CZ293968B6 - Složený biomateriál pro zabránění chirurgických adhezí tkáněŹ jeho použití a způsob - Google Patents

Abstract

Nové biomateriály v podstatě tvořené esterifikovanými deriváty kyseliny hyaluronové nebo zesítěnými deriváty kyseliny hyaluronové pro použití v odvětví chirurgieŹ obzvláště pro použití v prevenci pooperačních adhezí@ Dále způsob zabránění pooperačních adhezí tkání za použití těchto nových biomateriálůŕ

Description

Složený biomateriál pro zabránění chirurgických adhezí tkáně, jeho použití a způsob

Oblast techniky

Tato technika se zabývá novými biomateriály, v podstatě tvořenými esterifíkovanými deriváty kyseliny hyaluronové nebo zesítěnými deriváty kyseliny hyaluronové pro užití v chirurgickém odvětví, zvláště pro použití v prevenci pooperačních adhezí tkání.

Dosavadní stav techniky

Tvorba pooperačních adhezí je běžnou komplikací v břišní nebo pánevní chirurgii, což může vést ke značné nemocnosti. Rozvoj adhezí může být ovlivněn mnoha faktory: mechanickým traumatem chemikáliemi, vyschnutím serózní blány v kombinaci s krví, ischemií, infekcí a cizím materiálem - o tom všem je známo, že to přispívá ke zvýšené tvorbě adhezí. Dalšími příčinami jsou nitrobřišní záněty a vrozené abnormality. Patofyziologický mechanismus zůstává ještě nejasný, ale byla naznačena společná centrální dráha, v níž hraje důležitou roli fibrinolýza.

Chirurgické poranění tkáně je příčinou uvolnění výpotku, obsahujícího tekutinu a krev. Tento výpotek tvoří fíbrinový most, jenž přetrvává několik dní, během nichž dochází k buněčnému růstu. Není-li výpotek v tomto období absorbován nebo lyžován, stává se z něj vrostlá vazivová buňka a následné ukládání kolagenu vede ke vzniku trvalé jizvy, spojující dva přilehlé povrchy, a této jizvě se říká srůst (adheze). Je možno učinit závěr, že tvorba adhezí bude pravděpodobně výsledkem zánětlivé odezvy.

V tomto posledně jmenovaném případě se výzkum zaměřil na hledání bioabsorbovatelných materiálů s krátkým obdobím přetrvávání in vivo, které by fungovaly jako bariéry proti tvorbě adhezí, dokud nezačne hojení; zamezilo by se tak problémům zaviněným neabsorbovatelnými materiály (infekce, zvápenatění implantátů, tvorba jizev atd.).

Jedním zvlášť slibným polymerem je kyselina hyaluronová (HA = hyaluronic acid), složka mimobuněčné hmoty, nacházející se všude v lidském těle. Ukázalo se, že roztoky kyseliny hyaluronové redukovaly pooperační tvorbu adhezí po operacích břišních (Urman, B. et al.: Effect of Hyaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhesions Formation in the Rat Model: Fertil. Steril. 1991, 56: 563; Shushan, A. et al.: Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative - Intraperitoneal Adhesions: J. Reprod. Med. 1994: 39: 398) a ortopedických (Hagberg L., Gerdin, B.: Sodium Hyaluronate as an Adjunctive in Adhesion Prevention After Flexor Tendon Surgery in Rabbits; J. Hand. Surg. 1992; 17 A: 935).

Fidia Advanced Biopolymers vyvinuli chemické deriváty kyseliny hyaluronové, tj. vnitřní estery (řada ACP) a estery s neaktivními alkoholy (řada HYAFF) (Rastrelli, A., et al.: Hyaluronic Acid Esters, a New Class of Semisynthetic Biopolymers: Chemical and Physico-chemical Properties, Clinical Implant Materials, Advanced in Biomaterials, G. Heinrike, V. Sollz and AJC Lee (Eds), Elsevier, Amsterdam 1990; 9: 199 - 205), které vykazují fyzikálně chemické vlastnosti, odlišné od vlastní kyseliny hyaluronové (tj. delší dobu přetrvávání a možnost opracování k výrobě pomůcek), ale mají toleranční a biokompatibilní vlastnosti, typické pro původní biologický polymer. Kromě toho jsou tyto deriváty charakterizovány z hlediska chemického a toxikologického.

Cílem této techniky byl vývoj řady gelu ACP, který se zkoušel za účelem zhodnocení účinků tohoto gelu v prevenci adhezí.

Vznik adherencí nebo fibrózních hmot, které se tvoří mezi sousedními tkáněmi, postiženými poraněním nebo pooperační ischemií, je stále ještě jednou z nejzávažnějších komplikací mnoha

- 1 CZ 293968 B6 chirurgických postupů. K tomu, aby bylo možno se této komplikaci vyhnout, bylo navrženo velké množství metod, ale problém zůstal v podstatě nevyřešen.

Jednou z navrhovaných metod bylo použití suspenzí dextranu (di Zerega G. S., Contemporary 5 Adhesion Prevention, Fertility and Sterility, Vol. 61, No. 2, February '94), injekčně vpravených do peritoneální dutiny po chirurgickém výkonu. Klinické výsledky použití takovýchto roztoků dextranu byly většinou sporné. Navíc bylo použití roztoků dextranu provázeno častými komplikacemi - otoky, bolestmi v břiše, dusností.

Bylo též navrhováno, aby se mezi poranění orgány umístily bariéry ve formě definovaných struktur (síťoviny, membrány) (di Zerega G. S., Contemporary Adhesion Prevention, Fertility and Sterility, Vol. 61, No. 2. February '94), nebo viskózní gely (Genzyme, patent US 4 937 20 patent US 5 017 229).

Ukázalo se však, že obecně jsou tyto bariéry neúčinné, protože vyvolávaly ischemie či zánětlivé reakce v důsledku přítomnosti cizích těles. Jediné materiály, schválené v současnosti pro klinické používání, jsou bariéry založené na okysličené regenerované celulóze (Interceed®) a bariéry založené na lehčeném polytetrafluorethylenu (e-PTFE) (Goretex patent US 4 478 665 a patent US 4 482 516) nebo polyethylenu či polypropylenu.

Navíc k faktu, že klinická zkoumání účinnosti takovýchto bariér dávají vysoce rozporné výsledky, je nutno si též povšimnout, že oba zmíněné materiály jsou doprovázeny značnými kontraindikacemi. Užití bariérových membrán z e-PTFE nebo polyethylenu či polypropylenu znamená implantaci syntetického materiálu, který je lidskému tělu cizí a není biodegradabilní 25 a který může vyžadovat druhou chirurgickou operaci, a to k odstranění či repozici bariérové membrány kvůli reakcím zánětlivého typu.

V preklinických a klinických modelech se ukázalo, že síťoviny, založené na okysličené regenerované celulóze jsou účinné v prevenci tvorby adhezí, ale pouze tehdy, předchází-li jejich aplikaci důkladné zastavení krvácení.

V prevenci adhezí bylo proto navrženo použití viskózních roztoků kyseliny hyaluronové (HA) o vysoké molekulové hmotnosti jakožto pomocného prostředku prevence adhezí (Grainger, D. A., et al.: The Use of Hyaluronic Acid Polymers to Reduce Postoperative Adhesions; J. of

Gynecol. Surg., Vol. 7, No. 2, 1991; Human, B. et al.: Effect of Hyaluronic Acid on

Postoperative Intraperitoneal Adhesion Formation in the Rat Model, Fertility and Sterility, Vol. 56, No. 3, September 1991; Shushan, A., et al.: Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative Intraperitoneal Adhesions, J. of Reproductive Med., Vol. 39, No. 5, May 1994; Mitchel, J. D., et al.: Reduction in Experimental Pericardial Adhesions Using a Hyaluronic Acid 40 Bioabsorbable Membrane, Eur. J. Cardio-thorac. Surg., 8,149 - 152, 1994).

Avšak kyselina hyaluronová jako taková je charakterizována velmi rychlým absorpčním časem, který je inkompatibilní s časem přetrvávání, nutným pro prevenci adhezí. Nadto přírodní kyselina hyaluronová nemůže být zpracovávána a jako taková transformována do formy biomateriálu. 45 Aby se prodloužil její čas odbourávání a umožnilo se její zpracování do různých fyzických forem pro použití v různých odvětvích chirurgie, byly vyvinuty estery kyseliny hyaluronové a zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové. Příprava esterů kyseliny hyaluronové, kde všechny karboxylové skupiny nebo část karboxylových skupin jsou esterifikovány, příprava zesítěných derivátů kyseliny hyaluronové, kde část karboxyskupin projde zesítěním, a jejich využití v odvětvích 50 farmacie, kosmetiky a chirurgie a v odvětvích biodegradabilních plastických hmot, jsou popsány v amerických patentech US 4 851 521 a 4 956 353 a EP 0 216 453 a EP 0 341 745.

-2CZ 293968 B6

Podstata vynálezu

Současný vynález poskytuje biomateriály pro využití ve způsobu prevence pooperačních adhezí tkáně. Biomateriály jsou tvořeny benzylestery kyseliny hyaluronové a/nebo vnitřně zesítěnými deriváty kyseliny hyaluronové a mohou se nacházet ve formě gelů, membrán, tkanin nebo síťovin a netkaných látek.

Současný vynález tudíž popisuje přípravu zdravotnických a chirurgických předmětů založených na benzylesteru kyseliny hyaluronové nebo na zesítěných derivátech kyseliny hyaluronové, užívaných jednotlivě nebo ve směsi jednoho s druhým, charakterizovaných vysokou biokompatibilitou a převoditelných do fyzických forem, což je činí vhodnými pro různá použití v chirurgii včetně chirurgie laparoskopické. Materiály jsou také kompletně biodegradabilní a nepotřebují odstraňování z místa aplikace, není proto nutná druhá chirurgická operace. Jsou-li připraveny ve formě gelu, zesítěné deriváty představují materiály se značně větší viskozitou než nemodifikovaný polymer a s variabilními dobami odbourávání. Nadto, jak materiály založené na benzylesterech, tak materiály založené na zesítěných derivátech podle předloženého vynálezu mohou být ve formě membrán, tkanin nebo síťovin a netkaných látek (připravených podle postupů, které jsou samy o sobě popsány v US 4 851 521, US 4 956 353, WO 93/11803, WO 94/17837 a EP 0 341 745) a jsou charakterizovány následujícími technickými specifikacemi:

- tloušťka membrán se pohybuje mezi 10 mikrometry a 1,5 mm, obzvláště 20 až 50 pm;

- tloušťka tkanin nebo síťovin se pohybuje mezi 200 pm a 1,5 mm

- netkané látky jsou v podstatě charakterizovány plošnou hmotností, která se pohybuje mezi 20 g/m² a 500 g/m² a tloušťkou mezi 0,2 mm a 5 mm, obzvláště méně než 1 mm.

Tyto materiály mohou být použity jednotlivě nebo spolu nebo ve spojení s jinými materiály tvořenými syntetickými polymery (např. gely založené na zesítěné kyselině hyaluronové + polypropylenu, nebo membrány v podstatě tvořené esterifikovanými deriváty HA + polypropylenem nebo membrány tvořené esterifikovanými deriváty HA, potažené gelem zautozesítěné HA).

Současný vynález se také týká použití složených materiálů ve formě gelů (pro zesítěné deriváty), membrán, tkanin a netkaných látek, sestávajících v podstatě z benzylesterů nebo zesítěných derivátů kyseliny hyaluronové ve spojení s nebiodegradabilními materiály ve formě síťovin nebo membrán nebo netkaných látek jako je e-PTFE, polyethylen, polypropylen, polyester (Dacron). Současný vynález se tudíž týká nové třídy zdravotnických a chirurgických předmětů pro použití v odvětví chirurgie k prevenci tvorby pooperačních adhezí.

Stručný popis nákresů

Diagramy 1 - 10 jsou grafy výsledků studií adhezí na zvířecích krysích modelech.

Materiály

Jak je zmíněno výše, současný vynález je charakterizován materiály tvořenými deriváty kyseliny hyaluronové, zvláště benzylesterovými deriváty a vnitřně zesítěnými deriváty.

Termín „kyselina hyaluronová“ (dále zde též uváděna jako „HA“) je v literatuře používán k označení kyselého polysacharidu o různých molekulových hmotnostech tvořených zbytky kyseliny D-glukuronové a A-acetyl-D-glukosaminu, který se přirozeně vyskytuje (myšlen polysacharid, nikoliv glukosamin - pozn. překl.) v povrchu buněk, v základních mimobuněčných substancích pojivových tkání obratlovců, v očním sklivci, ve tkáni lidské pupeční šňůry a v kohoutích hřebenech. Kyselina hyaluronová hraje důležitou úlohu v biologickém organizmu, především jako mechanická opora buněk mnoha tkání jako kůže, šlach, svalů a chrupavek a je tudíž hlavní složkou mimobuněčné hmoty. Ale kyselina hyaluronová plní také další funkce

-3 CZ 293968 B6 v biologických procesech, jakými jsou např. hydratace tkání, zajištění hladkého pohybu, buněčná migrace, funkce buňky a diferenciace (Viz například, A. Balasz et al., Cosmetics & Toiletries, No. 5/84, str. 8-17). Kyselina hyaluronová může být extrahována zvýše zmíněných přírodních tkání, jako např. jsou kohoutí hřebeny, nebo také z určitých bakterií. Dnes může být kyselina hyaluronová připravována též mikrobiologickými metodami. Molekulová hmotnost čisté kyseliny hyaluronové získané extrakcí se pohybuje v oblasti 8 až 13 miliónů. Avšak molekulární řetězec polysacharidu může být celkem snadno odbouráván vlivem různých fyzikálních a chemických faktorů, jako jsou vlivy mechanické, či pod vlivem radiace, hydrolýzy, oxidačních činidel či enzymů. Proto se často při obyčejných purifíkačních procedurách originálních extraktů získávají odbourané frakce o nižší molekulové váze. (Viz Balasz et al., výše zmíněný text). Kyselina hyaluronová, její molekulární frakce a příslušné soli jsou užívány jako léčiva a jejich používání se navrhuje také v kosmetice (viz např. zmíněný článek od Balasze & spol. a francouzský patent 247 84 68).

Třebaže je termín „kyselina hyaluronová“ běžně užíván v nevhodném smyslu, protože znamená, jak je vidět z výše uvedených textů, celou řadu polysacharidů se střídáním zbytků kyseliny D-glukuronové a TV-acetyl-D glukosaminu s měnícími se molekulovými hmotnostmi či dokonce odbourané frakce téhož, a třebaže se může plurál „kyseliny hyaluronové“ zdát příhodnější, diskuse bude pokračovat s použitím formy singuláru ve vztahu ke kyselině hyaluronové v jejich různých formách včetně jejich molekulárních frakcí, a zkratka „HA“ bude také často používána k popisu tohoto kolektivního termínu.

Benzylesterové deriváty

První vybraný materiál vynálezu je založen na benzylesteru kyseliny hyaluronové, zvláště na 80 až 100% esterech, kde 80 až 100 % karboxylových skupin je esterifíkováno. Ty benzylestery, kde je esterifíkováno 80 až 99 % karboxylových skupin HA benzylovou skupinou, jsou uváděny jako „parciální estery“, protože jen část karboxylových skupin je esterifikována a zbylé karboxylové skupiny jsou buď volné, či tvoří sůl se zásadou nebo s kovem alkalických zemin, jako je sodík, vápník nebo draslík. Nejlepšími pro biomateriály této techniky jsou tzv. „úplné“ benzylestery, kde jsou esterifíkovány všechny karboxyskupiny HA. U těchto úplných esterů mohou být všechny karboxyskupiny HA esterifíkovány benzylovou skupinou (uváděné též jako HYAFF 11), nebo část (75 až 99 %) může být esterifikována benzylovou skupinou a všechny zbývající karboxylové skupiny jsou esterifíkovány lipidovým řetězcem / alkylovým zbytkem z alifatického alkoholu Cio_2o a tím se dostane to, co může být uváděno jako „smíšené“ estery. Z těchto alifatických alkoholů je nejlepší palmitický alkohol (Ci6-hexadecyl) a stearylalkohol (Cio octadecyl). Tyto smíšené deriváty se mohou vyskytovat rovněž ve formě parciálních esterů, to jest derivátů, kde část (75 až 99 %) karboxylových skupin je esterifikována benzylovou skupinou a některé, ale ne všechny ze zbývajících karboxylových skupin jsou esterifíkovány alifatickým alkoholem Ci₀-C₂₀. Z nich jsou nejlepší ty, které jsou esterifíkovány benzylem (nejméně 75 %) a nejméně z 5 % jsou esterifíkovány alifatickým alkoholem Cio-C_2o.

Benzylestery kyseliny hyaluronové podle této techniky mohou být připravovány metodami, známými samy o sobě z esterifíkací karboxylových kyselin, například úpravou volné kyseliny hyaluronové alkoholem (benzyl a/nebo Cio-C₂o alkohol) v přítomnosti katalyzátorů, jako jsou silné anorganické kyseliny nebo iontoměniče kyselinového typu, nebo etherifikující reagens, schopné zavést požadovaný alkoholický zbytek v přítomnosti anorganických nebo organických zásad.

Benzylestery kyseliny hyaluronové však mohou být výhodně připraveny podle zvláštní metody popsané vEP 216 453. Tato metoda sestává z úpravy kvartérní amonné soli kyseliny hyaluronové etherifíkujícím činidlem, nejlépe v aprotickém organickém rozpouštědle.

Pro přípravu benzylesterů je možno použít kyseliny hyaluronové jakéhokoliv původu, jako například kyseliny, extrahované zvýše zmíněných přírodních výchozích materiálů, například

-4CZ 293968 B6 z kohoutích hřebenů. Příprava takovýchto kyselin je popsána v literatuře: přednostně jsou používány purifikované hyaluronové kyseliny. Podle této techniky jsou obzvláště používány kyseliny obsahující molekulární frakce celých kyselin, získané přímo extrakcí organických materiálů s molekulovými hmotnostmi, pohybujícími se v širokém rozpětí, například od asi 90 % až 80 % (Μ = 11,7 - 10,4 milionů) od 0,2 % (M = 30 000) molekulové hmotnosti celé kyseliny o molekulové váze 13 milionů, nejlépe mezi 5 % a 0,2 %. Takové frakce mohou být získány různými postupy, popsanými v literatuře, například hydrolyzováním, oxidováním, enzymatickými či fyzikálními procedurami, jako jsou například procedury mechanické nebo radiační. Prvotní extrakty jsou tudíž často tvořeny během těchto stejných purifíkačních procedur (viz například článek od Balasze a spol., citovaný výše v „Cosmetics & Toiletries“). Separace apurifikace získaných molekulárních frakcí jsou prováděny známými technikami, například molekulární filtrací. Jednou frakcí purifikované HA vhodné pro použití podle této techniky je například ta, která je známa jako „nezánětlivý -NIF-NaHA hyaluronát sodný“ popsaný Balazsem v příručce „Healon - směrnice k jeho použití“ v Ophtalmic Surgery, D. Miller a R. Stegmann, eds. John Wiley and Sons, N. Y., 81983: str. 5.

Jakožto výchozí materiály pro benzylester jsou obzvlášť důležité dvě purifikované frakce, které lze získat z kyseliny hyaluronové, například té, extrahované z kohoutích hřebenů, známé jako „Hyalastin“ a „Hyalectin“. Frakce Hyalastin má průměrnou molekulovou hmotnost asi mezi 500 000 a 730 000. Kombinovaná frakce těchto dvou frakcí byla izolována také a byla charakterizována jakožto frakce o průměrné molekulové hmotnosti asi od 250 000 do asi 350 000. Tato kombinovaná frakce může být získána s výtěžkem 80 % úplné kyseliny hyaluronové, dostupné v tomto speciálním výchozím materiálu, zatímco frakce Hyalectin může být získána s výtěžkem 30 % a frakce Hyalastin s výtěžkem 50 % počáteční HA. Příprava těchto frakcí je popsána v EP 0 138 572.

Následující příklady popisují přípravu benzylesterů HA.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava benzylesterů kyseliny hyaluronové (HA).

12,4 g tetrabutylamoniové soli HA o molekulové hmotnosti 170 000 odpovídající 20 mval monomerické jednotky se rozpustí v 620 ml dimethylsulfoxidu pří 25 stupních, přidá se 4,5 g (25 mval) benzylbromidu a 0,2 tetrabutylamoniumjodidu a roztok se uchová 12 hodin při 30 °C. Výsledná směs se opatrně vlije do 3.500 ml ethylacetátu, za stálého promíchávání. Utvoří se precipitát, který se zfiltruje a čtyřikrát promyje 500 ml ethylacetátu a nakonec se suší ve vakuu dvacet čtyři hodiny při 30 °C. Získá se 9 g jmenovaného benzylesterového produktu. Kvantitativní určení esterových skupin se provádí podle metody popsané na str. 169- 172 práce S. Siggia a J. G. Hanna „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“ - 4. vydání, John Wiley and Sons.

Příklad 2: Příprava benzylesterů kyseliny hyaluronové (HA) g draselné soli HA o molekulové hmotnosti 162 000 se suspenduje ve 200 ml dimethylsulfoxidu; přidá se 120 mg tetrabutylamoniumjodidu a 2,4 g benzylbromidu.

Suspenze se neustále promíchává 48 g při 30 °C. Výsledná směs se pomalu vlije do 1000 ml ethylacetátu za stálého promíchávání. Utvoří se precipitát, který se zfiltruje a čtyřikrát se promyje 150 ml ethylacetátu a nakonec se suší ve vakuu dvacet čtyři hodiny při 30 °C. Získá se 3,1 g jmenovaného benzylesterů. Kvantitativní určení esterových skupin se provádí podle metody

-5CZ 293968 B6 popsané na str. 169 - 172 práce S. Siggia a J. G. Hanna „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons.

Příklad 3: Příprava derivátu kyseliny hyaluronové, kde 75 % jejích reaktivních skupin je esterifikováno benzylalkoholem a zbylých 25 % je esterifikováno oktadecylovým alkoholem (stearyl alkohol, CH₃-(CH₂)₁₆-CH₂-OH)

6,21 g tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 180 000 (10 mval) se rozpustí v 248 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) při pokojové teplotě. K roztoku se přidá 0,89 ml benzylbromidu (7,5 mval) a roztok se nechá stát 12 hodin při 30 °C. Pak se roztok zchladí na pokojovou teplotu a přidá se k němu 0,83 g oktadecylbromidu (2,5 mval). Roztok se zahřívá na 30 °C po 24 hodin. Pak se přidá 2,5% hmotn. roztok NaCl ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonu a přitom se míchá. Utvoří se precipitát, který se zfíltruje a promyje třikrát jedním stem ml směsi aceton/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a pak se suší ve vysokém vakuu 24 hodin při 30 °C. Takto se získá 5,1 gramů požadovaného produktu. Kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu a hexadecylalkoholu se provádí plynovou chromatografií, která následuje po alkalické hydrolýze. Celkový obsah esterových skupin se určuje kvantitativně podle saponifikační metody popsané na str. 169 - 172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“ - 4. vydání, John Wiley and Sons Publication.

Příklad 4: Příprava derivátu kyseliny hyaluronové, kde je 75 % jejích karboxylových reaktivních skupin esterifikováno benzylalkoholem a zbývajících 25 % je esterifikováno hexadecylalkoholem (Cetyl Palmityl alkohol, CH₃-(CH₂)i4-CH₂-OH)

6,21 g tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 180 000 (10 mval) se rozpustí v 248 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) při pokojové teplotě.

K tomuto roztoku se přidá 0,89 ml benzylbromidu (7,5 mval) a roztok se nechá stát 12 hodin při 30 °C. Pak se roztok zchladí na pokojovou teplotu a přidá se kněmu 0,76 g hexadecylbromidu (2,5 mval). Roztok se zahřívá na 30 °C po 24 hodin. Pak se přidá 2,5% (hmotnostní) roztok NaCl ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonu a přitom se míchá. Utvoří se precipitát, který se zfíltruje a třikrát se promývá 100 ml směsi aceton/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a pak se suší ve vysokém vakuu 24 hodin při 30 °C. Takto se získá pět gramů požadovaného produktu. Kvantitativní stanovení obsahu benzylalkoholu a hexadecylalkoholu se provádí plynovou chromatografií, která následuje po alkalické hydrolýze. Celkový obsah esterových skupin je kvantifikován podle saponifíkační metody popsané na str. 169-172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication).

2. Vnitřně zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové

Zesítěné deriváty kyseliny hyaluronové, užité v materiálech předkládaného vynálezu, jsou popsány vEP 0 341 745. Tyto zesítěné deriváty jsou vnitřní a/nebo intramolekulámí estery kyseliny hyaluronové, kde část karboxyskupin je esterifíkována hydroxylovými skupinami téže molekuly a/nebo různými molekulami kyseliny hyaluronové, kdy se tvoří laktonové nebo intermolekulámí esterové vazby. Tyto „vnitřní“ estery, kde nedochází k žádanému zásahu OH skupin jiných alkoholů, mohou být také definovány jako „autozesítěná kyselina hyaluronová“, jelikož tvorba mono- nebo polymolekulámího síťování je důsledek výše zmíněné vnitřní esterifikace. Adjektivum „zesítěné se vztahuje ke křížovým spojům mezi karboxyly a hydroxyly molekul kyseliny hyaluronové.

Autozesítěné produkty jsou zvláště parciální vnitřní estery, kde procento „síťování“ se pohybuje zejména mezi 0,5 až 20 %, obzvláště 4,5/5,0 % počtu karboxyskupin v kyselině hyaluronové. V procesu přípravy jsou karboxyskupiny HA molekuly aktivovány přidáním substancí,

-6CZ 293968 B6 schopných takovouto aktivaci navodit. Nestabilní meziprodukty získané z aktivační reakce se spontánně oddělí, buď po přidání katalyzátoru, a/nebo poté, kdy je zvýšena teplota, a tvoří výše zmíněné vnitřní esterové vazby s hydroxyly téže molekuly nebo jiných molekul kyseliny hyaluronové. Podle stupně požadované vnitřní esterifíkace jsou aktivovány buď všechny, nebo alikvotní část karboxyreaktivních skupin (alikvotní část se získá použitím nadbytku aktivačních substancí nebo vhodnými metodami dávkování).

Karboxyskupiny, které mají být přetvořeny na vnitřní esterové skupiny, mohou být aktivovány počínaje kyselinou hyaluronovou, obsahující volné karboxyskupiny, nebo, ještě lépe, kyselinou hyaluronovou, obsahující karboxyskupiny tvořící soli, například soli kovů, nejlépe alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, a především s kvartémími amonnými solemi, jako jsou ty, popsané dále. Jako výchozí substance však mohou být použity také soli s organickou bází, jako jsou aminy.

Metody pro aktivaci karboxyskupin volných i tvořících soli jsou samy o sobě známy, obzvláště na poli syntézy peptidů, a ti, kdož jsou v této problematice zběhlí, mohou snadno určit, která z metod je nej vhodnější, obzvláště zda užít či neužít výchozí substance v jejich formě volné či tvořící soli. Aktivační metody známé samy o sobě pro postupy peptidové syntézy a užitečné v přípravných postupech tohoto vynálezu jsou popsány například v práci M. Bodanszkého „In search of new methods in peptide synthesis“, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449-474; aE. Grosse et al., „The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology“, Academie Press, lne., 1979, Vol. 1, Chapter 2. Podle takovýchto procedur je aktivována karboxylová složka, to jest, karboxylová složka je převedena do reaktivní formy. Takováto aktivace typicky zahrnuje reakci mezi kyselinou a aktivační látkou podle schématu:

O

I

R - COOH ->R - C - X kde X je polovina, která odebírá elektron. Většina aktivovaných derivátů karboxylových kyselin jsou tudíž smíšené anhydridy včetně, v Širším smyslu, také kyselých azidů a kyselých chloridů, které mohou být považovány za snížené anhydridy azoimidu a HC1 za aktivační látku. Navíc, aktivace karboxylové složky může být doprovázena tvorbou meziproduktů - „aktivovaných esterů: Tyto „aktivované estery“ mohou být různých typů, ale obzvláště užitečné „aktivované estery“ jsou ty, které jsou připraveny použitím dicyklohexylkarbodiimidu, p-nitrofenylesterů, trichíorfenylesterů, pentachlorfenylesterů a O-acylderivátů hydroxylaminů, zvláště esterů jV-hydroxysukcinimidu.

Všechny tyto různé typy aktivačních procedur jsou užitečné v přípravě zesítěné HA vynálezu, jelikož všechny tyto procedury mohou být charakterizovány jako postupy, které důležitou měrou zahrnují reakci karboxylové skupiny s aktivačním činidlem, což v podstatě vede k tvorbě substituční skupiny, snadno schopné reakce s hydroxylovou skupinou, tak, aby se snadno utvořila vnitřní esterová vazba, charakteristická pro produkty vynálezu: počet karboxyreaktivních skupin, které mají být převedeny na vnitřní estery, v poměru k počtu aktivovaných karboxylových funkcí; a tento počet závisí na kvalitě použitého aktivačního činidla.

Nejlepší postup pro přípravu zesítěné HA je proto charakterizován reakcí HA, mající volné nebo neutralizované karboxyskupiny, s činidlem, které aktivuje karboxyreaktivní skupiny, možno též v přítomnosti pomocného činidla, povzbuzujícího tvorbu meziproduktových aktivovaných derivátů a/nebo terciární organické nebo anorganické zásady, vystavením směsi teplu nebo ozařování (zejména UV světlu) a, je-li to požadováno, tvorbou solí volných karboxyskupin nebo uvolněním karboxyskupin, které tvoří sůl. Z látek, schopných aktivovat karboxyskupinu, mohou být použity látky konvenční, popsané v literatuře, například ty, které se užívají při syntéze

-7CZ 293968 B6 peptidů, avšak s výjimkou těch, které by měly pozměňovací či destrukční účinek na molekulární strukturu výchozí HA, jako jsou látky, používané při tvorbě karboxylových halogenů.

Nejlepší látky, jejichž účinkem se tvoří aktivované estery, jsou látky jako např. karbodiimidy, dicyklohexylkarbodiimid, benzylizopropylkarbodiimid, benzylethylkarbodiimid, ethoxyacetylen, Woodwardovo činidlo (7V-ethyl-5-fenylizoxazol-3-sulfonát) nebo halogenové deriváty alifatických, cykloalifatických nebo aromatických uhlovodíků, nebo heterocyklické složky s halogenem, uvedeným v pohyb přítomností jedné nebo více aktivačních skupin, jako je chloracetonitryl a obzvláště soli 2-chlor-N-alkylpyridinu jako je chlorid 2-chlor-N-methylpyridinu nebo další alkylové deriváty s nižšími alkylovými skupinami, jako ty, které mají až 6 atomů uhlíku. Namísto chloridových derivátů mohou ovšem být použity jiné halogenové deriváty, například deriváty bromidu.

Tato aktivační reakce může být provedena v organických rozpouštědlech, obzvláště aprotických, jakými jsou dialkylsulfoxidy, dialkylkarboxylamidy, zejména dialkylsulfoxidy nižšího alkylu, zvláště dimethylsulfoxid, polymethylenové sulfoxidy, jako je tetramethylensulfoxid, dialkyly nebo polymethylensulfony, jako je tetramethylensulfon, sulfolan a dialkylamidy nižšího alkylu nižších alifatických kyselin, kde alkylové skupiny mají jako maximum šest atomů uhlíku, jako je dimethyl nebo diethylformamid nebo dimethyl- nebo diethylacetamid. Mohou se však použít také jiná rozpouštědla, a ta nemusí být vždy aprotická - jako jsou: alkoholy, ethery, ketony, estery - jako jsou nižší alifatické dialkyloxyhydrokarbidy, jako je dimethoxyethan - a obzvlášť alifatické nebo heterocyklické alkoholy a ketony s nízkou teplotou varu, jako jsou nižší JV-alkylpyrolidony, jako 7V-methylpyrolidon nebo TV-ethylpyrolidon, hexafluorizopropanol a trifluorethanol. Pokud jsou jako karboxyl-aktivační látky užity halogenové deriváty, zejména ve formě solí, jako je výše zmíněný 2-chlor-7V-methylpyridinchlorid, je lepší použít sůl kovu nebo sůl organické báze výchozího polysacharidu, obzvlášťjednu z kvartémích amonných solí, popsaných později, jako je tetrabutylamonná sůl. Tyto soli mají tu obzvláštní výhodu, že jsou velmi rozpustné ve výše zmíněných organických rozpouštědlech, v nichž má zesíťovací reakce nejlepší účinek a tudíž zaručuje výborný výtěžek. Je dobré přidat do směsi látku, schopnou redukovat kyselinu, jako jsou organické zásady, uhličitany, bikarbonáty, nebo zásadité acetáty či acetáty alkalických zemin, či organické zásady a zejména terciární zásady jako pyridin a jeho homology, jako kolidin, nebo alifatické aminové zásady, jako triethylamin nebo N-methylpiperazin.

Použití kvartémích amonných solí představuje obzvlášť výhodný postup. Takové amonné soli jsou dobře známé a připravují se stejným způsobem jako jiné známé soli. Odvozují se z alkylů, které mají nejlépe mezi 1 a 6 atomy uhlíku. Nej lepší je použít tetrabutylamonné soli. Jedna varianta postupu, při němž se používají kvartémí amonné soli, spočívá v reakci alkalické soli, například sodné nebo draselné, v přítomnosti katalytického množství kvartémí amonné soli, jakou je tetrabutylamoniumjodid.

Látky, které katalyzují aktivaci karboxyskupin a mají být přidány k aktivačním činidlům, jsou uvedeny v literatuře, a jsou to také již dříve zmíněné zásady. Například tedy, jsou-li karboxylové skupiny aktivovány solemi izothiazolinu, je nejlepší přidat do reakční směsi trochu triethylaminu.

Reakce, při níž se tvoří aktivované meziprodukty, jako a zvláště estery, probíhá při teplotě, doporučené v literatuře, avšak tato teplota může být měněna tak, jak to okolnosti vyžadují, a ten, kdo je zběhlý v tomto postupu, ji může snadno určit. Tvorba vazeb vnitřních esterů může nastat v poměrně širokém teplotním rozpětí, například mezi 0 °C a 150 °C, nejlépe při pokojové teplotě nebo o něco výše, například mezi 20 °C a 75 °C.

Vzestup teploty podporuje tvorbu vazeb vnitřních esterů, právě tak jako vystavení radiaci o vhodné vlnové délce (ultrafialové paprsky).

Substrát kyseliny hyaluronové může být jakéhokoliv původu a může být různých typů, o nichž bylo psáno dříve. Nejlepší výchozí materiály HA jsou ty, jejichž průměrná molekulová hmotnost

-8CZ 293968 B6 je 150 000 až 730 000, zvláště 150 000 až 450 000. Mimoto se rozsah vnitřního zesítění může lišit, ale materiály, které jsou pro tento vynález nejlepší, využívají zesítěnou HA do stupně 4,5 až 5 % karboxylových skupin.

Následující příklady popisují přípravu užitečných zesítěných produktů HA pro výrobu materiálů tohoto vynálezu.

Příklad 5: Příprava 1% zesítěné kyseliny hyaluronové (HA).

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých při vnitřní esterifikaci.

% karboxyskupin neutralizovaných sodíkovým iontem.

6,21 g tetrabutylamonné soli HA o molekulové hmotnosti 170 000, odpovídající 10 mval monomerické jednotky se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C. Přidá se 0,01g (0,1 mval) triethylaminu.

Příklad 6: Příprava 5% zesítěné kyseliny hyaluronové.

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých ve vnitřní esterifikaci.

% karboxyskupin neutralizovaných sodíkovým iontem.

6,21 g tetrabutylamonné soli HA o molekulové hmotnosti 85 000, odpovídající 10 mval monomerické jednotky, se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C, přidá se 0,051 g (0,5 mval) triethylaminu a výsledný roztok se 30 minut promíchává. Přidá se roztok 0,128 g (0,5 mval) 2-chlor-l-methylpyridinjodidu v 60 DMSO; přidává se po kapkách v průběhu časového intervalu jedné hodiny a směs se uchovává 15 hodin při 30 °C. Poté se přidá roztok, tvořený

100 ml vody a 2,5 g chloridu sodného a výsledná směs se pak pomalu vlije do 750 ml acetonu, za stálého míchání. Utvoří se precipitát, který se pak zfiltruje a promyje třikrát 100 ml směsi aceton/voda 5:1 a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 h při 30 °C. Získá se 3,95 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin se provádí podle saponifikační metody, popsané na str. 169 - 172 práce „Quantitative Organic Analysis Via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication.

Příklad 7: Příprava 10% zesítěné kyseliny hyaluronové (HA).

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých ve vnitřní esterifikaci.

% karboxyskupin neutralizovaných sodíkovým iontem.

6,21 g tetrabutylamoniové soli HA o molekulové hmotnosti 620 000, odpovídající 10 mval monomerické jednotky se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C. Přidá se 0,101 g (1,0 mval) triethylaminu a výsledný roztok se 30 minut promíchává. Pak se pomalu, po kapkách přidá roztok 0,255 g (1,0 mval) 2-chlor-l-methylpyridinjodidu během časového intervalu 1 hodiny a směs se udržuje 15 hodin při 30 °C. Pak se přidá roztok, tvořený 100 ml vody a 2,5 g chloridu sodného a výsledná směs se za stálého míchání pomalu vlije do 750 ml acetonu. Utvoří se precipitát, který

-9CZ 293968 B6 se zfiltruje a promyje třikrát 100 ml směsi aceton/voda 5:1a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 h při 30 °C. Získá se 3,93 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin se provádí podle saponifikační metody popsané na str. 169- 172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication.

Příklad 8: Příprava 10% zesítěné kyseliny hyaluronové (HA).

Popis produktu:

% karboxyskupin užitých ve vnitřní esterifíkaci.

% karboxyskupin tvořících sůl se sodíkem.

6,21 g tetrabutylamoniové soli o molekulové hmotnosti 170 000, odpovídající lOmval monomerické jednotky, se rozpustí v 248 ml DMSO při 25 °C. Přidá se 0,118 g (1 mval) pyridinchloridu a výsledný roztok se promíchává 30 minut. Přidá se roztok 0,16 g TV-benzyl-TVethylkarbodiimidu ve 20 ml DMSO. Přidává se pomalu po kapkách v časovém intervalu jedné hodiny a směs se udržuje 45 hodin při teplotě 30 °C. Přidá se roztok ze 100 ml vody a 2,5 g chloridu sodného a výsledná směs se pomalu vlije do 750 ml acetonu, přičemž se stále promíchává. Utvoří se precipitát, který se pak zfiltruje a propláchne třikrát 100 ml směsi aceton/voda 5:1 a třikrát 100 ml acetonu a nakonec se suší ve vakuu 24 hodin při teplotě 30 °C. Získá se 3,9 gramů jmenované sloučeniny. Kvantitativní stanovení esterových skupin se provádí podle saponifikační metody popsané na str. 169 - 172 práce „Quantitative Organic Analysis via Functional Groups“, 4. vydání, John Wiley and Sons Publication.

3. Příprava biomateriálů

Následující příklady popisují přípravu chirurgických / zdravotnických výrobků podle vynálezu, obsahující úplný benzylester HA nebo autozesítěný derivát HA, nebo kombinaci obou. Jak bylo uvedeno výše, postupy pro přípravu membrán, tkanin, tkaných síťovin a netkaných látek jsou popsány v US 4 956 353, WO 93/11804, WO 93/11803, WO 94/17837 a EP 0 341 745.

Příklad 9: Příprava výrobku založeného na HYAFF 11 + polypropylénové síťce

Připraví se roztok HYAFF 11 v DMSO (110 mg/ml). Poté, co se složky definitivně rozpustí, roztok se přefiltruje přes 20 mikrometrovou filtrační plachetku a je zbaven plynů tím, že se umístí na dvě hodiny do vakua. 5 ml tohoto roztoku se vylije a rozprostře na skleněnou destičku. Pak se tam umístí polypropylénová síťka (nejlépe 6x11 cm) a přes ni se přelije dalších 10 ml roztoku. Rozprostře se po celé síťce a jakýkoli přebytek se odstraní. Skleněná destička se ponoří do lázně obsahující ethanol/vodu (90:10) na 5 hodin, aby se přípravek mohl srazit a destička aby se mohla odstranit. Přípravek se pak ponoří do lázně absolutního ethanolu na 16 hodin. Pak se suší na destičce ve vakuu 30 minut při 63 °C.

Příklad 10: Příprava výrobku založeného na tkanině z HYAFF 11, pokryté filmem z HYAFF 11

Připraví se roztok HYAFF 11 v DMSO (110 mikrogramů/ml). Když je rozpuštění úplné, roztok se přefiltruje přes 20 mikrometrovou filtrační plachetku a zbaví se plynů umístěním do vakua na 2 hodiny. 5 ml roztoku se vylije a rozprostře na skleněnou destičku a pak se na povrch umístí gáza z HYAFF 11 (10x20cm) tak, aby přilnula bez jakýchkoli záhybů nebo vzduchových bublin, a přes ni se přelije dalších 10 ml roztoku. Rovnoměrně se rozprostře po gáze a jakýkoli přebytek se odstraní. Skleněná destička se ponoří do lázně obsahující ethanol na 30 minut, aby se

-10CZ 293968 B6 přípravek mohl srazit a destička aby se mohla odstranit. Přípravek se pak nechá 16 hodin v ethanolu a suší se na destičce ve vakuu 30 minut při 63 °C.

Příklad 11: Membrána z HYAFF 11 s výztuží z HYAFF 7

Podle následujícího postupu byla vyvinuta složená membrána obsahující benzylester kyseliny hyaluronové HYAFF 11, tj. kyselina hyaluronová esterifikovaná stoprocentně benzylalkoholem, se síťovou výztuží, obsahující ethylester kyseliny hyaluronové HYAFF 7, což je kyselina hyaluronová, stoprocentně esterifikovaná ethanolem. Výrobek má plošnou váhu 14 mg/cm², jeho tloušťka je 0,25 mm, minimální mez pevnosti v tahu za sucha 400 kg/cm² a poměrné prodloužení při přetržení 7%; za mokra jsou tytéž parametry 50 kg/crrt² a 55%. Pevnost v roztržení za sucha je 90 kg/cm², za mokraje 50 kg/cm².

Síťovina HYAFF 7 byla sestrojena takto: Roztok HYAFF 7 dimethylsulfoxidu o koncentraci 125 mg/ml byl přiváděn posuvným zubovým čerpadlem do trysky pro zvlákňování za mokra, která má 100 otvorů, každý o průměru 65 mikronů. Extrudované vrstevnaté vlákno se přivede do srážení lázně, obsahující absolutní ethanol a pak se přes transportní válce přivede do tří po sobě jdoucích proplachovacích lázní, které rovněž obsahují absolutní ethanol. Poměr mezi rychlostí třetího válce (III) a rychlostí prvního válce (I) se jmenuje průtahový poměr. Má hodnotu 1,05, pokud rychlost jednotlivých válců je následující: Válec I 23 otáček za minutu, válce II a III 24 ot./min. a válec IV 25 ot/min. Po průchodu vrstevnatého vlákna proplachovacími lázněmi se vlákno suší teplým vzduchem při teplotě 45 °C a navine na navíjecí rám (8). Vlákno má index 237 denier. Pák se vlákno ohne 135x na metr a utká na stavu do hladké pleteniny textilního čísla 14. Ze stavu se látka protáhne kalandrem, který ji ztenčí. Diagram 2 ukazuje síťovinu, vzniklou tímto postupem.

Dvěma stříkacími pistolemi se aplikuje polymerická hmota - sprej roztoku HYAFF 11 v dimethylsulfoxidu o koncentraci 40 mg/ml. Takto postříkaná síťovina se přemístí do srážení lázně obsahují absolutní ethanol, do promývací komory obsahující chemicky čistou destilovanou vodu a do speciální sušicí komory, mající teplotu 50 °C (17).

Příklad 12: Netkaná látka sestávající z HYAFF 11

Následujícím postupem byla připravena netkaná látka obsahující benzylester kyseliny hyaluronové HYAFF 11, vážící 40 g/m² a o tloušťce 0,5 mm:

Připraví se roztok HYAFF 11 v dimethylsulfoxidu o koncentraci 135 mg/ml (připraví se v cisterně) a přivede se posuvovým zubovým čerpadlem do trysky pro zvlákňování za mokra, která má 3000 otvorů, každý o průměru 65 mikronů. Extrudovaná vlákenná hmota se přemístí do srážecí lázně, obsahující absolutní ethanol. Poté se transportními válci přivede do dvou po sobě jdoucích proplachovacích lázní, obsahujících absolutní ethanol. Průtahový poměr prvního válce je nastaven na nulu, zatímco průtahový poměr mezi ostatními válci je nastaven na 1,05. Po průchodu proplachovacími lázněmi se vlákenná hmota suší proudem horkého vzduchu (45 až 50 °C) a válcovou řezačkou se nařeže na 40 mm vlákna. Takto získaná hmota vláken se vyklopí do násypného žlabu vedoucího do mykacího / snovacího lapovacího stroje, z něhož vyjde jako pavučina 1 mm silná a o váze 40 mg/m². Pavučina se pak postříká sprejem roztoku HYAFF 11 v dimethylsulfoxidu 80 mg/ml, umístí se do ethanolové srážení lázně a posléze do sušicí komory. Konečná tloušťka materiálu je 0,5 mm.

- 11 CZ 293968 B6

Příklad 13: Netkaná látka složená z HYAFF 11 a HYAFF 7

Následujícím postupem byla připravena netkaná látka vážící 200 g/m² a 1,5 mm silná, složená ze směsi ethylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 7, a benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, ve stejném množství.

mm dlouhá vlákna HYAFF 7 a HYAFF 11, získaná zvlákňovacím postupem dle Příkladu 10, se důkladně smísila ve spirálovém mixeru. Směs vláken se přivedla do mykacího stroje, odkud vyšla jako pavučina o síle 1,8 mm a váze 200 g/m². Pavučina pak prošla jehlovacím strojem, který zní vyrobil 1,5 mm silnou netkanou látku, vážící 200 g/m², v níž byly zmíněné dva materiály perfektně promíchány.

Příklad 14: Netkaná látka z parciálního a úplného benzylesteru

Následujícím postupem byla získána netkaná látka o váze 40 g/m² a 0,5 mm silná, obsahující směs benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a parciálního (75%) benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 1 lp75, v totožném procentním poměru.

Příprava HYAFF 1 lp75: 10 g tetrabutylamonné soli kyseliny hyaluronové, m.hm. = 620,76, odpovídající 16,1 nmolu, se rozpustí ve směsi TV-methyl-pyroIidonu / voda 90/10, 2,5% na váhu, aby se získalo 400 ml roztoku. Roztok se zchladí na 10 °C, pak se probublává purifikovaným dusíkem po dobu 30 minut, a pak je esterifikován 1,49 mililitry (odpovídá 12,54 nmol) benzylbromidu. Roztok se pomalu jemně protřepává 60 hodin při 15 až 20 °C.

Následné purifikace se dosáhne precipitaci v ethyl acetátu, poté, co byl přidán nasycený roztok chloridu sodného, a následným promýváním směsí ethyl acetát/absolutní ethanol 80/20. Tuhá složka se oddělí filtrací a vystaví se působení bezvodého acetonu. Takto se získá 6,8 g produktu, což se rovná asi 95% výtěžku.

Vlákna HYAFF 11 a HYAFF 1 lp75, 40 mm dlouhá, získaná postupem, uvedeným v příkladu 1, se důkladně promísila ve spirálovém mixeru. Smíšená vlákna se přivedla do mykacího stroje, odkud vyšla jako 1 mm silná pavučina o váze 40 mg/m². Na pavučinu se pak nastříkal sprej roztoku HYAFF 11 v dimethylsulfoxidu (80 mg/ml), pavučina se umístila do ethanolové srážecí lázně, pak do promývací komory obsahující vodu nebo směs vody a ethanolu v poměru od 10 do 95 % ethanolu, a nakonec do sušicí komory. Materiál měl konečnou tloušťku 0,5 mm, a vlákna HYAFF 11 a HYAFF 11 p75 byla perfektně promíšena a naadherována k sobě.

Příklad 15: Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11

Podle následujícího postupu byla připravena vrstevnatá netkaná látka, složená z vrstvy benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a z vrstvy netkané viskózy (Jettex 2005 zORSA), o plošné váze 80 g/m², tloušťce 2 mm, a procentuální absorpci vody 560 % podle váhy.

Vrstva, která přijde do kontaktu s kůží, sestává z vláken HYAFF 11 vyrobených zvlákňováním za mokra a tvořících roušky 30 g/m². Vlákna jsou upravena do tvaru roušek. Tato vrstva se přistěhuje ke druhé vrstvě netkané viskózy o plošné váze 30 g/m². Konečný netkaný výrobek tudíž sestává ze dvou perfektně spojených vrstev o celkové plošné váze 80 g/m², tloušťce 2 mm, a procentuální absorpci vody 560 % podle váhy.

- 12CZ 293968 B6

Příklad 16: Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11

Podle následujícího postupu byla získána vrstevnatá netkaná látka, obsahující smíšenou vrstvu benzylesteru kyseliny hyaluronové, HYAFF 11, a alginátu draselného v poměru 1:1, a vyztužující netkanou látku z polypropylenu (netkaný základ, 50 g/m² zNEUBERGER) o plošné váze 70 g/m², tloušťce 1,5 mm, a procentuální absorpci vody 450 % podle váhy:

Vlákna HYAFF 11 a alginátu draselného, 40 mm dlouhá, získaná konvenční technikou spřádání za mokra, byla promíšena, utvořila se z nich rouška 20 g/m², a ta se přistěhovala k netkané látce o plošné váze 50 g/m². Výsledný materiál sestává ze dvou vrstev netkané látky s celkovou plošnou váhou 70 g/m², o tloušťce 1,5 mm, a procentuální absorpci vody 450 % podle váhy.

Příklad 17: Vrstevnatá netkaná látka založená na HYAFF 11

Podle následující postupu byla získána vrstevnatá netkaná látka sestávající z vrstvy benzylesteru kyseliny hyaluronové HYAFF 11 a vrstvy polyurethanové pěny jako LYOBEND (z DELCON) o plošné váze 100 g/m², tloušťce 6 mm, a procentuální absorpci vody 860 % podle váhy:

Vrstva, přicházející do kontaktu skůží sestává z vláken HYAFF 11 vyrobených technikou spřádání za mokra a vytvarovaných do formy roušky 45 g/nf, která je přistěhována ke druhé vrstvě z polyurethanové pěny. Výsledný netkaný výrobek sestává ze dvou perfektně spojených vrstev o celkové plošné váze 100 g/m², tloušťce 6 mm, a procentuální absorpci vody 860 % podle váhy.

Příklad 18: Příprava membrány vyrobené z derivátu kyseliny hyaluronové, majícího 80% karboxylových skupin esterifikovaných benzylalkoholem (C6H5-CH2-OH), 10 % karboxylových skupin zahrnutých do vnitřních esterových vazeb a zbývajících 10 % tvořících sůl se sodíkem.

6,21 g tetrabutylamoniové soli kyseliny hyaluronové o molekulové hmotnosti 180 000 (10 mval) se rozpustí ve 248 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) při teplotě okolí. K tomuto roztoku se přidá 0,951 ml benzyl bromidu (8,0 mval) a roztok se nechá stát 12 hodin při 30 °C. Přidá se 0,101 g triethylaminu (1,0 mval) a roztok se po 30 minut míchá. Přidá se 0,255 g (1 mval) 2-chlor-lmethyl-pyridin jodidu v 60 ml DMSO a směs se nechá stát 15 hodin při 30 °C. Přidá se 2,5% roztok (váha na objem) chloridu sodného ve vodě a výsledná směs se vlije do 750 ml acetonu a přitom se míchá. Utvoří se precipitát, který se zfiltruje a proplachuje třikrát ve 100 ml směsi aceton/voda 5:1, třikrát 100 ml acetonu a nakonec sušen ve vakuu 24 hodin při 30 °C. Takto je získáno 4,5 g požadovaného produktu. Kvantitativní určení obsahu benzylalkoholu se provádí plynovou chromatografíí, následující po alkalické hydrolýze. Celkový obsah esterových skupin se měří saponifikační metodou popsanou na str. 169 - 172 práce „Quantitative Analysis Via Functional Groups“, čtvrté vydání, John Wiley and Sons Publication.

Takto připravený esterový derivát je rozpuštěn na koncentraci 150 mg/ml v DMSO při teplotě 30 °C. Rozpuštěný derivát je filtrován přes 20 mikronovou síťku a vložen do extrusního reaktoru, napojeného na filmový průtlačník o tloušťce méně než 1 mm. Produkt je extrudován v koagulační lázni, obsahující roztok, který umožní, aby byl DMSO z výrobku extrahován (např. ethanol), a materiál z filmového průtlačníku je navinut na sérii válců, opatřených ventilací, aby se membrána usušila.

Preklinické studie

Následující studie podávají přehled výsledků, které ukazují užitečnost vynalezených výrobků v prevenci pooperačních adhezí tkání a ukazují zlepšené výsledky zásluhou těchto výrobků ve srovnání s výrobky dřívějšími.

-13CZ 293968 B6

Studie 1

Tato studie demonstruje vysoký výskyt tvorby chirurgických adhezí pozorovaný na navozeném modelu poškození jater u krys, představujících pozitivní kontrolu při srovnávání preventivního účinku zdravotnických a chirurgických pomůcek, odvozených z HA, proti tvorbě adherencí. Pro tyto experimenty byly vybrány krysy plemene Sprague Dawley, o váze 275 až 300 g. Poškození jater bylo provedeno 21 živočichům.

Každému zvířeti byla provedena laparotomie abdominální incizí po anestézii roztokem Ketaminu, lOOmg/kg a Xylazinu, 11 mg/kg, připravených sterilním způsobem a podaných nitrosvalově.

Játra byla upevněna a odkryta; dolní lalok byl poraněn jemným tlakem sterilním tamponem, dokud se neobjevila krev. Po zastavení krvácení poraněného povrchu byla laparotomie uzavřena stehem z hedvábí velikosti 3. Zvířata byla utracena po 7 až 21 dnech.

Adheze byla hodnocena podle toho, jak snadno šly přilehlé povrchy (horní a spodní) od sebe oddělit chirurgickými pinzetami, na základě následující stupnice:

žádná adheze - povrchy jdou od sebe lehká až střední adheze - povrchy lze od sebe odtáhnout pinzetou výrazná adheze mezi dvěma povrchy, jakýkoli pokus je od sebe oddělit končí roztržením tkáně

V této studii byly jako klinicky významné hodnoceny ty adheze, které měly u tohoto zvířecího modelu stupeň 2. V této pozitivní kontrolní skupině (tvorba adhezí) mělo 17 zvířat z 21 (80,9 %) adheze, dosahující stupně 2.

Studie 2

Tato studie ilustruje významnou redukci v tvorbě adhezí, pokud se použije gel vyrobený ze zesítěné kyseliny hyaluronové (ACP), nebo gáza, založená na benzylesteru HA HYAFF 11, samotná, nebo v kombinaci s hemostatickým Surgicelem a Heparinem 50IU/ml. Gel ACP byl rozprostřen po ošetřovaném povrchu. Chirurgický protokol popsaný v příkladu 1 byl užit jako zvířecí model navození tvorby adhezí. Významná redukce v tvorbě adhezí mezi dvěma přilehlými povrchy levého jaterního laloku je zobrazen v Tab 1.

-14CZ 293968 B6

MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2)
Tkanina HYAFF 11	6	50%
Tkanina HYAFF 11 + SURGICEL	6	16%
Tkanina HYAFF 11 + Surgicel + heparin	6	16%
Tkanina HYAFF 11 + heparin	6	33%
Membrána HYAFF 11 (20 mm silná)	11	36%
HYAFF 11 netkaná látka + Surgicel	6	33%
ACP	24	20%

Je zřejmé, že užití těchto pomalu biodependabilních biomateriálů jako neprostupné bariéry pro zánětlivé buňky mezi dvěma přilehlými povrchy redukuje tvorbu adhezí, jak je zřejmé ze srovnání s 80,9 % adhezí, pozorovaných v kontrolní skupině popsané v Příkladu 1.

Studie 3

Tento příklad ukazuje vysoký výskyt tvorby pooperačních adhezí pozorovaný na modelu chirurgických lézí, navozených na břišní stěně kiys vzatých jako pozitivní kontroly, a srovnání tohoto modelu s preventivním účinkem zdravotnických pomůcek sestávajících z derivátů HA tohoto vynálezu (HYAF 11 + polypropylenová síťka) proti tvorbě adhezí.

Léze byla navozena celkem u 24 zvířat (12 kontrola, 12 test). Každému zvířeti byla provedena laparotomie abdominální incizí poté, co byla podána anestézie roztokem Ketaminu lOOmg/kg a Xylazinu 11 mg/kg připravených za sterilních podmínek a podaných nitrosvalově.

Tkáň nalevo od incize byla zvednuta dvěma chirurgickými pinzetami, aby se zpřístupnila břišní stěna. Část peritoneálního povrchu 1,5 cm x 1,5 cm byla odstraněna chirurgickými nůžkami, dokud se neobjevil exsudát. Svalový snopek odstraněn nebyl. V kontrolní skupině bylo nutno přišít přes operovaný povrch polypropylenovou síťku (měřící dvojnásobek povrchu léze). Byl použit bioabsorbovatelný steh Vycil velikost 6. Tím se zajistil tažný odpor břišní stěny. Před aplikací materiálu byla na operovaném povrchu zajištěna důkladná hemostáza (= zastavení krvácení). Zvířata byla utracena za 14 dní - střední doba citovaná v příkladu 1 - a adherence byla zhodnocena podle následující stupnice:

žádná adheze lehké adheze bez vaskularizace, jdou snadno odstranit

-15CZ 293968 B6 střední adheze bez vaskularizace, jdou od sebe odtáhnout ručně pevná adheze, neprůhledná, vaskularizovaná, lze ji oddělit obtížně-je nutno užít skalpel velmi pevná adheze, silná, neprůhledná, vaskularizovaná, lze ji pouze odstřihnout chirurgickými nůžkami, s následnou destrukcí tkáně.

Adheze se stupněm více než 2 byly považovány za závažné.

V pozitivní kontrolní skupině (tvorba adhezí) mělo 12 zvířat z 12 (=100 %) adheze se stupněm více než 2, zatímco při použití výrobků vynálezu byla zřetelná redukce ve výskytu adhezí mezi břišní stěnou a vnitřními orgány, jak ukazuje Tab. 2.

MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2)
HYAFF11+ polypropylénová síťka	12	25%
Kontrola - polypropylénová síťka	12	100%

Je zřejmé, že použití materiál HYAFF 11 vynálezu jako bariéry (nepropustné pro zánětlivé buňky) mezi poraněný vnitřní povrch (břišní stěna) a přilehlé orgány redukuje tvorbu adhezí ve srovnání se 100% adhezí v kontrolní skupině, ošetřené jen polypropylénovou síťkou.

Studie 4

Tato studie ilustruje možnosti autozesítěné kyseliny hyaluronové (ACP) ve formě gelu a použité jako povlak k redukci tvorby adhezí, v modelu lézí, navozených na slepém střevě krys. Tento typ lézí vykazuje tvorbu adhezí, pokud je ošetřen oplachováním fyziologickým roztokem a zastavením krvácení po operaci, a nijak jinak.

Jako v Příkladu 1, byly použity krysy plemene Sprague Dawley o váze 275 až 300 gramů. Každému zvířeti se provedla laparotomie abdominální incizí po anestézii roztokem Ketaminu, 100 mg/kg, a Xylazinu, 11 mg/kg, připravených za sterilních podmínek a podaných injekčně nitrosvalově. Slepé střevo bylo lokalizováno a exponováno. Na povrchu střeva se navodila léze pevným předmětem (měděný disk o průměru lem, napojený na napájecí zařízení, elektronicky nastavené na teplotu 69,5 °C. Kontakt disku s povrchem střeva byl 15 vteřin. Vznikla patrná léze s exsudátem. Po opláchnutí poraněné oblasti fyziologickým roztokem a zastavení krvácení Surgicelem byla laparotomie uzavřena stehem z hedvábí velikosti 3.0. Po utracení zvířat za 14 dní, střední čas uvedený v Příkladu 1, byly hodnoceny adherence podle následující stupnice: 0 žádná adheze lehká adheze bez vaskularizace, lze ji snadno oddělit středně silná adheze bez vaskularizace, lze ji odtáhnout ručně pevná adheze, neprůhledná a vaskularizovaná, lze ji obtížně oddělit, je nutno užít skalpel velmi pevná adheze, silná, neprůhledná a vaskularizovaná, lze ji pouze odstřihnout chirurgickými nůžkami, s následnou destrukcí tkáně.

-16CZ 293968 B6

V tomto zvířecím modelu adheze se stupněm vyšším než 2 byly brány jako závažné. Je zřejmá redukce tvorby adhezí, byl-li užit gel ACP jako bariéra, ve srovnání s kontrolou ošetřenou pouze samotným oplachováním fyziologickým roztokem a zastavením krvácení (Tabulka 3).

Tabulka 3

MATERIÁL	POČET ZVÍŘAT	POČET VÝRAZNÝCH ADHEZÍ (STUPEŇ 2)
Kontrola (fyziolog. roztok + zastavení krvácení)	17	70%
ACP	11	40%

Je zřejmé, že použití jmenovaného materiálu jako bariéry redukuje tvorbu adhezí, ve srovnání s kontrolním ošetřováním samotným oplachováním fyziologickým roztokem a zastavením krvácení.

Studie 5 - Účinek derivátů kyseliny hyaluronové HYAFF - 7 a HYAFF llp75 v prevenci pooperační tvorby adhezí v modelu jatemích lézí krys

Zvířecí model: Krysí samci Harlan SD, váha 250 g.

Typ léze: Břišní oblast byla důkladně očištěna roztokem jódu, pak byla provedena asi 3 cm laparotomie pro expozici jater. Pravý spodní lalok jater byl poškrábán a navozena tak léze sterilní dřevěnou špachtlí, dokud se neobjevila krev.

Testované materiály:

Pokus 1: HYAFF 1 lp75, parciální benzylester kyseliny hyaluronové ve formě gázy a netkané látky.

Pokus 2: HYAFF 7, úplný ethylester kyseliny hyaluronové ve formě gázy a netkané látky.

Aplikace materiálu: po zastavení krvácení konvenčními hemostatikem, byly testované a kontrolní materiály umístěny mezi spodní (oblast léze) a horní jaterní lalok (přilehlý povrch) bez použití švu, aby nastal bariérový efekt a zabránilo se tvorbě adhezí.

Zhodnocení a pozorování:

Prováděla se pozorování mezi sedmým a dvacátým prvním dnem po operaci. Adheze, které se utvořily, byly hodnoceny na základě následujících vizuálních označení:

= Žádné adheze = Lehké adheze = Výrazná přítomnost adhezí

Kromě zhodnocení co do stupně síly adhezí, byl zhodnocen také stupeň zánětu, a to mikroskopicky (tkáňová reakce na aplikaci materiálu). Histologické vzorky se barvily hematoxylin - eosinem a Malloryho trichromovým barvením.

-17CZ 293968 B6

Výsledky:

Experiment 1:

Materiály založené na HYAF 11 p75, parciálním benzylesteru kyseliny hyaluronové, byly testovány v experimentu 1 samostatně, v kombinaci s hemostatikem Surgicel, a v kombinaci s hemostatikem plus saturací heparinem (1 000 U/ml). Tyto postupy jsou v chirurgické praxi běžné.

Diagram 1 je graf, zobrazující účinek biomateriálů, jsou-li užity samostatně. Žádný efekt v prevenci adhezí nebyl pozorován v případech biomateriálů založených na HYAFF llp75 a Interceedu, a i když ve druhém případě se trend zdál lepší, i když ne významně rozdílný, jaterní laloky byly kompletně srostlé a bylo možno pozorovat výraznou zánětlivou reakci. Totéž bylo vidět při histologickém vyšetření biopsií, kde bylo možno pozorovat přítomnost velkého počtu zánětlivých buněk, neutrofilů, makrofágů, a vyzrálých vláken kolagenu.

Na diagramech 2 a 3 byly materiály užity v kombinaci se Surgicelem a se Surgicelem + heparinem. Trendy pozorované v diagramu 1 byly potvrzeny u materiálů založených na HYAFF 1 lp75, zatímco Interceed nasycený heparinem vykazoval, zdá se, lepší výsledky. Tato situace byla potvrzena histologicky.

Závěr: Materiály, založené na HYAFF llp75 nemohou být použity v prevenci pooperačních adhezí, jelikož mají zánětlivý účinek; ten je zaviněn pravděpodobně uvolněním oligomerů kyseliny hyaluronové o nízké molekulové váze, z hlediska mimořádné krátkého degradačního času produktů.

Experiment 2:

V Experimentu 2 byly testovány biomateriály, založené na HYAFF 7, ethylesteru kyseliny hyaluronové, v kombinaci se Surgicelem a Surgicelem + heparinem. V žádném případě nebyl pozorován účinek co do prevence pooperačních srůstů. Zdá se, že Interceed používaný se Surgicelem a heparinem dává pozitivnější výsledek (Diagram 4).

Mikroskopická vyšetření tyto údaje potvrdila a zjistilo se při nich velké množství zánětlivých buněk a kolagenových vláken v případě používání HYAFF 7. V tomto případě, tak, jako v minulém, biomateriály založené na HYAFF 7 nemohou být použity v prevenci tvorby pooperačních srůstů, jelikož je pravděpodobné, že do organismu uniká ethanol.

Studie 6 - Účinnost biomateriálů založených na HYAFF 11 v prevenci pooperační tvorby srůstů ve dvou odlišných modelech lézí, navozených u zvířat: 1) Nitrojatemí abraze u krys - 2) Léze břišní stěny u krys.

Zvířecí model 1

Břišní oblast byla desinfíkována jódem a alkoholem a pak se provedl řez k odkrytí jater. V tomto zvířecím modelu byl vnitřní povrch spodního jatemího laloku poškrábán, dokud se neobjevil exsudát. V poškozené oblasti bylo pečlivě zastaveno krvácení Tabotampem (Ethicon) a materiál byl zanechán na poškozeném povrchu bez připevnění, protože výrobek má vysoce mukoadhezivní vlastnosti. Byly testovány dva výrobky, založené na HYAFF 11, oba jsou komerční verze 20 mikrometrů silné membrány, nazvané Transprocess a Hyalobarrier 20. za 14 dní po operaci se provedlo makroskopické zhodnocení výše popsaným systémem stupňů, aby se určily adheze. Další zhodnocení se provedlo co do procenta zvířat, u nichž byl zjištěn stupeň 2 (významná adheze).

-18CZ 293968 B6

Výsledky

Diagram 5 je graf, představující stupně adhezí, navozených v pokusu. Hyalobarrier 20 redukuje četnost tvorby adhezí ve srovnání s neléčenými kontrolami a dvěma ošetřováními kyselinou hyaluronovou o vysoké a nízké molekulové váze. Podobný trend byl zaznamenán, třebaže bez jakýchkoli statisticky významných rozdílů, v případě dalšího materiálu na bázi HYAFF 11, zvaného Transprocess. Diagram 6 ukazuje procenta případů adhezí se stupněm 2 v každé pokusné skupině (chirurgicky významná adheze). Tendence zjištěná předchozím diagramem (1), byla potvrzena i v tomto případě, s redukcí tvorby adhezí stupně 2 (procento výskytu menší než 50% při ošetřování Hyalobarrierem 20 a Transprocessem).

Zvířecí model 2

Po desinfekci břišní oblasti jódem a ethanolem byla provedena mediánní laparotomie, aby se zpřístupnila břišní stěna a peritoneum. Skalpelem se provedla incize 2 x 2 cm a pak se odstranilo peritoneum a svalová vrstva. Při tomto typu operace je nutno sešít poškozenou oblast materiálem, který podporuje růst tkáně a přitom zaručuje adekvátní tažnou sílu, aby se zabránilo zhroucení břišní stěny. Obecně se užívají nedegradabilní materiály s polymerickou hmotou, jako jsou síťky z polypropylenu, polyesteru nebo lehčeného polytetrafluorethylenu. Avšak užití takovýchto materiálů samotných není dostačující ktomu, aby se zabránilo vytvoření srůstů se střevními kličkami, což vede ke střevní obstrukci a k chronickým bolestem.

Makroskopické zhodnocení se provedlo 14 dní po operaci, s použitím stupňů adhezí od 0 do 4. Dále se provedlo zhodnocení procenta zvířat se stupněm více než 2 (významné adheze).

Výsledky

Tento pokus demonstruje, že potažení syntetické síťky Proleň (polypropylenová síťka, mající široké použití v břišní chirurgie) HYAFFem 11 a rouška zHYAFFu 11 na síťce Proleň, připevněná stehem, může redukovat tvorbu pooperačních adhezí. Diagram 7 ukazuje, že kombinovaný produkt nazvaný Hyalobarrier Plus (HYAFF 11 rozprostřený a sražený na Prolenu) a spojení Hyalobarrieru ve formě filmu na prolenu výrazně redukuje adheze ve srovnání s prolenem samotným. Diagram 8 tento trend potvrzuje, s nižším procentem významných adhezí (více než 2) po ošetření HYAFFem 11 oproti ošetření samotnou prolenovou síťkou.

Studie 7 - Účinky biomateriálů z gelu ACP na prevenci pooperační tvorby adhezí za období 14 dnů na zvířecí modely jaterního poškození krys a střevního poškození krys.

Účelem této studie bylo zhodnocení účinků biomateriálů, založených na gelu ACP, při redukci nebo zábraně tvorby pooperačních adhezí. Ukázky testovaných materiálů byly zhodnoceny ve srovnání s kyselinou hyaluronovou o vysoké molekulové váze a ve srovnání s komerčně dostupnými biomateriály, okysličenou regenerovanou celulosou (TC 7 Interceed) používanou při zábraně tvorby adhezí v břišní, pánevní a gynekologické chirurgii.

Byl použit model poškození krysích jater lézí a poškození krysího střeva spáleninou, jelikož to jsou charakteristické modely experimentálního navození adhezí. Účinky testovaných a kontrolních materiálů v prevenci pooperačních adhezí byly zhodnoceny pozorováním místa lézí pouhým okem s použitím stupňů adhezí. Byl použit model poškození krysích jater (Experiment 1) a poškození krysích střev (Experiment 2), jelikož to jsou standardizované a reprodukovatelné modely experimentálního navození adhezí. Po poranění byly užity biomateriály, založené na ACP, jako bariéra mezi přilehlými povrchy jaterních laloků a vnitřních orgánů.

V obou experimentech byla zhodnocena účinnost gelů ACP co do jejich schopností zabránit tvorbě adhezí nebojí redukovat, ve srovnání sTC 7 Interceed, absorbovatelnou bariérou proti

-19CZ 293968 B6 tvorbě adhezí z okysličené regenerované celulosy, široce používanou v klinické praxi, ve srovnání s kopolymerickým roztokem „Thermogel“, roztokem kyseliny hyaluronové o vysoké molekulové váze a skupinou neošetřených živočichů (formální operace).

Počáteční údaje:

Experiment 1 - Poškození krysích jater

Testované materiály:

2

KÓD PRODUKTU	SMK 0002	SMK 0002
BĚŽNÉ JMÉNO	ACP gel	ACP gel
KOMERČNÍ JMÉNO	Hyalogel Barrier	Hyalogel Barrier
DODAVATEL	FAB	FAB
ČÍSLO ŠARŽE	101/96	104/96
DATUM EXPIRACE	20-02-96	20-02-96
SKLADOVANÍ	pod 30 °C	pod 30 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	žádná	žádná

Gely ACP byly suspendovány ve vodě na koncentraci 60 mg/ml. Testované materiály byly dodávány vysterilizované autoklávováním v 5ml injekčních stříkačkách a zacházelo se s nimi sterilně. Gely ACP byly aplikovány jako povlak na poškozený povrch jatemích laloků po zastavení krvácení Tabotampem. Každé zvíře dostalo během operace jednorázovou dávku gelu, 15 dostačující na úplné potažení poraněného povrchu (asi 2 ml).

Kontrolní materiály:

2 3

OBCHODNÍ JMÉNO	TC7 Interceed	HYAL	Thermogel
VÝROBCE/ DODAVATEL	Johnson & Johnson Patient Care, New Briinswick, NJ	FAB	BASF Pharma

-20CZ 293968 B6

POPIS	Bariéra z okysličené regenerované celulózy	Kyselina hyaluronová m. hm. 800 000	Kyselina pluronová
ČÍSLO ŠARŽE	2710TCM	0108 st	1/95
DATUM EXPIRACE	11-97	05-97
SKLADOVÁNÍ	pod 30 °C	pod 30 °C	pod 8 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	žádná	žádná

Interceed byl nařezán za sterilních podmínek, byl použit samotný i nasycený Heparinem (500 U/ml) a potom aplikován tak, aby oddělil oba přilehlé povrchy jatémích laloků ve velikosti, která překračovala hranice poraněné oblasti o několik mm. HYAL, kyselina hyaluronová o vysoké molekulové váze (rozpuštěná ve vodě na koncentraci 10 mg/ml) a Thermogel byly dodány ve sterilní stříkačce.

Interceed byl aplikován přímou aplikací bez chirurgických stehů. HYAL, Kyselina hyaluronová a Thermogel byly aplikovány po zastavení krvácení na poraněný povrch injekční stříkačkou ve formě povlaku. Každé zvíře dostalo během operace jednorázovou dávku, postačující k tomu, aby poraněná oblast byla kompletně potažena nebo pokryta.

Návrh experimentu:

K tomuto pokusu byly vybrány krysy plemene Sprague Dawley o váze 275 až 300g. Díky zkušenostem z předchozích pokusů byla jako doba, adekvátní pro zhodnocení tvorby adhezí na těchto zvířecích modelech, vzata doba 14 dnů. Při udaném počtu zvířat, požadovaných pro tuto studii, byla zvířata připravována několik dní po sobě.

Bylo použito celkem 78 zvířat, podle následujícího schématu:

SKUPINA	OŠETŘENÍ	POČET ZVÍŘAT
Formální operace	Neošetřeno	12
Kontroly	Samotná TC 7 Interceed	12
Kontroly	TC7 Interceed + Heparin	6
Kontroly	HYAL	12
Kontroly	Thermogel	12
Ošetřeno	rouška ACP 5% (šarže 101/96)	12
Ošetřeno	rouška ACP 5% (šarže 104/96)	12

-21 CZ 293968 B6

Příprava zvířat:

Zvířata byla uspána nitrosvalovým podáním injekce Ketaminu (Gellini Pharmaceutical) / Xylazinu (Bayer), oholena a pak desinfikována roztokem jódu a ethanolem. Následoval levostranná laparotomie, levý jatemí lalok byl nadzvednut a vnitřní povrch levého a středního jatemího laloku byl poraněn jemným třením dřevěným aplikátorem, dokud se neukázalo krvácení nebo serosní exsudát.

Použití materiálů:

Po zastavení krvácení Surgicelem nebo Tabotampem byly mezi povrchy obou laloků umístěny testované materiály, tak, aby pokryly celou poškozenou oblast a mezi laloky utvořily bariéru. K sešití bylo použito dvou vrstev hedvábných stehů (3.0). Po operaci bylo 4 dny podáváno antibiotikum (Procacillina podkožně 30 000 I. U. na krysu) a analgetikum (Temgesic nitrosvalově, 0,05 mg/kg).

Stupeň adhezí:

dní po operaci byla zvířata utracena CO₂. Stupeň adhezí byl hodnocen pozorováním pouhým okem. Bylo použito následující značení stupně adhezí:

= žádná adheze.

= slabá až středně silná adheze. Oba laloky se daly chirurgicky oddělit mechanickým tahem kleštičkami.

= Výrazná adheze, oba laloky byly na sebe zcela přilehlé, jakýkoli pokus o jejich oddělení měl za následek poškození tkáně.

Vstřebatelnost materiálů byla zhodnocena vizuálním stanovením přítomnosti materiálů, navíc místo ošetření bylo fotografováno.

Po provedení tohoto pozorování byla celá játra chirurgicky odstraněna a naložena do 10% pufrovaného formalínu na 48 hodin.

Po fixaci byl pitevním nožem oddělen od jater 2mm příčný řez, zahrnující i poškozenou oblast. Takto získané vzorky byly podrobeny histologické analýze.

Tkáňová analýza:

Histologická analýza:

Vzorky byly fixovány v neutrálním pufrovaném formalínu 10%, pak dehydratovány a zality do parafínu standardními postupy. 8 mikronový řez byl obarven Massonovým trichromem (na průkaz tkáňové zánětlivé reakce) a v případě potřeby toluidinovou modří (na průkaz přítomnosti zbytků materiálů).

Experiment 2 - popáleniny krysích střev

-22CZ 293968 B6

Testované materiály:

2

KÓD PRODUKTU	SMK 0002	SMK 0002
BĚŽNÉ JMÉNO	ACP 5% vysoká m. hm.	ACP 5%
komerční název	Hyalogel Barrier	Hyalogel Barrier
DODAVATEL	FAB	FAB
ČÍSLO ŠARŽE	3/94	ACP 5% (šarže 101/94)
DATUM EXPIRACE	07/95	07/95
SKLADOVÁNÍ	pod 30 °C	pod 30 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	žádná	žádná

5% gely ACP o vysoké mol. hm. šarže 3/94 byly suspendovány ve vodě na koncentraci 20 mg/ml. 5% ACP šarže 101/94 byl suspendován na koncentraci 50 mg/ml. Veškeré testované 5 materiály byly dodány vysterilizované autoklávováním v 5 ml stříkačkách a bylo s nimi sterilně zacházeno. Gely ACP byly aplikovány jako povlak na popálený povrch poté, co bylo zastaveno krvácení Tabotampem. Každé zvíře dostalo v době operace jednorázovou dávku, asi 2 ml, postačující k úplnému potažení poraněného povrchu.

ío Kontrolní materiály:

2 3

OBCHODNÍ NÁZEV	TC 7 Interceed	HYAL	Thermogel
VÝROBCE/ DODAVATEL	Johnson & Johnson Patient Care. New Brunswick, NJ	FAB	BASF Pharma

POPIS	Bariéra z okysličené regenerované celulózy	Kyselina hyaluronová m. hm. 1 200 000	Kyselina pluronová
ČÍSLO ŠARŽE	2710TCM	0108 st	1/94
DATUM EXPIRACE	11-97	05-97	--
SKLADOVÁNÍ	pod 30 °C	pod 30 °C	pod 8 °C
PŘEDBĚŽNÁ OPATŘENÍ	žádná	žádná

-23 CZ 293968 B6

Interceed byl nařezán za sterilních podmínek, byl užit samostatně i nasycený Heparinem (500 U/ml), a pak aplikován tak, aby od sebe oddělit přilehlé povrchy obou jaterních laloků ve velikosti, přesahující poraněnou oblast o několik mm. HYALL, kyselina hyaluronová o vysoké molekulové váze (rozpuštěná ve vodě na koncentraci 10 mg/ml) a Thermogel byly dodány ve sterilních injekčních stříkačkách. Interceed byl aplikován přímo, bez chirurgického šití. Kyselina hyaluronová a Thermogel byly aplikovány na poraněný povrch ve formě povlaku po zastavení krvácení injekční stříkačkou. Každé zvíře dostalo jednorázovou dávku, dostačující na to, aby poraněný povrch byl zcela potažen nebo pokryt.

Návrh experimentu:

Pro tento pokus byly použity krysy plemene Sprague Dawley (275 až 300 g). Ze zkušenosti z předchozích pokusů se jako doba, adekvátní pro zhodnocení tvorby adhezí u tohoto zvířecího modelu určila doba 14 dnů. Vzhledem k počtu zvířat, nutných pro tuto studii, se zvířata připravovala postupně. Celkem bylo vzato 59 zvířat podle následujícího schématu:

Experiment 2

SKUPINA	OŠETŘENI	POČET ZVÍŘAT
Formální operace	neošetřeno	10
Kontrola	TC 7 Interceed	6
Kontrola	Kyselina hyaluronová m. hm. 1 200 000	12
Kontrola	Thermogel	13
Ošetřeni	ACP 5% (šarže 101/94)	12
Ošetřeni	ACP 5% o vysoké mol. v., šarže 3/94	6

Příprava zvířat:

Zvířata byla uspána nitrosvalovým podáním Ketaminu (Gellini Pharmaceutical) / Xylazinu (Bayer), oholena a pak desinfíkována roztokem jódu a ethanolem. Provedl se středový břišní řez přes kůži a svalovou tkáň, aby se zpřístupnilo střevo. Spálenina se navodila na povrchu slepého střeva elektronicky zahřívaným měděným diskem (průměr 1 cm) za standardního tlaku 15 vteřin při 69,3 °C.

Použití materiálů:

Po zastavení krvácení Surgicelem nebo Tabotampem byly testované a kontrolní materiály umístěny na povrch střeva bez šití, aby se pokiyla celá popálená oblast a utvořila se bariéra mezi pobřišnicí a vnitřními orgány. Pobřišniční svalová vrstva byla uzavřena nepřerušovanými hedvábnými stehy 3-0, kožní vrstva byla uzavřena kožními svorkami a přerušovaným stehem 3-0. Na závěr operace se podalo antibiotikum (Procacillina podkožně 30 000 I.U. na krysu) a analgetikum (Temgesic nitrosvalově 0,05 mg/kg). Oboje bylo podáváno 4 dny.

Pozorování a vyhodnocení:

-24CZ 293968 B6

Stupeň adhezí:

dní po operaci byla zvířata utracena CO₂. Stupeň adhezí byl zhodnocen pozorováním pouhým okem. Bylo použito následující stupnice adhezí:

= žádná adheze = lehká adheze, avaskulární, snadno oddělitelná = středně silná adheze, vaskularizovaná, souvislá lze ji oddělit ručně = neprůhledná, vaskularizovaná, obtížně oddělitelná za použití skalpelu = silná, neprůhledná, vaskularizovaná, oddělitelná pouze chirurgickými nůžkami za poškození tkáně.

Vstřebatelnost materiálů byla zhodnocena vizuálně na přítomnost materiálů, navíc, místo ošetření bylo fotografováno.

Výsledky

Experiment 1

Jedno zvíře uhynulo během podávání anestetika, umístění biomateriálůbylo snadno proveditelné. Dbalo se na to, aby materiály byly přichyceny na tkáň spodního jaterního laloku. U zvířat, ošetřených ACP, nebyly pozorovány žádné známky onemocnění nebo utrpení po operaci.

Dvě zvířata, ošetřená kyselinou hyaluronovou, uhynula dva dny po operaci. Nekroptické vyšetření ukázalo vnitřní krvácení.

Vyhodnocení tvorby adhezí: Bylo provedeno po 14 dnech - týkalo se adhezí, utvořených mezi dvěma přilehlými povrchy jaterního laloku po poškození tkáně. V době pozorování byly rozpadlé všechny materiály, použité při ošetření: stupeň adhezí u zvířat, ošetřených 5% ACP (šarže 104/96) bylo výrazně nižší než všechny kontrolní materiály a neošetřené kontroly. U 5% ACP šarže 101/96 byla redukce tvorby adhezí vyšší, než u TC 7 Interceedu nasyceného heparinem, ale nebyly zaznamenávány žádné statistické rozdíly; nicméně oba typy ošetření vykazovaly výrazné rozdíly (p = méně než 0,05) ve srovnání s kontrolami a neléčenými.

Histomorfologická pozorování: 14 dní po operaci bylo mikroskopií zjištěno, že materiály pro ošetření, vyrobené z ACP, jsou vysoce biokompatibilní, a byla pozorovatelná pouze velmi slabá zánětlivá reakce. Ze zánětlivých buněk bylo přítomno pouze několik neutrofilů a obrovských buněk. Nebyla zaznamenána žádná migrace těchto buněk nebo jejich průnik do míst mezi oběma laloky. TC 7 Interceed vykazoval v mnoha případech tkáňovou reakci, pokud byly jatemí laloky částečně srostlé; rámcové pozorování odhalilo přítomnost organizovaných kolagenových vláken. Zdá se, že zánětlivá reakce ustupuje, pokud je pomůcka pro ošetření nasycena heparinovým roztokem. Na většině nálezů bylo znát, že biomateriály se zcela odbouraly. Skupina bez ošetření vykazovala střední až silnou zánětlivou reakci.

Experiment 2

Celkem 2 zvířata uhynula během podávání anestetika. Umístění biomateriálů bylo snadno proveditelné, a po umístění se materiály nehýbaly. U zvířat, ošetřených ACP, nebyly pozorovány známky nemoci nebo utrpení po operaci.

Čtyři zvířata, ošetřená kyselinou hyaluronovou o mol. v. 1 200 000, a tři zvířata s Thermogelem uhynula mezi dvěma a pěti dny po operaci. Nekroptické vyšetření ukázalo u všech těchto zvířat vnitřní krvácení.

-25CZ 293968 B6

Zhodnocení tvorby adhezí:

V tomto pokusu, 14 dní po operaci, (Diagram 10), 5% gely ACP 101/94 a 3/94 vykázaly redukci pooperační tvorby adhezí ve srovnání s kyselinou hyaluronovou mol. v. 1 200 000 a s neléčenými kontrolami. Účinek gelů ACP byl srovnatelný s účinkem bariéry z Interceedu, nasycené heparinem. Byly zjištěny statistické rozdíly mezi těmito skupinami a skupinami bez ošetření (p = méně než 0,05). Všechny pomůcky pro ošetření a kontrolu byly zcela absorbovány.

Histomorfologická pozorování:

Při rámcovém pozorování za 14 dní tkáně ošetřené ACP vykazovaly jen slabou tkáňovou zánětlivou reakci, síla granulované tkáně byla jen velmi malá a nebyly zaznamenány žádné nepříznivé reakce na střevě v případě srůstu s přilehlým peritoneálním povrchem. Začaly se organizovat kolagenové fibrily a proces hojení byl dokončen. V případě kyseliny hyaluronové byla pozorována zánětlivá reakce s přítomností značného počtu kolagenových vláken, což je známkou adheze; bylo vidět silnou granulovanou tkáň. Totéž bylo vidět u neošetřených kontrol.

Diskuze

Tvorba adhezí patří mezi hlavní příčiny pooperační nemocnosti v břišní a pánevní chirurgii, často vedoucí k ucpání tenkého střeva a kjiným závažným patologickým komplikacím. Jsou-li postiženy pánevní orgány, srůsty jsou schopny narušit fyziologické funkce, což má za následek neplodnost. Mechanismus pooperační tvorby adhezí a jejich znovuvytváření není ještě dobře probádán. Experimentální svědectví naznačují, že tvorba adhezí mezi dvěma chirurgicky poraněnými povrchy je přirozenou opozicí během procesu hojení, protože je mnohem účinnější zkombinovat dvě místa opravy tkáně do jednoho ohniska hojení, z čehož vyplývá tvorba spojovacích srůstů mezi dvěma přilehlými povrchy.

V tomto screeningu bylo zjištěno, že použití běžného prostředku k zastavení krvácení, Surgicelu, po operaci, a úspěšné umístění biodegradabilní bariéry z derivátu kyseliny hyaluronové zabraňuje tvorbě adhezí. Navíc mohou materiály být použity ve spojení s fíbrinolytiky. Redukce tvorby adhezí ve srovnání s oxidovanou regenerovanou celulosou TC 7 dopadla příznivě.

Biomateriály založené na HYAFF 11 prokázaly dobrou biokompatibilitu a malou tvorbu zánětů. Stupeň rozpadu testovaných biomateriálů z FAB byl odlišný, což je v důsledku rozdílné fyzické formy ošetření: biomateriály HYAFF 11 přetrvávaly několik týdnů. Rozsah kontrolovaných stupňů rozpadu, jichž může být dosaženo při použití těchto derivátů kyseliny hyaluronové, může být užitečně využit pro prevenci adhezí po operacích na odlišných anatomických místech aplikace, např. v gynekologii nebo v břišně - pánevní chirurgii. Výsledky naznačují, že deriváty kyseliny hyaluronové (gáza a membrány z HYAFF 11) mají svou úlohu v prevenci tvorby adhezí po operacích.

Tak, jak byl tento vynález popsán, bude zjevné, že totéž může být obměněno mnoha různými způsoby. Takovéto variace nebudou brány jako něco, co se odchyluje od ducha a cíle vynálezu, a myslí se na to, že všechny takovéto modifikace, jak by byly zřejmé odborníkovi, znalému stavu techniky, budou zahrnuty do rámce následujících patentových nároků.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Složený biomateriál pro prevenci pooperačních adhezí tkání, vy zn a č uj icí se tím, že obsahuje nejméně jeden derivát kyseliny hyaluronové vybraný ze skupiny sestávající z:

   a) benzylesteru kyseliny hyaluronové, kde 75 až 100 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je esterifikováno benzylovým radikálem a až 25 % karboxylových skupin je esterifikováno alkylovým radikálem alifatického alkoholu Cio až C₂o, pod podmínkou, že je esterifikováno nejméně 80 % karboxylových skupin a

   b) autozesítěného derivátu kyseliny hyaluronové kde 0,5 až 20 % karboxylových skupin kyseliny hyaluronové je zesítěno hydroxylovými skupinami téže nebo jiné molekuly kyseliny hyaluronové, přičemž biomateriál je ve formě gelu, membrány nebo ploché síťovány, nebo ploché tkané nebo netkané látky nebo jejich kombinací.
2. 2. Složený biomateriál podle nároku 1, vyznačující se tím, že derivát je úplný benzylester, v němž jsou všechny karboxylové skupiny kyseliny hyaluronové esterifikovány benzylovou skupinou.
3. 3. Složený biomateriál podle nároku 1,vyznačující se tím, že derivát je benzylester, kde 80 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou.
4. 4. Složený biomateriál podle nároku 1,vyznačující se tím, že derivát je benzylester, kde 75 % karboxylových skupin je esterifikováno benzylovou skupinou a zbylých 25 % karboxylových skupin je esterifikováno alifatickým zbytkem alifatického alkoholu Cio až C₂₀.
5. 5. Složený biomateriál podle nároku 4, vyznačující se tím, že alkohol je stearylalkohol nebo palmitoylalkohol.
6. 6. Složený biomateriál podle nároku 1, vyznačující se tím, že autozesítěný derivát má zesítěno 4,5 až 5,0 % karboxylových skupin molekuly kyseliny hyaluronové.
7. 7. Složený biomateriál podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že dále obsahuje nebiodegradabilní syntetický polymer.
8. 8. Složený biomateriál podle nároku 7, v y z n a č u j í c í se t í m , že syntetický polymer je vybrán ze skupiny sestávající se z polypropylenu, polyethylenu, polyesteru a polytetrafluorethylenu.
9. 9. Složený biomateriál podle nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že je ve formě membrány, síťoviny, tkané nebo netkané látky.
10. 10. Složený biomateriál podle nároků 1 až 6, v y z n a č u j í c í se t í m , že je ve formě gelu.
11. 11. Složený biomateriál podle nároků 1 až 10 pro použití v prevenci pooperačních adhezí tkání.
12. 12. Složený biomateriál podle nároku 11 pro použití v prevenci pooperačních adhezí tkání, kde se na tkáň zahrnutou do operace aplikuje složený biomateriál ve formě podle nároků 9 a 10.