ES2325877T3 - Moleculas de tipo factor vii o viia. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado polipeptídico que comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de Nglicosilación introducido in vivo, en el que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en la que se ha introducido un sitio de N-glicosilación in vivo mediante la sustitución V253N.
Description
Moléculas de tipo factor VII o VIIa.
La presente invención se refiere a nuevos
conjugados polipeptídicos del Factor VII (FVII) o Factor VIIa
(FVIIa), a su preparación y a su uso en terapia, en particular para
el tratamiento de una variedad de trastornos relacionados con la
coagulación.
La coagulación de la sangre es un proceso que
consiste en una interacción compleja de diversos componentes (o
factores) sanguíneos que eventualmente da lugar a un coágulo de
fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en
lo que se ha denominado la "cascada" de la coagulación son
proenzimas o cimógenos, es decir, proteínas enzimáticamente
inactivas que se convierten en una forma activa mediante la acción
de un activador. Uno de estos factores de la coagulación es el
FVII.
El FVII es una proteína plasmática dependiente
de la vitamina K sintetizada en el hígado y segregada a la sangre
en forma de glicoproteína de cadena sencilla con un peso molecular
de 53 kDa (Broze & Majerus, J. Biol. Chem 1980; 255:
1242-1247). El cimógeno FVII se convierte en una
forma activada (FVIIa) mediante la escisión proteolítica en un
único sitio, R152-I153, que da como resultado dos
cadenas unidas por un único puente disulfuro. El FVIIa en un
complejo con el factor tisular (complejo FVIIa) es capaz de
convertir al factor IX y al factor X en sus formas activadas,
seguido de reacciones que dan lugar a la producción rápida de
trombina y la formación de fibrina (\diametersterud &
Rapaport, Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74:
5260-5264).
El FVII es sometido a modificaciones
post-traduccionales, incluyendo la carboxilación
dependiente de vitamina K, que da como resultado 10 residuos de
ácido \gamma-carboxiglutámico en la región
N-terminal de la molécula. Así, los residuos número
6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 mostrados en la SEQ ID NO: 1
son los residuos ácidos \gamma-carboxiglutámicos
en el dominio Gla importantes para la actividad del FVII. Otras
modificaciones post-traduccionales incluyen la
adición de un resto azúcar en dos sitios de
N-glicosilación de origen natural en la posición
145 y 322, respectivamente, y en dos sitios de
O-glicosilación de origen natural en la posición 52
y 60, respectivamente. El gen que codifica para el FVII humano
(hFVII) se ha mapeado para el cromosoma 13 en
q34-qter 9 (de Grouchy y col., Hum Genet 1984; 66:
230-233). Contiene nueve exones y se extiende 12,8
Kb (O'Hara y col., Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:
5158-5162). La organización del gen y la estructura
de la proteína del FVII son similares a las de otras proteínas
procoagulantes dependientes de la vitamina K, con los exones 1a y
1b que codifican para la secuencia señal; el exón 2 el propéptido y
el dominio Gla; el exón 3 una región hidrófoba corta; los exones 4
y 5 los dominios de tipo factor de crecimiento epidérmico; y el exón
6 a 8 el dominio catalítico serin-proteasa
(Yoshitake y col., Biochemistry 1985; 24:
3736-3750).
Existen informes sobre las estructuras
tridimensionales experimentales del hFVIIa (Pike y col., PNAS.
U.S.A., 1999; 96: 8925-30 y
Kemball-Cook y col., J. Struct. Biol, 1999; 127:
213-223), del hFVIIa formando un complejo con el
factor tisular soluble usando procedimientos cristalográficos por
rayos X (Banner y col., Nature, 1996; 380: 41 y Zhang y col.,
J.Mol.Biol, 1999; 285: 2089), y de fragmentos más pequeños del hFVII
(Muranyi y col., Biochemistry, 1998; 37: 10605 y Kao y col.,
Biochemistry, 1999; 38: 7097).
Se ha informado de relativamente pocas variantes
de la proteína del FVII obtenidas por ingeniería genética (Dickinson
& Ruf, J Bio Chem, 1997; 272: 19875-19879,
Kemball-Cook y col., J Biol Chem, 1998; 273:
8516-8521, Bharadwaj y col., J Biol Chem, 1996; 271:
30685-30691, Ruf y col., Biochemistry, 1999; 38:
1957-1966).
Existen informes sobre la expresión del FVII en
BHK u otras células de mamífero (WO 92/15686, WO 91/11514 y WO
88/10295) y la co-expresión del FVII y la
endoproteasa kex2 en células eucariotas (WO 00/28065).
Las preparaciones comerciales de FVIIa
recombinante humana se venden como NovoSeven®. NovoSeven® está
indicado para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes
con hemofilia A o B. NovoSeven® es el único rFVIIa disponible en el
mercado para el tratamiento eficaz y fiable de episodios de
sangrado.
En el documento WO 91/1154 se ha informado de
una forma inactiva del FVII en la que se ha(n) modificado la
arginina 152 y/o la isoleucina 153. Estos aminoácidos están
localizados en el sitio de activación. El documento WO 96/12800
describe la inactivación del FVIIa mediante un inhibidor
serin-proteinasa; la inactivación mediante
carbamilación del FVIIa en el grupo
\alpha-aminoácido I153 ha sido descrita por
Petersen y col., Eur J Biochem, 1999; 261: 124-129.
La forma inactivada es capaz de competir con el FVII o FVIIa de tipo
silvestre por la unión al factor tisular e inhibe la actividad
coagulante. Se ha sugerido el uso de la forma inactivada del FVIIa
para el tratamiento de pacientes que estén en estados
hipercoagulables, tales como pacientes con sepsis, en riesgo de
infarto de miocardio o de ictus trombótico.
En el "Summary Basis for Approval for
NovoSeven®" se ha informado de una semi-vida del
rFVIIa circulante de 2,3 horas, número de referencia
96-0597 de la FDA. Para alcanzar y mantener el
efecto terapéutico o profiláctico deseado son necesarias dosis
relativamente altas y la administración frecuente. Como
consecuencia, es difícil de obtener la regulación de la dosis
adecuada y la necesidad de administraciones intravenosas frecuentes
impone restricciones sobre la calidad de vida del paciente.
Otro problema en el tratamiento actual del
rFVIIa es la inestabilidad relativa de la molécula con respecto a
la degradación proteolítica. La degradación proteolítica es un
obstáculo importante para la obtención de una preparación en
disolución frente a un producto liofilizado. La ventaja de obtener
una preparación soluble estable reside en una manipulación más
fácil para el paciente, y, en el caso de emergencias, una acción más
rápida, que potencialmente le puede salvar la vida. En el documento
WO 88/10295 se han descrito intentos para prevenir la degradación
proteolítica mediante mutagénesis dirigida en los sitios
proteolíticos principales.
Una molécula con una semi-vida
en circulación más prolongada reduciría el número de
administraciones necesarias. Dada la asociación del producto FVIIa
actual a inyecciones frecuentes, y el potencial para obtener niveles
terapéuticos de FVIIa más óptimos, con un efecto terapéutico
mejorado simultáneo, existe una clara necesidad de moléculas de
tipo FVII o FVIIa mejoradas. Una forma de incrementar la
semi-vida en circulación de una proteína es
asegurar que se reduce el aclaramiento renal de la proteína. Esto se
puede conseguir conjugando la proteína con un resto químico, que
sea capaz de conferir un aclaramiento renal reducido a la
proteína.
Además, la unión de un resto químico a la
proteína o la sustitución de aminoácidos expuestos a proteolisis
pueden bloquear de forma eficaz a una enzima proteolítica del
contacto que da lugar a la degradación proteolítica de la proteína.
El polietilenglicol (PEG) es uno de esos restos químicos que se ha
usado en la preparación de productos de proteínas terapéuticas.
El documento WO 98/32466 sugiere que el FVII,
entre muchas otras proteínas, se puede PEGilar, pero no contiene
ninguna información adicional al respecto.
El documento EP 0370205A describe un
procedimiento para la adición de cadenas de carbohidratos a
polipéptidos introduciendo un tripéptido
Asn-X-Thr/Ser.
La patente de EE.UU. 5.580.560 describe un
factor VII o VIIa modificado con al menos una sustitución y/o
supresión de un residuo lisina, arginina, isoleucina, fenilalanina o
tirosina en posición 38, 32, 290, 315, 341, 304, 42, 44, 278 ó
332.
Esta solicitud describe moléculas FVII y FVIIa
mejoradas, en particular moléculas hFVII y hFVIIa recombinantes,
que proporcionan uno o más de los beneficios deseados anteriormente
mencionados. Así, el conjugado de la presente invención tiene una o
más propiedades mejoradas comparado con el rFVIIa disponible
comercialmente, incluyendo una semi-vida funcional
in vivo incrementada y/o una semi-vida
plasmática incrementada, y/o una biodisponibilidad incrementada y/o
una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica. En
consecuencia, el tratamiento médico con un conjugado de la
invención ofrece una serie de ventajas sobre el compuesto rFVIIa
disponible actualmente, tal como una duración más prolongada entre
inyecciones.
Por consiguiente, en un primer aspecto la
invención se refiere a un conjugado polipeptídico de comprende al
menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de
N-glicosilación introducido in vivo, en el
que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho
conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrado
en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y
en el que se ha introducido un sitio de
N-glicosilación in vivo mediante la
sustitución V253N.
En aspectos adicionales la invención se refiere
a: una secuencia de nucleótidos que codifica la parte polipeptídica
del conjugado de la invención; un vector de expresión que alberga la
secuencia de nucleótidos de la invención; una célula hospedadora
que comprende la secuencia de nucleótidos de la invención o el
vector de expresión de la
invención.
invención.
En otros aspectos adicionales la invención se
refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden el conjugado de
la invención así como al uso de los conjugados.
En el contexto de la presente solicitud e
invención se aplican las siguientes definiciones:
El término "conjugado" (o de manera
intercambiable "polipéptido conjugado") está previsto que
indique una molécula heterogénea (en el sentido de compuesta o
quimérica) formada por la unión covalente de uno o más polipéptidos
a uno o más restos no polipeptídicos tales como moléculas
poliméricas, compuestos lipófilos, restos azúcares o agentes
derivantes orgánicos. Preferentemente, el conjugado es soluble en
las concentraciones y condiciones pertinentes, es decir, soluble en
fluidos fisiológicos tales como la sangre. Ejemplos de polipéptidos
conjugados de la invención incluyen polipéptidos glicosilados y/o
PEGilados. El término "unión covalente" significa que el
polipéptido y el resto no polipeptídico están directamente unidos de
manera covalente entre sí, o bien están indirectamente unidos de
manera covalente entre sí mediante un resto o restos intermedios,
tales como un puente, un espaciador, o un resto o restos de
enlace.
El término "polipéptido no conjugado" se
puede usar como la parte polipeptídica del conjugado.
Cuando se usa en el presente documento, el
término "resto no polipeptídico" significa una molécula que es
capaz de conjugarse con un grupo de unión del polipéptido de la
invención. Ejemplos preferidos de esas moléculas incluyen moléculas
poliméricas, restos azúcares, compuestos lipófilos, o agentes
derivantes orgánicos. Cuando se usa en el contexto de un conjugado
de la invención se entenderá que el resto no polipeptídico está
unido a la parte polipeptídica del conjugado a través de un grupo
de unión del polipéptido. Como se ha explicado anteriormente, el
resto no polipeptídico puede estar directamente unido de manera
covalente al grupo de unión o puede estar indirectamente unido de
manera covalente al grupo de unión a través de un resto o restos
intermedios, tales como un puente, un espaciador, o un resto o
restos de enlace.
La "molécula polimérica" es una molécula
formada por un enlace covalente de dos o más monómeros, en la que
ninguno de los monómeros es un residuo aminoácido, excepto cuando el
polímero es albúmina humana u otra proteína plasmática
abundante.
El término "polímero" se puede usar de
manera intercambiable con el término "molécula polimérica".
Está previsto que el término cubra moléculas de carbohidratos
unidas mediante glicosilación in vitro, es decir, una
glicosilación sintética realizada in vitro que normalmente
supone la unión covalente de una molécula de carbohidrato con un
grupo de unión del polipéptido, opcionalmente usando un agente de
entrecruzamiento.
Las moléculas de carbohidratos unidas mediante
glicosilación in vivo, tal como N- u
O-glicosilación (como se describe en profundidad a
continuación) se denominan en el presente documento "resto
azúcar". Excepto cuando en el conjugado esté expresamente
indicado el número de restos no polipeptídicos, tales como
molécula(s) polimérica(s) o restos azúcares, cada
referencia a "un resto no polipeptídico" contenido en un
conjugado o usado de otra forma en la presente invención hará
referencia a uno o más restos no polipeptídicos, tales como
molécula(s) polimérica(s) o restos azúcares.
El término "grupo de unión" está previsto
que indique un grupo funcional del polipéptido, en particular uno
de sus residuos aminoácidos o un resto carbohidrato, capaz de unirse
a un resto no polipeptídico tal como una molécula polimérica, una
molécula lipófila, un resto azúcar o un agente derivante orgánico.
Los grupos de unión útiles y sus restos no polipeptídicos
correspondientes son evidentes de la tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Para la N-glicosilación, el
término "grupo de unión" se usa de una forma no convencional
para indicar los residuos aminoácidos que constituyen un sitio de
N-glicosilación (con la secuencia
N-X-S/T/C, en la que X es un
residuo aminoácido excepto prolina, N es asparagina y S/T/C es
serina, treonina o cisteína, preferentemente serina o treonina, y
lo más preferentemente treonina). Aunque el residuo asparagina del
sitio de N-glicosilación es al que se une el resto
azúcar durante la glicosilación, dicha unión no se puede llevar a
cabo a menos que estén presentes los otros residuos aminoácidos del
sitio de N-glicosilación.
Por consiguiente, cuando el resto no
polipeptídico es un resto azúcar y la conjugación se debe llevar a
cabo mediante N-glicosilación, el término
"residuo aminoácido que comprende un grupo de unión para el resto
no polipeptídico" como se usa en relación con alteraciones de la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de interés se debe
entender que significa que se deben alterar uno o más residuos
aminoácidos que constituyen un sitio de
N-glicosilación, de tal forma que se introduce un
sitio de N-glicosilación funcional en la secuencia
de aminoácidos o se elimina de dicha secuencia.
En la presente solicitud, los nombres de los
aminoácidos y los nombres de los átomos (por ejemplo, CA, CB, CD,
CG, SG, NZ, N, O, C, etc) se usan según está definido en el Protein
DataBank (PDB) (www.pdb.org) basados en la nomenclatura de la IUPAC
(IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides
(nombres de los residuos, nombres de átomos, etc.), Eur. J.
Biochem., 138, 9-37 (1984) junto con sus
correcciones en Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)).
El término "residuo aminoácido" pretende
indicar un residuo aminoácido contenido en el grupo que consta de
residuos de alanina (Ala o A), cisteína (Cys o C), ácido aspártico
(Asp o D), ácido glutámico (Glu o E), fenilalanina (Phe o F),
glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), lisina
(Lys o K), leucina (Leu o L), metionina (Met o M), asparagina (Asn
o N), prolina (Pro o P), glutamina (Gln o Q), arginina (Arg o R),
serina (Ser o S), treonina (Thr o T), valina (Val o V), triptófano
(Trp o W), y tirosina (Tyr o Y).
La terminología usada para la identificación de
las posiciones de los aminoácidos se ilustra a continuación: G124
indica que la posición 124 está ocupada por un residuo de glicina en
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. G124R
indica que el residuo de glicina de la posición 124 ha sido
sustituido con un residuo de arginina. Las sustituciones
alternativas están indicadas con una "/", por ejemplo, K32D/E
significa una secuencia de aminoácidos en la que la lisina en
posición 32 se sustituye con ácido aspártico o ácido glutámico. Las
sustituciones múltiples están indicadas con un "+", por
ejemplo, K143N+N145S/T significa una secuencia de aminoácidos que
comprende una sustitución del residuo lisina en posición 143 con un
residuo asparagina y una sustitución del residuo asparagina en
posición 145 con un residuo serina o treonina. La inserción de un
residuo aminoácido adicional, tal como la inserción de un residuo
alanina después de G124 está indicada mediante G124GA. Una
supresión de un residuo aminoácido está indicada mediante un
asterisco. Por ejemplo, la supresión de una glicina en posición 124
está indicada mediante G124*. A menos que se indique otra cosa, la
numeración de los residuos aminoácidos del presente documento se
realiza en relación a la secuencia de aminoácidos del FVII/FVIIa de
tipo silvestre mostrado en la SEQ ID NO: 1.
El término "difiere de" como se usa en
relación con mutaciones específicas pretende indicar que permita que
estén presentes diferencias adicionales aparte de la diferencia en
aminoácidos especificada. Por ejemplo, además de la eliminación y/o
introducción de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de
unión para el resto no polipeptídico, el polipéptido FVII o FVIIa
puede comprender otras sustituciones que no están relacionadas con
la introducción y/o eliminación de tales residuos aminoácidos. Así,
además de las alteraciones en los aminoácidos descritas en el
presente documento dirigidas a la eliminación y/o introducción de
sitios de unión para el resto no polipeptídico, se entenderá que la
secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención puede, si
se desea, contener otras alteraciones que no necesariamente están
relacionadas con la introducción o eliminación de sitios de unión,
es decir, otras sustituciones, inserciones o supresiones. Esto puede
incluir, por ejemplo, el truncamiento del N- y/o
C-término por uno o más residuos aminoácidos, o la
adición de uno o más residuos extras en el N- y/o
C-término, por ejemplo, la adición de un residuo
metionina en el N-término así como "sustituciones
de aminoácidos conservativas", es decir, sustituciones realizadas
dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por
ejemplo, aminoácidos pequeños, aminoácidos ácidos, aminoácidos
polares, aminoácidos básicos, aminoácidos hidrófobos y aminoácidos
aromáticos.
Las sustituciones preferidas en la presente
invención se pueden seleccionar, en particular, de los grupos de
sustituciones conservativas listadas en la tabla siguiente.
Los términos "mutación" y
"sustitución" se usan de manera intercambiable en el presente
documento.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El término "secuencia de nucleótidos"
pretende indicar una extensión consecutiva de dos o más moléculas de
nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede ser de origen
genómico, ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquiera de sus
combinaciones. El término "reacción en cadena de la polimerasa"
o "PCR" generalmente se refiere a un procedimiento para la
amplificación in vitro de una secuencia deseada de
nucleótidos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU.
4.683.195. En general, el procedimiento de la PCR supone ciclos
repetidos de síntesis de extensión del cebador, usando cebadores de
oligonucleótidos capaces de hibridarse preferentemente a un ácido
nucleico molde. "Célula", "célula hospedadora", "línea
celular" y "cultivo celular" se usan de manera
intercambiable en el presente documento y todos esos términos se
debe entender que incluyen la progenie que resulta del crecimiento
o el cultivo de una célula. "Transformación" y
"transfección" se usan de manera intercambiable para referirse
al proceso de introducción de ADN en una célula.
"Unido de manera operable" se refiere a la
unión covalente de dos o más secuencias de nucleótidos, por medio
de ligación enzimática u otra forma, en una configuración relativa
entre sí tal que se puede llevar a cabo la función normal de las
secuencias. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica
una presecuencia o una secuencia líder secretora está unida de
manera operable a una secuencia de nucleótidos que codifica para un
polipéptido si se expresa en forma de preproteína que participa en
la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido
de manera operable a una secuencia codificante si afecta a la
transcripción de la secuencia; un sitio de unión del ribosoma está
unido de manera operable a una secuencia codificante si está
situado de manera que facilita la traducción. Generalmente, "unido
de manera operable" significa que las secuencias de nucleótidos
que están unidas son contiguas y, en el caso de una secuencia líder
secretora, contiguas y en fase de lectura. La unión se consigue por
ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no
existen, entonces se usan adaptadores o enlazadores de
oligonucleótidos sintéticos, junto con procedimientos de
recombinación de ADN habituales.
El término "introducir" se refiere a la
introducción de un residuo aminoácido que comprende un grupo de
unión para un resto no polipeptídico, en particular, mediante la
sustitución de un residuo aminoácido existente, o alternativamente,
mediante la inserción de un residuo aminoácido adicional.
El término "eliminar" se refiere a la
eliminación de un residuo aminoácido que comprende un grupo de unión
para un resto no polipeptídico, en particular, mediante la
sustitución del residuo aminoácido a eliminar por otro residuo
aminoácido, o alternativamente, mediante la supresión (sin
sustitución) del residuo aminoácido a eliminar.
El término "FVII" o "polipéptido FVII"
se refiere a una molécula FVII proporcionada en forma de cadena
sencilla.
El término "FVIIa" o "polipéptido
FVIIa" se refiere a una molécula FVII proporcionada en su forma
bicatenaria activada, en la que se ha escindido el enlace peptídico
entre R152 e I153 de la forma de cadena sencilla. Cuando en el
presente documento se usa la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID
NO: 1 para describir la secuencia de aminoácidos del FVIIa, se
entenderá que una de las cadenas comprende los residuos aminoácidos
1-152, y la otra cadena los residuos aminoácidos
153-406.
Los términos "rFVII" y "rFVIIa" se
refieren a moléculas FVII y FVIIa producidas mediante técnicas
recombinantes, respectivamente.
Los términos "hFVII" y "hFVIIa" se
refieren al FVII y FVIIa humano silvestre, respectivamente.
El término "sitio catalítico" se usa para
referirse a la tríada catalítica que consta de S344, D242 y H193
del polipéptido FVII. El término "FVIIa activo", "polipéptido
FVIIa activo", "conjugado FVIIa activo" o "conjugado
activo" se usa para referirse a un polipéptido o conjugado FVIIa
que posee al menos el 10% de la actividad catalítica del FVIIa de
tipo silvestre. La actividad catalítica, como se usa en el presente
documento, se puede determinar de manera conveniente en el ensayo
descrito en la sección titulada Procedimiento de medición de la
actividad catalítica o en el ensayo titulado Procedimiento de
medición de bajos niveles de actividad catalítica (véase la
sección Materiales y procedimientos del presente documento).
Preferentemente, un conjugado activo tiene al menos el 15%, tal
como al menos el 20%, por ejemplo, al menos el 25%, más
preferentemente al menos el 30%, tal como al menos el 40%, lo más
preferentemente al menos el 50%, por ejemplo, al menos el 60% de la
actividad catalítica del hFVIIa de tipo silvestre, cuando se somete
a pruebas en los ensayos descritos anteriormente.
Preferentemente, un conjugado activo es capaz de
unirse al factor tisular y activar posteriormente el factor
plasmático X y/o IX. Así, en una forma de realización preferida, el
polipéptido FVIIa o uno de sus conjugados tiene una actividad
coagulante de al menos el 25%, comparada con el FVIIa de tipo
silvestre, tal como una actividad coagulante de al menos el 50%
comparada con el FVIIa, por ejemplo, una actividad coagulante de al
menos el 75% comparada con el FVII de tipo silvestre. Así, la
actividad coagulante del polipéptido FVIIa activo o uno de sus
conjugados está preferentemente en el intervalo del
25-200% comparada con el FVIIa de tipo silvestre.
En particular, se prefiere que el polipéptido o el conjugado FVIIa
tengan una actividad coagulante en el intervalo del
30-150% comparada con el FVIIa de tipo silvestre,
tal como una actividad coagulante en el intervalo del
30-100% comparada con el FVIIa de tipo silvestre. La
actividad coagulante se puede determinar mediante cualquier
procedimiento conocido en la materia, como se describe en
profundidad en la sección de Materiales y procedimientos
posteriormente. No obstante, se prefiere particularmente que la
actividad coagulante se determine de acuerdo con el procedimiento
descrito en la sección titulada "Medición de la sensibilidad
reducida a la degradación proteolítica" (véase sección de
Materiales y procedimientos).
\global\parskip1.000000\baselineskip
El término "semi-vida
funcional in vivo" se usa con su significado normal, es
decir, el tiempo al cual el 50% de la actividad biológica del
polipéptido o el conjugado aún está presente en el cuerpo/órgano
diana, o el tiempo al cual la actividad del polipéptido o el
conjugado es el 50% del valor inicial. Como alternativa a la
determinación de la semi-vida funcional in
vivo, se puede determinar la "semi-vida
sérica", es decir, el tiempo al cual el 50% de las moléculas de
polipéptido o de conjugado circulan en plasma o en el torrente
sanguíneo antes de ser aclaradas. La determinación de la
semi-vida sérica a menudo es más simple que la
determinación de la semi-vida funcional in
vivo y la magnitud de la semi-vida sérica
normalmente es una buena indicación de la magnitud de la
semi-vida funcional in vivo. Términos
alternativos a la semi-vida sérica incluyen
"semi-vida plasmática",
"semi-vida en circulación", "aclaramiento
sérico", "aclaramiento plasmático" y
"semi-vida de aclaramiento". El polipéptido o
el conjugado se aclaran por la acción de uno o más de los sistemas
reticuloendoteliales (RES), riñón, bazo o hígado, por la
eliminación mediada por el factor tisular, por el receptor SEC o por
otro receptor, y por proteolisis específica o inespecífica.
Normalmente, el aclaramiento depende del tamaño (en relación al
límite para la filtración glomerular), la carga, cadenas de
carbohidratos unidas, y la presencia de receptores celulares para
la proteína. La funcionalidad a retener normalmente se selecciona de
la actividad procoagulante, proteolítica o de unión al receptor. La
semi-vida funcional in vivo y la
semi-vida sérica se pueden determinar mediante
cualquier procedimiento adecuado conocido en la materia como se
describe en profundidad en la sección de Materiales y
procedimientos a continuación.
El término "incrementado" como se usa en
relación a la semi-vida funcional in vivo o
la semi-vida plasmática se usa para indicar que la
semi-vida relevante del conjugado o del polipéptido
está estadísticamente incrementada de forma significativa en
relación a la de la molécula de referencia, tal como un rFVIIa no
conjugado (por ejemplo, NovoSeven®) según se determina en
condiciones comparables. Por ejemplo, la semi-vida
relevante se puede incrementar en al menos el 25% aproximadamente,
tal como en al menos el 50% aproximadamente, por ejemplo, en al
menos el 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 500% o 1000%
aproximadamente.
El término "aclaramiento renal" se usa con
su significado normal para indicar todo aclaramiento que tiene
lugar en los riñones, por ejemplo, mediante filtración glomerular,
excreción o degradación tubular en las células tubulares. El
aclaramiento renal depende de las características físicas del
conjugado, incluyendo el tamaño (diámetro), el volumen
hidrodinámico, la simetría, la forma/rigidez, y la carga.
Normalmente, un peso molecular de 67 kDa aproximadamente se
considera que es un valor límite para el aclaramiento renal. El
aclaramiento renal se puede establecer mediante cualquier ensayo
adecuado, por ejemplo, un ensayo in vivo establecido.
Normalmente, el aclaramiento renal se determina administrando un
conjugado polipeptídico marcado (por ejemplo, radiomarcado o
marcado por fluorescencia) a un paciente y midiendo la actividad
marcada en la orina recogida del paciente. El aclaramiento renal
reducido se determina en relación a un polipéptido de referencia
correspondiente, por ejemplo, el polipéptido no conjugado
correspondiente, un polipéptido silvestre no conjugado
correspondiente u otro polipéptido conjugado (tal como un
polipéptido conjugado no según la invención), en condiciones
comparables. Preferentemente, la velocidad de aclaramiento renal del
conjugado se reduce en al menos el 50%, preferentemente en al menos
el 75%, y lo más preferentemente en al menos el 90% comparada con un
polipéptido de referencia relevante.
La capacidad de los conjugados de la invención
para presentar una sensibilidad reducida a la degradación
proteolítica es de máxima importancia. Las composiciones que
comprenden productos de degradación normalmente tendrán menos
actividad específica comparada con composiciones en las que ninguna
o sólo una pequeña parte del conjugado se ha degradado. Además, el
contenido de productos de degradación no fisiológicos en la
composición a administrar puede disparar el sistema inmunitario del
paciente. El término "sensibilidad reducida a la degradación
proteolítica" está previsto que signifique principalmente que el
conjugado tiene una sensibilidad reducida a la degradación
proteolítica en comparación con un FVIIa de tipo silvestre no
conjugado según se determina en condiciones comparables.
Preferentemente, la degradación proteolítica se reduce en al menos
el 10%, tal como al menos el 25% (por ejemplo, el
10-25%), más preferentemente en al menos el 35%, tal
como al menos el 50% (por ejemplo, el 10-50%, tal
como el 25-50%), incluso más preferentemente en al
menos el 60%, tal como en al menos el 75% o incluso en al menos el
90%. Más preferentemente, la degradación proteolítica se reduce en
un 100%. Así, preferentemente el conjugado de la invención es
sometido a degradación proteolítica en un menor grado que el FVIIa
de tipo silvestre, es decir, comparado con el FVIIa de tipo
silvestre no conjugado, la degradación proteolítica del conjugado
de la invención se reduce preferentemente en un
10-100%, tal como en un 25-100%,
más preferentemente en un 50-100%, y lo más
preferentemente en un 75-100%. Los presentes
inventores han desarrollado una prueba preliminar in vitro
adecuada, que se puede emplear en la valoración de si tales
conjugados poseen una sensibilidad reducida a la escisión
proteolítica (autoproteolisis reducida). Así, en una forma de
realización preferida de la invención, el conjugado de la invención
tiene una sensibilidad reducida a la degradación proteolítica (como
se ha definido anteriormente) comparada con el FVIIa de tipo
silvestre cuando se determina mediante el procedimiento descrito en
la sección titulada "Medición de la sensibilidad reducida a la
degradación proteolítica", cuando se determina mediante el
procedimiento descrito en la sección titulada Procedimiento de
medición de la actividad catalítica o cuando se determina
mediante el procedimiento descrito en la sección titulada
Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad
catalítica (véase sección de Materiales y procedimientos
del presente documento).
El término "FVII parental" o "polipéptido
parental" está previsto que indique la molécula a modificar de
acuerdo con la presente invención. Un FVII parental típico es el
hFVII o el hFVIIa (incluyendo rFVIIa (NovoSeven®)) con la secuencia
de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1.
Una "variante" es un polipéptido, que
difiere en uno o más residuos aminoácidos del polipéptido parental,
normalmente en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15
residuos aminoácidos.
Los conjugados de la invención son el resultado
de una nueva estrategia general para el desarrollo de moléculas
FVII o FVIIa mejoradas. Más específicamente, mediante la eliminación
y/o introducción de un residuo aminoácido que comprende un grupo de
unión para el resto no polipeptídico es posible adaptar
específicamente el polipéptido para así hacer la molécula más
susceptible a la conjugación con el resto no polipeptídico elegido,
optimizar el patrón de conjugación (por ejemplo, asegurar una
distribución y un número de restos no polipeptídicos óptimos en la
superficie de la molécula FVII o FVIIa y asegurarse de que sólo
están presentes en la molécula los grupos de unión previstos para
ser conjugados) y así obtener una nueva molécula conjugada, que
tiene o no tiene actividad FVII y además una o más propiedades
mejoradas comparadas con las moléculas FVII o FVIIa disponibles
actualmente. Por ejemplo, cuando el número total de residuos
aminoácidos que comprenden un grupo de unión para el no polipéptido
elegido se incrementa o se reduce hasta un nivel optimizado, el
aclaramiento renal del conjugado normalmente se reduce
significativamente debido a la forma, tamaño y/o carga alterada de
la molécula obtenida mediante la conjugación.
En formas de realización preferidas de la
presente invención se altera más de un residuo aminoácido del
polipéptido FVII o FVIIa, por ejemplo, la alteración comprende la
eliminación y la introducción de residuos aminoácidos que
comprenden un grupo de unión para el resto no polipeptídico elegido.
Además de la eliminación y/o introducción de residuos aminoácidos,
el polipéptido puede comprender otras sustituciones o
glicosilaciones que no estén relacionadas con la introducción y/o
eliminación de residuos aminoácidos que comprenden un grupo de unión
para el resto no polipeptídico. Además, el polipéptido puede estar
unido, por ejemplo, a un inhibidor serinproteinasa para inhibir el
sitio catalítico del polipéptido.
El residuo aminoácido que comprende un grupo de
unión para un resto no polipeptídico, ya sea eliminado o
introducido, se selecciona en base a la naturaleza del resto no
polipeptídico elegido y, en la mayoría de los casos, en base al
procedimiento con el cual se tiene que llevar a cabo la conjugación
entre el polipéptido y el resto no polipeptídico. Por ejemplo,
cuando el resto no polipeptídico es una molécula polimérica tal como
polietilenglicol o un óxido de polialquileno, los residuos
aminoácidos derivados que comprenden un grupo de unión se pueden
seleccionar del grupo constituido por lisina, cisteína, ácido
aspártico, ácido glutámico, histidina, y tirosina, preferentemente
cisteína y lisina, en particular lisina.
Siempre que se debe introducir o eliminar un
grupo de unión para un resto no polipeptídico del polipéptido FVII
o FVIIa de acuerdo con la presente invención, la posición del
polipéptido a modificar preferentemente está localizada en la
superficie del polipéptido, y más preferentemente está ocupada por
un residuo aminoácido que tiene más del 25% de su cadena lateral
expuesta al disolvente, preferentemente más del 50% de su cadena
lateral expuesta al disolvente. Tales posiciones se han identificado
en base a un análisis de la estructura tridimensional de la
molécula FVII o FVIIa humana como se describe en la sección de
Materiales y procedimientos en el presente documento.
Además, la posición se selecciona preferentemente de una parte de la
molécula FVII que está localizada fuera de la región del sitio de
unión del factor tisular y/o la región del sitio activo. Estas
regiones están identificadas en la sección de Materiales y
procedimientos en el presente documento. No obstante, se debe
subrayar que en ciertas situaciones, por ejemplo, en el caso de que
se desee un conjugado inactivado, puede ser ventajoso realizar
modificaciones dentro o cerca de esas regiones. Por ejemplo, está
contemplado que se puedan insertar de manera ventajosa uno o más
grupos de unión para los restos no polipeptídicos, tales como
grupos de unión para sitios de N-glicosilación in
vivo, en la región del sitio activo o en el borde de la
hendidura de unión del sitio activo de la molécula FVII. La región
del sitio activo y el borde de la hendidura de unión del sitio
activo están definidos en la sección de Materiales y
procedimientos del presente documento y está constituido por los
siguientes residuos:
I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177,
C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194,
F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233,
Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244,
L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325,
Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345,
G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365,
C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y
F405 (región del sitio activo); y N173, A175, K199, N200, N203,
D289, R290, G291, A292, P321 y T370 (borde de la hendidura de unión
del sitio activo).
Para determinar una distribución óptima de los
grupos de unión, la distancia entre los residuos aminoácidos
localizados en la superficie de la molécula FVII o FVIIa se calcula
en base a la estructura tridimensional del polipéptido. Más
específicamente, se determina la distancia entre los CBs de los
residuos aminoácidos que comprenden tales grupos de unión, o la
distancia entre el grupo funcional (NZ para la lisina, CG para el
ácido aspártico, CD para el ácido glutámico, SG para la cisteína) de
uno y el CB de otro residuo aminoácido que comprende un grupo de
unión. En el caso de la glicina, se usa CA en lugar de CB. En la
parte del polipéptido FVII o FVIIa de un conjugado la invención,
cualquiera de dichas distancias preferentemente es superior a 8
\ring{A}, en particular superior a 10 \ring{A} para evitar o
reducir una conjugación heterogénea.
En el caso de la eliminación de un grupo de
unión, el residuo aminoácido relevante que comprende tal grupo, y
que ocupa una posición como se ha definido anteriormente, se
sustituye preferentemente con un residuo aminoácido diferente que
no comprende un grupo de unión para el resto no polipeptídico en
cuestión. Normalmente, el residuo aminoácido a eliminar es uno para
el que la conjugación supone una desventaja, por ejemplo, un residuo
aminoácido localizado en o cerca de un sitio funcional del
polipéptido (puesto que la conjugación en ese sitio puede dar como
resultado la inactivación o una actividad FVII o FVIIa reducida del
conjugado resultante debido a un reconocimiento deteriorado del
receptor). En el presente contexto, el término "sitio
funcional" está previsto que indique uno o más residuos
aminoácidos que es/son esenciales o están involucrados de otra forma
en el funcionamiento o comportamiento del FVII o FVIIa. Tales
residuos aminoácidos son una parte del sitio funcional. El sitio
funcional se puede determinar mediante procedimientos conocidos en
la materia y preferentemente se identifica mediante el análisis de
la estructura del complejo FVII-factor tisular
(véase Banner y col., Nature 1996; 380: 41-46).
En el caso de la introducción de un grupo de
unión, un residuo aminoácido que comprende ese grupo se introduce en
la posición, preferentemente mediante la sustitución del residuo
aminoácido que ocupa esa posición.
El número exacto de grupos de unión presentes
disponibles para la conjugación en el polipéptido FVII o FVIIa
depende del efecto deseado a conseguir mediante la conjugación. El
efecto a obtener depende, por ejemplo, de la naturaleza y el grado
de conjugación (por ejemplo, la identidad del resto no
polipeptídico, el número de restos no polipeptídicos deseables o
posibles para conjugar al polipéptido, dónde se deben conjugar y
dónde se debe evitar la conjugación, etc.).
La semi-vida funcional in
vivo depende del peso molecular del conjugado, y el número de
grupos de unión necesarios para proporcionar una
semi-vida incrementada, que depende así del peso
molecular del resto no polipeptídico en cuestión. En una forma de
realización, el conjugado de la invención tiene un peso molecular de
al menos 67 kDa, en particular de al menos 70 kDa, por ejemplo,
como se mide por SDS-PAGE según Laemmli, U.K.,
Nature Vol 227 (1970), p680-85. El FVII tiene un
peso molecular de 53 kDa aproximadamente, y por tanto son necesarios
10-20 kDa adicionales para obtener el efecto
deseado. Esto se puede conseguir, por ejemplo, conjugando
2-4 moléculas de PEG de 10 kDa o como se describe en
otra parte del presente documento.
Para evitar demasiada interrupción en la
estructura y la función de la molécula parental, la parte
polipeptídica del conjugado normalmente tendrá una secuencia de
aminoácidos con una identidad a la SEQ ID NO: 1 superior al 90%,
preferentemente superior al 95%, tal como superior a 96%. En
particular, la parte polipeptídica del conjugado normalmente tendrá
una secuencia de aminoácidos con una identidad a la SEQ ID NO: 1
superior al 97%, tal como superior al 98%, superior al 99%,
superior al 99,25% o superior al 99,5%.
La homología/identidad de la secuencia de
aminoácidos se determina convenientemente a partir de secuencias
alineadas, usando por ejemplo, el programa ClustalW, versión 1.8,
Junio 1999, usando los parámetros por defecto (Thompson y col.,
1994, ClustalW: Improving the sensitivity of progressive multiple
sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix
choice, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680) o a
partir de la base de datos de las familias PFAM versión 4.0
(http://pfam.wustl.edu/) (Nucleic Acids Res. 1 Enero 1999; 27 (1):
260-2) mediante el uso de GENEDOC versión 2.5
(Nicholas, K.B., Nicholas H.B. Jr., y Deerfield, D.W. II. 1997
GeneDoc: Analysis and Visualization of Genetic Variation, EMBNEW.
NEWS 4: 14; Nicholas, K.B. y Nicholas H.B. Jr. 1997 GeneDoc:
Analysis and Visualization of Genetic Variation).
Planteado de manera diferente, el número total
de residuos aminoácidos a alterar de acuerdo con la presente
invención (comparado con la secuencia de aminoácidos mostrada en la
SEQ ID NO: 1) normalmente no excederá de 15. Preferentemente, la
parte polipeptídica de FVII o FVIIa del conjugado de la invención o
del polipéptido de la invención comprende una secuencia de
aminoácidos que difiere en 1-15 residuos aminoácidos
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1,
normalmente en 1-10 o en 2-10
residuos aminoácidos, por ejemplo, en 1-8 o en
2-8 residuos aminoácidos, tal como en
3-7 o en 4-6 residuos aminoácidos de
la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1. Así,
normalmente la parte polipeptídica del conjugado o del polipéptido
de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que difiere
de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 en un
máximo de 15 residuos aminoácidos (tal como 15 residuos
aminoácidos), en un máximo de 14 residuos aminoácidos (tal como 14
residuos aminoácidos), en un máximo de 13 residuos aminoácidos (por
ejemplo 13 residuos aminoácidos), en un máximo de 12 residuos
aminoácidos (tal como 12 residuos aminoácidos), en un máximo de 11
residuos aminoácidos (tal como 11 residuos aminoácidos), en un
máximo de 10 residuos aminoácidos (por ejemplo 10 residuos
aminoácidos), en un máximo de 9 residuos aminoácidos (tal como 9
residuos aminoácidos), en un máximo de 8 residuos aminoácidos (tal
como 8 residuos aminoácidos), en un máximo de 7 residuos aminoácidos
(tal como 7 residuos aminoácidos), en un máximo de 6 residuos
aminoácidos (tal como 6 residuos aminoácidos), en un máximo de 5
residuos aminoácidos (tal como 5 residuos aminoácidos), en un máximo
de 4 residuos aminoácidos (tal como 4 residuos aminoácidos), en un
máximo de 3 residuos aminoácidos (tal como 3 residuos aminoácidos) o
en un máximo de 2 residuos aminoácidos (tal como 2 residuos
aminoácidos).
Análogamente, el conjugado de la invención
normalmente contiene, por ejemplo, 1-15 restos no
polipeptídicos, normalmente 1-10 restos no
polipeptídicos o 2-10 restos no polipeptídicos, tal
como 1-8 ó 2-8 restos no
polipeptídicos, por ejemplo, 1-6,
1-4, 3-7 ó 4-6
restos no polipeptídicos.
Preferentemente, el conjugado de la invención
tiene una o más de las siguientes propiedades mejoradas:
semi-vida funcional in vivo incrementada,
semi-vida plasmática incrementada, aclaramiento
renal reducido y sensibilidad reducida a la degradación
proteolítica comparada con rFVIIa (por ejemplo, NovoSeven®).
Es sabido de, entre otros, el documento WO
88/10295 que la degradación proteolítica del FVII/FVIIa
principalmente tiene lugar en diversos sitios proteolíticos en la
molécula, a saber, en las posiciones K32, K38, I42, Y44, K143,
R290, R315, K341, R392, R396 y R402 (o mejor dicho, entre las
posiciones K32-D33,
K38-L39,142-S43,
Y44-S45, K143-R144,
R290-G291, R315-K316,
K341-G342, R392-S393,
R396-P397 y R402-A403). Así, una
estrategia para incrementar, por ejemplo, la
semi-vida funcional in vivo, la
semi-vida plasmática incrementada o para reducir la
sensibilidad a la degradación proteolítica es modificar el
polipéptido parental en y/o alrededor de uno o más de estos sitios
de degradación proteolíticos, por ejemplo, mediante la introducción
de restos no polipeptídicos en y/o alrededor de estos sitios. Así,
se puede introducir un grupo de unión en una o más de las posiciones
identificadas anteriormente mencionadas o en la posición -4, -3,
-2, -1, 1, 2, 3, 4, preferentemente en la posición 2, -1, 1, 2, tal
como la posición -1, 1, en relación con la posición directamente
involucrada en la degradación proteolítica.
Más específicamente, se puede introducir un
sitio de glicosilación in vivo no de origen natural, en
particular, un sitio de N-glicosilación in
vivo no de origen natural (véase con detalle a continuación) en
posiciones seleccionadas del grupo constituido por
28-48,139-147,
286-294, 311-319,
338-345, y 388-406. En particular,
se puede introducir el sitio de glicosilación in vivo, tal
como el sitio de N-glicosilación in vivo
(véase con detalle a continuación) en posiciones seleccionadas del
grupo constituido por 30-34, 36-46,
141-144, 288-292,
313-317, 341-343,
390-398 y 400-404. Se puede
introducir el sitio de glicosilación in vivo, tal como el
sitio de N-glicosilación in vivo (véase con
detalle a continuación) en posiciones seleccionadas del grupo
constituido por 31-33 (por ejemplo, posiciones 31,
32 ó 33), 37-39 (por ejemplo, posiciones 37, 38 ó
39), 41-46 (por ejemplo, posiciones 41, 42, 43, 44,
45 ó 46), 142-144 (por ejemplo, posiciones 142,143
ó 144), 289-291 (por ejemplo, posiciones 289, 290 ó
291), 314-316, (por ejemplo, posiciones 314, 315 ó
316), 341-342 (por ejemplo, posiciones 341, 342 ó
343), 391-393 (por ejemplo, posiciones 391, 392 ó
393), 395-397 (por ejemplo, posiciones 395, 396 ó
397) y 401-403 (por ejemplo, posiciones 401, 402 ó
403). La introducción se realiza preferentemente mediante
sustitución.
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El conjugado de la invención es uno que
comprende al menos un resto azúcar unido covalentemente a un
polipéptido, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido
difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ
ID NO: 1 en que se ha introducido al menos un sitio de glicosilación
no de origen natural mediante la sustitución V253N. Se puede
introducir un sitio de glicosilación no de origen natural en
combinación con la eliminación de un sitio de glicosilación de
origen natural. El sitio de glicosilación introducido es, en
particular, un sitio de N-glicosilación in
vivo.
Cuando se usa en el presente contexto, el
término "sitio de glicosilación de origen natural" cubre los
sitios de glicosilación en las posiciones N145, N322, S52 y S60. De
forma similar, el término "sitio de
O-glicosilación in vivo de origen
natural" incluye las posiciones S52 y S60, mientras que el
término "sitio de N-glicosilación in vivo
de origen natural" incluye las posiciones N145 y N322.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido FVII
o FVIIa difiere de la mostrada en la SEQ ID NO: 1 en que se ha
introducido al menos un sitio de glicosilación no de origen natural
(por ejemplo, al menos un sitio de N-glicosilación
in vivo no de origen natural), tal como 1-15
sitios de glicosilación no de origen natural (por ejemplo,
1-15 sitios de N-glicosilación in
vivo no de origen natural), en particular, 1-10,
1-6 ó 2-4 sitios de glicosilación
no de origen natural (por ejemplo, 1-10,
1-6 ó 2-4 sitios de
N-glicosilación in vivo no de origen
natural), preferentemente mediante sustitución.
Se debe entender que para preparar un conjugado,
en el que el polipéptido del conjugado comprende uno o más sitios
de glicosilación, el polipéptido se debe expresar en una célula
hospedadora capaz de unir restos azúcar (oligosacáridos) al
sitio(s) de glicosilación o alternativamente se debe someter
a glicosilación in vitro. Ejemplos de células hospedadoras
glicosilantes se dan en la sección a continuación titulada
"Acoplamiento a un resto azúcar".
En una forma de realización interesante de este
aspecto, se introduce un sitio de glicosilación in vivo en
una posición de la molécula FVII o FVIIa parental ocupada por un
residuo aminoácido expuesto a la superficie de la molécula,
preferentemente con más del 25% de la cadena lateral expuesta al
disolvente, en particular más del 50% expuesta al disolvente (estas
posiciones se identifican en la sección de Procedimientos del
presente documento). A continuación se introduce el sitio de
N-glicosilación de tal forma que el
N-residuo de dicho sitio está localizado en dicha
posición. Análogamente, se introduce un sitio de
O-glicosilación de manera que el residuo S o T que
genera ese sitio está localizado en dicha posición. Ejemplos de
tales posiciones incluyen K32S/T, I42S/T, Y44S/T, K143S/T, R290S/T,
R315S/T, K341S/T, R392S/T, R396S/T, R402S/T y sus combinaciones.
Con respecto a la
N-glicosilación, el sitio de glicosilación in
vivo se introduce en una posición en la que sólo es necesaria
una mutación para crear el sitio (es decir, donde cualquier otro
residuo aminoácido necesario para crear un sitio de glicosilación
funcional ya está presente en la molécula).
En otras palabras, el conjugado según la
invención es preferentemente un conjugado, en el que la secuencia
de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEQ ID NO: 1 en que al
menos una secuencia N-X'-X de origen
natural se sustituye con una secuencia
N-X'-S o
N-X'-T, en la que X' es cualquier
aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto S y T.
De manera similar, el conjugado según la
invención es preferentemente un conjugado, en el que la secuencia
de aminoácidos del polipéptido difiere de la SEQ ID NO: 1 en que al
menos una secuencia X-X'-S o
X-X'-T de origen natural presente
de manera natural en la SEQ ID NO: 1 se sustituye con una secuencia
N-X'-S o
N-X'-T, en la que X' es cualquier
aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto N.
Ejemplos específicos de tales sustituciones que
crean un sitio de N-glicosilación in vivo
incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por
F4S/T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S/T, E82S/T,
N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N,
T128N, A175S/T, G179N, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N,
E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N,
R277N, L280N, G291N, P303S/T, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N,
K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, y
sus combinaciones. Preferentemente, la sustitución se selecciona del
grupo constituido por F4S/T, P10N, Q21N, W41N, A51N, G58N, G59S/T,
N95S/T, G97S/T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N,
T128N, A175S/T, I186S/T, V188N, R202S/T, I205S/T, D212N, E220N,
V253N, E265N, T267N, E270N, L280N, G291N, P303S/T, G318N, G331N,
D334N, K337N, R353N, Y357N, M391N, y sus combinaciones.
Alternativamente, se puede introducir un sitio
de glicosilación in vivo en una posición ocupada por un
residuo lisina o un residuo arginina, preferentemente ocupada por un
residuo lisina, en particular de manera que el
N-residuo del sitio de
N-glicosilación o el residuo S o T de un sitio de
O-glicosilación sustituya al residuo lisina.
Planteado de otra forma, el conjugado puede ser
uno en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido difiere
de la SEQ ID NO: 1 en que al menos una secuencia
K-X'-X o una secuencia
R-X'-X, preferentemente una
secuencia K-X'-X, presente de manera
natural en la SEQ ID NO: 1 se sustituye por una secuencia
N-X'-S o
N-X'-T, en la que X' es cualquier
aminoácido excepto P, y X es cualquier aminoácido excepto S y T.
Ejemplos específicos de tales sustituciones que
crean un sitio de N-glicosilación in vivo
incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por
K32N+A34S/T, K38N+P40S/T, K62N+Q64S/T, K85N+D87S/T,
K137N+P139S/
T, K143N+N145S/T, K148N+Q149S/T, K161N+E163S/T, K197N+K199S/T, K199N+W201S/T, K316N+G318S/T,
K337N, K341N+D343S/T, K389N+M391S/T y sus combinaciones.
T, K143N+N145S/T, K148N+Q149S/T, K161N+E163S/T, K197N+K199S/T, K199N+W201S/T, K316N+G318S/T,
K337N, K341N+D343S/T, K389N+M391S/T y sus combinaciones.
En una forma de realización más interesante del
aspecto de la glicosilación descrito anteriormente, se puede
introducir un sitio de glicosilación, en particular un sitio de
N-glicosilación, en posiciones en o en los
alrededores de los sitios de degradación proteolíticos descritos
anteriormente (véase la sección titulada "Conjugado de la
invención").
Así, ejemplos específicos de tales sustituciones
que crean un sitio de N-glicosilación in vivo
incluyen una sustitución seleccionada del grupo constituido por
K32N+A34S/T, F31N+D33S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T,
K38N+
F40S/T, T37N+L39S/T, R36N+K38S/T, L39N+W41S/T, F40N+I42S/T, W41N, I42N+Y44S/T, S43N, Y44N+D46S/
T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T, L141N+K143S/T, I140N+
E142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, R290N+A292S/T, D289N+G291S/T, L288N+
R290S/T, L287N+D289S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T,
Q313N+R315S/T, Q312N, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, K341N+D343S/T, S339N+K341S/T,
G342N, D343N+G345S/T, R392N+E394S/T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T,
E394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+I400S/T, V399N+L401S/T,
L400N+R402S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+N145S/T, R290N+A292S/T, R315N+V317S/T, K341N+
D343S/T, R392N+E394S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+
F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R290N+A292T, R315N+V317T, 341N+D343T, R392N+E394T, R396N+
G398T, R402N+P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
F40S/T, T37N+L39S/T, R36N+K38S/T, L39N+W41S/T, F40N+I42S/T, W41N, I42N+Y44S/T, S43N, Y44N+D46S/
T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T, K143N+N145S/T, E142N+R144S/T, L141N+K143S/T, I140N+
E142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, R290N+A292S/T, D289N+G291S/T, L288N+
R290S/T, L287N+D289S/T, G291N, A292N+A294S/T, T293N+L295S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T,
Q313N+R315S/T, Q312N, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, K341N+D343S/T, S339N+K341S/T,
G342N, D343N+G345S/T, R392N+E394S/T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T,
E394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+I400S/T, V399N+L401S/T,
L400N+R402S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+N145S/T, R290N+A292S/T, R315N+V317S/T, K341N+
D343S/T, R392N+E394S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+
F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R290N+A292T, R315N+V317T, 341N+D343T, R392N+E394T, R396N+
G398T, R402N+P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
En una forma de realización adicional más
interesante de la invención, se prefiere que el sitio de
glicosilación in vivo se introduzca en una posición que no
forme parte de la región de unión del factor tisular ni forme parte
de la región del sitio activo y el borde de la hendidura de unión
del sitio activo como se ha definido en el presente documento. Está
contemplado que esas variantes de glicosilación pertenecerán
principalmente a la clase de conjugados activos como se ha definido
anteriormente.
Así, ejemplos específicos de sustituciones que
crean dicho sitio de N-glicosilación in vivo
incluyen sustituciones seleccionadas del grupo constituido por
K32N+A34S/T, I30N+K32S/T, A34N+R36S/T, K38N+F40S/T, T37N+L39S/T,
W41N, Y44N+D46S/T, S45N+G47S/T, D46N+D48S/T, G47N+Q49S/T,
K143N+N145S/T, E142N+R144S/T,
L141N+K143S/T, I140N+B142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, L288N+R290S/T,
L287N+D289S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, R392N+E394S/
T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T, B394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+
G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+L400S/T, V399N+L401S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+
F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+
N145S/T, R315N+V317S/T, R392N+E294S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R315N+V317T, R392N+E394T, R396N+G398T, R402N+
P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
L141N+K143S/T, I140N+B142S/T, R144N+A146S/T, A146N+K148S/T, S147N+P149S/T, L288N+R290S/T,
L287N+D289S/T, R315N+V317S/T, S314N+K316S/T, K316N+G318S/T, V317N+D319S/T, G318N, R392N+E394S/
T, M391N, L390N+R392S/T, K389N+M391S/T, S393N+P395S/T, B394N+R396S/T, P395N+P397S/T, R396N+
G398S/T, P397N+V399S/T, G398N+L400S/T, V399N+L401S/T, L401N+A403S/T, R402N+P404S/T, A403N+
F405S/T, P404N+P406S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+ R315N+V317S/T. Preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34S/T, K38N+F40S/T, Y44N+D46S/T, K143N+
N145S/T, R315N+V317S/T, R392N+E294S/T, R396N+G398S/T, R402N+P404S/T y sus combinaciones, tales como K143N+N145S/T+R315N+V317S/T. Más preferentemente, la sustitución se selecciona del grupo constituido por K32N+A34T, K38N+F40T, Y44N+D46T, K143N+N145T, R315N+V317T, R392N+E394T, R396N+G398T, R402N+
P404T y sus combinaciones, en particular K143N+N145T+ R315N+V317T.
Además de un resto azúcar, el conjugado según el
aspecto de la invención descrito en la presente sección puede
contener restos no polipeptídicos adicionales, en particular una
molécula polimérica, como se describe en la presente solicitud,
conjugada a uno o más grupos de unión presentes en la parte
polipeptídica del conjugado.
Se debe entender que cualquiera de los cambios
de los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados
en esta sección se pueden combinar con cualquiera de los cambios de
los aminoácidos, en particular las sustituciones, especificados en
las otras secciones del presente documento que describen cambios
específicos de los aminoácidos.
Por ejemplo, cualquiera de las variantes
glicosiladas descritas en la presente sección que han introducido
y/o eliminado al menos un sitio de glicosilación, tal como una
variante que comprende las sustituciones R315N + V317T y/o K143N +
N145T, se puede conjugar adicionalmente a una molécula polimérica,
tal como PEG, o cualquier otro resto no polipeptídico. Para este
propósito, la conjugación se puede conseguir mediante el uso de
grupos de unión ya presentes en el polipéptido FVII o FVIIa o
grupos de unión que pueden haber sido introducidos y/o eliminados,
en particular, tal que para la conjugación hay disponibles un total
de 1-6, en particular 3-4 ó
1,2,3,4,5, ó 6 grupos de unión.
Preferentemente, en un conjugado de la invención
en el que el polipéptido FVII o FVIIa comprende dos sitios de
glicosilación, el número y el peso molecular del resto no
polipeptídico se selecciona de manera que el peso molecular total
añadido por el resto no polipeptídico esté en el intervalo de
5-25 kDa, tal como en el intervalo de
10-25 kDa, en particular de 5 kDa aproximadamente,
12 kDa aproximadamente, 15 kDa aproximadamente o 20 kDa
aproximadamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En general, un conjugado polipeptídico según la
invención se puede producir cultivando una célula hospedadora
apropiada en condiciones que contribuyen a la expresión del
polipéptido, y recuperando el polipéptido, en el que a) el
polipéptido comprende al menos un sitio de N- u
O-glicosilación y la célula hospedadora es una
célula hospedadora eucariota capaz de la glicosilación in
vivo, y opcionalmente b) el polipéptido se somete a conjugación
con un resto no polipeptídico in vitro. Se entenderá que la
conjugación se debe diseñar para así producir la molécula óptima
con respecto al número de restos no polipeptídicos unidos, el tamaño
y la forma de tales moléculas (por ejemplo, si son lineales o
ramificadas), y el sitio(s) de unión en el polipéptido. El
peso molecular del resto no polipeptídico a usar se puede
seleccionar, por ejemplo, en base al efecto deseado a conseguir.
Por ejemplo, si el propósito primario de la conjugación es conseguir
un conjugado con un elevado peso molecular (por ejemplo, para
reducir el aclaramiento renal) normalmente es deseable conjugar tan
pocos restos no polipeptídicos de elevado peso molecular como sea
posible para obtener el peso molecular deseado. Cuando es deseable
un elevado grado de protección esto se puede obtener mediante el uso
de un número suficientemente elevado de restos no polipeptídicos de
bajo peso molecular (por ejemplo, con un peso molecular de entre 300
Da aproximadamente y 5 kDa aproximadamente, tal como un peso
molecular de entre 300 Da y 2 kDa) para proteger eficazmente todos o
la mayor parte de sitios de escisión de la proteasa u otros sitios
vulnerables del polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para conseguir la glicosilación in vivo
de una molécula FVII que comprende uno o más sitios de
glicosilación, la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido debe estar insertada en un hospedador de expresión
eucariota glicosilante. La célula hospedadora de expresión se puede
seleccionar entre células fúngicas (hongos filamentosos o
levaduras), células de insectos o animales o de células de plantas
transgénicas. En una forma de realización la célula hospedadora es
una célula del mamífero, tal como una célula CHO, BHK o HEK, por
ejemplo, célula HEK 293, o una célula de insecto, tal como una
célula SF9, o una célula de levadura, por ejemplo, S.
cerevisiae o Pichia pastoris, o cualquiera de las células
hospedadoras mencionadas en lo sucesivo.
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido de la presente invención o la
parte polipeptídica de un conjugado de la invención, en forma
glicosilada, se puede producir mediante cualquier procedimiento
adecuado conocido en la materia. Tales procedimientos incluyen la
construcción de una secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido y la expresión de la secuencia en un hospedador
transformado o transfectado adecuado. La célula hospedadora es una
célula hospedadora \gamma-carboxilante tal como
una célula de mamífero.
Se puede construir una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido o la parte polipeptídica de un
conjugado de la invención aislando o sintetizando una secuencia de
nucleótidos que codifica el FVII parental, tal como el hFVII con la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 y a
continuación cambiando la secuencia de nucleótidos para así llevar
a cabo la introducción (es decir, inserción o sustitución) o
eliminación (es decir, supresión o sustitución) del
residuo(s) aminoácido relevante.
\newpage
La secuencia de nucleótidos se modifica de
manera conveniente mediante mutagénesis dirigida de acuerdo con
procedimientos convencionales. Alternativamente, la secuencia de
nucleótidos se prepara mediante síntesis química, por ejemplo,
usando un sintetizador de oligonucleótidos, en el que los
oligonucleótidos se diseñan basándose en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido deseado, y preferentemente seleccionando
aquellos codones que están favorecidos en la célula hospedadora en
la que se producirá el polipéptido recombinante. Por ejemplo, se
pueden sintetizar varios oligonucleótidos pequeños que codifican
para porciones del polipéptido deseado y se pueden ensamblar
mediante PCR, ligación o reacción en cadena de ligación (LCR)
(Barany, PNAS 88: 189-193, 1991). Los
oligonucleótidos individuales normalmente contendrán protuberancias
5' o 3' para el ensamblaje complementario.
Están disponibles procedimientos alternativos de
modificación de secuencias de nucleótidos para la producción de
variantes de polipéptidos para la selección de alto rendimiento, por
ejemplo, procedimientos que suponen el entrecruzamiento homólogo
tal como se describe en la patente de EE.UU. 5.093.257, y
procedimientos que suponen la recomposición de genes, es decir, la
recombinación entre dos o más secuencias de nucleótidos homólogas
que resultan en nuevas secuencias de nucleótidos que tienen una
serie de alteraciones en los nucleótidos cuando se comparan con las
secuencias de nucleótidos de partida. La recomposición de genes
(también conocido como recomposición de ADN) supone uno o más
ciclos de fragmentación aleatoria y re-ensamblaje de
las secuencias de nucleótidos, seguido de la selección para
seleccionar secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos con
las propiedades deseadas.
Una vez ensamblados (mediante síntesis,
mutagénesis dirigida u otro procedimiento), la secuencia de
nucleótidos que codifica el polipéptido se inserta en un vector
recombinante y se une de manera operable a secuencias control
necesarias para la expresión del FVII en la célula hospedadora
transformada deseada.
Naturalmente, se debe entender que no todos los
vectores y secuencias para el control de la expresión funcionan
igual de bien a la hora de expresar la secuencia de nucleótidos que
codifica un polipéptido descrito en el presente documento. Tampoco
todos los hospedadores funcionan igual de bien con el mismo sistema
de expresión. No obstante, alguien experto en la materia puede
hacer una selección entre estos vectores, secuencias para el
control de la expresión y hospedadores sin una experimentación
innecesaria. Por ejemplo, en la selección de un vector, se debe
considerar el hospedador debido a que el vector se debe replicar en
él o debe ser capaz de integrarse en el cromosoma.
También se debe considerar el número de copias
del vector, la capacidad para controlar ese número de copias, y la
expresión de otras proteínas codificadas por el vector, tales como
marcadores antibióticos. En la selección de una secuencia para el
control de la expresión, también se deben considerar una variedad de
factores. Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa de
la secuencia, la capacidad para su control, y su compatibilidad con
la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido, en
particular en lo que respecta a estructuras secundarias
potenciales. Los hospedadores se deben seleccionar con la
consideración de su compatibilidad con el vector seleccionado, la
toxicidad del producto codificado por la secuencia de nucleótidos,
sus características de secreción, su capacidad para plegar
correctamente el polipéptido, sus requerimientos en fermentación o
en cultivo, y la facilidad de purificación de los productos
codificados por la secuencia de nucleótidos.
El vector recombinante puede ser un vector que
se replica autónomamente, es decir, un vector, que existe como
entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la
replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido. Alternativamente,
el vector es uno que, cuando se introduce en una célula hospedadora,
se integra en el genoma de la célula hospedadora y se replica junto
con el cromosoma(s) en el cual se ha integrado.
El vector es preferentemente un vector de
expresión, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica el
polipéptido de la invención está unida de manera operable a
segmentos adicionales necesarios para la transcripción de la
secuencia de nucleótidos. El vector normalmente procede de un
plásmido o ADN vírico. Una serie de vectores de expresión adecuados
para la expresión en las células hospedadoras mencionadas en el
presente documento están disponibles comercialmente o están
descritos en la bibliografía. Los vectores de expresión útiles para
hospedadores eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que
comprenden secuencias para el control de la expresión de SV40,
virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Vectores
específicos son, por ejemplo, pCDNA3.1 (+)\Hyg (Invitrogen,
Carlsbad, CA, EE.UU.) y pCIneo (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.).
Vectores de expresión útiles para células de levaduras incluyen el
plásmido 2P y sus derivados, el vector POT1 (patente de EE.UU.
4.931.373), el vector pJSO37 descrito en Okkels, Ann. New York Acad.
Sci. 782, 202-207, 1996, y pPICZ A, B o C
(Invitrogen). Vectores útiles para células de insecto incluyen
pVL941, pBG311 (Cate y col., "Isolation of the Bovine and Human
Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human
Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98
(1986), pBluebac 4.5 y pMelbac (ambos disponibles en Invitrogen).
Vectores de expresión útiles para hospedadores bacterianos incluyen
plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E.
coli, incluyendo pBR322, pET3a y pET12a (ambos de Novagen Inc.,
WI, EE.UU.), plásmidos de un rango de hospedadores más amplio,
tales como RP4, fagos de ADN, por ejemplo, los numerosos derivados
del fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros fagos de ADN, tales
como M13 y los fagos de ADN de cadena sencilla filamentosos.
Otros vectores para su uso en esta invención
incluyen aquellos que permiten la amplificación en número de copias
de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales
vectores amplificables son muy conocidos en la materia. Incluyen,
por ejemplo, vectores capaces de ser amplificados mediante
amplificación DHFR (véase, por ejemplo, Kaufman, patente de EE.UU.
Nº 4.470.461, Kaufman y Sharp, "Construction Of A Modular
Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For
Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp.
1304-19 (1982)) y amplificación con glutamina
sintetasa ("GS") (véase, por ejemplo, documentos de EE.UU.
5.122.464 y EP 338.841).
El vector recombinante además puede comprender
una secuencia de ADN que permite al vector replicarse en la célula
hospedadora en cuestión. Un ejemplo de esa secuencia (cuando la
célula hospedadora es una célula de mamífero) es el origen de
replicación de SV40. Cuando la célula hospedadora es una célula de
levadura, las secuencias adecuadas que permiten al vector
replicarse son el plásmido de levaduras 2\mu, los genes de
replicación REP 1-3 y el origen de replicación.
El vector también puede comprender un marcador
seleccionable, por ejemplo, un gen cuyo producto complementa un
defecto en la célula hospedadora, tal como el gen que codifica para
la dihidrofolato reductasa (DHFR) o el gen TPI de
Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene
40, 1985, pp. 125-130), o uno que confiera
resistencia a un fármaco, por ejemplo, ampicilina, kanamicina,
tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina o metotrexato.
Para Saccharomyces cerevisiae, los marcadores seleccionables
incluyen ura3 y leu2. Para hongos filamentosos, los marcadores
seleccionables incluyen amdS, pyrG, arcB, niaD y sC.
El término "secuencias control" se define
en el presente documento para incluir todos los componentes, que
son necesarios o ventajosos, para la expresión del polipéptido de la
invención. Cada secuencia control puede ser nativa o exógena a la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido. Tales
secuencias control incluyen, pero no están limitadas a, una
secuencia líder, una secuencias de poliadenilación, una secuencia
propeptídica, una secuencia promotora, potenciadora o activadora
aguas arriba, una secuencia del péptido señal, y un terminador de
la transcripción. Como mínimo, las secuencias control incluyen un
promotor.
En la presente invención se pueden usar una
amplia variedad de secuencias control de la expresión. Tales
secuencias control de la expresión útiles incluyen las secuencias
control de la expresión asociadas a genes estructurales de los
anteriores vectores de expresión, así como cualquier secuencia
conocida por controlar la expresión de genes de células procariotas
o eucariotas y sus virus, y sus diversas combinaciones.
Ejemplos de secuencias control adecuadas para
dirigir la transcripción en células de mamífero incluyen los
promotores tempranos y tardíos de SV40 y adenovirus, por ejemplo, el
promotor principal tardío de adenovirus 2, el promotor de
MT-1 (gen de metalotienina), el promotor génico
intermedio-temprano de citomegalovirus humano
(CMV), el promotor del factor de elongación humano 1\alpha
(EF-1\alpha), el promotor de la proteína de
choque térmico 70 mínimo de Drosophila, el promotor del virus
del sarcoma de Rous (RSV), el promotor de la ubiquitina C humana
(UbC), el terminador de la hormona del crecimiento humana, las
señales de poliadenilación de la región Elb de adenovirus o SV40 y
la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M., J. Mol. Biol., 20 agosto
de 1987; 196 (4): 947-50).
Para mejorar la expresión en células de mamífero
se puede insertar un intrón sintético en la región sin traducir 5'
de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Un
ejemplo de un intrón sintético es el intrón sintético del plásmido
pCI-Neo (disponible en Promega Corporation, WI,
EE.UU.).
Ejemplos de secuencias control adecuadas para
dirigir la transcripción en células de insecto incluyen el promotor
de polihedrina, el promotor P10, el promotor de la proteína básica
del virus de la polihedrosis en Autographa californica, el
promotor del gen 1 inmediato-temprano de baculovirus
y el promotor génico retardado-temprano 39K de
baculovirus, y la secuencia de poliadenilación de SV40. Ejemplos de
secuencias control adecuadas para su uso en células hospedadoras de
levadura incluyen los promotores del sistema de
\alpha-acoplamiento de levaduras, el promotor de
la triosafosfatoisomerasa (TPI) de levaduras, promotores de genes
glicolíticos o genes de la alcoholdeshidrogenasa de levaduras, el
promotor ADH2-4c, y el promotor GAL inducible.
Ejemplos de secuencias control adecuadas para su uso en células
hospedadoras de hongos filamentosos incluyen el promotor y
terminador ADH3, un promotor derivado de los genes que codifican la
amilasa triosa fosfato isomerasa o proteasa alcalina TAKA de
Aspergillus oryzae, una \alpha-amilasa de
A. niger, una glucoamilasa de A. niger o A.
nidulans, la acetamidasa de A. nidulans, la proteinasa o
lipasa aspártica de Rhizomucor miehei, el terminador TPI1 y
el terminador ADH3.
La presencia o ausencia de un péptido señal
dependerá, por ejemplo, de la célula hospedadora de expresión usada
para la producción del polipéptido a expresar (si es un polipéptido
intracelular o extracelular) y si es deseable obtener la secreción.
Para su uso en hongos filamentosos, el péptido señal puede proceder
de manera conveniente de un gen que codifica una amilasa o
glucoamilasa de la especie Aspergillus, un gen que codifica
una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de
Humicola lanuginosa. El péptido señal preferentemente
procede de un gen que codifica una TAKA amilasa de A. oryzae,
una \alpha-amilasa neutra de A. niger, una
amilasa estable en medio ácido de A. niger, o una
glucoamilasa de A. niger. Para su uso en células de insecto,
el péptido señal puede proceder de manera conveniente de un gen de
insecto (cf. documento WO 90/05783), tal como el precursor de la
hormona adipocinética de Lepidopteran manduca sexta (cf.
patente de EE.UU. 5.023.328), la melitina de abeja (Invitrogen), la
UDPglucosiltransferasa ecdisteroide (egt) (Murphy y col., Protein
Expression and Purification 4, 349-357 (1993) o
human pancreatic lipase (hpl) (Methodscin Enzymology 284, pp.
262-272, 1997). Un péptido señal preferido para su
uso en células de mamífero es aquel del hFVII o el péptido señal de
la cadena ligera kappa de Ig murina (Coloma, M (1992) J. Imm.
Methods 152: 89-104). Para su uso en células de
levadura se ha encontrado que los péptidos señal adecuados son el
péptido señal del factor \alpha de S. cereviciae (cf.
patente de EE.UU. 4.870.008), un péptido señal carboxipeptidasa
modificado (cf. L.A. Valls y col., Cell 48, 1987, pp.
887-897), el péptido señal BAR1 de levadura (cf.
documento WO 87/02670), el péptido señal de la proteasa aspártica 3
de levadura (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani y col., Yeast
6, 1990, pp. 127-137), y la secuencia líder
sintética TA57 (documento WO 98/32867).
\newpage
La secuencia de nucleótidos de la invención que
codifica un polipéptido FVII, ya sea preparada por mutagénesis
dirigida, síntesis, PCR u otros procedimientos, puede incluir
opcionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido
señal. El péptido señal está presente cuando el polipéptido se debe
secretar de la célula en la cual se expresa. Ese péptido señal, si
está presente, debe ser uno reconocido por la célula seleccionada
para la expresión del polipéptido. El péptido señal puede ser
homólogo (por ejemplo, ser aquél normalmente asociado al hFVII) o
heterólogo (es decir, originado en otra fuente distinta de hFVII) al
polipéptido o puede ser homólogo o heterólogo a la célula
hospedadora, es decir, ser un péptido señal expresado normalmente en
la célula hospedadora o uno que normalmente no se expresa en la
célula hospedadora. Por consiguiente, el péptido señal puede ser
procariota, por ejemplo, procedente de una bacteria tal como E.
coli, o eucariota, por ejemplo, procedente de una célula de
mamífero, insecto o levadura.
Se puede usar cualquier hospedador adecuado para
producir el polipéptido o la parte polipeptídica del conjugado de
la invención, incluyendo células de hongos (incluyendo levadura),
plantas, insectos, mamíferos, u otras células o líneas celulares
animales apropiadas, así como animales o plantas transgénicos.
Ejemplos de células hospedadoras fúngicas filamentosas incluyen
cepas de Aspergillus, por ejemplo, células de A.
oryzae, A. niger, o A. nidulans, Fusarium o
Trichoderma. Las células fúngica se pueden transformar
mediante un proceso que supone la formación del protoplasto, la
transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared
celular de una forma conocida per se. Los procedimientos
adecuados para la transformación de células hospedadoras de
Aspergillus se describen en los documentos EP 238 023 y la
patente de EE.UU. 5.679.543. Procedimientos adecuados para la
transformación de especies de Fusarium se describen por
Malardier y col., 1989, Gene 78: 147-156 y el
documento WO 96/00787. Ejemplos de células hospedadoras de levadura
adecuadas incluyen cepas de Saccharomyces, por ejemplo,
S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Klyveromyces, Pichia,
tales como P. pastoris o P. methanolica, Hansenula,
tales como H. Polymorpha o Yarrowia. La levadura se
puede transformar usando los procedimientos descritos por Becker y
Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast
Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194,
pp 182-187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito y
col., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen y col., 1978,
Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: y como
se describe por Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, EE.UU.
(en el protocolo del producto para el Yeastmaker^{TM} Yeast
Transformation System Kit). Ejemplos de células hospedadoras de
insecto adecuadas incluyen una línea celular de Lepidoptora,
tal como células de Spodoptera frugiperda (Sf9 o Sf21) o de
Trichoplusioa ni (High Five) (patente de EE.UU.
5.077.214).
La transformación de células de insecto y la
producción de polipéptidos heterólogos en ellas se puede realizar
como se describe por Invitrogen. Ejemplos de células hospedadoras de
mamífero adecuadas incluyen líneas celulares de ovario de hámster
chino (CHO), (por ejemplo, CHO-K1; ATCC
CCL-61), líneas celulares de mono verde (COS) (por
ejemplo, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC
CRL-1651)); células de ratón (por ejemplo, NS/O),
líneas celulares de riñón de cría de hámster (BHK) (por ejemplo,
ATCC CRL-1632 o ATCC CCL-10), y
células humanas (por ejemplo, HEK 293 (ATCC
CRL-1573)), así como células de plantas en cultivo
de tejidos. Líneas celulares adecuadas adicionales son conocidas en
la materia y están disponibles en repositorios públicos tales como
la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Además, la
célula de mamífero, tal como una célula CHO, se puede modificar
para expresar sialiltransferasa, por ejemplo,
1,6-sialiltransferasa, por ejemplo, como se
describe en la patente de EE.UU. 5.047.335, para proporcionar una
glicosilación mejorada del polipéptido FVII o FVIIa.
Para incrementar la secreción puede ser de
interés particular producir el polipéptido de la invención junto
con una endoproteasa, en particular una PACE (enzima conversora de
aminoácidos básicos emparejados) (por ejemplo, como se describe en
la patente de EE.UU. 5.986.079), tal como una endoproteasa Kex2 (por
ejemplo, como se describe en el documento WO 00/28065).
Los procedimientos para la introducción de ADN
exógeno en células hospedadoras de mamífero incluyen transfección
mediada por fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada
por DEAE-dextrano, transfección mediada por
liposomas, vectores víricos y el procedimiento de transfección
descrito por Life Technologies Ltd, Paisley, RU, usando
Lipofectamine 2000. Estos procedimientos son bien conocidos en la
materia y, por ejemplo, están descritos por Ausubel y col. (eds.),
1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,
Nueva York, EE.UU. El cultivo de células de mamífero se realiza
según procedimientos establecidos, por ejemplo, como se describe en
(Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, editado por Nigel
Jenkins, 1999, Human Press Inc, Totowa, Nueva Jersey, EE.UU. y
Harrison MA y Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge
University Press 1997).
En los procedimientos de producción de la
presente invención, las células se cultivan en un medio nutriente
adecuado para la producción del polipéptido usando procedimientos
conocidos en la materia. Por ejemplo, las células se pueden
cultivar por cultivo en un matraz agitado, fermentación a pequeña
escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas,
discontinuas, semi-continuas, o en estado sólido) en
fermentadores industriales o de laboratorio realizadas en un medio
adecuado y condiciones que permiten que el polipéptido se pueda
expresar y/o aislar. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente
adecuado que comprende fuentes de carbono y de nitrógeno y sales
inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la materia. Los
medios adecuados están disponibles en proveedores comerciales o se
pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en
catálogos de la American Type Culture Collection). Si el
polipéptido se secreta al medio nutriente, el polipéptido se puede
recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se secreta,
se puede recuperar de los lisados celulares.
El polipéptido resultante se puede recuperar
mediante procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, el
polipéptido se puede recuperar del medio nutriente mediante
procedimientos convencionales incluyendo, pero no limitado a,
centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización,
evaporación, o precipitación.
Los polipéptidos se pueden purificar mediante
una variedad de procedimientos conocidos en la materia incluyendo,
pero no limitado a, cromatografía (por ejemplo, de intercambio
iónico, afinidad, hidrófoba, cromatoenfoque, y exclusión
molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque
isoeléctrico preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo,
precipitación con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o
extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson
y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989).
El FVII de cadena sencilla se puede purificar y
se puede activar al FVIIa de doble cadena mediante una serie de
procedimientos como se describen en la bibliografía (Broze y
Majerus, 1980, J. Biol. Chem. 255: 1242-47 y Hedner
y Kisiel, 1983, J. Clin. Invest. 71: 1836-41). Otro
procedimiento mediante el cual se puede purificar el FVII de cadena
sencilla es mediante la incorporación de iones Zn durante la
purificación, como se describe en la patente de EE.UU.
5.700.914.
En una forma de realización, el polipéptido se
purifica en forma de FVII de cadena sencilla, que posteriormente se
PEGila. El polipéptido FVII de cadena sencilla PEGilado se activa
mediante el uso de una enzima inmovilizada (por ejemplo, los
factores IIa, IXa, Xa y XIIa) o mediante la autoactivación usando
una matriz de intercambio iónico cargada positivamente o
similar.
Es ventajoso purificar primero el FVII en su
forma de cadena sencilla, a continuación PEGilarlo (si se desea) y
por último activarlo mediante uno de los procedimientos descritos
anteriormente o mediante autoactivación como se describe por
Pedersen y col., 1989, Biochemistry 28: 9331-36. La
ventaja de llevar a cabo la PEGilación antes de la activación es
que se evita la PEGilación del nuevo aminoterminal formado por la
escisión de R152-I153. La PEGegilación de este
nuevo aminoterminal volvería a la molécula inactiva, puesto que para
la actividad es necesaria la formación de un puente de hidrógeno
entre D242 y el amino terminal de I153.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a una composición, en particular a una composición
farmacéutica, que comprende un cojugado polipeptídico de la
invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El conjugado o la composición farmacéutica según la invención se
puede usar como medicamento. Preferentemente, el conjugado
polipeptídico se puede usar para la fabricación de un medicamento
para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o trastorno
relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero. Por ejemplo, el
conjugado polipeptídico se puede usar para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento o la profilaxis de enfermedades en
las que es deseable una formación incrementada de coágulos, tales
como el tratamiento de pacientes con enfermedades que dan como
resultado una coagulación sanguínea inadecuada en respuesta a daños
en los vasos sanguíneos. En particular, el conjugado polipeptídico
se puede usar para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de pacientes hemofílicos, hemofílicos con inhibidores
para el FVIII y PIX, pacientes con trombocitopenia, pacientes con
trombocitopatías, tales como trombastenia de Glanzmann, defectos en
la liberación de plaquetas y defectos en la reserva de
almacenamiento, pacientes con enfermedad de von Willebrand,
pacientes con enfermedades hepáticas, o personas, por lo demás
sanas, con problemas de sangrado graves, por ejemplo, debido a
traumatismo o cirugía mayor, que han desarrollado inhibidores para
el FVIIa, trastornos de sangrado tales como hemofílicos y otros
normalmente asociados a daños tisulares graves.
En otro aspecto, el conjugado polipeptídico o la
composición farmacéutica que comprende el conjugado (activo) de la
invención se puede usar en un procedimiento para el tratamiento de
un mamífero que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con el
FVIIa/TF (tal como uno o más de las enfermedades o trastornos
mencionados anteriormente), que comprende la administración a un
mamífero que lo necesite de una cantidad eficaz de tal polipéptido,
conjugado o composición.
Los conjugados polipeptídicos de la invención se
administran a pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz,
normalmente una aproximadamente equivalente a aquella empleada en
terapia con el rFVII tal como NovoSeven®, o a una dosificación
superior. Por "dosis terapéuticamente eficaz" en el presente
documento se quiere decir una dosis que es suficiente para producir
los efectos deseados en relación con la dolencia por la cual se
administra. La dosis exacta dependerá de las circunstancias, y
alguien experto en la materia la puede determinar usando técnicas
conocidas. Normalmente, la dosis debe ser capaz de prevenir o
reducir la gravedad o propagación de la dolencia o indicación
tratada. Será evidente para aquellos expertos en la materia que una
cantidad eficaz de un polipéptido, conjugado o composición de la
invención depende, entre otros, de la enfermedad, la dosis, el
calendario de administración, si el polipéptido o conjugado o
composición se administra solo o junto con otros agentes
terapéuticos, la semi-vida plasmática de las
composiciones, y el estado de salud general del paciente.
Preferentemente, el polipéptido, conjugado, o composición de la
invención se administra en una dosis eficaz, en particular, una
dosis que es suficiente para normalizar el trastorno de la
coagulación.
El conjugado polipeptídico de la invención
preferentemente se administra en una composición que incluye un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
"Farmacéuticamente aceptable" significa un vehículo o
excipiente que no provoca ningún efecto adverso en los pacientes a
los que se administra. Tales vehículos y excipientes
farmacéuticamente aceptables son muy conocidos en la materia (véase,
por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.
R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical
Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer y L.
Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; y Handbook of
Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed.,
Pharmaceutical Press [2000]).
El conjugado polipeptídico de la invención se
puede formular en composiciones farmacéuticas mediante
procedimientos muy conocidos. Las formulaciones adecuadas se
describen en Remington's Pharmaceutical Sciences de E.W. Martin
(Mark Publ. Co., 16ª Ed., 1980).
El conjugado polipeptídico de la invención se
puede usar "como está" y/o en una de sus formas salinas. Las
sales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales con
metales alcalinos o metales alcalino-térreos, tales
como sodio, potasio, calcio y magnesio, así como, por ejemplo, sales
de cinc. Estas sales y complejos pueden estar presentes en
estructuras cristalinas y/o amorfas.
La composición farmacéutica de la invención se
puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos.
Estos agentes se pueden incorporar como parte de la propia
composición farmacéutica o se pueden administrar separadamente del
polipéptido o conjugado de la invención, simultáneamente o de
acuerdo con otro calendario de tratamiento. Además, el polipéptido,
el conjugado o la composición farmacéutica de la invención se puede
usar como adyuvante para otras terapias.
Un "paciente" a objeto de la presente
invención incluye tanto humanos como otros mamíferos. Así, los
procedimientos son aplicables tanto en terapia en humanos como en
aplicaciones veterinarias. La composición farmacéutica del
conjugado polipeptídico de la invención se puede formular en una
variedad de formas, por ejemplo, en forma de líquido, gel,
liofilizado, o en forma de sólido comprimido. La forma preferida
dependerá de la indicación particular a tratar y será evidente para
alguien experto en la materia.
En particular, la composición farmacéutica del
conjugado polipeptídico de la invención se puede formular en forma
liofilizada o soluble estable. El conjugado polipeptídico se puede
liofilizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la
materia. Un conjugado polipeptídico puede ser una forma soluble
estable por la eliminación o la protección de los sitios de
degradación proteolíticos. La ventaja de obtener una preparación
soluble estable radica en una manipulación más sencilla para el
paciente y, en el caso de emergencias, una acción más rápida, que
potencialmente le puede salvar la vida. La forma preferida dependerá
de la indicación particular tratada y será evidente para alguien
experto en la materia.
La administración de las formulaciones de la
presente invención se puede realizar en una variedad de formas,
incluyendo, pero no limitado a, oral, subcutánea, intravenosa,
intracerebral, intranasal, transdérmica, intraperitoneal,
intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, intraocularmente, o
cualquier otra forma aceptable. Las formulaciones se pueden
administrar de forma continua por infusión, aunque es aceptable
inyección en bolo, usando técnicas muy conocidas en la materia,
tales como bombas o implantes. En algunos casos, las formulaciones
se pueden aplicar directamente en forma de disolución o
pulverizador.
Un ejemplo preferido de una composición
farmacéutica es una disolución diseñada para la administración por
vía parenteral. Aunque en muchos casos las formulaciones
farmacéuticas en disolución se proporcionan en forma líquida,
apropiadas para su uso inmediato, tales formulaciones parenterales
también se pueden proporcionar en forma congelada o en forma
liofilizada. En este último caso, la composición se debe descongelar
antes de su uso. Esta última forma a menudo se usa para mejorar la
estabilidad del compuesto activo contenido en la composición en una
variedad de condiciones de almacenamiento más amplia, como es
reconocido por aquellos expertos en la materia que las
preparaciones liofilizadas generalmente son más estables que sus
homólogas líquidas. Tales preparaciones liofilizadas se
reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más
diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para
inyección o solución salina fisiológica estéril.
En el caso de parenterales, para el
almacenamiento se preparan en forma de formulaciones liofilizadas o
disoluciones acuosas mezclando, según sea apropiado, el polipéptido
con el grado de pureza deseado con uno o más vehículos, excipientes
o estabilizantes farmacéuticamente aceptables empleados normalmente
en la materia (todos ellos que se denominan "excipientes"),
por ejemplo, agentes tamponantes, agentes estabilizantes,
conservantes, isotonificantes, tensioactivos o detergentes no
iónicos, antioxidantes y/o aditivos diversos.
Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH
en un intervalo próximo a las condiciones fisiológicas. Normalmente
están presentes a una concentración comprendida entre 2 mM
aproximadamente y 50 mM aproximadamente. Los agentes tamponantes
adecuados para su uso con la presente invención incluyen ácidos
tanto orgánicos como inorgánicos y sus sales, tales como tampones
de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato
monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido
cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido
cítrico-citrato monosódico, etc.), tampones de
succinato (por ejemplo, mezcla de ácido
succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido
succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
succínico-succinato disódico, etc.), tampones de
tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido
tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido
tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido
tartárico-hidróxido sódico, etc.), tampones de
fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido
fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido
fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato
monosódico-fumarato disódico, etc.), tampones de
gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido
glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido
glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
glucónico-gluconato de potasio, etc.), tampones de
oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido
oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido
oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
oxálico-oxalato de potasio, etc.), tampones de
lactato (por ejemplo, mezcla de ácido
láctico-lactato sódico, mezcla de ácido
láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido
láctico-lactato de potasio, etc.) y tampones de
acetato (por ejemplo, mezcla de ácido
acético-acetato sódico, mezcla de ácido
acético-hidróxido sódico, etc.). Posibilidades
adicionales son tampones de fosfato, tampones de histidina y sales
de trimetilamina tales como Tris.
Los estabilizantes se refieren a una amplia
categoría de excipientes que pueden abarcar una función que va
desde agente de relleno a un aditivo que solubiliza el agente
terapéutico o que ayuda a prevenir la desnaturalización o la
adherencia a la pared del contenedor. Los estabilizantes típicos
pueden ser alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados
anteriormente); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina,
glutamina, asparagina, histidina, alanina, omitina,
L-leucina, 2-fenilalanina, ácido
glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de
azúcares, tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol,
sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y
similares, incluyendo ciclotoles tales como inositol;
polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que
contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico,
tioglicolato sódico, tioglicerol,
\alpha-monotioglicerol y tiosulfato sódico;
polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos);
proteínas tales como seroalbúmina humana, seroalbúmina bovina,
gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como
polivinilpirrolidona; monosacáridos tales como xilosa, manosa,
fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y
sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa, y polisacáridos tales
como dextrano. Los estabilizantes normalmente están presentes en el
intervalo de 0,1 a 10.000 partes en peso en base al peso de la
proteína activa.
Los conservantes se añaden para retrasar el
crecimiento microbiano, y normalmente se añaden en cantidades del
0,2-1% (en p/v) aproximadamente. Los conservantes
adecuados para su uso con la presente invención incluyen fenol,
alcohol bencílico, meta-cresol, metilparabeno,
propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de
benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro o yoduro de benzalconio),
cloruro de hexametonio, alquilparabenos tales como metil o
propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y
3-pentanol.
Los isotonificantes se añaden para asegurar la
isotonicidad de las composiciones líquidas e incluyen alcoholes de
azúcares polihídricos, preferentemente alcoholes de azúcares
trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol,
arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihídricos
pueden estar presentes en una cantidad entre el 0,1% y el 25% en
peso, normalmente entre el 1% y el 5%, teniendo en cuenta las
cantidades relativas de los otros principios.
Los tensioactivos o detergentes no iónicos
(también conocidos como "agentes humectantes") pueden estar
presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como
para proteger al polipéptido terapéutico frente a la agregación
inducida por la agitación, que también permite exponer a la
formulación a tensión superficial de deslizamiento sin provocar la
desnaturalización del polipéptido. Los tensioactivos no iónicos
adecuados incluyen polisorbatos (20, 80, etc.), polioxámeros (184,
188, etc.), polioles Pluronic®, monoéteres de polioxietilensorbitán
(Tween®-20, Tween®-80, etc.).
Otros excipientes adicionales incluyen agentes
de relleno o cargas (por ejemplo, fécula), agentes quelantes (por
ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico,
metionina, vitamina E) y codisolventes.
El principio activo también se puede atrapar en
microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de
coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina o
poli-(metilmetacrilato), en sistemas de administración de fármacos
coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina,
microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en
macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, supra. Las formulaciones
parenterales a usar para la administración in vivo deben ser
estériles. Esto se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, por
filtración a través de membranas de filtración estériles.
La invención se describe con más detalle en los
siguientes ejemplos no limitantes.
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO: 1 muestra la proteína hFVII
(incluyendo los residuos \gamma-carboxilados).
SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de ADNc que
codifica la proteína hFVII.
SEQ ID NO: 3 muestra la proteína hFVII (sin los
residuos \gamma-carboxilados).
SEQ ID NO: 4 muestra un casete de expresión para
la expresión del FVII en células de mamífero.
SEQ ID NO: 5 muestra el cebador CBProFpr174.
SEQ ID NO: 6 muestra el cebador CBProFpr175.
SEQ ID NO: 7 muestra el cebador CBProFpr216.
SEQ ID NO: 8 muestra el cebador CBProFpr229.
SEQ ID NO: 9 muestra el cebador CBProFpr221.
SEQ ID NO: 10 muestra el cebador
CBProFpr228.
SEQ ID NO: 11 muestra el cebador
CBProFpr226.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa el programa de ordenador Access (B. Lee y
F. M. Richards, J. Mol. Biol. 55: 379-400 (1971))
versión 2 (© 1983 Universidad de Yale) para computar el
área superficial accesible (ASA) de los átomos individuales en la
estructura. Este procedimiento normalmente usa un tamaño de sonda de
1,4 \ring{A} y define el Área superficial accesible (ASA) como el
área formada por el centro de la sonda. Antes de este cálculo todas
las moléculas de agua y todos los átomos de hidrógeno se deben
eliminar del grupo coordinado, así como otros átomos no directamente
relacionados con la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
El ASA fraccional de los átomos de cadena
lateral se computa por la división de la suma del ASA de los átomos
en la cadena lateral con el valor que representa el ASA de los
átomos de cadena lateral de ese tipo de residuo en un tripéptido
Ala-x-Ala extendido (véase, Hubbard,
Campbell & Thornton (1991) J. Mol. Biol. 220,
507-530). Para este ejemplo el átomo CA es
considerado como parte de la cadena lateral de residuos de glicina,
pero no para los residuos restantes. La tabla siguiente se usa como
patrón 100% ASA para la cadena lateral:
Los residuos no detectados en la estructura se
definen como con una exposición del 100% puesto que se piensa que se
encuentran en regiones flexibles. Los ácidos
\gamma-carboxiglutámicos en las posiciones 6, 7,
14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 se definen todos como expuestos al
100%.
\vskip1.000000\baselineskip
La distancia entre átomos se determina de la
manera más sencilla usando software de gráficos moleculares, por
ejemplo, InsightII® v. 98.0, MSI INC.
\vskip1.000000\baselineskip
La región del sitio catalítico se define como
cualquier residuo que tenga al menos un átomo a 10 \ring{A} de
cualquier átomo de la tríada catalítica (residuos H193, D242,
S344).
\vskip1.000000\baselineskip
El sitio de unión del receptor se define como
que comprende todos los residuos que varían su área superficial
accesible tras la unión del receptor. Esto se determina mediante, al
menos, dos cálculos del ASA; uno sobre el ligando(s)
aislado en el complejo ligando(s)/receptor(es) y otro sobre el complejo ligando(s)/receptor(es) completo.
aislado en el complejo ligando(s)/receptor(es) y otro sobre el complejo ligando(s)/receptor(es) completo.
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de la semi-vida
biológica in vivo se puede llevar a cabo en una serie de
ensayos como se describe en la bibliografía. Un ejemplo de un
ensayo para la medición de la semi-vida in
vivo del rFVIIa o de sus variantes se describe en la referencia
de la FDA número 96-0597. Resumiendo, la actividad
coagulante del FVII se mide en plasma extraído antes de y durante
un periodo de 24 horas después de la administración del conjugado,
polipéptido o composición. Se mide el volumen aparente medio de la
distribución en el estado constante y se determina el aclaramiento
medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara una composición que contiene el
conjugado (100-750 \mug/ml, preferentemente 600
\mug/ml), 1,5 mg de Ca^{2+}/ml (en forma de cloruro cálcico),
manitol (30 mg/ml), polisorbato 80 (0,1 mg/ml), cloruro sódico (3
mg/ml) y tampón de glicilo-glicina(1,3 mg/ml,
pH 5,5).
Se prepara una composición similar que contiene
el rFVIIa de tipo silvestre.
A continuación se determina la actividad
coagulante inicial o, alternativamente, la actividad amidolítica
inicial, como se describe en la sección titulada "Procedimiento
de medición de la actividad coagulante" o como se describe
en la sección titulada "Procedimiento de medición de niveles
bajos de actividad catalítica" o "Procedimiento de
medición de la actividad catalítica".
A continuación las composiciones se incuban a
37ºC hasta que la composición que contiene el rFVIIa de tipo
silvestre haya perdido al menos el 25%, preferentemente al menos el
50%, de su actividad coagulante o amidolítica inicial.
A continuación se mide la actividad coagulante o
amidolítica de la composición que contiene el conjugado de la
invención.
A continuación se expresa en porcentaje la
sensibilidad reducida a la degradación proteolítica del conjugado de
la invención comparada con el rFVIIa de tipo silvestre.
\vskip1.000000\baselineskip
La degradación proteolítica se puede medir
usando el ensayo descrito en la patente de EE.UU. 5.580.560, Ejemplo
5, en el que la proteolisis es autoproteolisis.
Además, la proteolisis reducida se puede probar
en un modelo in vivo usando muestras radiomarcadas y
comparando la proteolisis del tipo silvestre y de los conjugados
extrayendo muestras de sangre y sometiéndolas a
SDS-PAGE y autorradiografía. Independientemente del
ensayo usado para determinar la degradación proteolítica,
"degradación proteolítica reducida" está previsto que
signifique una reducción medible en la escisión comparada con
aquella obtenida con el FVIIa de tipo silvestre no conjugado según
se mide con barrido de geles SDS-PAGE teñidos con
Coomassie, HPLC o según se mide mediante la actividad catalítica
conservada en comparación con el tipo silvestre usando el ensayo
cromogénico descrito a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determina el peso molecular del rFVIIa
conjugado o sin conjugar, o de sus conjugados por
SDS-PAGE, filtración en gel, transferencias
Western, espectroscopia de masas láser de desorción asistida por
matriz o centrifugación en equilibrio, por ejemplo,
SDS-PAGE según Laemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970),
pp. 680-85.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad amidolítica en muestras diluidas de
FVII/FVIIa y medio líquido/acondicionado de fermentación se puede
determinar usando COASET® FVII (Chromogenix, Art. No 82 19 00). La
actividad amidolítica se determina de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Resumiendo, el FX está presente en exceso y se
convierte en FXa mediante el FVIIa a 37ºC. El FXa generado a
continuación hidroliza el sustrato cromogénico S2765
(N-\alpha-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)
dando como resultado la liberación de la molécula cromófora,
para-nitroanilina (pNA) que absorbe luz a una
longitud de onda de 405 nm. La reacción se detiene mediante la
adición de ácido acético. La cantidad de FVII/FVIIa en la muestra
se determina por comparación con una curva patrón preparada a partir
de FVIIa (que abarca entre 125 \mug/ml y 1 ng/ml en tampón de
ensayo).
\vskip1.000000\baselineskip
La capacidad de los conjugados para escindir
sustratos peptídicos pequeños se puede medir usando el sustrato
cromogénico S-2288
(D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida).
El FVIIa recombinante se diluye en Tris 0,1 M, NaCl 0,1 M,
CaCl_{2} 5 mM, pH 8,3 que contiene BSA al 0,1%. La reacción se
inicia mediante la adición del sustrato S-2288 a 1
mM y la absorción a 405 nm se mide después de incubar durante 30
minutos a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad del FVIIa se mide usando un ensayo
de coagulación patrón de una fase esencialmente como se describe en
el documento WO 92/15686. Resumiendo, la muestra a probar se diluye
en Tris 50 mM (pH 7,5), BSA al 0,1% y se incuban 100 \mul con 100
\mul de plasma deficiente en FVII y 200 \mul de tromboplastina C
que contiene Ca^{2+} 10 mM. Se miden los tiempos de coagulación y
se compara con una curva patrón usando una reserva de plasma humano
normal citrado en diluciones seriadas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para este ejemplo se usa la estructura de rayos
X del rFVIIa en un complejo con el factor tisular soluble de Banner
y col., J Mol Biol, 1996; 285: 2089. Nótese que la numeración de los
residuos en la referencia no sigue la secuencia. Aquí hemos usado
la numeración secuencial según la SEQ ID NO: 1. Los ácidos
\gamma-carboxiglutámicos en las posiciones 6, 7,
14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35 aquí se denominan todos GLU
(abreviatura de tres letras) o B (abreviatura de una letra).
Los residuos 143-152 no están
presentes en la estructura.
\vskip1.000000\baselineskip
La realización de cálculos del ASA fraccional de
fragmentos de FVII solos combinados con la definición de las
accesibilidades de residuos no estándar y/o desaparecidos descrita
en los procedimientos dio como resultado los siguientes residuos
con más del 25% de su cadena lateral expuesta a la superficie: A1,
N2, A3, F4, L5, B6, B7, L8, R9, P10, S12, L13, E14, E16, K18, E19,
E20, Q21, S23, F24, E25, E26, R28, E29, F31, K32, D33, A34, E35,
R36, K38, L39, W41, I42, S43, S45, G47, D48, Q49, A51, S52, S53,
Q56, G58, S60, K62, D63, Q64, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74,
A75, E77, G78, R79, E82, T83, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90,
V92, N93, E94, G97, E99, S103, D104, H105, T106, G107, T108, K109,
S111, R113, E116, G117, S119, L120, L121, A122, D123, G124, V125,
S126, T128, P129, T130, V131, B132, I140, L141, E142, K143, R144,
N145, A146, S147, K148, P149, Q150, G151, R152, G155, K157, V158,
P160, K161, E163, L171, N173, G174, A175, N184, T185, I186, H193,
K197, K199, N200, R202, N203,1205, S214, B215, H216, D217, G218,
D219, S222, R224, S232, T233, V235, P236, G237, T238, T239, N240,
H249, Q250, P251, V253, T255, D256, B265, R266, T267, E270, R271,
F275, V276, R277, F278, L280, L287, L288, D289, R290, G291, A292,
T293, L295, E296, N301, M306, T307, Q308, D309, L311, Q312, Q313,
R315, K316, V317, G318, D319, S320, P321, N322, T324, E325, Y326,
Y332, S333, D334, S336, K337, K341, G342, H351, R353, G354, Q366,
G367, T370, V371, G372, R379, E385, Q388, K389, R392, S393, E394,
P395, R396, P397, G398, V399, L400, L401, R402, P404 y P406.
Los siguientes residuos tenían más del 50% de su
cadena lateral expuesta a la superficie: A1, A3, F4, L5, E6, E7, L8,
R9, P10, E14, E16, K18, E19, E20, Q21, S23, E25, E26, E29, K32, A34,
E35, R36, K38, L39, I42, S43, G47, D48, A51, S52, S53, Q56, G58,
S60, K62, L65, Q66, S67, I69, F71, L73, P74, A75, E77, G78, R79,
E82, H84, K85, D86, D87, Q88, L89, I90, V92, N93, E94, G97, T106,
G107, T108, K109, S111, E116, S119, L121, A122, D123, G124, V131,
E132, L141, E142, K143, R144, N145, A146, S147, K148, P149, Q150,
G151, R152, G155, K157, P160, N173, G174, A175, K197, K199, N200,
R202, S214, E215, H216, G218, R224, V235, P236, G237, T238, H249,
Q250, V253, D256, T267, F275, R277, F278, L288, D289, R290, G291,
A292, T293, L295, N301, M306, Q308, D309, L311, Q312, Q313, R315,
K316, G318, D319, N322, E325, D334, K341, G354, G367, V371, E385,
K389, R392, E394, R396, P397, G398, R402, P404 y P406.
\vskip1.000000\baselineskip
Al realizar los cálculos del ASA fraccional los
siguientes residuos en el FVII humano cambian su ASA en el complejo.
Estos residuos estaban definidos como los constituyentes del sitio
de unión al receptor: L13, K18, F31, E35, R36, L39, F40, I42, S43,
S60, K62, D63, Q64, L65,I69, C70, F71, C72, L73, P74, F76, E77, G78,
R79, E82, K85, Q88, I90, V92, N93, E94, R271, A274, F275, V276,
R277, F278, R304, L305, M306, T307, Q308, D309, Q312, Q313, E325 y
R379.
La región del sitio activo se define como
cualquier residuo que tenga al menos un átomo a una distancia de 10
\ring{A} de cualquier átomo de la tríada catalítica (residuos
H193, D242, S344): I153, Q167, V168, L169, L170, L171, Q176, L177,
C178, G179, G180, T181, V188, V189, S190, A191, A192, H193, C194,
F195, D196, K197, I198, W201, V228, I229, I230, P231, S232, T233,
Y234, V235, P236, G237, T238, T239, N240, H241, D242, I243, A244,
L245, L246, V281, S282, G283, W284, G285, Q286, T293, T324, E325,
Y326, M327, F328, D338, S339, C340, K341, G342, D343, S344, G345,
G346, P347, H348, L358, T359, G360, I361, V362, S363, W364, G365,
C368, V376, Y377, T378, R379, V380, Q382, Y383, W386, L387, L400 y
F405.
El borde de la región de la hendidura de unión
del sitio activo se definió mediante inspección visual de la
estructura 1FAK.pdb del FVIIa como: N173, A175, K199, N200, N203,
D289, R290, G291, A292, P321 y T370.
La secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 2,
que engloba la forma corta del ADNc de longitud completa que
codifica el factor VII humano de coagulación de la sangre con su
péptido señal corto nativo (Hagen y col., 1986. PNAS 83: 2412), se
sintetizó para facilitar una alta expresión en células de mamífero.
Primero, el contexto del codón de iniciación ATG se modificó según
la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M. J Mol Biol, 20 agosto de
1987; 196 (4): 947-50), de manera que hay un
emparejamiento perfecto con la secuencia consenso corriente arriba
del codón de iniciación ATG. En segundo lugar, se modificó el marco
de lectura abierto del ADNc del factor humano de coagulación de la
sangre nativo predisponiendo en el uso del codón hacia los codones
usados frecuentemente en genes humanos altamente expresados.
Además, se insertaron dos codones de detención de la traducción al
final del marco de lectura abierto para facilitar una detención
eficiente de la traducción. El gen completamente sintético y el gen
del FVII humano optimizado para la expresión se ensamblaron en
oligonucleótidos de ADN 70-meros y en último
término se amplificaron usando cebadores terminales insertando
sitios BamHI y HindIII en los extremos 5' y 3'
respectivamente, usando técnicas de PCR convencionales, que dio como
resultado la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 4):
\newpage
Se preparó un vector para la clonación del
producto de la PCR generado que engloba el casete de expresión para
el factor VII humano de coagulación de la sangre nativo clonando el
intrón en pCINeo (Promega). El intrón sintético en pCINeo se
amplificó usando condiciones de PCR convencionales como se ha
descrito anteriormente y los cebadores:
que da como resultado un fragmento
de PCR de 332 pb. El fragmento se cortó con NheI y
BamHI antes de clonar en pCDNA3.1/HygR (obtenido de
InvitroGen) que da como resultado
PF#34.
\vskip1.000000\baselineskip
El casete de expresión para el factor VII humano
de coagulación de la sangre nativo se clonó entre los sitios
BamHI y HindIII de PF#34, que da como resultado el
plásmido PF#226.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó PCR con extensión de las protuberancias
de secuencias (SOE) para generar construcciones que tienen
variantes de los marcos de lectura abiertos del factor humano de
coagulación de la sangre con codones sustituidos. En la
SOE-PCR tanto la parte N-terminal
como la parte C-terminal del marco de lectura
abierto de FVII primero se amplificó en PCRs primarias
individuales.
Por ejemplo, para cambiar los codones para R315
y V317 por los codones para N315 y T317 se usaron los siguientes
cebadores emparejados para las PCR primarias:
A continuación los productos de la PCR primaria
se combinaron y se añadieron los cebadores terminales (CBProPpr216 y
CBProFpr221) dando como resultado el producto secundario de longitud
completa que codifica la variante R315N + V317T FVII deseada. El
producto de la PCR secundaria se digirió con BamHI y
HindIII antes de la clonación en el vector PF#34 entre los
sitios BamHI y HindIII que da como resultado
PF#249.
Además, en los casos en los que la
mutación(es) introducida estaban suficientemente próximas a
un único sitio de restricción de las endonucleasas en la variante
del plásmido de expresión, se construyeron genes usando un
procedimiento de construcción que engloba una única etapa de PCR y
una clonación posterior. Por ejemplo, la sustitución K143N+N145T se
introdujo mediante el uso de los cebadores de PCR:
en una sola reacción de
PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la PCR se clonó posteriormente
usando los sitios de restricción de las endonucleasas XbaI y
HindIII.
Usando la estrategia anterior, se prepararon los
siguientes conjugados de glicosilación y sus actividades
amidolíticas se probaron como se ha descrito en la sección titulada
Procedimiento de medición de bajos niveles de actividad
catalítica. Además, parte de los conjugados se sometieron a un
ensayo de coagulación de una sola etapa descrito en la sección
titulada Medición de la sensibilidad reducida a la degradación
proteolítica. Los resultados obtenidos se compilan en la tabla
siguiente.
Para evitar la autolisis del FVII humano de tipo
silvestre se introdujo un sitio de glicosilación en posición 315
realizando las sustituciones R315N y V317T como se ha descrito
anteriormente, que da como resultado PF#249.
Tras la transfección de células CHO K1, usando
Lipofactamine 2000, se obtuvieron bajos niveles de expresión
transitorios. La realización del ensayo sobre el sobrenadante
transitorio a las 24 horas mediante el ensayo amidolítico, COASET®
FVII, indicó que la variante era activa. Después de seleccionar
usando 400 \mug/ml de higromicina B se obtuvo una reserva de
clones estables. Esta reserva expresa la variante R315N+V317T a 0,2
\mug/ml aproximadamente, permitiendo el análisis de transferencia
Western para la determinación del grado de uso del sitio de
glicosilación introducido. Se sometió a ensayo un sobrenadante de 24
horas de la reserva estable mediante transferencia Western y reveló
el uso parcial del sitio de glicosilación introducido en la
posición 315, está glicosilada aproximadamente la mitad de la
proteína secretada completamente procesada. No obstante, si el
sitio de glicosilación nativo se mueve de la posición 145 a la
posición 143, realizando las sustituciones K143N+N145T, el sitio de
glicosilación introducido en la posición 315 está completamente
glicosilado como se comprueba mediante transferencia Western.
Se sembró la línea celular (ATCC #
CRL-1573) a una confluencia del 20% en matraces
T-25 usando DMEM, FCS al 10% inactivado por calor
con elevado contenido en glucosa (Gibco/BRL Cat # 10091), 5
\mug/ml de filoquinona y se dejó crecer hasta confluencia. La
monocapa de células confluentes se transfectó con 1, 2, 5, 10 y 20
\mug del plásmido p226 descrito anteriormente usando el agente de
transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) según las
instrucciones del fabricante. Después de 24 horas tras la
transfección se extrajo una muestra del medio. La concentración del
FVII en los experimentos de expresión transitorios a las 24 horas
fue, de media, 0,15 \mug/ml.
Posteriormente, se administró a las células
medio de selección que contiene 100 \mug/ml de higromicina B.
Después de tres semanas de selección, con la renovación del medio
cada tres o cuatro días, las células resistentes a higromicina se
transfectaron hasta confluencia en los matraces con 1 \mug de ADN
del plásmido y 2 \mug de ADN del plásmido. Las células de cada
uno de los cinco matraces se recogieron y se reunieron. La reserva
estable resultante de transfectantes que expresan el factor VII
humano de coagulación de la sangre nativo se congeló en nitrógeno
líquido según los procedimientos habituales.
Se descongeló un vial de la reserva de
transfectantes HEK293 PF#226 y las células se sembraron en un matraz
de tejidos de 75 cm^{2} que contiene 15 ml de DMEM con un elevado
contenido glucosa, FCS al 10%, filoquinona (5 mg/ml), 100 U/l de
penicilina, 100 \mug/l de estreptomicina, que se usó para todos
los experimentos siguientes, y se cultivó durante 24 horas. Las
células se recogieron, se diluyeron y se pusieron en placas de
microtitulación de 96 pocillos a una densidad celular de 1/2
célula/pocillo. Después de 12 días había presentes en los pocillos
colonias de 20-100 células aproximadamente y se
marcaron aquellos pocillos que contenían sólo una colonia. Después
de crecer durante dos días más, se añadió 100 \mul de medio a
todos los pocillos. Dos días después, se cambió el medio en todos
los pocillos que sólo contenían una colonia. Las primeras colonias
se transfirieron a matraces de cultivo de tejidos de 25 cm^{2}
después de tres días y dependiendo del nivel de confluencia las
colonias se transfirieron a matraces de cultivo de tejidos de 25
cm^{2} en los siguientes 11 días. Cuando llegaron a confluencia
en los matraces de tejidos T-25 el medio se cambió y
se permitió a los clones segregar el FVII al medio de cultivo
durante 24 horas, tras las cuales los sobrenadantes se recogieron y
se sometieron a ensayo para la presencia del factor VII usando el
ensayo amidolítico COASET FVII. Se encontró que un clon, C18,
expresa 29 \mug/ml del FVII.
Se construyeron, esencialmente como se describe
en el ejemplo 3, los plásmidos de expresión para la expresión de los
mutantes R290N+A292T y G291N del borde del sitio activo.
Usando el ensayo amidolítico COASET® FVII (véase
anteriormente) se evaluó la capacidad de las dos variantes de
glicosilación del FVII, R290N+A292T y G291N, para inhibir la
actividad del rFVIIa. Los plásmidos PF#250 que codifican
R290N+A292T y el plásmido PF#294 que codifica G291N se transfectan
en células HEK293 cultivadas en suero casi confluentes usando
Lipofectamine 2000. Las células transfectadas se incubaron a 37ºC
con el 5% de CO_{2} durante tres horas después de la transfección
antes de cambiar el medio a medio exento de suero (DMEM,
ITS-A, ExCyte, filoquinona, P/S). 40 horas después
de la transfección el medio acondicionado se recogió y se aclaró por
centrifugación para el análisis.
Se preparó una curva patrón a partir de rFVIIa:
0,0125 ng, 0,025 ng, 0,05 ng, 0,075 ng y 0,1 ng. A alícuotas de 50
\mul de medio acondicionado sin diluir, diluido 2 veces, diluido 5
veces, diluido 10 veces y diluido 50 veces de las dos variantes de
glicosilación inactivas R290N+A292T y G291N o del medio
acondicionado de un simulacro de transfección se le añadió 0,025 ng
de rFVIIa. Cuando se sometió a ensayo en el ensayo COASET FVII los
0,025 ng del FVIIa correspondían a una señal de DO_{405} = 0,35
(primera carrera) y DO_{405} = 0,26 (segunda carrera).
Los resultados obtenidos se compilan en la tabla
a continuación:
Como se observa de los datos anteriores los
conjugados de glicosilación G291N y R290N+A292T inhiben la función
del rFVIIa.
\vskip1.000000\baselineskip
La purificación del Factor VII DE tipo silvestre
y de sus conjugados se realizó a 4ºC. El sobrenadante de las
células que expresan el conjugado (o del FVII de tipo silvestre) se
esterilizó por filtración (0,22 \mum) y se diluyó 2 veces en agua
milliQ fría. Se añadió EDTA hasta 5 mM, el pH se ajustó a 8,6 y la
conductividad estaba por debajo de 10 mS/cm. La muestra se aplicó
sobre una resina Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia)
equilibrada a 4ºC en Tris 10 mM a pH 8,6. Después de la aplicación
de la muestra, la columna se lavó con Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl 150
mM, hasta que la absorción a 280 nm alcanzó niveles basales. A
continuación la columna se equilibró en Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl
100 mM. El conjugado unido (o el FVII de tipo silvestre) se eluyó
con Tris 10 mM (pH 8,6), NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM. Las
fracciones enriquecidas en el conjugado (o el FVII de tipo
silvestre) se reunieron y se concentraron por diálisis o usando
unidades de concentración Vivaspin (Vivascience).
La auto-activación del conjugado
(o del FVII de tipo silvestre) se obtuvo por concentración y la
incubación de la proteína eluida en Tris 10 mM (pH
7,8-8,6), NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM.
Alternativamente, el conjugado (o el FVII de
tipo silvestre) se activó a 37ºC mediante el Factor Xa acoplado a
una columna de sefarosa activada con CNBr en Tris 10 mM (pH
7,4-8,0) NaCl 100 mM, CaCl_{2} 5 mM.
El conjugado (o el FVII de tipo silvestre) se
sometió a intercambio de tampón con una disolución que contiene
CaCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, manitol al 3%, Tween80 al 0,05%, se
tamponó a pH 5,6 y se esterilizó por filtración antes de almacenar a
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El factor VII se conjugó con
metoxipolietilenglicol (mPEG) con un peso molecular de 5 kDa
aproximadamente usando M-PEG-CHO
(M-ALD-5000, obtenida de Shearwater)
en un tampón que contiene citrato sódico 10 mM, CaCl_{2} 20 mM,
NaCl 100 mM, pH 5,5. M-PEG-CHO
estaba presente en un exceso molar de 50-100 veces,
y la concentración de la proteína era de 0,2-0,5
mg/ml. La reacción se llevó a cabo en lotes de
300-1500 \mul a temperatura ambiente durante 1
hora con agitación, y se añadió NaBH_{3}CN
500-1000 veces en exceso y se prosiguió con la
incubación durante toda la noche a temperatura ambiente.
El FVII PEGilado se sometió a intercambio de
tampón con el tampón A (Tris 10 mM a pH 7,6) y se aplicó a 4ºC sobre
una columna mono Q (Pharmacia) equilibrada en tampón A. La proteína
unida se eluyó en un gradiente del 0-100% de B (Tris
10 mM (pH 7,6), NaCl 500 mM) con 40 volúmenes de columna.
\vskip1.000000\baselineskip
Tanto el FVII de tipo silvestre como los
conjugados de la invención se formulan en un tampón de
glicilo-glicina de 1,3 mg/ml a pH 5,5 que contiene
1,5 mg/ml de CaCl_{2}, 30 mg/ml de manitol, 0,1 mg/ml de
polisorbato 80 y 3 mg/ml de NaCl. Para la determinación de la
semi-vida in vivo se administra cada una de
las preparaciones a ratas Sprague-Dawley en forma
de inyección intravenosa en bolo. Las inyecciones se administran
lentamente durante 10 segundos aproximadamente para reducir el
riesgo potencial de fallo cardiaco debido a la elevada
concentración de Ca^{2+}. Se extraen muestras de sangre de cada
una de las nueve ratas anestesiadas a intervalos adecuados, por
ejemplo, 1 minuto, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos y 1 hora
después de la inyección. Las muestras de sangre se recogen en tubos
de 1 ml que contienen 50 \mul de una disolución de
citrato-fosfato-dextrosa con
adenina (Sigma #C4431) para prevenir la coagulación. Inmediatamente
después de la recolección, las muestras se almacenan a 0ºC
aproximadamente hasta la centrifugación y posterior recolección de
los sobrenadantes plasmáticos citrados para ensayo. Las muestras se
someten a ensayo mediante el ensayo de coagulación de una etapa como
se ha descrito en la sección Medición de la sensibilidad
reducida a la degradación proteolítica y a continuación se
calculan las semi-vidas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Maxygen ApS
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas similares al Factor VII o
VIIa
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 0212W0100
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221>.MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6)..(35)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = ácido
\gamma-carboxiglutámico o ácido glutámico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1338
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (115)..(1335)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 406
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Casete de expresión para la expresión del FVII en
células de mamífero
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr174
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctggctag ccactgggca ggtaagtatc a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr175
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr216
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttaaggatc ccgccaccat ggtcagccag
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr229
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggagtccccg gttttgttgg actgctgc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr221
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacttaagctt ttatcaaggg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr228
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcagcagtcc aacaaaaccg gggactcc
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Cebador CBProFpr226
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattctagaa aaccggaccg ctagcaaacc
\hfill30
Claims (19)
1. Un conjugado polipeptídico que comprende al
menos un resto azúcar unido covalentemente a un sitio de
N-glicosilación introducido in vivo, en el
que la secuencia de aminoácidos de la parte polipeptídica de dicho
conjugado difiere de la del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada
en la SEQ ID NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y
en la que se ha introducido un sitio de
N-glicosilación in vivo mediante la
sustitución V253N.
2. El conjugado polipeptídico de la
reivindicación 1, en el que se han introducido dos o más sitios de
N-glicosilación in vivo.
3. Una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido con una secuencia de aminoácidos que difiere de la
secuencia del FVII o FVIIa de tipo silvestre mostrada en la SEQ ID
NO: 1 en 1-15 residuos aminoácidos, y en la que se
ha introducido un sitio de N-glicosilación in
vivo mediante la sustitución V253N.
4. Un vector de expresión que alberga la
secuencia de nucleótidos de la reivindicación 3.
5. Una célula hospedadora que comprende una
secuencia de nucleótidos según la reivindicación 3 o un vector de
expresión según la reivindicación 4.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 5,
en la que dicha célula hospedadora es una célula
\gamma-carboxilante capaz de la glicosilación
in vivo.
7. Un procedimiento para producir un conjugado
polipeptídico según la reivindicación 1 ó 2, que comprende el
cultivo de una célula hospedadora como se ha definido en la
reivindicación 5 ó 6 en condiciones que da lugar a la expresión del
polipéptido, y la recuperación del polipéptido, en el que la célula
hospedadora es una célula hospedadora eucariota capaz de la
glicosilación in vivo.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en
el que la célula hospedadora es una célula de mamífero.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que la célula hospedadora es una célula CHO, una célula BHK o una
célula HEK.
10. Una composición que comprende un conjugado
polipeptídico como se ha definido en la reivindicación 1 ó 2 y un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
11. Un conjugado polipeptídico como se ha
definido en la reivindicación 1 ó 2 para su uso como
medicamento.
12. Uso de un conjugado polipeptídico como se ha
definido en la reivindicación 1 ó 2 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno
relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero.
13. Uso según la reivindicación 12, en el que la
enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF se selecciona del
grupo constituido por enfermedades en las que es deseable una
formación incrementada del coágulo.
14. Uso según la reivindicación 12, en el que la
enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF es hemofilia.
15. Uso según la reivindicación 12, en el que la
enfermedad o trastorno relacionado con el FVIIa/TF es
traumatismo.
16. El conjugado polipeptídico de la
reivindicación 1 ó 2, para su uso en el tratamiento de un trastorno
o enfermedad relacionado con el FVIIa/TF en un mamífero.
17. El conjugado polipeptídico de la
reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de enfermedades en
las que es deseable una formación incrementada del coágulo.
18. El conjugado polipeptídico de la
reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de hemofilia.
19. El conjugado polipeptídico de la
reivindicación 16, para su uso en el tratamiento de traumatismo.
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