CZ286286B6

CZ286286B6 - Aplikační forma, sterilizační prostředek, doplňkové krmivo a způsob sterilizace

Info

Publication number: CZ286286B6
Application number: CZ19962456A
Authority: CZ
Inventors: Nigel Benjamin; Hamish Dougall
Original assignee: Aberdeen University
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2000-03-15
Also published as: JPH09508921A; CN1144484A; PL316033A1; ATE264685T1; EP0746327A1; JP3875262B2; CA2183549A1; ES2218541T3; DE69532921D1; AU1669995A; DE69532921T2; CA2183549C; FI114852B; NO311494B1; WO1995022335A1; NO963446L; CZ245696A3; EP0746327B1; FI963232A; KR100385297B1

Abstract

Řešení se týká antimikrobiálního prostředku, který obsahuje farmaceuticky přijatelné činidlo pro zajištění kyselé reakce a farmaceuticky přijatelný zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru pro tyto ionty, přičemž činidlo pro zajištění kyselé reakce i zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou uloženy odděleně a určeny pro uvedení do styku při použití prostředku za uvolnění oxidu dusnatého, činidlo pro zajištění kyselé reakce i zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou obsaženy ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem a činidlo pro zajištění kyselé reakce je přítomno v množství, dostatečném pro snížení pH příslušného prostředí pod hodnotu 4. Součást řešení tvoří také použití tohoto prostředku ke sterilizaci a jako doplňkové krmivo.ŕ

Description

Antimikrobiální prostředek a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká antimikrobiálního prostředku pro léčení stavů, způsobených mikroorganismy u člověka i jiných živočichů, a jeho použití ke sterilizaci a jako doplňkového krmivá s antibakteriálním účinkem.

Dosavadní stav techniky

Přestože nitrity byly užívány jako konzervační prostředky v potravinářství řadu let, nebyl až dosud osvětlen mechanismus, jímž dochází při použití těchto prostředků k hubení mikroorganismů. Nyní bylo zjištěno, že nitrity v nízkých koncentracích mohou účinně snížit populace bakterií, houbových organismů i virů v živočišném organismu v případě, že pH prostředí je nižší než 4. Je velmi pravděpodobné, že právě tímto mechanismem dochází u savců k ničení organismů, které se do organismu savců dostávají polknutím společně s potravou.

V důsledku cirkulace dochází u člověka ke kontinuálnímu přívodu dusičnanů do úst, kde dochází k rychlé redukce na dusitany bakteriemi na jazyku. Účinnost vylučování dusičnanu slinami spočívá v tom, že běží o přívod prekurzoru pro vznik oxidu dusíku rozkladem nitritu.

Bylo prokázáno, že v případě, že se vystaví kvasinky Candida albicans a bakterie Escherichia coli působení koncentrací nitritu ve slinách a současně kyselým podmínkám, jaké jsou obvykle v žaludku na dobu 1 hodina, dochází v závislosti na použité dávce ke snížení doby přežívání těchto mikroorganismů. Je zřejmé, že tvorba oxidů dusíku a/nebo kyseliny dusité v ústech a v žaludeční a střevní soustavě, zvláště v její horní části z okyseleného dusitanu je preventivní ochranou před mikrobiální infekcí.

V ústech bakterie rychle redukují dusičnany na dusitany. Jakmile se dusitany dostanou do kyselého prostředí v žaludku, dochází protonací dusitanu ke vzniku kyseliny dusité (pKa přibližně 3,5). Z kyseliny dusité se dále tvoří oxidy dusíku, jak je dále znázorněno:

NO (1)

2HNO₂ = H₂O + N₂O₃ (2) (3)

Endogenní dusičnan i dusičnan z potravy je účinně koncentrován slinnými žlázami na více než desetinásobek koncentrace v plasmě a pak vylučován slinami. To znamená, že sliny jsou kontinuální zdrojem dusičnanu v horní části zažívací soustavy. Přeměna dusičnanu v horní části zažívací soustavy. Přeměna dusičnanu na dusitan v ústech je rychlá a je u člověka omezena na povrch jazyka, u krysy je omezena na poslední třetinu jazyka.

Funkce oběhu dusičnanu ze střev do slin není známa, avšak její příčinou může být skutečnost, že žaludeční kyselina sama o sobě často nestačí ke zničení požitých mikroorganismů a že primární úloha vylučování dusičnanu ve slinách a přeměna na dusitan spočívá v tom, že jde o prekurzory oxidů dusíku v žaludku, tyto oxidy pak zničí požité mikroorganismy.

Svrchu uvedený mechanismus je pravděpodobně využitelný k destrukci mikroorganismů na pokožce, zejména v případě napadení plísněmi, jako u tak zvané atletické nohy nebo při tinea pedis.

- 1 CZ 286286 B6

Bylo zjištěno, že dusitany v koncentracích až 4 % v interním nosiči ve formě krémů nebo mazání při smísení s organickou kyselinou, například kyselinou salicylovou produkují oxidy dusíku, které účinně hubí infekční organismy na pokožce včetně hub, kvasinek, bakterií a virů. 5 Kombinace dusitanů a kyseliny způsobí mírné zarudnutí nebo erythem pokožky vzhledem k uvolnění oxidů dusíku, nedochází však k zánětu pokožky.

Svrchu uvedený mechanismus je také možno využít ke sterilizaci různých předmětů, například umělého chrupu při použití sterilizačního roztoku dusitanu. Běžné roztoky, které působí účinnou 10 sterilizaci umělého chrupu mají obvykle nepříjemnou chuť vzhledem k použití dezinfekčních prostředků na bázi chloru. V případě použití kombinace dusitanu a kyseliny je možno získat roztok s antimikrobiálním účinkem, který je bez chuti nebo má jen nepatrnou pachuť. Další předměty, například kontaktní čočky je možno sterilizovat obdobným způsobem.

Gastroenteritis je v současné době stále ještě hlavním programem při pěstování vepřů a dalších užitkových zvířat. Jde zejména o infekce enteropatogenními kmeny Escherichia coli, zvláště těmi, které obsahují antigen K88. Přestože se kyselá reakce v žaludku považuje za hlavní obranný systém hostitele, který vytváří barieru proti infekci, která se do organismu dostává ústy, je v řadě případů zřejmě neúčinná a organismy se tak dostávají u těchto zvířat do distálnějších 20 částí střev.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří antibakteriální prostředek, který obsahuje farmaceuticky přijatelné činidlo pro zajištění kyselé reakce a farmaceuticky přijatelný zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru pro tyto ionty, přičemž činidlo pro zajištění kyselé reakce i zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou uloženy odděleně a určeny pro uvedené do styku při použití prostředku za uvolnění oxidu dusnatého, činidlo pro zajištění kyselé reakce i 30 zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou obsaženy ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem a činidlo pro zajištění kyselé reakce je přítomno v množství, dostatečném pro snížení pH příslušného prostředí pod hodnotu 4.

Činidlem pro zajištění kyselé reakce je s výhodou organická kyselina, například kyselina 35 salicylová nebo askorbová. Prekurzorem pro dusitanové ionty může být dusičnan alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin, schopný přeměny působením enzymu.

Farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem může být interní krém nebo mazání. Zvláště výhodnou formou je prostředek, v němž činidlo pro zajištění kyselého prostředí a zdroj 40 dusitanových iontů nebo prekurzor pro tyto ionty odděleně uloženy v krému nebo mazání pro smísení přímo v příslušném prostředí pro uvolnění dusitanových iontů.

Kyselá složka může být dodávána také ve formě tablet nebo v kapalné formě.

Uvedený prostředek je možno použít ke sterilizaci předmětů tak, že se

1) připraví farmaceuticky přijatelné činidlo pro zajištění kyselosti prostředí a farmaceuticky přijatelný zdroj dusitanových iontů,

2) činidlo pro zajištění kyselosti se smísí se zdrojem dusitanových iontů v kapalném nosiči nebo ředidle ve styku s předmětem, který má být sterilizován při snížení pH pod hodnotu 4 za současné sterilizace předmětu dusitanovými ionty.

-2CZ 286286 B6

Podstatu vynálezu tvoří rovněž použití prostředku jako doplňkového krmivá, které obsahuje farmaceuticky přijatelné činidlo pro zajištění kyselosti a farmaceuticky přijatelný zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru pro tyto ionty v množství, které je dodatečně k dosažení příznivého antibakteriálního farmaceutického účinku, avšak při němž ještě nedochází k příznivým účinkům u zvířete.

Činidlem pro zajištění kyselosti může být stejně jako svrchu kyselina salicylové nebo askorbová a zdrojem dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru pro tyto, ionty může být anorganický dusičnan stejně jako svrchu. V případě, že jde o krmivo pro vepře, mělo by být doplňkové krmivo použito v množství, které zajistí pro každé dospělé zvíře dávku 0,3 až 5,0 g/den, s výhodou dávku přibližně 1 g/den.

Vynález bude dále podrobněji vysvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy a příklady provedení.

Přehled obrázků na vý kresech

Na obr. 1 je znázorněn diagram, prokazující vliv působení dusičnanu a odlišné koncentrace vodíkových iontů na přežívání kvasinek Candida albicans. Na vertikální ose je uvedena optická hustota v jednotkách absorbance, na horizontální oseje uvedeno pH.

Na obr. 2 jsou znázorněny křivky růstu pro Escherichia coli po působení samotné kyseliny nebo po působení kombinace kyseliny a dusitanu. Na vertikální ose je znázorněna optická hustota v jednotkách absorbance, na horizontální oseje uveden čas v hodinách.

Na obr. 3 jsou znázorněny křivky růstu pro Escherichia coli po působení prostředí o pH 3 a současně různých koncentracích dusitanů, na vertikální ose je znázorněna optická hustota v jednotkách absorbance, na horizontální oseje znázorněn čas v hodinách.

Na obr. 4 je znázorněna tvorba oxidu dusnatého z dusitanu sodného při různých hodnotách kyselosti, na vertikální ose je znázorněna koncentrace oxidu dusnatého v nM a na horizontální oseje uvedena hodnota pH.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Jak je znázorněno na výsledcích, shrnutých na obr. 1, je možno prokázat účinek svrchu uvedené kombinace podle vynálezu na kvasinky. Postupuje se tak, že se Sabouradův bujón naočkuje jedinou kolonií Candida albicans a kultura se pěstuje přes noc. 10 mikrolitrů bujónu se pak přidá k 940 mikrolitrů Sabouraudova bujónu s citrátovým/fosfátovým pufrem a mimoto se přidá ještě 50 mikrolitrů dusitanu sodného do konečné koncentrace 250 mikromol nebo destilovaná voda v případě kontrolního pokusu. Směs se inkubuje 1 hodinu při teplotě 37 °C, pak se odebere podíl 10 mikrolitrů a ten se pěstuje ve 190 mikrolitrech standardního Sabouraudova bujónu za kontinuálního protřepávání (Gallenkampův inkubátor) na mikrotitrační plotně s 96 vyhloubeními při teplotě 37 °C. Růst se sleduje měřením optické hustoty při 570 nm v pravidelných časových intervalech. Výsledky jsou uvedeny jako průměr ze 16 oddělených pokusů.

Na obr. 1 je znázorněn vliv působení dusitanu a různé koncentrace vodíkových iontů na přežívání Candida albicans. Bílé sloupce jsou sloupce pro růst Candida albicans po jedné hodině po vystavení působení samotné kyseliny, zatímco tmavé sloupce vyjadřují růst po působení

-3 CZ 286286 B6 kyseliny a 250 mikromol dusitanu sodného. Statisticky významný rozdíl proti kontrolám je možno prokázat při p > 0,05 (Mann-Whitneyův U-test). Je zřejmé, že inkubace Candida albicans v kyselém prostředí po dobu jedné hodiny má jen malý vliv na vypěstované množství životaschopných organismů, zatímco po přidání dusitanu sodného v koncentraci 250 mikromol dochází k uhynutí mikroorganismu při snížení pH pod hodnotu 4. Dusitan byl účinný při hubení Candida albicans při pH 1 při všech koncentracích nad 250 mikromol (údaje nejsou uvedeny). Dusitan v množství 5 nN způsobil uhynutí mikroorganismu až do pH 5. Významné je, že náhodného vzorku deset pracovníků v laboratoři bylo možno při běžné stravě na lačno prokázat koncentraci dusitanu ve slinách v rozmezí 23 až 220 mikromol, průměrně 114 mikromol, avšak po použití 200 mg dusičnanu draselného v roztoku došlo po 40 minutách k vzestupu nad 409 až 1890 mikromol, v průměru na 1030 mikromol.

Příklad 2

Na obr. 2 jsou znázorněny růstové křivky pro Escherichia coli po působení kyseliny a 250 mikromol dusitanu (vyplněné symboly). Růst byl statisticky významně snížen při pH 2, 3 a 4 v přítomnosti dusitanu ve srovnání s kontrolou při p < 0,05.

Bylo užito téhož postupu jako v případě výsledků, uvedených na obr. 1 s tím rozdílem, že byl užit kmen NCTC 10 418 Escherichia coli, pěstovaný na MacConkeyově agaru a dále byl užit živný bujón (Oxoid CM1) místo Sabouraudova bujónu. Výsledky, znázorněné na obr. 2 jsou průměrem z 20 pokusů. Jak je zřejmé z obr. 2, Escherichia coli je citlivější k působení kyseliny než Candida albicans. Nicméně působení pH 2 na dobu 1 hodiny neusmrtí všechny organismy, jak je zřejmé z jejich dalšího růstu v živném bujónu. Při pH 3 již přežívá velký počet organismů. Po přidání 250 mikromol dusitanu k prostředí zcela usmrtí Escherichia coli při pH 2 a statisticky významně sníží životaschopnost tohoto organismu při pEI 3 a 4. Dusitany v této koncentraci nemají žádný účinek při pH vyšším než 4.

Příklad 3

Na obr. 3 jsou znázorněny růstové křivky Escherichia coli po působení pH 3 a různých koncentracích dusitanů v rozmezí 10 až 1000 mikromol. Postup byl stejný jako při získávání výsledků z obr. 2. Z obr. 3 je zřejmé, že existuje přímý vztah mezi toxickým účinkem dusitanů na Escherichia coli a koncentrací těchto látek při pH 3. Již koncentrace 10 mikromol měla zřetelný účinek, při koncentraci 1 mM došlo k úplnému uhynutí Escherichia coli.

Příklad 4

Na obr. 4 je znázorněna tvorba oxidu dusnatého z dusitanu sodného v mikromol při různě kyselém prostředí. Bylo užito týchž podmínek jako v případě obr. 1. Dusitan byl přidáván k citrátovému/fosfátovému pufru k dosažení konečných koncentrací, znázorněných na obr. 4. Koncentrace oxidu dusnatého v pufru byly měřeny příslušným měřicím zařízením (ISO-NO, World Precision Instruments), napojený na systém Maclab a na počítač Macintosh. Měření bylo zaznamenáváno kontinuálně a odečítáno každé 2 minuty po dosažení stálé koncentrace oxidu dusnatého. Na obr. 4 je znázorněno uvolnění oxidu dusnatého v důsledku snížení pH. Oxid dusnatý vzniká za podmínek, znázorněných na obr. 4, snadno prochází buněčnými membránami, má vysokou afinitu pro respirační enzymy, obsahující železo a síru a poškozuje bakteriální DNA. Při enzymatické produkci působením aktivovaných bílých krvinek bude kyselina dusičná usmrcovat mikroorganismy z Leishmania sp., Staphylococcus., Francisella sp. a Microbacterium

-4CZ 286286 B6 a také Candida albicans. Reakce se superoxidy v kyselém prostředí může mimoto vést ke tvorbě vysoce reaktivních hydroxylových radikálů.

Příklad 5

Aby bylo možno prokázat účinek kombinace 2 % hmotnostních kyseliny salicylové a 2 % hmotnostních dusitanu sodného u devíti dobrovolníků s mikrobiologicky prokázanou houbovou infekcí nohou, bylo užito postupu, při němž byla svrchu uvedená směs obou látek kontinuálně užívána každý den, po dvou týdnech došlo u všech nemocných s výjimkou jednoho k vymizení mikroorganismů. Pokud jde o příznaky, které byly hodnoceny podle stupnice, odděleně hodnotící zrudnutí, tvorbu puchýřků, hnisavých ložisek, olupování, svědění a tvorbu stroupků k poklesu z průměrného hodnocení 7 před začátkem léčení na průměrnou hodnotu 2 po ukončení léčení.

Příklad 6

Byl sledován účinek použití dusičnanu nebo dusitanu místně v ústech ve formě pasty na zuby, ústní vody nebo jiného nosného prostředí ke snížení počtu organismů, vyskytujících se v zubním povlaku a způsobujících zubní kaz a k prevenci infekce Candida albicans nebo jiných organismů a bylo prokázáno, že aplikace uvedených látek je účinná.

Pozorování, že oxidy dusíku, vznikající neenzymaticky z dusitanů za podmínek, podobných podmínkách v žaludku usmrcující Candida albicans a Escherichia coli rozšiřují svrchu uvedená pozorování i na zažívací soustavu. Escherichia coli je blízce příbuzná bakteriím Salmonella, Shigella a dalším patogenním enterobakteriím, které způsobují záněty žaludku a střev u savců.

Tyto výsledky vysvětlují účinnou sekreci dusičnanů slinným žlázami. Dusičnan je neškodným prekurzorem, z něhož vznikají po přeměně na dusitany v kyselém prostředí látky, hubící mikroorganismy. Je možné, že mikroorganismy z čeledi Lactobacillus přechodně produkují dostatečné množství kyseliny v ústech po jídle s obsahem uhlohydrátů k potlačení růstu patogenních bakterií v ústech, je však zřejmé, že aplikace malého množství dusičnanů může být žádoucí v kontaminovém prostředí jako prekurzor nitrosaminú.

Produkce oxidů dusíku v zažívací soustavě může být nedostatečná v případě, že ústní mikroorganismy, které převádějí dusičnany na dusitany jsou potlačeny, například v případě léčení antibiotiky se širokým spektrem. Podobně v případě, že je snížena produkce žaludeční kyseliny nebo v případě, že je snížen přívod dusičnanů, který je do značné míry závislý na požívání listových zelenin, může být tento ochranný mechanismus porušen. Tím vznikají situace, při nichž mohou snadněji vzniknout orální a střevní infekce.

Svrchu uvedené studie byly zaměřeny na Candida albicans, Escherichia coli a další uvedené organismy, může však být důležité organismus chránit i proti dalším závažným patogenním mikroorganismům, které mohou po použití způsobit dvanáctníkové vředy, jako je například Helicobacter pylori, v případě amoebové dysenterie a v případě přítomnosti střevních parazitů. Ve všech těchto případech je možno využít aplikační formy podle vynálezu a dalších předmětů, tvořících podstatu vynálezu.

V případě doplňkového krmivá jde o levný a jednoduchý prostředek prevence zánětu žaludku a střev v chovu vepřů modifikací přímo dusičnanů v jejich krmivu bez použití antibiotik.

Claims

-5CZ 286286 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Antimikrobiální prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelné činidlo pro zjištění kyselé reakce a farmaceuticky přijatelný zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru pro tyto ionty, přičemž činidlo pro zajištění kyselé reakce i zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou uloženy odděleně a určeny pro uvedení do styku při použití prostředku za uvolnění oxidu dusnatého, činidlo pro zajištění kyselé reakce i zdroj dusitanových iontů nebo dusičnanového prekurzoru jsou obsaženy ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem a činidlo pro zajištění kyselé reakce je přítomno v množství, dostatečném pro snížení pH příslušného prostředí pod hodnotu 4.
2. Antimikrobiální prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako činidlo pro zajištění kyselé reakce obsahuje organickou kyselinu.
3. Antimikrobiální prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že jako činidlo k zajištění kyselé reakce obsahuje kyselinu salicylovou nebo askorbovou.
4. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že jako dusičnanový prekurzor obsahuje dusičnan alkalického kovu nebo kovu alkalických zemin.
5. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že je ve formě pro místní podání na pokožku.
6. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že jako farmaceutický nosič obsahuje inertní krém nebo mazání a činidlo pro zajištění kyselosti a zdroj dusitanových iontů jsou uloženy odděleně do odpovídajícího krému nebo mazání pro smísení a uvolnění dusitanových iontů na určeném místě použití.
7. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků laž4, vyznačující se tím, že má formu tablety nebo kapalnou formu.
8. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků laž7, vyznačující se tím, že je upraven pro použití na dermatomykózy nohou nebo tinea pedis.
9. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků laž8, vyznačující se tím, že při použití organické kyseliny jako prostředku k zajištění kyselosti je koncentrace dusitanu v inertním krému nebo mazání až 4 % hmotnostní, vztaženo na hmotnost prostředku.
10. Antimikrobiální prostředek podle některého z nároků laž9, vyznačující se tím, že je upraven pro léčení stavů, spojených s C. albicans, čeledi Leishmania a čeledi Staphylococcus.
11. Použití antimikrobiálního prostředku podle nároků 1 až 4 ke sterilizaci předmětů.
12. Použití antimikrobiálního prostředku podle nároků 1 až 4 jako doplňkového krmivá.

4 výkresy