CZ296039B6

CZ296039B6 - Použití fosfolipáz v krmivech pro zvířata

Info

Publication number: CZ296039B6
Application number: CZ1997111A
Authority: CZ
Inventors: Robert Franciscus Beudeker; Arie Karst Kies
Original assignee: Gist-Brocades B. V.
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 2005-12-14
Also published as: DE69633480D1; PL184284B1; DE69633480T2; ES2229252T3; ATE277524T1; CZ11197A3; AU5225596A; SI9620013A; JPH0998726A; SI9620013B; NL1003096C2; CN1156955A; NL1003096A1; TW480175B; WO1996036244A1; AU700385B2; US6183739B1; PL318138A1; CN1099841C; IL118245A0

Abstract

Způsob zlepšení účinnosti využití krmiv pro zvířata a podpory růstu zvířat podáváním krmivového prostředku obsahujícího krmivo a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu v množství 1000 až 5 000 000 mezinárodních jednotek fosfolipázy na kg fosfolipidu. Fosfolipáza se míchá s krmivovou složkou a alespoň s jedním fosfolipidem. Prostředek je vhodný ke krmení nepřežvýkujících zvířat například nepřežvýkujících telat.

Description

(57) Anotace:

Použití fosfolípáz v krmivech pro zvířata

Oblast techniky

Předložení řešení se týká použití fosfolípáz v krmivech pro zvířata.

Dosavadní stav techniky

V gastrointestinálním traktu zvířat se vylučují četné enzymy k trávení krmiv. Každý z těchto enzymů působí na určitou složku krmivá v určité oblasti gastrointestinálního traktu. Například pepsiny jsou aktivní v kyselém prostředí žaludku, zatímco jiné proteázy, například chymotrypsin a karboxypeptidázy, jsou účinné v horní části tenkého střeva při hodnotě pH 6 až 7. Četné takové enzymy potřebují prekurzor před svojí aktivací. Například pepsin se vytváří jen zpepsinogenu v kyselém prostředí. Chymotrypsin a karboxypeptidázy se vylučují v neaktivní formě a aktivují se proteázou trypsin.

Trávení tuků je komplexní proces. Většina tuků v krmivech pro zvířata je dostupná ve formě triglyceridů. Tyto triglyceridy jsou obtížně, pokud vůbec, absorbovatelné ve střevech a potřebují se odbourat na monoglyceridy, diglyceridy, glycerol a na volné mastné kyseliny. Tato konverze se katalyzuje enzymem lipázou, která je vylučována pankreasem. Tento enzym je aktivní na fázovém rozhraní vody a oleje. Pro trávení potravy je důležité, aby byl tuk ve velmi malých kapičkách v emulzi oleje ve vodě. Emulgátory jsou povrchově aktivní činidla, která umožňují dispergaci tuku ve vodné fázi. Nejdůležitějším emulgátorem v gastrointestinálním traktuje žluč. Žluč se vylučuje v játrech a může se ukládat ve žlučníku. Žluč obsahuje například žlučové kyseliny a soli, cholesterol a fosfolipidy. Malé částice, micely, se vytvářejí směsí žlučových složek se (zbylými) triglyceridovými produkty.

Tyto micely difundují do lačníkových epitheliálních buněk, kde se jejich obsahy uvolňují a absorbují. V těchto epitheliálních buňkách se triglyceridy rekonstituují. Spolu s cholesterolem, cholesterolestery, fosfolipidy a proteiny vytvářejí nové, ve vodě rozpustné částice, označované jako chylomikrony.

Fosfolipidy jako takové se enzymaticky odbourávají působením fosfolipázy A a B, které rovněž vylučuje pankreas.

Lecitin je směs jak polárních tak neutrálních lipidů, která obsahuje alespoň 60 % polárních lipidů. Pro svůj hydrofobně/lipofilní charakter se polární lipidy (a tedy lecitiny) používají jako emulgátory. Polární lipidy zahrnují (glycero)fosfolipidy a glykolipidy. Základní struktura glycerofosfolipidů je následující:

-1 CZ 296039 B6

	H i	O
H -	1 C1 I	- 0 -	c -	Ri
Rž ~ C ~ 0 ~	I C2	- H
»	I		0
0	I
H -	C₃ I	- O -	P - \|	C - X
	I H		I 0

kde znamená

X zbytek cholinu, ethanolaminu, inositolu, šeřinu nebo atom vodíku.

Glycerofosfolipidy sestávají v podstatě z glycerolového podílu s mastnými kyselinami v poloze Cl a C2. Poloha C3 je esterifikována kyselinou fosforečnou. Kyselina fosforečná je často vázána s alkoholovou skupinou za vytváření následujících sloučenin:

fosfatidylethanolamin fosfatidylcholin fosfatidylserin fosfatidylinositol fosfatidylovou kyselinu (PA; X = vodík) (PE; X = ethanolamin) (PC; X = cholin) (PS; X = serin) (Pl; X = inositol)

Glycerofosfolipidy mající jen jeden (místo obvyklých dvou) zbytek mastné kyseliny, se označují jako lysofosfolipidy.

Lecitinu se používá jako emulgátoru v četných případech včetně pro potraviny a tuky. Emulgátory jsou povrchově aktivní činidla, která umožňují dispergaci olejové kapalné fáze ve vodné fázi. Emulgátory obsahují jak hydrofílní, tak lipofílní skupiny v téže molekule. Poměr hydrofílních k lypofílním skupinám, známý jako hodnota HLB, je charakteristickou hodnotou pro emulgátory.

V tucích rozpustné hydrofílní emulgátory mají hodnoty HLB O až méně než 10 zatímco ve vodě rozpustné sloučeniny mají HLB hodnoty nad 10 až 20.

Emulgátory jako lecitin se přidávají do krmiv pro zvířata k dosažení zlepšení výživné hodnoty krmiv nebo k dosažení lepší dispergace v případě tekutých tuků. Je také známo přidávat lysolecitin do krmiv pro zvířata (pod obchodním označením Lysoforte^R společnosti Kemin), který má zlepšené emulgační vlastnosti vedoucí ke zvýšení výživné hodnoty (Pluimveehouderij 24; 20 až 21 [18. března 1994]).

Emulgační vlastnosti lecitinu se využívají nejen při produkci zvířat včleňováním lecitinu do suché potravy ale také v oblastech, kdy se zvířatům podává kapalná potrava obsahující vysoký podíl tuků. To je především při nahrazování mléka telatům a pro náhražky mléka prasnic selatům. Funkcí lecitinu je produkovat nejjemnější možnou disperzi tuku ve snadno připravitelném ka

-2CZ 296039 B6 palném krmivu. Jemná disperze vede ke zlepšené stravitelnosti tuků zvířaty. Kromě toho lecitin má příznivý vliv na usazování nerozpustných podílů vkapalném krmivu.

V posledních letech začala průmyslová výroba krmiv používat průmyslově vyráběné enzymy k doplnění enzymů, vytvářených v gastrointestinálním traktu zvířat. Jakožto příklady se uvádějí fytázy, α-amylázy, proteázy a různé enzymy, odbourávající buněčné stěny různých rostlin. Ve známém stavu techniky se však nikde nepopisuje přidávání fosfolipáz do krmiv pro zvířata k podpoře růstu zvířat, jelikož zvířata sama již vylučují velká množství těchto enzymů v horní části svého tenkého střeva.

Evropský patentový spis číslo EP-A 0 619 079 popisuje použití kromě jiného fosfolipidů jakožto povlaků granulátů, obsahujících biologicky aktivní látky, které se včleňují do krmivá pro přežvýkavce. Takové povlaky chrání biologicky aktivní látky v žaludku, aby bylo umožněno jejich trávení a absorpce v orgánech za žaludkem. Evropský patentový spis číslo EP-A 0 619 079 uvádí také, že se do ochranného povlaku mohou popřípadě včleňovat fosfolipázy k napomáhání hydrolýze, nikde se však neuvádí nebo nedoporučuje přidávat fosfolipázy do krmiv k podpoře růstu a ke zlepšení účinného využití krmiv.

Britský patentový spis číslo GB-A 2 267 033 popisuje podporu růstu, doporučuje však přidávat prostředek obsahující fosfolipidový lecitin spolu se kmenem Streptomyces do siláže.Uvádí se, že kmen Streptomyces je schopen produkovat fosfolipázu A2 v průběhu fermentace siláže. Z toho vyplývá použití takového prostředku do krmivá pro zvířata, jehož výrobní proces zahrnuje fermentaci, která je kompatibilní s produkcí fosfolipáz uvedených kmenem Streptomyces. Proto se jeví potřeba vyvinout široce použitelnou a snadnou použitelnou fosfolipázovou přísadu do krmiv pro zlepšení využitelnosti krmiv a/nebo pro podporu růstu zvířat.

Podstata vynálezu

Způsob zlepšení účinnosti využití krmiv, spočívá podle předloženého řešení v tom, že se zvířatům podává krmivový prostředek obsahující krmivo a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití.

Řešení se také týká způsobu podpory růstu zvířat, při které se zvířatům podává krmivový prostředek obsahující krmivo a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití.

Předložené řešení se rovněž týká krmivového prostředku zlepšujícího využitelnost krmiv, který podle vynálezu spočívá v tom, že obsahuje krmivovou složku a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití.

Způsob přípravy krmivá pro zvířata spočívá podle předloženého řešení vtom, že se rekombinantně připravuje fosfolipáza v mikroorganismu nebo v transgenní rostlině a takto získaná fosfolipáza se míchá s krmivovou složkou.

Podle předloženého řešení se používá exogenní fosfolipázová přísada k okamžitému použití do krmiv pro zvířata ke zlepšení emulgačních vlastností fosfolipidů v gastrointestinálním traktu a tím ke zlepšení účinnosti využití krmiv a/nebo k podpoře růstu zvířat. Podporou růstu zvířat se zde rozumí podpora hmotnostních přírůstků v čase (rychlost růstu) a/nebo podpora růstu se zřetelem na využití krmivá (konverzní poměr krmivá).

Jakožto fosfolipázy, použitelné podle předloženého řešení, se uvádějí: fosfolipáza Al (EC 3.1.1.32), fosfolipáza A2, fosfolipáza B (lysofosfolipáza), fosfolipáza C a fosfolipáza D.

Zvláště se řešení týká použití krmiv, do kterých se přidává fosfolipáza A2 (EC 3.1.1.4). Fosfolipáza A2 se může produkovat izolací například z vepřového pankreasu jakožto vedlejší produkt

-3 CZ 296039 B6 například produkce inzulínu. Nebo se fosfolipáza A2 může produkovat rekombinantně expresí heterologního genu v mikroorganismu, jako je například Kluyveromyces lactis. Enzym se z takového mikroorganismu získá fermentací a následným zpracováním k získání enzymu o sobě známým způsobem.

Jinou možností pro exogenní přidání fosfolipáz do krmivá pro zvířata, obsahující lecitin, je přidání materiálu transgenních rostlin, obsahujících fosfolipázu, s výhodou transgenních semen, ve kterých je fosfolipáza syntetizována heterologní genovou expresí. Za tímto účelem se gen, kódující fosfolipázu, klonuje do rostlinného expresního vektoru za řízení vhodných rostlinných expresních signálů, například tkáňového specifického promotoru, jako pro semena specifického promotoru. Expresní vektor, obsahující fosfolipázový gen, se následně transformuje do rostlinných buněk a transformované rostlinné buňky se selektují pro regeneraci do celých rostlin. Takto získané transgenní rostliny se mohou nechat růst a sklízejí se a části rostlin, obsahující heterologní fosfolipázu, se mohou včleňovat do krmiv pro zvířata bud’ jako takové, nebo po dalším zpracování. Heterologní fosfolipáza se může získat v semenech transgenních rostlin nebo může být obsažena v jiném rostlinném materiálu, jako jsou například kořeny, stonky, listy, dřevo, květy, kůra a/nebo plody.

Proto se fosfolipázovou přísadou míní fosfolipáza, která není přirozenou složkou hlavních krmných substancí nebo v nich není obsažena ve své přirozené koncentraci, například se fosfolipáza přidává odděleně do krmivá od krmivových složek, a to samotná nebo v kombinaci s jinými krmivovými přísadami, neboje fosfolipáza integrální složkou jedné z krmivových složek, je však v ní produkována rekombinantní DNA technologií.

Fosfolipázovou přísadou k okamžitému použití se zde míní přísada, která se neprodukuje in šitu v krmivu pro zvířata. Fosfolipázová přísada k okamžitému použití se může přímo zkrmovat nebo se s výhodou zkrmuje přímo po smíšení s jinými složkami krmivá. Fosfolipázová přísada k okamžitému použití zahrnuje fosfolipázy, které jsou v neaktivní předformě, mohou se však aktivovat v gastrointestinálním traktu, například proteolytickým zpracováním.

Výhodné krmivo obsahuje fosfolipid, s výhodou lecitin, jak je obsažen v surovině, jako jsou například buď plně tučné sójové boby, plně tučné řepkové semeno, sójový olej, řepkový olej, nebo jiná olejnatá semena nebo olej bohatý lecitinem kromě exogenně přidávané fosfolipázy, kterou je s výhodou (mikrobiálně produkovaná) vepřová fosfolipáza A2. Krmivo však nemusí obsahovat fosfolipid, jelikož pankreasjiž sám vylučuje fosfolipid.

Podle předloženého řešení fosfolipáza, s výhodou (mikrobiálně produkovaná) vepřová fosfolipáza A2 je obsažena v mléčných náhražkách obsahujících lecitin pro mladá zvířata. Tím se zlepšuje stravitelnost tuku mladými zvířaty.

Podle předloženého řešení je také fosfolipáza obsažena v potravě pro ryby a korýše ke zlepšení jejich růstu a zužitkovatelnosti krmivá.

Po zpracování například fosfolipázou A2 (Pla2) hodnota HLB lecitinu se zvýší ze 7 na přibližně 8 nebo 9, což může přispívat k příznivému působení zpracování fosfolipázou A2 má emulgační vlastnosti lecitinu.

Vepřová fosfolipáza A2 nemá žádnou účinnost in vitro při hodnotě pH pod 6,0. Převažující pH v gastrointestinálním traktu zvířat s jedním žaludkem je pod 6,0 ve voleti a v žaludku.

Neočekávalo by se žádné příznivé působení přísady fosfolipázy A2 jelikož

a) se neočekává žádná účinnost přidané fosfolipázy do volete a žaludku jakožto důsledek nevhodného spojení převažující hodnoty pH a závislosti enzymu na hodnotě pH a

-4CZ 296039 B6

b) zvířata sama vylučují velká množství enzymu v horní části tenkého střeva, kde převažující hodnota pH je v souhlase se závislostí enzymu na hodnotě pH.

S překvapením se zjistilo, že přidání exogenní vepřové fosfolipázy A2 vede k výraznému zlepšení konverzního poměru krmivá u broilerů (příklad 3).

Vedle zvířat s jedním žaludkem se fosfolipáza A2 může také s výhodou používat pro zvířata s více žaludky. V průběhu časné laktace vysoko produkčních dojnic je například zájem na začlenění vysokých koncentrací tuků do jejich krmivá ke kompenzaci vysoce negativní energetické bilance. Z literatury je známo, že stravitelnost mastných kyselin v gastrointestinálním traktu dojnic se mění v závislosti kromě jiného na množství krmivá a zdroje tuku. Stavitelnost mastných kyselin je 87 % pro krmivo obsahující 500 g nasycených tuků v palmitové kyselině (Cl6:0) do 64 % pro krmivo obsahující 1000 g nasycených tuků ve stearové kyselině (C18:0) (Weisbjerg a kol., Acta Agric. Scand. Section A, Animal Sciences 421, str. 115 až 120, 1992).

Velký podíl kolísání stravitelnosti mastných kyselin v případě dojnic se vysvětluje variacemi stravitelnosti v tenkém střevu (Weisbjerg a kol, Acta Agric. Scand. Section A, Animal Sciences 421, str. 114 až 120, 1992). Působení fosfolipázy A2 v tenkém střevu dojnic podobně podporuje stravitelnost mastných kyselin.

Proteiny, například enzym fosfolipáza A2, se zpravidla v žaludečním systému rychle odbourávají. Proto se tyto proteiny mají uvolňovat v tenkém středu tak, aby se zabránilo jejich odbourání v žaludečním systému. Pracovníci v oboru znají četné způsoby, jak toho dosáhnout.

Významné zlepšení stravitelnosti tuků bylo zjištěno u nepřežvykujících telat po přidání fosfolipázy, zvláště vepřové fosfolipáza A2 (příklad 4).

Krmivo pro ryby a korýše se také často doplňuje poměrně vysokými koncentracemi fosfolipidů k dosahování přijatelného růstu, zdraví a zužitkování krmivá. Podle předloženého řešení se fosfolipáza může také přidávat do tohoto krmivá k dalšímu zlepšení růstu a využití krmivá.

Předložené řešení se proto také týká přidávání fosfolipázy a popřípadě fosfolipidů do krmivá pro zvířata k dosažení snížení množství drahých krmivových složek, jako jsou vitaminy a/nebo barvivá, které se do krmiv vnášejí.

Fosfolipáza se může přidávat do krmiv v koncentraci, která se mění v závislosti na typu a koncentraci fosfolipidů a na typu krmeného zvířete a je 1000 až 5 000 000 mezinárodních jednotek (IJ definovaných v příkladu 1) fosfolipázy na kg fosfolipidů. S výhodou se na 1 kg fosfolipidů přidává 10 000 až 500 000 mezinárodních jednotek fosfolipázy. Obecně krmivo pro zvířata obsahuje 1 až 2 g fosfolipidů na kg krmivá. Proto je vhodné množství fosfolipázy 10 až 1000 mezinárodních jednotek na kg krmivá, avšak nejvýhodnější je množství fosfolipázy 100 až 1000 mezinárodních jednotek na kg krmivá. Z toho vyplývá, že dávka fosfolipázy přidávané do krmivá, se může nastavovat v případě neobvyklého obsahu fosfolipidů v krmivu.

Podle výhodného provedení předloženého řešení se fosfolipáza získá použitím rekombinantní DNA technologie. Fosfolipáza se rekombinantně produkuje heterologní expresí fosfolipázového genu nebo cDNA ve vhodném hostitelském organismu nebo homologní nadexpresí vhodného endogenního genu.

Zde popsané specifické provedení předloženého řešení popisuje použití vepřové fosfolipázy A2, produkované heterologní genovou expresí ve kvasinkách Kluyveromyces lactis. Pracovníkům v oboru je však zřejmé, že fosfolipázy, získané z jiných zdrojů, budou působit podle předloženého řešení stejně. Takové fosfolipázy se mohou odvozovat od jiných savců, jako jsou například krysy, myši nebo lidé, přičemž pro všechny tyto savce jsou v oboru dostupné fosfolipázové A2

-5 CZ 296039 B6 geny. Nebo mohou být fosfolipázy odvozeny od jiných organismů než jsou savci, jako jsou například mikrobiální nebo dokonce rostlinné fosfolipázy.

Podobně mikroorganismy, použitelné pro produkci fosfolipázy, používané podle předloženého řešení, nejsou nutně omezeny na kvasinky Kluyveromyces lactis. Kromě z Kluyveromyces lactis úspěšná heterologní exprese vepřová fosfolipázová A2 genu je popsána v Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae a Aspergillus niger (Swinkels a kol., Antonie van Leeuwenhoek 64, str. 187 až 201, 1993). Proto se očekává, že úspěšnou (heterologní) expresi fosfolipáz podle předloženého řešení lze dosáhnout v širokém oboru mikroorganismů. Výhodnými organismy pro tento účel jsou bakterie rodu Bacillus a Escherichia, kvasinky rodu Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia a Candida a houby rodu Aspergillus, Trichoderma a Fusarium.

Způsoby exprese fosfolipáz v transgenním rostlinném materiálu, s výhodou v semenech, jsou popsány ve světové zveřejněné přihlášce vynálezu číslo WO 91/14772, kde se obecně popisují způsoby (heterologní) exprese enzymů v rostlinách, včetně specifických způsobů exprese enzymů pro semena.

Pracovníkovi v oboru je jasné, že přidání fosfolipázy ve formě transgenního rostlinného materiálu například transgenního semene obsahující fosfolipázu, může vyžadovat zpracování rostlinného materiálu tak, aby byl enzym dostupný nebo aby se alespoň jeho dostupnost zlepšila. Takové způsoby zpracování zahrnují různé mletí a drcení nebo tepelně mechanické zpracování, jako je vytlačování nebo expandování.

Řešení není omezeno na použití kmenů Streptomyces, schopných produkovat fosfolipázu A2 při fermentaci siláže, což je kromě jiného spojeno s těmito přednostmi:

- Může být zahrnuta jakákoliv fosfolipáza. To umožňuje použití fosfolipáz, které jsou endogenní pro zvířata, kterým se enzym podává, což usnadňuje schvalovací řízení pro produkt.

- To zároveň umožňuje volit fosfolipázu nejvhodnější pro použití jako krmivové přísady.

- Obchází se potřeba fermentace krmivá k dosažení produkce enzymu in sítu. To umožňuje přesné řízení množství fosfolipázové přísady do krmivá, což je důležité se zřetelem na optimum oboru koncentrací fosfolipázy pro určitá použití (příklad 3).

Pro formulaci jak enzymové přísady tak krmivá, obsahujícího tento enzym je velká pružnost.

Přísada savčí fosfolipázy A2 poskytuje neočekávatelně vysoký vliv na podporu růstu.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta jsou míněna hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese vepřové fosfolipázy A2 (PLA₂) ve kvasinkách Kluyveromyces lactis

Identifikace a molekulární klonování genu, kódujícího vepřový fosfolipázový A₂ protein, jsou podrobně popsány (Geus a kol, Nucl. Acid. Res. 15, str. 3743 až 3759, 1987 a van den Bergh a kol, Eur. J. Biochem. 170, str. 241 až 246,1987).

-6CZ 296039 B6

Jedním z těchto dobře charakterizovaných klonů, pCBO8T, obsahujících celou PLA₂ cDNA sekvenci a pro Kluyveromyces specifické genetické regulační prvky, se konstruovala expresní kazeta pKLAPLA-11 k dosažení exprese vepřové PLA₂ ve kvasinkách Kluyveromyces lactis. Jelikož PLA₂ cDNA sekvence a sekvence pro Kluyveromyces lactis jsou dostupné ve veřejné databázi, mohou pracovníci v oboru získat všechny materiály potřebné ke konstrukci expresní kazety pro expresi PLA₂ v Klueveromyces lactis.

Všechny molekulární klonovací techniky, jako například izolace a čištění nukleových kyselin, elektroforéza nukleových kyselin, enzymatická modifikace, štěpena a/nebo zesilování nukleových kyselin a transformace E. coli se provádějí o sobě známými způsoby z literatury (Sambrook a kol., 1989, Molecular Cloning: a laboratory manual“, Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring Harbour, New York; Innis a kol. (vyd.) 1990 a „PCR protocols, a guide to methods and applications“ Academie Press, San Diego). Syntézy oligo-deoxynukleotidů a analýza sekvencí DNA se provádějí za použití syntetizéru Applied Biosystems 380B DNA a sekvenceru 373A DNA, podle návodů, které k těmto zařízením dodávají jejich výrobci.

K usnadnění konstrukce pKLAPLA-11 se nejdříve zavádějí vhodná lemovací restrikčni místa na hranicích zralé PLAcDNA sekvence polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Současně se zavádějí na hranici 5', právě na místě štěpení pro PLA₂ a zralého PLA₂ proteinu, Smál a na hranici 3' koncový kódon, Xhol a Knpl restrikčni místa. Za tímto účelem se syntetizují dva oligonukleotidy:

o 1 i gomer 1 zralá PLA2

5' TGT CAT GCC CGG GCA TTA TGG CAG TTT CGT 3'

Srna 1 o I i gomer 2

5' AGT CCT CGG TAC CTC GAG TCA GCA GTA CTT CTT GGT GTC-3'

Kpnl Xhol stopkodon PLA2

PCR zesilování se provádí s oligomerem 1 a 2 jakožto primery a s pCBO8T jakožto matricí. Získaný zesilovaný 400 bp PLAcDNA fragment se digeruje se Smál a Kpnl a následně se včleňuje do vhodných míst pT718R molekulárním klonováním. Výsledný vektor se označuje jako pPLA-1. Takto modifikovaný PLAcDNA fragment se plně sekvencuje k ověření PCR zesilující reakce a k zavedení lemovacích restrikčních míst.

K zavedení Sa/1 restrikčního místa a optimálních kvasinkových translačních iniciačních sekvencí v hranici 5' preprosignální sekvence PLA₂ se syntetizují dva komplementární syntetické oligonukleotidy.

5' TCG ACA AAA ATG AAA TTC CTC GTG TTG GCT GTT CTG CTC ACAGT TTT TAC TTT AAG GAG CAC AAC CGA CAA GAC GAG TGT-> proPLA2

-GTG GGC GCT GCC CAG GAA GGC ATC AGC TCA A-3'

-CAC CCG CGA CGG GTC CTT CCG TAG TCG AGT T-5'

Po teplotní hybridizaci těchto dvou oligomerů získaný dvou řetězcový DNA fragment se molekulárně klonuje do vhodných míst (Sa/1 a Smál) pPLA-1. Získaný plazmid se označuje jako pKLAPLA-5 a zahrnuje celou preproPLA_2cDNA lemovanou na konci 5'jedním Sa/1 restrikčním místem a na konci 3' Xhol restrikčním místem.

Pro expresi vepřové PLA₂ v Kluyveromyces lactis se použije silného promotoru (Pi_ac) Kluyveromyces lactis. Vedle použití pro produkci laktázy v Kluyveromyces lactis se tohoto promotoru Plac použilo již dříve k expresi v Kluyveromyces lactis hovězího chymosinu (Berg van den J. a kol., Bio/Techol. 8. str. 15 až 139) a lidského sérového albuminu (HSA). Pro expresi HSA byl konstruován a popsán plazmid pGBHSA-20 (Swinkels a kol., 1993, Antonie van Leeuwenhoek 64, str. 187 až 201).

Pro expresi HSA v Kluyveromyces lactis je HSAcDNA sekvence v pGHBSA-20 řízena promotorem LAC4 Kluyveromyces lactis. Na zakončení 3' je HSAcDNA lemována terminátorovou sekvencí LAC4. Kromě toho pro sekvenci transformantů obsahuje pGBHSA-20 Tn5 fosfotransferázový gen, který přispívá k odolnosti k antibiotickému G418 (Geneticin, BRL; Reiss a kol, EMBO J. 3, str. 3317 až 3322, 1984) řízené promotorem S. cerevisiae ADH-1 (Bennetzen a Halí, J. Biol. Chem. 257, str. 3018 až 3025, 1982). V unikátním místě Sstl 1 LAC4 promotoru pGBHSA-20 obsahuje vektor E. coli pTZ19R, kterého se používá k zesílení E. coli. Před transformací Kluyveromyces lactis (K. lactis) E. coli pTZ19R sekvence se odstraňují z pGBHSA-20 Sstl 1 digescí a čistěním na agarosovém gelu. Transformace pGBHSA-20 linearizované v místě Sstll LAC4 promotoru do K. lactis vede k integraci do genomového LAC4 promotoru homologní rekombinací.

Pro expresi vepřové PLA₂ v K. lactis preproPLA₂ sekvence se fúzuje vhodně do K. lactis laktázové promotorové sekvence v pGBHSA-20. Za tímto účelem se pGBHSA-20 digeruje se Sa/1 a Xhol a HSAcDNA sekvence se nahrazuje pro Sa/l-Xhol DNA fragment pKLAPLA-5 molekulárním klonováním. Jak shora popsáno tento Sa/l-Xhol DNA fragment pKLAPLA-5 zahrnuje preproPLA₂ kódující sekvencí. Konečná exprese vektoru pro PLA₂ se označuje pKLAPLA-11.

Kvasinkové transformanty se generují způsobem, popsaným ve zveřejněné evropské přihlášky vynálezu číslo EP-A 0635574, který je založen na způsobu, který popsal Ito H. a kol. (J. Bacteriol, 153, str. 163 až 168, 1983). pKLAPLA-11 se linearizuje do LAC4 promotoru digescí Sstll 1. Sekvence pTZ19r se odstraní frakcionací a čištěním zagarosových gelů. Transferuje se 16 pg tohoto DNA fragmentu do K. lactic kmenů CNS 2360 a CBS 683 a získají se kolonie obou kmenů resistentní G4188 po inkubaci při teplotě 30 °C po dobu tří dnů.

Omezený počet transformantů každého hostitelského kmenu se počátečně selektuje do testu pro expresi aktivní vepřové PLA₂ do kultivačního prostředí. Transformanty se očkují do K. lactis YEPD kultivačního prostředí, které obsahuje 1 % (hmotnost/objem) kvasnicového extraktu, 2 % (hmotnost/objem) peptonu, 2 % (hmotnost/objem) glukózy, 2 % (hmotnost/objem) peptonu, 2 % (hmotnost/objem) glukózy a 50 pg/ml G418. Po třech dnech růstu při teplotě 30 °C se supematanty shromáždí a testují se na přítomnost aktivní PLA₂ zkouškou aktivity vaječného žloutku, popsanou níže, po zpracování vzorku trypsinem. Štěpení propeptidu je nutné k aktivaci neaktivního proenzymu (produkovaného K. lactis transformanty) na aktivní, zralou PLA₂.

Všechny transformanty se jeví jako producenti aktivní vepřové PLA₂ v množství 5 až 40 jednotek/ml.

Jedna jednotka je definována jako množství enzymu produkující 1 mikromol volné mastné kyseliny za minutu za standardních podmínek: substrát vaječného žloutku (0,4 % fosfolipidu), hodnota pH 8, hodnota 40 °C, 6 mM vápenatých iontů.

-8CZ 296039 B6

Příklad 2

Použití fosfolipázy A2 v krmivu pro zvířata

Provádějí se zkoušky sbroilery k testování účinnosti fosfolipázy A2. Samečci broilerů (Ross) mají od dne 1 do den 5 standardní výživu. Ve dnu 5 se zvířata z této skupiny vyberou a rozdělí se do klecí. Sleduje se hmotnost zvířat a její změny. Střední hmotnost a její odchylka jsou pro klece stejné. V jedné kleci se udržuje 15 zvířat. Klece jsou v budově pro broilery uměle vytápěné, větrané a osvětlované. Každá klec má 0,98 m² a drátěnou podlahu. Budova pro broilery je osvětlována 24 hodin denně. V průběhu posuvné periody se intenzita světla postupně snižuje. Teplota se postupně snižuje z 28 °C v prvním týdnu na 23 °C v posledním týdnu zkoušky. Vlhkost vzduchu je po celou pokusnou dobu udržována přibližně 60%. Zvířata jsou vakcinována proti nemoci New Castle injekcí ve stáří jednoho a patnácti dnů. Pokusná doba 33 dní zahrnuje předzkušební období 5 dní a 28 dní zkoušky.

Pokusná dieta se nabízí zvířatům neomezeně. Čerstvou vodu mají stále kdispozici.

Dieta je ve formě za studená peletizovaných (teplota udržována pod 65 °C) pelet o průměru 3 mm.

Pokus zahrnuje tato opatření:

a) dieta kukuřice/pšenice/sója (negativní kontrola)

b) dieta kukuřice/pšenice/sója + 100 IJ/kg

c) dieta kukuřice/pšenice/sója + 500 IJ/kg

Každé ošetření se opakuje šestkrát (90 kuřat celkem). Měří se přírůstky a konverze krmivá. Složení krmívaje uvedeno v tabulce I.

Tabulka I

Slouže diety kukuřice/pšenice/sója při zkoušce s broilery

Složka

Obsah (%) kukuřice pšenice sójový olej živočišný tuk maniok sójová moučka (50 % surového proteinu) sójové boby s plným obsahem tuku rybí moučka masová moučka s vysokým obsahem tuku hrách premix vitaminů a minerálů vápenec monokalciumfosfát chlorid sodný

DL-methionin

25,00

15,00

3,50

2,00

11,68

19,45

10,00

1,00

4,00

5,00

1,00

0,82

1,00

0,30

0,25

100,00

-9CZ 296039 B6

ME broilery (MJ/kg) surový protein (%) surový tuk (%) lysin (dostupný) methionin + cystein (dostupný) (%)

12,55 22,10 9,60 1,23 (1,04) 0,91 (0,79)

Enzym se do diety přidává po předchozím smíšením s nosičem. Dosažené výsledky jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

Vliv fosfolipázy A2 v dietě kukuřice/pšenice/sója na růst a konverzi krmivá pro broilery ve stáří 5 a 33 dní

	Příjem krmivá g	Růst g	Konverzní poměr krmivá
základní dieta	2613	1445	1,81
dieta + 100 IJ/kg krmivá	2569	1458	1,76
dieta + 500 IJ/kg krmivá	2526	1472	1,72

Ve druhé zkoušce, v podstatě stejné jako shora popsáno se používá základní diety pšenice/rýže/sója, specifikované v tabulce III.

Pokus zahrnuje tato opatření:

a) dieta pšenice/rýže/sója (negativní kontrola)

b) dieta pšenice/rýže/sója + 100 IJ/kg

c) dieta pšenice/rýže/sója + 500 IJ/kg

d) dieta pšenice/rýže/sója + 1000 IJ/kg

Všechny parametry jsou stejné jako při podávání diety kukuřice/pšenice/sója. Složení krmívaje uvedeno v tabulce III (procenta jsou míněna hmotnostně):

Tabulka III

Sloužení diety/pšenice/rýže/sója při zkoušce s broilery

Složka Obsah (%) pšenice40,00 rýže10,00 sójový olej1,00 živočišný tuk6,00 maniok4,28 sójová moučka (45,4 % surového proteinu) 22,00 sójové boby s plným obsahem tuku10,00 masová moučka 58 % surového proteinu3,00 premix vitaminů a minerálů1,00 vápenec0,94 monokalciumfosfát1,20 chlorid sodný0,26

-10CZ 296039 B6

L-lysin hydrochlorid DL-methionin	0,11 0,21 100,00
ME broilery (MJ/kg)	11,90
surový protein (%)	21,40
surový tuk (%)	10,50
lysin (dostupný)	1,23 (1,05)
methionin + cystein (dostupný) (%)	0,90 (0,77)

Enzym se do diety přidává po předchozím smíšením s nosičem. Dosažené výsledky jsou uvedeny v tabulce IV.

Tabulka IV

Vliv fosfolipázy A2 v dietě pšenice/rýže/sója na růst a konverzi krmivá pro broilery ve stáří 5 a 33 dní

	Příjem krmivá g	Růst g	Konverzní poměr krmivá
základní dieta	2752	1556	1,77
dieta +100 IJ/kg krmivá	2747	1568	1,75
dieta + 500 IJ/kg krmivá	2733	1586	1,72
dieta + 1000 IJ/kg krmivá	2725	1572	1,73

Z tabulky IV je zřejmé, že optimální obor koncentrací fosfolipázy, použitý při této zvláštní dietě pro broilery je více než přibližně 100 IJ/kg krmivá a méně než přibližně 10000 IJ/kg krmivá. Pro jiné systémy krmivá mohou být jiné optimální hodnoty, které se zjistí rutinní zkouškou.

Příklad 4

Použití fosfolipázy A2 jako náhrady mléka

Zkouška se provádí za použití tří skupin vždy po 5 samečcích telat Friesian, holandsko holštýnských friských telat.

V průběhu předzkouškového období nahrazuje potravu obchodní mléko. Po 14 dnech se zvířata rozdělí pro trojí ošetření, přičemž se přiblíží ke hmotnosti a jejím změnám. Zvířata se udržují v jednotlivých boxech. Stálé světlo je přírodní, boxy se větrají a udržují se na teplotě přibližně 18 °C.

Zvířata si na dietu zvykají 14 dní. Pak se kvantitativně shromažďují výkaly po 5 následujících dní po dobu 24 hodin denně. Zvířata se opatří postoji před zkušební periodou. Výkaly se shromažďují do plastových sáčků, upoutaných na postroji. Jednou denně se výkaly zváží, shromáždí a uskladní při teplotě -20 °C. Před analýzou se výkaly důkladně promísí a zpracují se na vzorky.

Zvířata se krmí jednotlivě podle výkrmného schématu. Používané náhražka mléka má toto složení:

	%
prášek odstředěného mléka	58,5
tuk	19,8
laktóza	17,6
škrob, vitaminy, minerály	4,1

-11 CZ 296039 B6

ME surový protein (N*6.25) surový tuk

8645,50 kJ/kg 21.5 % 19.5 %

Náhražka mléka se smísí s vodou před krmením a krmivo se podává o teplotě přibližně 40°C.

Podle ošetření sestává tuk z 18 % hovězího loje, z kokosového tuku a ze sádla. Lecitin se přidává v množství 10 %, vztaženo na obsah tuku.

Do této diety se přidává vepřová fosfolipáza A2 do konečné koncentrace 500 IJ/kg náhražky mléka. Měří se stravitelnost tuku. Výsledky jsou uvedeny v tabulce V.

Tabulka V

Vliv fosfolipázy A2 se stravitelnost různých tuků v případě nepřežvykujících telat majících 18 % tuků ve své dietě a 1,8 % lecitinu (10 % obsahu tuku). Fosfolipáza A2 se připravuje způsobem podle příkladu 2 a přidává se do diety v konečné koncentraci 500 IJ/kg náhražky mléka.

Bez fosfolipázy A2

S fosfolipázou A2 hovězí lůj kokosový tuk sádlo

Seznam sekvencí

70,0% 73,1%

95,6 % 96,2 %

79,4 % 84,3 % (1) Obecné informace

i) Přihlašovatel:

A) Jméno: Gist-brocades B.V.

B) Ulice: Wateringseweg

C) Město: Delft

E) Zem: Nizozemsko

F) Směrovací číslo (ZIP): 2611 XT

G) Telefon:+31-15-2799111

H) Telefax: +31-15-2793957 ii) Název vynálezu: Použití fosfolipáz v krmivech pro zvířata iii) Počet sekvencí: 4 iv) Forma pro počítač

A. Typ média: Floppy disk

B. Počítač: IBM PC kompatibilní

C. Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

D. Software: Patentln Release # 1.0, Version # 1,30 (EPO)

2. Informace o sekv. ID č. 1:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 30 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jednotlivý

D. Topologie: lineární

- 12CZ 296039 B6 ii) Typ molekuly: DNA (genomická) iii) Hypotetická: ne iv) Antimediátorová: ne xi) Popis sekvence ID. č. 1:

TGTCATGCCC GGGCATTATG GCAGTTTCGT

2. Informace o sekv. ID č. 2:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 39 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jednotlivý

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) iii) Hypotetická: ne iv) Antimediátorová: ne xi) Popis sekvence ID. ě. 2:

AGTCCTCGGT ACCTCGAGTC AGCAGTACTT CTTGGTGTC

3. Informace o sekv. ID ě. 3:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 73 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jednotlivý

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) iii) Hypotetická: ne iv) Antimediátorová: ne xi) Popis sekvence ID. č. 3:

TCGACAAAAA TGAAATTCCT CGTGTTGGCT GTTCTGCTCA CAGTGGGCGC

TGCCCAGGAA GGCATCAGCT CAA

-13 CZ 296039 B6

4. Informace o sekv. ID č. 4:

i) Charakteristiky sekvence

A. Délka: 69 párů bází

B. Typ: nukleová kyselina

C. Řetězec: jednotlivý

D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA (genomická) iii) Hypotetická: ne iv) Antimediátorová: ne xi) Popis sekvence ID. č. 4:

TTGAGCTGAT GCCTTCCTGG GCAGC6CCCA CTGTGAGCAG AACAGCCAAC

ACGAGGAATT TCATTTTTG

Průmyslová využitelnost

Krmivový prostředek pro zlepšení účinnosti využití krmiv pro zvířata například pro nepřežvykující telata a pro podporu růstu zvířat obsahující krmivo a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu v množství 1000 až 5 000 000 mezinárodních jednotek fosfolipázy na kg fosfolipidu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob zlepšení účinnosti využití krmiv, vyznačující se tím, že se zvířatům podává krmivový prostředek obsahující krmivo a fosfolipázovou přísadu kokamžitému použití.
2. Způsob podpory růstu zvířat, vyznačující se t í m , že se zvířata podává krmivový prostředek obsahují krmivo a fosfolipázovou přísadu k okamžitému použití.
3. Krmivový prostředek zlepšující využitelnost krmiv, v y z n a č uj í c í se tím, že obsahuje krmivovou složku a fosfolipázovou přísadu kokamžitému použití.
4. Růst zvířat podporující krmivový prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje krmivovou složku a fosfolipázovou přísadu kokamžitému použití.
5. Krmivový prostředek podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že obsahuje fosfolipid.
6. Krmivový prostředek podle nároku 5, vy z n a č uj í c í se t í m , že fosfolipid obsahuje lecitin.
7. Krmivový prostředek podle nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že fosfolipáza je živočišného, rostlinného nebo mikrobiálního původu.

- 14CZ 296039 B6
8. Krmivový prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že fosfolipázouje živočišná fosfolipáza A2 ze souboru zahrnujícího hovězí, vepřovou, myší, krysí a lidskou fosfolipázu A2.
9. Krmivový prostředek podle nároku 9, vy z n a č u j í c í se t í m , že fosfolipáza je získatelná expresí rekombinantní DNA v hostitelském organizmu.
10. Krmivový prostředek podle nároku 9, vy z n ač uj í c í se t í m , že hostitelským organizmem je mikroorganizmus volený ze souboru zahrnujícího bakterie, kvasinky a vláknité houby.
11. Krmivový prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že hostitelským organizmem je mikroorganizmus volený ze souboru zahrnujícího Bacillus, Escherichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, Candida, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Fusarium a Humicola.
12. Krmivový prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že hostitelským organizmem je mikroorganizmus volený ze souboru zahrnujícího Eschericia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis a Aspergillus niger.
13. Krmivový prostředek podle nároků 3 až 9, vyznačující se tím, že obsahuje rostlinný materiál získatelný z transgenních rostlin.
14. Krmivový prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje semena transgenních rostlin obsahujících fosfolipázu získatelnou expresí rekombinantní DNA.
15. Krmivový prostředek podle nároků 5 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje 1000 až 5 000 000 mezinárodních jednotek fosfolipázy na kg fosfolipidu.
16. Krmivový prostředek podle nároků 5 až 15, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje 100 až 1000 mezinárodních jednotek fosfolipázové přísady na kg krmivá.
17. Způsob přípravy krmivového prostředku podle nároků 3 až 16, vyznačující se tím, že se míchá fosfolipáza s krmivovou složkou.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se míchá fosfolipáza s krmivovou složkou a alespoň jedním fosfolipidem.
19. Způsob podle nároku 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se používá fosfolipáza připravená rekombinantně.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že se přidává fosfolipáza ve formě transgenního rostlinného materiál.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že se transgenní rostlinný materiál zpracovává tak, aby poskytoval fosfolipázu.
22. Použití krmivového prostředku obsahujícího krmivovou složku a fosfolipázovou přísadu ke krmení nepřežvykujících zvířat.
23. Použití krmivového prostředku obsahujícího krmivovou složku a fosfolipázovou přísadu ke krmení nepřežvykujících telat.