JPH0998726A

JPH0998726A - 動物飼料組成物

Info

Publication number: JPH0998726A
Application number: JP8119832A
Authority: JP
Inventors: Robert Franciscus Beudeker; フランシスカスブーデケルロベルト; Arie Karst Kies; カルストキースアリー
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1995-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 1997-04-15
Also published as: US6183739B1; IL118245A; NZ286574A; CN1099841C; NL1003096C2; CZ296039B6; ES2229252T3; PL318138A1; CZ11197A3; BR9606365A; TW480175B; US6017530A; SI9620013B; WO1996036244A1; AR001939A1; NL1003096A1; ATE277524T1; RO117142B1; DE69633480T2; AU700385B2

Abstract

(57)【要約】【課題】飼料物質及び使用準備ホスホリパーゼ添加剤
を含有する組成物を有する食餌を動物に与える、飼料利
用効率の改良方法及び／又は動物の生長促進方法の提
供。【解決手段】組成物は、少なくとも１つのリン脂質を
有する。この組成物を用いて脂肪消化性が改良されて、
動物の生長が促進される。リン脂質はレシチンであるの
が好ましく、好ましいホスホリパーゼは、ホ乳類ホスホ
リパーゼＡ２である。好ましい態様として、組換えＤＮ
Ａ法を用いてホスホリパーゼを製造し、微生物又はトラ
ンスジェニック植物などの好適な宿主内で酵素を発現さ
せる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、酵素の家畜飼料へ
の適用に関する。

【０００２】

【従来の技術】食物を消化するために、動物の胃腸系内
で多くの酵素が分泌される。これらの酵素の各々は、胃
腸系内の一部の特定の環境で特定の成分に作用する。例
えば、ペプシンは胃の酸性環境下で活性である一方、他
のプロテアーゼ、例えばキモトリプシン及びカルボキシ
ペプチダーゼは、ｐＨ６−７の小腸の上部で活性を示
す。これらの酵素の多くは、活性化前に前駆体を必要と
する。例えばペプシンは、酸性環境にあるペプシノーゲ
ンからのみ形成される。キモトリプシン及びカルボキシ
ペプチダーゼは双方ともに、不活性形態で分泌され、プ
ロテアーゼ・トリプシンによって活性化される。

【０００３】脂肪の消化は複雑な方法である。動物の食
餌内のほとんどの脂肪は、トリグリセリドの形態で利用
できる。これらのトリグリセリドは、腸でほとんど吸収
せず、あったとしてもわずかであり、モノ−及びジ−グ
リセリド、グリセロール並びに遊離脂肪酸に分解されな
ければならない。この変換は、膵臓から分泌する酵素、
即ちリパーゼにより触媒化される。この酵素は水と油の
界面で活性である。良好な消化のために、水中油エマル
ジョンの脂肪の小滴を有するのが本質的である。乳化剤
は水相中に脂肪を分散させる界面活性剤である。胃腸系
内の最も重要な乳化剤は胆汁である。胆汁は肝臓で分泌
し、胆嚢で貯蔵される。胆汁は、胆汁酸及び塩、コレス
テロール並びにリン脂質等を含んでいる。胆汁成分と
（残りの）トリグリセリド生成物との混合物により、小
粒子、即ちミセルが形成される。これらのミセルを空腸
上皮細胞に拡散させて、そこでその内容物が解放され吸
収される。これらの上皮細胞で、トリグリセリドは再構
築される。コレステロール、コレステロールエステル、
リン脂質及びタンパク質とともに、それらは新しい水溶
性粒子、即ちキロミクロンとよばれるものを形成する。

【０００４】レシチンなどのリン脂質は、膵臓で分泌さ
れるホスホリパーゼＡ及びＢの作用により酵素的に分解
される。レシチンは極性及び中性脂質の双方の混合物で
あり、極性脂質の含量は少なくとも60％である。この疎
水性／親水性により、極性脂質（ゆえにレシチン）は乳
化剤として用いられる。極性脂質として、（グリセロ）
リン脂質及び糖脂質が挙げられる。グリセロリン脂質の
基本的構造は、次のようなものである。

【０００５】

【化１】

【０００６】グリセロリン脂質は、基本的には、Ｃ₁-及
びＣ₂-位に脂肪酸を有するグリセロール部からなる。Ｃ
₃-位がリン酸でエステル化されている。このリン酸は、
アルコール群としばしば結合して、次の化合物を生成す
る。・ホスファチジル−エタノールアミン（ＰＥ；Ｘ＝エタノールアミン）・ホスファチジル−コリン（ＰＣ；Ｘ＝コリン）・ホスファチジル−セリン（ＰＳ；Ｘ＝セリン）・ホスファチジル−イノシトール（ＰＩ；Ｘ＝イノシトール）・ホスファチジン酸（ＰＡ；Ｘ＝水素）脂肪酸残基を（通常２つである代わりに）唯一有するグ
リセロリン脂質は、リゾリン脂質とよばれる。

【０００７】レシチンは、食物及び飼料を含む多くの適
用において乳化剤として用いられる。乳化剤は、水相に
油液相を分散させることができる界面活性剤である。乳
化剤は、同一分子内に親水性基及び脂肪親和性基の双方
を保持する。親水性基：脂肪親和性基の比率は、ＨＬＢ
値として知られており、乳化剤の特性を示すものであ
る。脂肪溶解性疎水性乳化剤は０から１０未満の範囲の
ＨＬＢ値を有する一方、水溶性化合物は１０〜２０のＨ
ＬＢ値を有する。向上した飼料栄養価を達成するか、又
は液状飼料の場合、良好な分散性を達成するために、レ
シチンのような乳化剤を動物飼料に加える。より良好な
栄養価をもたらす改良乳化特性を有するリゾレシチン
（ケミン社（Kemin company)から登録商標リゾフォルテ
（Lysoforte)として販売されている）を動物飼料に加え
ることもよく知られている（Pluimveehouderij 24 巻:2
0-21頁（1994年３月18日))。

【０００８】レシチンの乳化特性は、乾燥食糧にレシチ
ンを含めることにより家畜生産に利用できるだけでな
く、多割合で脂肪を含む液状飼料を動物に与える領域に
も利用できる。これらは、主に子ウシにとってのミルク
代替品及び子ブタにとっての雌ブタミルク置換物であ
る。レシチンの機能は、既に調製された液状飼料に脂肪
を可能な限り微細に分散させることにある。微細分散す
ることにより、動物による脂肪消化性を向上させること
になる。また、レシチンは液状飼料中の不溶性成分の消
化を助けるのに好都合な効果を示す。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】最近、飼料工業は工業
的に製造した酵素を使用し、動物の胃腸系内で製造され
る酵素を補足することをはじめている。例として、フィ
ターゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、及び種々の植
物細胞壁分解酵素が挙げられる。しかし、動物の生長を
促進させる目的で動物飼料に直接ホスホリパーゼを添加
することは、動物自身がこれらの酵素の大部分を小腸の
上部で既に分泌しているため、どの従来技術も記載して
いない。

【００１０】EP-A-0 619 079号は、反芻動物の飼料に含
める生物活性物質を含む粒状物のコーティング剤とし
て、特にリン脂質を使用することを開示している。コー
ティングは、第４胃後の消化器官による消化及び吸収さ
せるために、反芻胃の生物活性物質を保護するのに作用
する。EP-A-0 619 079号は、加水分解を助けるために保
護コーティングにホスホリパーゼを任意に含めることが
できることをさらに開示しているが、EP-A-0 619 079号
は、生長を促進させるか、又は飼料使用の効率を改良す
るために、飼料にホスホリパーゼを添加してもよいこと
を開示しておらず、示唆もしていない。GB-A-2 267 033
号は、生長促進に関するが、ストレプトマイシン株とと
もにリン脂質レシチンを含有するキットをサイレージに
添加することを教示している。ストレプトマイシン株
は、サイレージの発酵の際にホスホリパーゼＡ２を製造
できることを示唆していた。キットの使用は、その製造
工程がストレプトマイシン株によるホスホリパーゼ製造
と相同性のある発酵段階を有する動物飼料に限定される
ことが示唆されている。ゆえに、飼料使用の効率の改良
及び／又は動物の生長の促進のための、広範囲に適用可
能な、用途の広い使用準備ホスホリパーゼ飼料添加剤の
必要性がいまだに存在する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、飼料物質を含
有する組成物と使用準備ホスホリパーゼ添加剤とを含有
する食餌を動物に与える飼料利用効率の改良方法を提供
する。また、本発明は、飼料物質を含有する組成物と使
用準備ホスホリパーゼ添加剤とを含有する食餌を動物に
与える動物の生長促進方法を提供する。さらに、本発明
は、飼料物質及び使用準備ホスホリパーゼ添加剤を含有
する動物飼料組成物を提供する。さらに、本発明は、微
生物又はトランスジェニック植物でホスホリパーゼを組
換えにより製造し、得られたホスホリパーゼを飼料物質
と混合する工程を有する動物飼料の製造方法を提供す
る。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、動物用飼料に体外から
添加した、使用準備ホスホリパーゼを使用し、胃腸系の
リン脂質の乳化特性を向上させて、それにより飼料使用
効率を改良するか、又は動物の生長を促進させることを
開示している。動物の生長を促進させることは、本明細
書において、時間による体重増に関する生長促進（生長
速度）及び／又は飼料効率に関する生長促進（飼料転換
比）として定義する。本発明に使用できるホスホリパー
ゼとして、ホスホリパーゼＡ１（EC 3.1.1.32)、ホスホ
リパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ（リゾホスホリパー
ゼ）、ホスホリパーゼＣ及びホスホリパーゼＤがある。
特に、本発明は、ホスホリパーゼＡ２（EC 3.1.1.4）が
添加される飼料の応用を開示する。例えば、ホスホリパ
ーゼＡ２を、インシュリン生成物からの副生成物として
ブタの膵臓から単離することにより製造することができ
る。また、例えば、ホスホリパーゼＡ２を、クルイベロ
ミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）などの微
生物中の異種遺伝子の発現による組換えにより製造する
ことができる。この酵素は、そのような微生物から、発
酵及び酵素を回収する下流プロセシングにより得られ
る。

【００１３】レシチン含有動物飼料にホスホリパーゼを
体外からの添加する他の可能性は、ホスホリパーゼが異
種遺伝子発現により合成されているトランスジェニック
植物材料、好ましくはホスホリパーゼ含有トランスジェ
ニック種子を添加することである。これを得るために、
ホスホリパーゼをコードする遺伝子を、例えば組織特異
性プロモーター、種子特異性プロモーターのような適当
な植物発現シグナルの制御下で植物発現ベクターにクロ
ーン化する。ホスホリパーゼ遺伝子を含む発現ベクター
は次に植物細胞を形質転換し、形質転換植物細胞は全植
物の再生のために選択される。得られたトランスジェニ
ック植物を生長させ、繁殖させることができ、異種ホス
ホリパーゼを含む植物の一部をそれ自身又はプロセシン
グ後に動物飼料に含めることができる。異種ホスホリパ
ーゼをトランスジェニック植物の種子に含めるか、又は
根、茎、葉、樹、花、樹皮、及び／又は果実などの他の
植物材料に含めることできる。

【００１４】よって、ホスホリパーゼ添加剤は、主な飼
料物質の天然成分ではないか、又はその中に天然の濃度
で存在しないホスホリパーゼを意味し、例えばホスホリ
パーゼを飼料物質とは別に、単独又は他の飼料添加剤と
組合わせて飼料に添加するか、又はホスホリパーゼは飼
料物質の１つの絶対必要な一部であるが組換えＤＮＡ技
術により製造されるものであると理解される。使用準備
ホスホリパーゼ添加剤は、本明細書中、動物飼料中の元
の場所（in situ)では製造されない添加剤として定義さ
れる。使用準備ホスホリパーゼ添加剤を動物に直接与え
るか、又は好ましくは他の飼料成分と混合後に直接与え
るのがよい。使用準備ホスホリパーゼ添加剤は、不活性
代用形（pro-form）であるが胃腸系内で、例えばタンパ
ク質分解プロセシングにより活性化され得るホスホリパ
ーゼを実際に含んでいる。

【００１５】好ましい飼料はリン脂質を含んでおり、好
ましくは、例えば全脂大豆、全脂ナタネ、大豆油、ナタ
ネ油又は他のいかなる脂肪種子もしくは体外から添加し
たホスホリパーゼに加えてレシチンに豊富な油のよう
な、原材料内に存在するのと同じレシチンであり、（微
生物により製造される）ブタ・ホスホリパーゼＡ２であ
るのが好ましい。本発明の他の面として、ホスホリパー
ゼ、好ましくは（微生物により製造される）ブタ・ホス
ホリパーゼＡ２を、幼い動物に与えるレシチン含有ミル
ク代替品に含める。これにより、幼い動物の脂肪の消化
性が向上する。本発明のさらなる他の面として、生長及
び飼料転換比を向上させるために、ホスホリパーゼを魚
介類の食餌に含める。

【００１６】例えばホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）で
の処理において、レシチンのＨＬＢ値は７からおよそ８
又は９に上昇する。これはレシチンの乳化特性における
ホスホリパーゼＡ２処理の有利な効果に寄与するもので
ある。ブタ・ホスホリパーゼＡ２は、ｐＨ６．０以下で
生体で活性を示さない。単胃動物の胃腸系での有効なｐ
Ｈは、餌袋（crop）及び胃で６．０以下である。ホスホ
リパーゼＡ２を添加する有益な効果をだれも全く予想で
きなかった。その理由は、 a)有効ｐＨと酵素のｐＨ依存性との不適当な組合せの結
果として、餌袋及び胃の内部で添加ホスホリパーゼの活
性を予想できないこと、及び b)動物はそれ自身、有効なｐＨが酵素のｐＨ依存性と調
和する小腸の上部で、この酵素を大量に分泌することに
よる。驚くことに、ブタ・ホスホリパーゼＡ２を体外からの添
加することにより、ブロイラーにおいて著しく改良した
飼料転換比が得られることがわかった（実施例３）。

【００１７】単胃動物に加えて、ホスホリパーゼＡ２は
多胃動物に用いてもよい。例えば、毎日多くの牛乳を生
産する初期授乳期間、エネルギーバランスが大きく負と
なっているのを一部補償するために、それらの食餌に高
レベルで脂肪を含めることは興味あることである。毎日
の牛乳の胃腸系の脂肪酸の消化性は、特に食糧組成物及
び脂肪源の関数として変化することが文献から知られて
いる。パルミチン酸（Ｃ16:0）に飽和脂肪 500ｇを含む
食餌についての80％から、ステアリン酸（Ｃ18:0）に飽
和脂肪1000ｇを含む食餌について64％までの間で、脂肪
酸の消化性は変化することがわかっている（ヴァイスベ
ルク（Weisbjerg)ら、Acta Agric. Scand. Section A,
Animal Sciences 42巻、115-120 頁（1992年))。毎日の
牛乳中の脂肪酸の消化性の変化の大部分は、小腸の消化
性の変化によって説明される（同上、114-120 頁）。毎
日の牛乳の小腸におけるホスホリパーゼＡ２の作用は、
脂肪酸の消化性を増大するようである。酵素ホスホリパ
ーゼＡ２などのタンパク質は通常、第一胃内で迅速に崩
壊する。ゆえに、これらのタンパク質は、第一胃内での
崩壊を予防するように、小腸に運搬されるべきである。
第一胃内での不活性化から酵素を保護するために、多く
の配合法が当業者に利用される。

【００１８】ホスホリパーゼ、特にブタ・ホスホリパー
ゼＡ２を添加することで、非反芻幼獣による脂肪消化性
において、著しい改良が見出されている（実施例４）。
許容される生長、健康及び飼料転換を達成するために、
魚介類の食餌は、しばしば比較的高濃度のリン脂質で補
われている。本発明で、生長及び飼料転換比をさらに向
上させるために、リン脂質をこれらの飼料に添加するの
がよい。本発明のさらなる面として、ホスホリパーゼ及
び任意に添加してもよいリン脂質を動物飼料に添加する
ことにより、高価な飼料成分、例えば飼料に含めるビタ
ミン及び／又は着色剤の量を減少させることができるこ
とが挙げられる。

【００１９】ホスホリパーゼを、リン脂質のタイプ及び
濃度、並びにターゲットの動物の関数として変化する濃
度で飼料に添加する。その濃度は一般に、リン脂質１kg
当たり約 1,000〜5,000,000 国際単位（以下、ＩＵと略
する。定義は実施例１を参照のこと）である。リン脂質
１kg当たり約10,000〜500,000 ＩＵ添加するのが好まし
い。一般的には、動物飼料は１kg当たり、リン脂質を約
１〜２ｇ含んでいる。結果的には、飼料１kg当たり１〜
10,000ＩＵ／kg、又は好ましくは10〜 1,000ＩＵ／kgの
範囲が適当であるが、最も好ましくは、約 100〜 1,000
ＩＵ／kgの範囲がよい。飼料に添加するホスホリパーゼ
の量は、飼料に通常含まれないリン脂質により調整する
ことができる。本発明の好ましい態様として、ホスホリ
パーゼを、組換えＤＮＡ技術を用いて得る。ホスホリパ
ーゼは、ホスホリパーゼ遺伝子又は好適な宿主細胞中の
ｃＤＮＡの異種発現により、もしくは好適な内在遺伝子
の相同的な過発現（overexpression）により、組換えに
より製造される。

【００２０】本明細書に記載される本発明の特定の態様
では、イースト菌クルイベロミセス・ラクティス中での
異種遺伝子発現により製造されたブタ・ホスホリパーゼ
Ａ２を用いる。しかし、他の供給源から得たホスホリパ
ーゼも本発明において作用することを当業者は理解する
であろう。そのようなホスホリパーゼは、例えばラッ
ト、マウス又はヒトなどの他のホ乳類から誘導でき、そ
れらの全てのホスホリパーゼＡ２遺伝子が、当業界にお
いて入手可能である。また、例えば微生物又は植物ホス
ホリパーゼのような、ホ乳類以外の有機体からホスホリ
パーゼを誘導することもできる。同様に、本発明で用い
るホスホリパーゼの製造に用いる微生物は、イースト菌
クルイベロミセス・ラクティスだけに必ずしも限られな
い。クルイベロミセス・ラクティスの他に、ブタ・ホス
ホリパーゼＡ２の成功を収める異種発現が、エシェリキ
ア・コリ（大腸菌）（Escherichia coli）、サッカロミ
セス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）及びア
スパルギルス・ニゲル（Aspergillus niger)において報
告されている（スウィンクルス（Swinkles）ら、Antoni
e van Leeuwenhoek 64巻、187-201 頁（1993年))。ゆえ
に、本発明のホスホリパーゼの成功を収める（異種）発
現を、広範囲の微生物において得ることができる。この
目的に好ましい微生物として、バチルス（Bacillus）及
びエシェリキア属のバクテリア、サッカロミセス、クル
イベロミセス、ハンセニューラ（Hansenula)、ピキア
（Pichia）、ヤロウィア（Yarrowia）、及びカンジダ
（Candida)属のイースト菌、又はアスペルギルス、フザ
リウム（Fusarium）、及びトリコデルマ（Trichoderma)
属の糸状菌類が挙げられる。

【００２１】トランスジェニック植物材料、好ましくは
種子でのホスホリパーゼの発現方法に関して、我々は国
際出願第WO91/14772号を参考とした（この参考文献の内
容は本明細書に含まれる）。そこには、酵素の種子特異
的な発現方法を含めて、植物での酵素の（異種）発現の
一般的な方法が開示されている。例えばホスホリパーゼ
を含むトランスジェニック種子など、トランスジェニッ
ク植物材料の形態でホスホリパーゼを添加することは、
酵素を利用できるものとするため、又はその利用性を少
なくとも改良するために、植物材料のプロセシングを必
要とするであろうことを当業者は理解できるであろう。
そのようなプロセシング技術として、さまざまな粉砕
（milling)及び磨耗（grinding）技術もしくは押出（ex
trusion)又は拡張（expansion)のような熱機械的処理を
挙げることができる。

【００２２】本発明は、次の長所を特にもたらす、サイ
レージの発酵の際にホスホリパーゼＡ２を製造すること
ができるストレプトマイシン株の使用に限定されない。・どのようなホスホリパーゼも含めることができる。こ
れにより、酵素が適用される動物に相同性のあるホスホ
リパーゼを使用することができる。これにより、管轄官
庁から製造承認を得るのが促進される。・これにより、さらに飼料添加物として適用するのに最
も好適なホスホリパーゼを選択することができる。・その場で（in situ)酵素を製造するため、飼料を発酵
する必要性が回避される。これにより、飼料中のホスホ
リパーゼ添加剤の量を正確に制御することができ、ある
応用におけるホスホリパーゼ濃度範囲における最適値に
関して重要である（実施例３参照のこと）。・酵素添加剤及びそれを含有する飼料の双方の配合にお
いて大いな融通性をもたらす。・ホ乳類ホスホリパーゼＡ２の添加により、生長促進の
予期し得ない程の大いなる効果がもたらされる。本明細書の実施例は例示のためのものであり、本発明の
範囲を限定するためのものではない。

【００２３】

【実施例】

【実施例１】イースト菌クルイベロミセス・ラクティスでのブタ・ホ
スホリパーゼＡ₂(ＰＬＡ₂)の発現ブタ・ホスホリパーゼＡ₂ タンパク質をコードする遺伝
子の同定及び分子クローニングは、ド・ゲウス（de Geu
s)ら（Nucl. Acid Res. 15巻、3743-3759 頁（1987年))
及びファン・デン・ベール（van den Bergh)ら（Eur.
J. Biochem 170巻、241-246 頁（1987年))に既に詳細に
説明されている。これらの十分に特徴が分かっているク
ローン、完全なＰＬＡ₂ｃＤＮＡ配列及びクルイベロミ
セス特異性遺伝子調節要素を含む、ｐＣＢ０８Ｔの一つ
で、我々は、イースト菌クルイベロミセス・ラクティス
（K.lactis）内でブタＰＬＡ₂の発現を得るために、発
現カセットｐＫＬＡＰＬＡ−１１を構成した。ＰＬＡ₂
ｃＤＮＡ配列及びK.lactis調節要素の配列が、公共のデ
ータベースですべて入手可能であるので、当業者は、ク
ルイベロミセス・ラクティス内のＰＬＡ₂の発現のため
の発現カセットを構成するのに必要なすべての材料を得
ることができる。

【００２４】核酸の単離及び精製、核酸の電気泳動、酵
素修飾、核酸の分割及び／又は増幅、大腸菌の形質転換
など、すべての標準分子クローニング法は、文献に記載
されているように行った（サンブローク（Sambrook）ら
（1989年）『Molecular Cloning: a laboratory manua
l』（Cold Spring Harbour Laboratories, Cold Spring
Harbour, New York; イニス（Innis)ら（編）（1990
年）及び『PCR protocols, a guide to methods and ap
plications』（Academic Press, San Diego)）。オリゴ
−デオキシヌクレオチドの合成及びＤＮＡ配列分析を、
製造者のユーザーマニュアルに従ってアプライド・バイ
オシステム380B DNAシンセサイザー及び373A DNAシーク
エンサー（Applied Biosystems 380B DNA synthesizer
and 373A DNA sequencer）で行った。

【００２５】ｐＫＬＡＰＬＡ−１１の構成を促進するた
めに、第１の適当なフランキング制限部位を複製連鎖反
応（ＰＣＲ）により成熟ＰＬＡｃＤＮＡの境界に導入し
た。５'-境界、即ちプロ- と成熟ＰＬＡ₂タンパク質と
の分割部位、 SmaＩ及び３'-境界、即ち終止コドンの下
流で、 XhoＩ及び KpnＩ制限部位を同時に導入した。そ
うするために、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。

【００２６】

【化２】

【００２７】プライマーとしてオリゴマー１及び２、並
びにテンプレートとしてｐＣＢ０８Ｔを用いて、ＰＣＲ
増幅を行った。得られた増幅化400bp ＰＬＡｃＤＮＡフ
ラグメントを SmaＩ及び KpnＩで切断し、次に分子クロ
ーニングによりｐＴＺ１８Ｒの適当な部位に挿入した。
ＰＣＲ増幅反応及び導入したフランキング制限部位を照
合するために、この修飾化ＰＬＡｃＤＮＡフラグメント
を完全に配列化された。SalＩ制限部位及びＰＬＡ₂の
プレプロシグナル配列の５'-境界での最適イースト翻訳
初期配列を導入するために、２つの相補合成オリゴヌク
レオチドを合成した。

【００２８】

【化３】

【００２９】これら２つのオリゴマーをアニーリングし
た後、得られた二重らせんＤＮＡフラグメントをｐＰＬ
Ａ−１の適当な部位（ SalＩ及び SmaＩ）に分子クロー
ンした。得られたプラスミドは設計したｐＫＬＡＰＬＡ
−５であり、独特な SalＩ制限部位により５'-末端を、
及び XhoＩ制限部位により３'-末端をフランキングした
完全なプレプロＰＬＡ₂ｃＤＮＡを有している。K.lact
isでのブタＰＬＡ₂の発現に対して、K.lactisの強力な
ラクターゼプロモーター（Ｐ_LAC) を用いた。その他
に、K.lactisのラクターゼの製造に対して、このＰ_LAC
プロモーター配列を以前用いて、K.lactisにウシ・キモ
シン（ベルク・ファン・デン（Berg van den J）ら、Bi
o/Technol.８巻、135-139 頁（1990年))及びヒト血清ア
ルブミン（ＨＳＡ）を発現させた。ＨＳＡの発現のため
に、スウィンケルス（Swinkels）ら（1993年)(Antonie
van Leeuwenhoek 64巻、187-201 頁）に既述されるよう
に、プラスミドｐＧＢＨＳＡ−２０を構成した。

【００３０】K.lactisにＨＳＡを発現させるために、ｐ
ＧＢＨＳＡ−２０のＨＳＡｃＤＮＡ配列をK.lactis Ｌ
ＡＣ４プロモーターにより制御する。３'-末端でＨＳＡ
ｃＤＮＡをＬＡＣ４プロモーター配列でフランキングす
る。また、形質転換細胞の選択のため、ｐＧＢＨＳＡ−
２０は、S.cerevisiae ＡＤＨ１プロモーター（ベネッ
ツェン（Bennetzen)及びホール（Hall)(1982年）J. Bio
l.Chem. 257巻、3018-3025 頁）で制御された抗生物質
Ｇ418 に耐性を示すＴｎ５ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子を含んでいる（Geneticin, BRL; ライス（Reiss)ら
（1984年）EMBOJ. ３巻、3317-3322 頁）。ＬＡＣ４プ
ロモーターの独特な SstII部位において、ｐＧＢＨＳＡ
−２０は、E.coliでの増幅に用いられるE.coliベクター
ｐＴＺ１９Ｒを含んでいる。K.lactisの形質転換前にE.
coli ｐＴＺ１９Ｒ配列を、 SstII切断及びアガロース
ゲル精製によりｐＧＢＨＳＡ−２０から除去した。ＬＡ
Ｃ４プロモーターの SstII部位に直線化したｐＧＢＨＳ
Ａ−２０のK.lactisへの形質転換により、同種組換えに
よるゲノムＬＡＣ４プロモーターへの組込みが生じる。

【００３１】K.lactisのブタＰＬＡ₂の発現のために、
ｐＧＢＨＳＡ−２０のK.lactisラクターゼプロモーター
配列にプレプロＰＬＡ₂配列を適当に拡散させる。これ
によるｐＧＢＨＳＡ−２０を SalＩ及び XhoＩで切断
し、ＨＳＡｃＤＮＡ配列を分子クローニングによりｐＫ
ＬＡＰＬＡ−５の SalＩ-XhoＩＤＮＡフラグメントで
置換した。上記のように、このｐＫＬＡＰＬＡ−５の S
alＩ-XhoＩＤＮＡフラグメントは、配列をコードする
プレプロＰＬＡ₂を有する。最終的なＰＬＡ₂発現ベク
ターは、設計したｐＫＬＡＰＬＡ−１１であった。イー
スト形質転換細胞を、我々の公開された特許出願EP-A 0
635 574号に記載されている手順、即ちイトー（Ito
H.）らの方法（J. Bacteriol. 153巻、163-168 頁（19
83年))を基礎としたものにより発生させた。ｐＫＬＡＰ
ＬＡ−１１を、 SstII切断によるＬＡＣ４プロモーター
に直線化した。ｐＴＺ１９ｒ配列をアガロースゲルで分
別及び精製することにより除去した。このＤＮＡフラグ
メント15μｇをK.lactis株ＣＢＳ２３６０及びＣＢＳ６
８３にトランスファーして、30℃で３日間培養後、双方
の株についてＧ418 耐性コロニーを得た。

【００３２】各々の宿主株の限られた数の形質転換細胞
を初期段階で選択して、培養基で活性ブタＰＬＡ₂の発
現を試験した。イースト抽出物１％（w/v)；ペプトン２
％（w/v)；グルコース２％（w/v)及びＧ418 50μｇ／ｍ
ｌを含むK.lactisＹＥＰＤ培養基に形質転換細胞を接種
した。30℃で３日間生長させた後、以下に記載するよう
に、トリプシンでサンプルを処理した後、卵黄活性試験
により、上澄み液を収集して活性ＰＬＡ₂の存在を試験
した。（K.lactis形質転換細胞により製造された）不活
性プロ酵素を活性かつ成熟ＰＬＡ₂に活性化するため
に、プロペプチドの分割が必須である。すべての形質転
換細胞は、５〜40Ｕ／ｍｌの範囲の活性ブタＰＬＡ₂を
製造するようである。１単位（ＩＵ）は、標準条件、即
ち卵黄基質（０．４％リン脂質）、ｐＨ８、40℃、Ｃａ
²⁺６ｍＭの条件下で１分当たりにフリー脂肪酸１ミクロ
モルを製造する酵素量として定義される。

【００３３】

【実施例２】安定な酵素配合物の製造クルイベロミセス・ラクティスの肉汁を限外濾過に続く
濾過物に置いた。限外濾過液を 2.5時間ＣａＣｌ₂10ｍ
Ｍの存在下、ｐＨ８．０でトリプシン０．３％により処
理し、酵素を活性化させるために、プロ酵素のヘプタペ
プチドを除去した。防腐剤として、安息香酸及びソルビ
ン酸をｐＨ４．０で添加し、残存するトリプシン活性を
70℃で30分間不活性化させた。最終生成物は茶色っぽ
く、10.000ＩＵ／ｍｌの活性を含んでいた。この配合物
の安定性は、さらに精製し低温で貯蔵することにより改
良することができる。４℃で１ヵ月間貯蔵後、酵素活性
に損失は観察されなかった。

【００３４】

【実施例３】動物飼料のホスホリパーゼＡ２の適用ホスホリパーゼＡ２の効力の試験をブロイラーで試み
た。１日目〜５日目まで雄のブロイラー（ロス）に標準
の食餌を与えた。５日目に、この群から動物を選択し
て、カゴに分けた。動物の体重及びその多様性を考慮す
る。平均体重及びその偏差は、カゴ毎に同じである。１
５羽を１つのカゴに入れた。人工的に加温、換気及び照
明したブロイラーハウス内の状況下にカゴを置いた。各
カゴの床面積は０．９８ｍ²であり、ワイヤーの床であ
る。ブロイラーハウスを１日24時間照明する。実験の
間、光強度を徐々に減少させる。温度を第１週の28℃か
ら徐々に減少させて、実験の最終週に23℃にする。ブロ
イラー単位の湿度は実験の間およそ60％である。各々１
〜１４日目にスプレー法を用いてニューカッスル病に対
するワクチン予防接種した。実験前期間５日間及び試験
期間28日間からなる33日間、実験を続けた。

【００３５】実験の食餌は動物に自由に与えた。水は自
由に利用できる。飼料は直径３mmの低温のペレット状で
ある（温度は65℃以下に維持する）。実験には、次の処
理を有する。 a)トウモロコシ／小麦／大豆食餌（コントロール） b)トウモロコシ／小麦／大豆食餌＋ 100ＩＵ／ｋｇ c)トウモロコシ／小麦／大豆食餌＋ 500ＩＵ／ｋｇ各処理を、６回繰り返した（１つの処理に延べ90羽であ
った）。増加及び飼料転換を測定した。表１に用いた飼
料の組成を示す。

【００３６】

【表１】表１．ブロイラーに与える実験トウモロコシ／小麦／大豆食餌の組成成分含量（％）トウモロコシ２５．０小麦１５．０大豆油３．５動物性脂肪２．０キャッサバ１１．６８大豆粉（50％粗タンパク質）１９．４５全脂焙煎大豆１０．０魚粉餌１．０肉粉餌タンクかす(meat meal tankage) 高濃度油４．０エンドウ５．０ビタミン／ミネラル・プレミクス１．０石灰石０．８２リン酸モノカルシウム１．００塩（ＮａＣｌ）０．３０ DL−メチオニン０．２５１００．００ＭＥブロイラー（ＭＪ／ｋｇ）１２．５５粗タンパク質（％）２２．１粗脂肪（％）９．６リジン（有効）（％）１．２３（１．０４）メチオニン＋システイン（有効）（％）０．９１（０．７９）

【００３７】酵素を、担体にまず混合することにより、
この食餌に添加した。この結果を表２に示す。

【００３８】

【表２】表２．５日目〜33日目までのブロイラーの生長及び飼料転換比におけるトウモロコシ／小麦／大豆食餌内のホスホリパーゼＡ２の効果摂取飼料量（ｇ）生長（ｇ）飼料転換比基礎となる食餌２６１３１４４５１．８１基礎食餌２５６９１４５８１．７６＋ 100ＩＵ／kg飼料基礎食餌２５２６１４７２１．７２＋ 500ＩＵ／kg飼料

【００３９】上記の実験と本質的に同じであるが、表３
で特定する小麦／ライ麦／大豆食餌を基礎食餌として用
いる第２の実験を行った。実験は次の処理を有してい
る。 a)小麦／ライ麦／大豆食餌（コントロール） b)小麦／ライ麦／大豆食餌＋ 100ＩＵ／ｋｇ c)小麦／ライ麦／大豆食餌＋ 500ＩＵ／ｋｇ d)小麦／ライ麦／大豆食餌＋1000ＩＵ／ｋｇ他のすべてのパラメータは、トウモロコシ／小麦／大豆
実験について上記したのと同じにした。

【００４０】

【表３】表３．ブロイラーに与える実験小麦／ライ麦／大豆食餌の組成成分含量（％）小麦４０．０ライ麦１０．０大豆油１．０動物性脂肪６．０キャッサバ４．２８大豆粗挽粉（45.4％粗タンパク質）２２．０全脂焙煎大豆１０．０肉粉餌タンクかす（58粗タンパク質）３．０ビタミン／ミネラル・プレミクス１．０石灰石０．９４リン酸カルシウム１．２０塩（ＮａＣｌ）０．２６ L-リジンHCl ０．１１ DL−メチオニン０．２１１００．００ＭＥブロイラー（ＭＪ／ｋｇ）１１．９粗タンパク質（％）２１．４粗脂肪（％）１０．５リジン（有効）（％）１．２３（１．０５）メチオニン＋システイン（有効）（％）０．９０（０．７７）

【００４１】酵素を、担体にまず混合することにより、
この食餌に添加した。この結果を表４に示す。

【００４２】

【表４】表４．５日目〜33日目までのブロイラーの生長及び飼料転換比における小麦／ライ麦／大豆食餌内のホスホリパーゼＡ２の効果摂取飼料量（ｇ）生長（ｇ）飼料転換比基礎となる食餌２７５２１５５６１．７７基礎食餌２７４７１５６８１．７５＋ 100ＩＵ／kg飼料基礎食餌２７３３１５８６１．７２＋ 500ＩＵ／kg飼料基礎食餌２７２４１５７２１．７３＋1000ＩＵ／kg飼料

【００４３】表４に示されるように、この特定のブロイ
ラー食餌に用いられるホスホリパーゼ濃度の範囲に最適
値がある。即ち約 100ＩＵ／kg飼料より多く、約1000Ｉ
Ｕ／kg飼料未満である。他のシステムについても異なる
最適値が存在し、通常の実験で決定できる。

【００４４】

【実施例４】ミルク代替品中のホスホリパーゼＡ２の応用雄フリージァン・ダッチ・ホルスタイン、即ちフリージ
ァン牛を各５頭有する３グループを用いて、実験を行っ
た。実験前の期間、市販のミルク代替品を飲ませてい
た。14日後、３つの処理をするために、体重及び体重の
変化を考慮して牛を分けた。牛を各々のボックスにいれ
た。安定状態は、自然に照明し、換気し、温度を約18℃
に維持した。14日間、この食餌を与えた。次に、１日に
24時間につき、５日間連続して糞を定量的に収集した。
実験期間の前に、牛に引き具を付けた。引き具を付けた
プラスチックバッグに糞を収集した。１日に１回、糞の
重さを計り、−20℃でプールし貯蔵した。分析前に、糞
を全部混合し、サブサンプルとした。その体重により個
々に次の飼料スキームで動物に餌を与えた。用いたミル
ク代替品は次の組成を有する。

【００４５】スキム・ミルク粉５８．５％脂肪１９．８％ラクトース１７．６％スターチ、ビタミン、ミネラル４．１％ＭＥ４４５０kcal／kg 粗タンパク質（Ｎ^*６．２５）２１．５％粗脂肪１９．５％

【００４６】餌を与える前にミルク代替品粉を水と混合
し、温度約40℃で与える。処理により、脂肪は、牛脂18
％、ココナッツ脂肪又はラードからなる。レシチンを脂
肪含量の10％の濃度で添加する。ブタ・ホスホリパーゼ
Ａ２を、ミルク代替品の 500ＩＵ／kgの最終濃度で、こ
れらの食餌に添加した。脂肪の消化性を測定した。結果
を表５に示す。

【００４７】

【表５】表５．食餌中に脂肪18％及びレシチン1.8 ％
（脂肪の10％）が入っている、非反芻幼獣による種々の
脂肪の消化性についてのホスホリパーゼＡ２処理の効
果。実施例２で示すようにホスホリパーゼを調製し、ミ
ルク代替品に 500ＩＵ／kgの最終濃度で添加した。ホスホリパーゼＡ２なしホスホリパーゼＡ２あり牛脂７０．０％７３．１％ココナッツ脂肪９５．６％９６．２％ラード７９．４％８４．３％

【００４８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 TGTCATGCCC GGGCATTATG GCAGTTTCGT 30

【００４９】配列番号：２配列の長さ：３９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｙｅｓ配列 AGTCCTCGGT ACCTCGAGTC AGCAGTACTT CTTGGTGTC 39

【００５０】配列番号：３配列の長さ：７３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列 TCGACAAAAA TGAAATTCCT CGTGTTGGCT GTTCTGCTCA CAGTGGGCGC TGCCCAGGAA 60 GGCATCAGCT CAA 73

【００５１】配列番号：４配列の長さ：６９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｙｅｓ配列 TTGAGCTGAT GCCTTCCTGG GCAGCGCCCA CTGTGAGCAG AACAGCCAAC ACGAGGAATT 60 TCATTTTTG 69

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】飼料物質を含有する組成物と使用準備ホ
スホリパーゼ添加剤とを含有する食餌を動物に与える飼
料利用効率の改良方法。
【請求項２】飼料物質を含有する組成物と使用準備ホ
スホリパーゼ添加剤を含有する食餌を動物に与える動物
の生長促進方法。
【請求項３】飼料物質及び使用準備ホスホリパーゼ添
加剤を含有する飼料利用効率を改良している動物飼料組
成物。
【請求項４】飼料物質及び使用準備ホスホリパーゼ添
加剤を含有する生長を促進させる動物飼料組成物。
【請求項５】リン脂質を含有する請求項３又は請求項
４記載の組成物。
【請求項６】リン脂質がレシチンを含有する請求項５
記載の組成物。
【請求項７】ホスホリパーゼがホ乳類、植物又は微生
物から得られる請求項３〜請求項６のいずれか１項記載
の組成物。
【請求項８】ホスホリパーゼが、ウシ、ブタ、マウ
ス、ラット及びヒトホスホリパーゼＡ２を有する群から
選ばれるホ乳類ホスホリパーゼＡ２である請求項７記載
の組成物。
【請求項９】ホスホリパーゼが、宿主生物内の組換え
ＤＮＡの発現により得られる請求項３〜請求項８のいず
れか１項記載の組成物。
【請求項１０】宿主生物が、バクテリア、イースト及
び糸状菌類を含有する群から選ばれる微生物である請求
項９記載の組成物。
【請求項１１】微生物が、バチルス、エシェリキア、
サッカロミセス、クルイベロミセス、ハンセニューラ、
ピキア、ヤロウィア、カンジダ、アスペルギルス、トリ
コデルマ、ペニシリウム、ケカビ、フザリウム及びヒュ
ーミコラから選ばれる属である請求項10記載の組成物。
【請求項１２】微生物が、エシェリキア・コリ（大腸
菌）、サッカロミセス・セレビジエ、クルイベロミセス
・ラクティス又はアスペルギルス・ニゲルである請求項
11記載の組成物。
【請求項１３】トランスジェニック植物から得られる
ホスホリパーゼを含む植物材料を含有する請求項３〜請
求項９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】組換ＤＮＡの発現により得られるホス
ホリパーゼを含むトランスジェニック植物の種子を含有
する請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】リン脂質１kg当たりホスホリパーゼを
1,000 〜5,000,000国際単位で含有する請求項５〜請求
項１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】ホスホリパーゼ添加剤が、飼料１kg当
たり約 100〜1000国際単位の範囲の濃度で存在する請求
項３〜請求項１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】ホスホリパーゼを飼料物質に混合する
工程を有する請求項３〜請求項１６のいずれか１項記載
の動物飼料を製造する方法。
【請求項１８】ホスホリパーゼを飼料物質及び少なく
とも１つのリン脂質と混合する工程を有する請求項５〜
請求項１６のいずれか１項記載の動物飼料を製造する方
法。
【請求項１９】ホスホリパーゼが、組換えにより製造
される請求項１７又は請求項１８記載の方法。
【請求項２０】ホスホリパーゼをトランスジェニック
植物材料の形態で添加する請求項１９記載の方法。
【請求項２１】ホスホリパーゼが入手できるようにト
ランスジェニック植物材料を処理する請求項２０記載の
方法。
【請求項２２】組換ホスホリパーゼを製造することが
できる、トランスジェニック植物から得られる種子。
【請求項２３】組換ホスホリパーゼを製造することが
できる、トランスジェニック植物から得られる植物材
料。
【請求項２４】非反芻動物に与える、飼料物質及びホ
スホリパーゼ添加剤を含有する組成物の使用。
【請求項２５】非反芻幼獣に与える、飼料物質及びホ
スホリパーゼ添加剤を含有する組成物の使用。