durchgeführt. Der pH-Wert wird dabei durch Zugabe einer Mischung von KOH und {

NaOH (5%, Gewichtsverhältnis 1:1) konstant bei 3,6 gehalten. Wenn die vorgegebene Methanol-Menge verbraucht ist, setzt man |

erneut eine Menge von insgesamt 75g Methanol zu. ί

Nachdem schließlich die Biomasse-Konzentration im Fermentor einen Wert von etwa 10g/I erreicht hat, kann mit dem !

kontinuierlichen Betrieb bei einer Verweilzeit von 8Std. begonnen werden. Dabei kommt nunmehr eine Näht lösung zum Einsatz, ; die entsprechend den o.g. Angaben für eine Biomasse-Konzentration von 20g/l bilanziert wurde und 6,0% Methanol enthält. Auf

den Zusatz von Hefeextrakt kann dabei verzichtet werden. j

Nach einer Zeit von etwa 24Std. verläuft der Prozeß stabil bei einer Zellkonzentration von 18g/l ohne Anzeichen von .

Schleimbildung. Der Proteingehalt der abgetrennten und getrockneten Zellmasse liegt zwischen 70 und 75% (Asche-Gehalt: ί

Beispiel 2:

Der Stamm Methylobacter acidophilus wird in einen 6I Di uck-Rührfermontor eingeimpft, so daß die aktuelle Biomasse-

Konzentration im Fermentor bei etwa 1 g/l liegt. Das Fermentationsmedium enthält die für den Zuwachs 10 g BTS/I erforderlichen _;

Mengen an Mineralsalzen und einen geringen Anteil an Hefeextrakt, die Zusammensetzung entspricht der wie in Beispiel 1. j

Die Züchtung wird zunächst diskontinuierlich unter Rühren und ständiger Belüftung mit 1001 Luft/l Fermentorinhalt bei einer ^:

Temperatur von 32°C und bei Normaldruck durchgeführt. Der pH-Wert wird dabei durch Zugabe einer Mischung von KOH und _;

NaOH (5% Gewichtsverhältnis 1:1) konstant bei 3,6 gehalten. Wenn die vorgegebene Methanol-Menge verbraucht ist, setzt man :

erneut eine Menge von insgesamt 75g Methanol zu.

Nachdem schließlich die Biomasse-Konzentration im Fermentor einen Wert von etwa 10g/I erreicht hat, beginnt man mit dem

kontinuierlichen Betrieb unter folgenden Bedingungen.

Man erhöht den Systemdruck auf 4,5at und führt eine Nährlösung folgender Zusammensetzung zu:

Methanol	94,5 g/l
NH₄CI	25,2 g/l
K₂HPO₄	7 6 g/l
MgSO₄-7H₂O	5,0 g/l
CuSO₄-5H₂O	30,2 mg/l
CoSO₄-5H₂O	7,6 mg/1
MnSO₄-4H₂O	60,5 mg/1
H₃BO₄	88,2 mg/1
FeCI₂-7H₂O	52,9 mg/1
CaCI₂-6H₂O	90,7 mg/1
Na₂MoO₄ -2H₂O	11,4 mg/1
ZnCI₂-7H₂O	10,7 mg/1

Die Verweilzeit beträgt 7,5 Stunden. Die Temperatur 32⁰C. Der Fermentorinhalt wird ständig mit 1001 Luft/l Fermentorinhalt bei 4,5at belüftet und intensiv gerührt. Die Einhaltung des pH-Wertes von 3,6 erfolgt automatisch unter Verwendung einer 10%ifjen Mischung von KOH und NaOH (Gewichtsverhältnis 1:1).

Nach etwa 36 Stunden stellt sich eine stabile Zellkonzentration von 63g/l ein. Eine SchleimDildung erfolgt nicht. Die getrocknete Zellrr,?sse besteht zu 68 bis 76% aus Protein {Aschegehalt = 8%).

Claims

! Patentansprüche:

1. Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen auf Methanol oder Glucose als einziger ί Kohlenstoffquelle unter Anwesenheit eines wäßrigen Nährmediums, dadurch gekennzeichnet, daß ί der Bakterienstamm Methylobacter acidophilus η. sp. (IMET B346) verwendet wird. j
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-Wert von 2,0 bis 6,0, vorzugsweise bei 3,6 durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem Systemdruck von 1 bis 10 at durchgeführt wird.