DD202589A5

DD202589A5 - Verfahren zur herstellung von narasin

Info

Publication number: DD202589A5
Application number: DD82239578A
Authority: DD
Inventors: Ralph E Kastner; Robert L Hamill
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1981-05-06
Filing date: 1982-05-04
Publication date: 1983-09-21
Also published as: AR227589A1; PL236281A1; ZA823056B; PH17799A; AU557316B2; GB2097794A; HU189578B; FI70595C; US4342829A; PT74842B; GB2097794B; PT74842A; IE52295B1; EP0064409A1; JPS57202291A; ATE10289T1; KR850001230B1; DE3261230D1; CS227700B2; IE821067L

Abstract

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Narasin durch Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies Streptomyces oder einer Narasin produzierenden Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an Narasin durch diesen Mikroorganismus in dem Kulturmedium, das darin besteht, dass man als Mikroorganismus den neuen Organismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 oder eine Narasin produzierende Mutante oder Variante hiervon verwendet. Dieses Verfahren ergibt das gewünschte Narasin in besonders wirtschaftlicher Weise und hoher Ausbeute, so dass hierdurch ein technisch sehr interessanter Weg zur Herstellung dieses wertvollen Antibiotikums bereitgestellt wird.

Description

2395 7 8 2

10 Aktenzeichen: X-5759

15 Vertreter:

Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung:

20 · Verfahren zur Herstellung von Narasin Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues mikrobiologi-25 sches Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Narasin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

^ Narasin.ist ein bekanntes Polyetherantibiotikum. Die Herstellung von Narasin durch Züchtung von Streptomyces aureofaciens NRRL 5758 oder Streptomyces aureofaciens NRRL 8092 wird in US-PS 4 038 384 beschrieben, und in diesem Zusammenhang wird auch auf J. Antibiot. 31, 1 bis

³⁵ 6 (1978) hingewiesen.

AMAI1982*ÜO743

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Ferner wird auch auf Developments in Industrial Microbiology (Publikation der Society for Industrial Microbiology (1977)), Band 18, Kapitel 38, Seiten 481 bis 485 verwiesen, worin sich eine Arbeit von Boeck et al mit dem Titel "Narasin, a new Polyether Antibiotic; Discovery and Fermentation Studies" befindet.

IQ Narasin ist gegen grampositive Bakterien, anaerobe Bakterien und Pilze wirksam, und es stellt ferner auch ein wertvolles Mittel gegen Coccidien sowie ein Mittel zur Erhöhung der Futterverwertung bei Wiederkäuern dar.

15 . Aufgabe der Erfindung:

Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Narasin lassen immer noch zu wünschen übrig, und Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung dieses Antibiotikums, das diesen Wirkstoff in gegenüber den bekannten Verfahren verbesserter Weise ergibt.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß gelöst durch ein neues Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Narasin durch Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies Streptomyces oder einer Narasin produzierenden

Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentlichen Menge an Narasin durch diesen Mikroorganismus

in dem Kulturmedium und gegebenenfalls Isolierung des erhaltenen Narasins aus dem Kulturmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus

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] Streptomyces granuloruber NRRL 12389 oder eine Narasin produzierende Mutante oder Variante hiervon verwendet.

Zur Erfindung gehört ferner auch ein Kulturmedium zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze sowie als Mikroorganismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 oder eine Narasin produzierende Variante oder Mutante hiervon enthält.

Der erfindungsgemäß zu verwendende neue Mikroorganismus ist eine von einer Bodenprobe, die in der Umgebung des Surinamflusses bei Surinam in Südamerika gesammelt wurde, abgeleitete biologisch reine Kultur. Diese Kultur wird vorliegend mit der Nummer A-39912 bezeichnet, obwohl sie, wie oben erwähnt, unter der Nummer NRRL 12389 hinterlegt ist.

Die.Kultur A-39912 ist als Streptomyces granuloruber klassifiziert, und zwar auf Basis einer gleichzeitigen Züchtung von Streptomyces rubra, Streptomyces griseoruber und Streptomyces griseoaurantiacus und unter Anwendung der von Shirling und Gottlieb ("Methods of Characterization. of Streptomyces species", Int. Bull, of Systematic Bateriol. 16, 313 bis 340 (1966) empfohlenen Methoden und Medien und Einsatz bestimmter ergänzender Untersuchungen. Die Kultur A-39912 ist ferner auch mit der in J. Antibiot. 28, 194 bis 199 (1975) angegebenen Beschreibung von Streptomyces longispororuber verglichen worden.

Die Kultur A-39912 unterscheidet sich von Streptomyces rubra unter anderem dadurch, daß sie Granulate bildet, ° nämlich Kristalle von Undecylprodiginin, einen purpurroten Farbstoff erzeugt, ein purpurrotes bis schwarzes vegetatives Mycel bildet und Nitrat reduziert. Die Kultur

i rcn λ0 a Q * ί \ ί> ii \) 2 -J

239578 2

A-39912 bildet ein rotes und graues Luftmycel, während das Luftmycel von Streptomyces griseoruber grau ist. Das von der Kultur A-39912 gebildete purpurrote bis

schwarze vegetative Mycel unterscheidet sich ebenfalls vom gelbbraunen bis rötlichorgangen vegetativen Mycel von Streptomyces griseoruber· Im Gegensatz zur Kultur A-39912 bildet Streptomyces griseoaurantiacus das unter-"IQ scheidungsfähige purpurrote bis schwarze vegetative Mycel nicht. Im Gegensatz zu A^39912 bildet weder Streptomyces griseoruber noch Streptomyces griseoaurantiacus die purpurroten Kristalle von Undecylprodig inin.

Ein Vergleich der Kultur A-39912 mit den oben erwähnten Kulturen zeigt demnach signifikante Unterschiede. Bei der vorliegenden Kultur handelt es sich demnach um eine neue Spezies, die als Streptomyces granuloruber bezeichnet wird.

Charakterisierung des Narasin produzierenden Stammes

Morphologie

Der vorliegende Stamm bildet spiralförmige Sporophoren. Die Sporen sind aufgrund einer elektronenmikroskopischen Untersuchung glatt und weisen eine ovale bis leicht zylindrische Form auf. Die Sporen haben Abmessungen von im Mittel 1,3 μπι χ 2,015 μπι mit einem Bereich von 1,3 um χ 1,3 μΐη bis 2,6 μΐη.

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Kulturcharakteristiken

Die Wachstumscharakteristiken von Streptomyces granuloruber auf verschiedenen Medien gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

Die Zuordnung der Farbnamen erfolgt gemäß der ISCC-NBS-TO Methode (K-L. Kelly und D.B. Judd, "The ISCC-NBS-Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names",. U.S. Department of Commerce Circ. 553, 1955, Washington, D.C.). Die in Klammern angegebenen Werte beziehen sich auf die Farbskala von Tresner und Backus (H.D. Tresner und E.J. Backus, "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335 bis 338 (1956). Die. Bezeichnungen der jeweiligen Farbtafeln sind unterstrichen angegeben. In Klammern sind die Farbblöcke nach Maerz und Paul angeführt (A. Maerz und M.R. Paul, "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, N.Y., (1950)).

Tabelle I

Kulturcharakteristiken auf verschiedenen Medien

Medium

Charakteristiken

Tomatenpaste-Hafermehl-Agar

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite purpurschwarz /.56E8/, genügend Luftmycel und, Sporen der Farbzuordnungen von (GY) 5fe schwach gräulichbraunrötlich bis (R) 5dc gräulichgelblichpink. Kein oder wenig braunes wasserlösliches Pigment.

-·- 239578

Tabelle I (Fortsetzung)

Medium Charakteristiken

Glyceriri-Glycin-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (Medium ISP Nr. 2)

Hafermehl-Agar (Medium ISP Nr. 3)

Anorganische Salze-Stärke-Agar (Medium ISP Nr. 4)

Glycerin-Asparagin-Agar (Medium ISP Nr. 5)

Nähr-Agar

Trypton-Hefeextrakt-Agar Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite dunkelpurpurrot _/55H4_/, genügend Luftmycel und Sporen mit der FärbZuordnung (R) 5dc gräulichgelblichpink. Kein lösliches Pigment.

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite schwarz bis schwarzrot /56C1_/ bis /56H12/· -Reichliches Luftmycel und Sporen mit der Farbzuordnung von (W) b weiß bis (GY) d hellgrau. Kein oder nur wenig braunes wasserlösliches Pigment.

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite mittelrotbraun [1 Jl_/, gutes Luftmycel und Sporen mit der Farbzuordnung (GY) d hellgrau. Etwas braunes wasserlösliches Pigment.

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite mittelrotbraun /VJ^/. Reichliches Luftmycel und Sporen mit der Farbzuordnung (R) 5de gräulichgelblichpink. Kein wasserlösliches Pigment.

Reichliches Wachstum, Farbe der Unterseite mittelrotbraun /J5G9_/. Gutes Luftmycel und Sporen mit der FärbzuOrdnung (R) 5dc gräulichgelblichpink. Kein wasserlösliches Pigment.

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite gräulichgelb /_ 1 2B2/ . Weder Luftmycel noch Sporen. Keine Farbzuordnung. Kein wasserlösliches Pigment.

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite gräulichgelb /12B2/. Weder Luftmycel noch Sporen. Keine Farbzuordnung. Kein wasserlösliches Pigment.

239578 2

Tabelle I (Fortsetzung)

Medium CaIc iummalat-Agar

Emerson-Agar

Glueöse-Asparagin-Agar

Bennett-Agar

Tyrosin-Agar

Czapek-Lösung-Agar

Charakteristiken

Ausreichendes Wachstum, Farbe der Unterseite fahlgelb /10B2/. Genügend Luftmycel und Sporen mit der Farbzuordnung (GY) 2gi hellolivbraun. Kein wasserlösliches Pigment.

Reichliches Wachstum. Farbe der Unterseite mittelgelbbraun _/13ϊΠ/. Weder Luftmycel noch Sporen. Keine Farbzuordnung. Kein wasserlösliches Pigment.

Gutes bis reichliches Wachstum. Farbe der Unterseite schwarzrot. /_56J10/. Gutes, bis reichliches Luftmycel und. Sporen mit der Farbzuordnung (GY) 5fe hellgraurötlichbraun. Etwas braunes wasserlösliches Pigment. .

Gutes Wachstum. Farbe der Unterseite graugelb /_ 1 2J5/ . Weder Luftmycel noch Sporen. Keine FärbZuordnung. Kein wasserlösliches Pigment.

Reichliches Wachstum. Farbe der Unterseite dunkelpurpurrot _/54J6/. Ausreichend bis gutes Luftmycel ,und Sporen mit der Farbzuordnung (W) b weiß bis (R) 6ec gräulichgelblichpink. Bräunliches wasserlösliches Pigment.

Genügendes Wachstum. Farbe der Unterseite f ahlorangegelb 7.9B2/ . Genügend Luftmycel und Sporen mit der FärbZuordnung (GY) 2de gelblichgrau. Hellbraunes wasserlösliches Pigment.

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Der vorliegende Mikroorganismus ist unter Anwendung üblicher Verfahren auch hinsichtlich ausgewählter physiologischer Eigenschaften untersucht worden. Die hierbei beobachteten Eigenschaften und die gefundenen Charakteristiken gehen aus der folgenden Tabelle II hervor:

co

to

Oi

Tabelle Il Physiologische Eigenschaften von A-39912

Bildung von melanoidartigem Pigment auf:

1. Trypton-Hefeextrakt-Brühe (ISP Nr. 1)

2. Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Schräge (ISP Nr. 6)

3. Tyrosin-Agar-Schräge (ISP Nr. 7) Nitratreduktion Gelatineverflüssigung Kartoffelstöpsel

Karottenstöpsel

Stärkehydrolyse -Verwendung von Medium ISP Nr. anorganische Salze-Stärke

Temperaturbedarf

Magermilch

NaCl-Verträglichkeit pH-Bereich für das Wachstum kein melanoidartiges Pigment kein melanoidartiges Pigment kein melanoidartiges Pigment positive Reaktion

positive Reaktion - 100 % nach 14 Tagen kein Wachstum

kein Wachstum

Hydrolyse

reichliches Wachstum und Sporulation bei Temperaturen zwischen 25.und 43°C. Kein Wachstum bei einer Temperatur von unter 2 5⁰C und einer Temperatur von über 43⁰C.

Peptonisierung

= 3,5%, jedoch weniger als 4,0 % Wachstum von pH 5,5 bis 9,5

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Die KohlenstoffVerwertung wird bestimmt unter Verwendung des Grundmediums von Pridham und Gottlieb,'dem die Kohlenstoffquellen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 % zugesetzt sind, und hierzu wird auf die bereits oben erwähnte Veröffentlichung von Shirling und Gottlieb in Int. Bull, of Systematic Bacteriol. 16, 313 bis (1966) hingewiesen. Vor Zusatz zum Grundmedium werden die Kohlenstoffquellen sterilisiert. Es werden Ablesungen nach 8-tägiger und 14-tägiger Bebrütung bei 3 0°C vorgenommen, wobei die Endwerte entsprechend aufgezeichnet werden.

Die unter Verwendung der Kultur A-39912 bei den Versuchen über die Kohlenstoffverwertung erhaltenen Ergebnisse, gehen aus der folgenden Tabelle III hervor.

Tabelle III 20

Kohlenstoffverwertung

Subst-rat: Kohlenstoffquellen, die Reaktion von A-39912

dem Grundmedium von Pridham und nach 14 Tagen Gottlieb zugesetzt werden

—

L-Arabinose . ++

D-Fructose ++

D-Glucose . ++

Isoinosit ++

D-Mannit -

D-Raffinose +

L-Rhamnose ++

Saccharose +_

^r D-Xylose ++

D-Galactose ++

Kontrolle - Kohlenstoff

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Kohlenstoffquellen nach dem Internationalen Streptomyces Projekt (gemäß der oben angegebenen Literaturstelle von f. Shirling und Gottlieb) .

. Schlüssel:

++ = starke positive Verwertung + = positive Verwertung IQ +_ = zweifelhafte Verwertung - = negative Verwertung

Zellwandstudien ·

Unter Anwendung hydrolysierter Gesamtzellen des Mikroorganismus bestimmt man die Gegenwart bestimmter diagnostischer Zucker. Für die Bestimmung der Isomeren von Diaminopimelinsäure werden isolierte Zellwände verwendet.

Die Bestimmung der Zellwandzucker erfolgt unter Anwendung einer Abwandlung des Verfahrens von M.P. Lechevalier ("Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes Into Genera"). Diese Methoden sind von entsprechenden Arbeitskreisen des Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbiology (Dr.

Thomas G. Pridham, Convenoer) entwickelt worden, die am Institute of Microbiology, Rutgers University, The State · University of New Jersey, New Brunswick, N.J., (1971) abgehalten worden sind. Die Isomeren von Diaminopimelinsäure sind unter Anwendung des Verfahrens von Becker et al, Appl. Microbiol.11, 421 bis 423 (1964) ermittelt worden. Die Auswertung aller Platten erfolgt nach 8-tägiger und nach 14-tägiger Inkubation bei 3O⁰C. Die bei diesen Zellwanduntersuchungen erhaltenen Ergebnisse gehen aus fol-

35 gender Aufstellung hervor.

- 12 -

239578 .2

untersuchung

Beobachtete Ergebnisse

Isomere von 2,6-Diaminopimelinsäure

festgestellte diagnostische Zucker

LL-Isomer Glucose, Ribose

Die folgende Tabelle IV zeigt einen Vergleich der Muster der Kohlenstoffverwertung von A-3 9912, Streptomyces (chainia) rubra ATCC 17755, Streptomyces griseoruber ATCC 23919 und Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 19840.

CO CO K3 NO-- —· -

Cn O Ch O Cn O CM—·

Tabelle IV

Kohlenstoffverwertungsmuster von A-39912, STREPTOMYCES (CHAINIA) RUBRA ATCC 17755, STREPTOMYCES GRISEORUBER ATCC 23919 und STREPTOMYCES GRISEOAURANTIACÜS ATCC 19840 Kohlenstoffquelle A-39912 ATCC 17755 ATCC 2 3919 ATCC 19840

D-Glucose ++ ++ ++ ++

L-Arabinose + - ++ ++

Saccharose ._+ + - -

D-Xylose ++ + ++ + +

Isoinosit ^{+ +} i ++ + +

D-Fructose ++ + ++'++ '

D-Mannit - + - ++ oo

Rhamnose ++ + ++ ++ '

Raffinose ^ +_ -- -

++ = starke positive Verwertung + = positive Verwertung +_ = fragliche Verwertung

= negative Verwertung * ^*

- 14 1

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Die folgende Tabelle V zeigt einen Vergleich der Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen A-39912 und Streptomyces (chainia) rubra ATCC 17755, Streptomyces griseoruber ATCC 23919 und Streptomyces griseoaurantiacus ATCC 1984 0.

co cn	CO O	ro cn	IO —> O cn	A-39912	ATCC 17755 S. (chainia) rubra	+	(chainia) rubra	—	O Oi	+
		Tabelle V	spiralförmig	spiralförmig	-	und Streptomyces	+		+
Vergleich von A-3991	2, Streptomyces	glatt	glatt	hydrolysiert	ATCC 23919 S. griseoruber	peptonisiert	ATCC 17755,	peptonisiert
Streptomyces griseoruber ATCC 23919	purpurrot bis schwarz, rötlichbraun	gelbbraun, bräunlichorange		spiralförmig		griseoaurantiacus ATCC 1984 0
Testbedingungen	rot bis grau	rot	glatt	ATCC 19840 S. griseoaurantiacus
Sporenketten- morphologie	+	gelbbraun, rötlichorange	spiralförmig
Sporenoberfläche	+	grau	glatt
vegetative Farbe	peptonisiert	gelbbraun, olivgrau-rötlichbraun
Farbe der Luf t- mycelmasse		grau
Gelatinever flüssigung
Nitratreduktion
Magermilch
Bildung von melanoidartigem Pigment

co cn	co σ	ro CM Tabelle	to —· O CM V (Fortsetzung)	O CM
Testbedingungen	A-39912	ATCC 17755 S. (chainia) rubra	ATCC 23919 S. griseoruber	ATCC 19840 S. griseoaurantiacus
Bildung VOn₁ Kristallen auf:

Medium ISP Nr. 2 Medium ISP Nr. 3

Tomatenpaste-Hafermehl

Isomeres von 2,6-Diaminopimelinsäure

LL

Kristalle von Uhdecylprodiginin

CaJ COcn

OO

239578 L

Eine Reihe morphologischer und physiologischer Eigenschaften der oben erwähnten vier verschiedenen Stämme 5 befinden sich in Übereinstimmung mit Ausnahme der vegetativen Farbe, der Farbe der Luftmycelmasse und der Granulatbildung auf verschiedenen Medien, wie dies aus der obigen Tabelle V hervorgeht.

]0 Der Narasin produzierende Mikroorganismus Streptomyces granuloruber ist in der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Center, U.S. Deaprtment of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt worden und von dort ohne jegliche Beschränkung über eine Verfügbarkeit unter der Nummer NRRL 12389 allgemein erhältlich.

Genauso wie bei anderen Mikroorganismen sind auch die Eigenschaften der Narasin produzierenden Kultur Streptomyces granuloruber mit der Nummer NRRL 12389 einer Variation zugänglich. So lassen sich erfindungsgemäß beispielsweise auch Mutanten (spontane oder induzierte), Transkonjuganten und Rekombinanten (unter Einschluß von rekombinierender DNA auf Plasmiden) des Stammes NRRL 12389 oder hiervon abgeleiteter Organismen verwenden, die das Antibiotikum Narasin produzieren.

Zur Bildung von Narasin-mittels Streptomyces granuloruber eignet sich eine Anzahl verschiedener Medien.

Diese Medien sollen, assimilierbare Quellen für Kohlen·" hydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthalten. Zu geeigneten Kohlenstoffquellen gehören Glucose, Stärke und Dextrin. Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören Pepton, enzymhydrolysiertes Casein, Baumwollsaatmehl

^ und Fleischpepton.

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Die für das Wachstum und die Entwicklung des Mikroorganismus erfoderlichen essentiellen Spurenelemente können als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen der Medien in Mengen vorkommen, die für das Wachstum und die biosynthetischen Erfordernisse des Organismus ausreichen* Es kann sich jedoch günstig auswirken, wenn man den Kulturmedien weitere lösliche anorganische Nährsalze zusetzt, die für entsprechende Ionen von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Ammonium," Chlorid, Carbonat, Phosphat, Sulfat oder Nitrat sorgen.

Zur Bildung wesentlicher Mengen an Narasin unter Verwendung von NRRL 12389 wird unter Anwendung submerser aerober Fermentationsbedingungen in entsprechenden Tanks gearbeitet. Kleine Mengen an Narasin lassen sich jedoch auch durch Schüttelkolbenkultur erreichen. Bei einer Tankfermentation arbeitet man vorzugsweise mit einem vegetativen Inokulum. Die Herstellung des vegetativen

Inokulums erfolgt durch Beimpfung eines kleinen Volumens an Kulturmedium, mit der Sporenform, mit Mycelbruchstücken . oder mit einem lyophilisierten Pellet des Mikroorganismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Sodann wird das vegetative Inokulum in einen größeren Tank übertragen, in dem nach einer geeigneten Inkubationszeit das Antibiotikum Narasin in optimaler Ausbeute gebildet wird.

^ou Der pH-Wert des nichtbeimpften Fermentationsmediums ist abhängig von dem zur Produktion verwendeten Medium, er fällt für alle Fermentationsmedien jedoch in einen Bereich von etwa pH 6,5 bis 7,5.

Der Narasin bildende Mikroorganismus kann über einen breiten Temperaturbereich von etwa 25 bis 43⁰C wachsen. Zu einer optimalen Bildung von Narasin mittels NRRL 12389 scheint es bei einer Temperatur von etwa 30⁰C zu

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kommen.

Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, so

wird auch im vorliegenden Fall in das Kulturmedium . - sterile Luft eingeblasen. Für ein sauberes Wachstum des Mikroorganismus sollte bei der Tankproduktion mit einer Luftmenge von etwa 0,25 bis. 1,0 Volumina pro Volumen

10 Kulturmedium und pro Minute (Volumen/Volumen/min)

gearbeitet werden. In einem 10 1 fassenden Reaktionsgefäß beträgt die optimale Lüftmenge etwa 0,2 Volumina pro Volumen Kulturmedium und pro Minute, und dies läßt sich durch Rühren mittels herkömmlicher Flügelrührer unter einer Rotationsgeschwindigkeit von etwa 4 00 Upm erreichen. Falls die Schaumbildung bei großtechnischem Fermentationsmedium zu einem Problem wird, dann muß man gegebenenfalls· kleine Mengen, nämlich beispielsweise Mengen von 0,2 ml/1, eines Antischaummittels zusetzen,

20 wie Propylenglykol.

Die Bildung des Antibiotikums Narasin läßt sich während der Fermentation entweder durch Messung der Agardiffusion oder durch turbidimetrische Methoden überwachen. Zu hierfür geeigneten Testorganismen gehören beispielsweise Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis und Micröcoccus luteus. .

Eine entsprechende antibiotische Wirksamkeit ist im on

allgemeinen nach etwa 4 0 Stunden vorhanden und bleibt über eine Zeitdauer von wenigstens zwei oder mehr Tagen während der Fermentationsdauer erhalten. Zu einer maximalen Bildung an Antibiotikum kommt es innerhalb einer Fermentationszeit von etwa 2 bis 4 Tagen.

Das Antibiotikum Narasin läßt sich aus dem Fermentationsmedium durch an sich bekannte Methoden gewinnen,

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und hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf US-PS 4 038 384.

Der neue Narasin produzierende Mikroorganismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 bildet wesentliche Mengen des Faktors A von Narasin und ferner auch geringe Mengen der Faktoren B sowie D von Narasin. Die Komponenten des Narasinkomplexes lassen sich in Form einzelner Antibiotika gewinnen, indem man den Komplex beispielsweise säulenchromatographisch weiter reinigt. Die einzelnen Faktoren von Narasin werden unter anderem in US-PS 4 038 384 beschrieben.

Ausführungsbeispiele

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden unter Verwendung verschiedener Fermentationsmedien weiter erläutert. Eine Beschränkung der Erfindung auf die aus den Beispielen hervorgehenden Ausführungsformen ist jedoch hierdurch nicht beabsichtigt.

Beispiel 1

Zur Herstellung einer Schrägagarkultur von Strepto-, myces granuloruber NRRL 12389 geht man von' folgendem

Medium aus: 30

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Bestandteile	Menge (g/l)
Kartoffeldextrin	10,0
enzymhydrolysiertes Casein	2,0
Rinderextrakt	1,0
Hefeextrakt	1,0
Agar	2,0
2 Czapek-Mineralmischung	2,0 ml/1
deionisiertes Wasser	qs auf 1,0 1

N-Z-Amin A (Humko Sheffield Chemical Co., Memphis,

Tenn.) .

Die Czapek-Mineralgrundmischung wird aus folgenden Bestandteilen hergestellt:

Bestandteile Menge (g/100 ml)

KCl ' " 10,0

MgSO₄-7H₂O 10,0

FeSO₄-7H₂O 0,2

deionisiertes Wasser qs auf 100 ml

Sporen von Streptomyces granuloruber NRRL 12389 werden auf einem aus obigen Bestandteilen bestehenden Nährschrägagar beimpft, und der auf diese Weise beimpfte Schrägagar wird etwa 7 Tage bei einer Temperatur von etwa 30⁰C bebrütet..Die reife Schrägagarkultur wird dann mit Wasser überdeckt und zum Ablösen der Sporen und des Mycels mit einem sterilen Werkzeug abgekratzt. Unter Verwendung von 1 ml der hierdurch erhaltenen Sporensuspension beimpft man dann 100 ml eines vegetativen

>j5 Mediums folgender Zusammensetzung:

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Menge	Uf	(g/l)
1	5,0
1	5,0
	5,0
	2,0
	5,0
	2,0 ml/1
1 ,0 1

Bestandteile

5 Dextrose

Sojabohnenmehl Maisquellwasser CaCO₃ NaCl

10 Czapek-Mineralgemisch deionisiertes Wasser

Das vegetative Inokulum bebrütet man in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Weithalskolben bei etwa 30⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden auf einem Reziprokschüttler mit einem Ausschlag von etwa 5 cm unter einer Geschwindigkeit von 108 Hüben pro Minute. Mit dem auf diese Weise bebrüteten Medium beimpft man dann entweder kleine Fermenter (wobei das Inokulum etwa 1 Volumenprozent des Fermentermediums ausmacht) oder Kolben für die zweite Stufe, um hierdurch ein größeres Volumen an Myeel zu bilden.

Man gibt jeweils 200 ml des Produktionsmediums in 1,0 1 fassende Erlenmeyer-Kolben und sterilisiert das Ganze etwa 30 Minuten bei 121⁰C. Das verwendete Produktionsmedium ist wie folgt zusammengesetzt:

Bestandteile	Menge (g/l)
Dextrose	10,0
verdaubare Melasse	20,0
Bactopepton	5,0
CaCO₃	2,0
Czapek-Mineralmischung	2,0 ml/1
deionisiertes Wasser	qs auf 1,0 1

2395 7 8 2

Nach Abkühlen beimpft man die Kolben mit einem 5%-igen Inokulum des vegetativen Inokulums. Die Kultur wird auf einem Reziprokschüttler mit einem Ausschlag von etwa 5 cm und unter einer Geschwindigkeit von 108 Hüben pro Minute bebrütet. Das Fermentationsgemisch hat am Ende von 72 Stunden einen pH-Wert von etwa 7,5. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von 3O⁰C durchgeführt-

Beispiel 2

Zur Herstellung von Narasin verwendet man ein steriles Produktsionsmedium folgender Zusammensetzung:

Bestandteile

20 Antischaummittel auf.. Basis eines Silicons

Glucose Melasse Pepton (Difco)

Menge	(g/l)
0,2
10,0
20,0
5,0
2,0
9,0	1

3 qs auf

deionisiertes Wasser

Antifoam A von Dow Corning

Das obige Produktionsmedium, das einen pH-Wert von 6,8 oU

hat, wird etwa 30 Minuten bei einer Temperatur von etwa 121⁰C unter einem überdruck von etwa 1,1 bis 1,3 bar sterilisiert. Das sterilisierte Medium hat einen pH-Wert von 6,9. Das sterilisierte Medium beimpft man dann mit 2,0 % Inokulum aus dem nach Beispiel 1 erhaltenen Medium der zweiten Stufe. Das inokulierte Produktsionsmedium läßt man dann in einem 10 1 fassenden Fermentationstank etwa 3 Tage bei einer Temperatur von etwa 30⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft

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in einer Menge von 0,2 Volumina pro Volumen Medium und pro Minute belüftet und mittels üblicher Rührer unter einer Geschwindigkeit von etwa 400 Upm gerührt.

Beispiel 3 10 Isolierung und Reinigung

18 1 Fermentationsbrühe werden mittels 1n wässriger Schwefelsäure auf pH 3 eingestellt und etwa 1 Stunde gerührt. Die Brühe wird unter Verwendung einer Filter— hilfe (Hyflo Supercel, nämlich eine von Johns-Manville Corporation hergestellte Diatomeenerde) filtriert und der Filterkuchen mit Wasser gewaschen. Der Filterkuchen wird mit 9 1 Methanol, das 3 % Kaliumhydrogencarbonat enthält, durch etwa 1-stündiges Rühren und anschließendes Abfiltrieren extrahiert. Anschließend wird der Filterkuchen erneut mit 9 1 Methanol extrahiert. Die Methanolextrakte werden vereinigt, auf ein Volumen von etwa 2 1 eingeengt und mittels 1n wässriger Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Das Gemisch wird zweimal mit je 2 1 Ethylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und unter Vakuum zu einem Rückstand eingeengt, den man in 150 ml Aceton löst. Die Acetonlösung wird mit 150 ml Wasser versetzt und mittels 1n wässriger Chlorwasserstoffsäure auf pH 3,0 eingestellt.

Das Gemisch wird etwa 1 Stunde gerührt. Die entstandenen öligen Kristalle werden abfiltriert, in 150 ml Aceton gelöst und mit 150 ml Wasser versetzt. Die Lösung hält man über Nacht auf Raumtemperatur, und durch anschliessendes Abfiltrieren der gebildeten Kristalle, Waschen mit Wasser und Trocknen unter Vakuum gelangt man zu Kristallen, die einen öligen Film aufweisen.

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Die öligen Kristalle werden in 5 ml Benzol gelöst, und die Lösung wird auf eine mit Siliciumdioxidgel gefüllte und in Benzol zubereitete Säule gegeben (1,8 χ 40. cm, Silicagel Sorte 6 2 von Grace). Die Säule wird der Reihe nach mit jeweils 250 ml Benzol, Gemischen aus Benzol und Ethylacetat (9:1), (4:1), (7:3) und (1:1), sowie mit Ethylacetat gewaschen, wobei man jeweils Fraktionen

10 mit einem Volumen von 20 bis 25 ml auffängt. Die

Elution der Aktivität wird durch einen Bioversuch und ferner, auch dünnschichtchromatographisch überwacht, wobei man für die dünnschichtchromatographische Untersuchung mit Siliciumdioxidgel beschichtete Platten verwendet, die man mittels Ethylacetat entwickelt. Zur Detektion der Flecken besprüht man die Platten mit Vanillin und Schwefelsäure, und als Detektionsorganismus wird Bacillus subtilis verwendet. Die lediglich eine Komponente, nämlich Narasin, enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Aceton gelöst, worauf man die Lösung mit 50 ml Wasser versetzt und bei Raumtemperatur bis zur Kristallisation stehen läßt. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert und unter Vakuum getrocknet, wodurch man zu 172 mg weißen Kristallen mit einem Schmelzpunkt von etwa 75 bis 78⁰C gelangt.

Aufgrund eines Vergleichs der NMR-, IR-, UV- und Massen-Spektren und der im Dünnschichtchromatogramm ^ου sowie im Papierchromatogramm erhaltenen Daten ergibt sich, daß die obigen Kristalle mit Narasin identisch sind. Die biologischen Daten dieser Kristalle, nämlich die Werte für die antimikrobielle und anticoccidiale Wirksamkeit, sind identisch mit den Daten einer authen-

tischen Probe von Narasin.

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Zur Identifizierung der durch A-39912 gebildeten purpurroten Kristalle, bedient man sich des im folgenden Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens.

Beispiel 4 ] 0 Undecylprodiginin - Produktion und Identifizierung

Chromatographierplatten aus Kunststoff mit den Abmessungen 23 cm χ 45 cm χ 10 mm, die 250 ml Tomatenpaste-Hafermehl-Agar enthalten, werden gemäß Antibiot. Ann.

1956 - 1957, Seiten 947 bis 953 hergestellt und mit einem 48-Stunden-Inokulum unter Verwendung von Trypton-Hefe-Brühe inokuliert, wobei man sich des Verfahrens von Shirling und Gottlieb gemäß obiger Literaturstelle bedient. Die verwendete Trypton-Hefe-Brühe hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (g/l)

Trypton (Difco) 5,0

Hefeextrakt 3,0

destilliertes Wasser qs auf 1,0 1

Die Brühe hat vor der"Behandlung im Autoklav und vor ihrer Verwendung einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2.

Nach Beimpfung und 14-tägiger Bebrütung der Platten bei einer Temperatur von 30⁰C lassen sich im Agar purpurrote Kristalle feststellen..

Der die purpurroten Kristalle enthaltende Agar wird 3~" längs der Peripherie des Kulturwachstums ausgeschnitten und viermal mit jeweils 500 ml.eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (4.-1) durch 15 Minuten langes Rühren auf einem Wasserbad extrahiert. Die Extrakte

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werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in T2 ml Chloroform gelöst, und die hierdurch erhaltene Lösung chromatographiert man dann mittels einer mit Siliciumdioxidgel (Grace 62) gefüllten und in Chloroform gepackten Säule (1,2x52 cm). Die Säule wird mit. Chloroform eluiert, wobei man jeweils Fraktionen von 10 ml sammelt. Bei der Fraktion 34 wechselt man das Eluiermittel unter Verwendung eines. Gemisches aus Chloroform und Methanol·(95:5). Die eluierten Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch unter Verwendung von mit Siliciumdioxidgel beschichteten Platten und Einsatz eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (9:1) überwacht, wobei man die purpurpigmentierten Flecken beobachtet. Die Fraktionen 9 bis 14, die am intensivsten purpurgefärbt sind (einziger Fleck im Dünnschichtchromatogramm), werden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Dioxan gelöst und die Lösung lyophilisiert, wodurch man zu 10,3 mg eines purpurfarbenen Pulvers gelangt. Das purpurfarbene Pulver ergibt bei der Elektronenstoßmassenspektrometrie unter hoher Auflösung ein Molekularmassenion von 393.27764 und durch Maximumangleichung eine empirische Formel von C₂₅H₃₅N O. Anhand dieser Daten und durch Vergleich der UV-, IR- und NMR-Spektren von Undecylprodiginin, wie sie in Agr. Biol. Chem. 31, 481 (1967) und J. Antibiot. 28, 194 (1975) beschrieben sind, wird das obige purpurfarbene Pulver als Undecylprodiginin

^v identifiziert.

Claims

.-"- 2395 7 8 2

] Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Narasin durch Züchtung eines Mikroorganismus der Spezies Streptomyces oder einer Narasin produzierenden Mutante oder Variante hiervon in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen bis zur Bildung einer wesentliehen Menge an Narasin durch diesen Mikroorganismus in dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 oder eine Narasin produzierende Mutante oder Variante hiervon verwendet.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 verwendet.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet., daß man das gebildete Narasin in einer weiteren Stufe aus dem Kulturmedium abtrennt.
4. Kulturmedium zur Durchführung des Verfahrens nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es assimilierbare Quellen für Kohlenhydrat, Stickstoff und anorganische Salze sowie als Mikroorganismus Streptomyces granuloruber NRRL 12389 oder eine Narasin produzierende Variante oder Mutante hiervon enthält.
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