JP3355186B2 - 改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法 - Google Patents

改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明はタンパク質、特に工業的に利用されている酵
素及び医薬品において利用されているタンパク質の改
質、並びにこれによって生産される改質タンパク質、か
かるタンパク質変異体を含む組成物、更には医学を含む
種々の分野におけるこの変異体の利用に関する。本発明
に関して、タンパク質を免疫学びタンパク質化学方法を
利用してエピトープ地図化し、そして遺伝子工学を介し
て事実上それらのアミノ酸配列を変え、これによってそ
れらの免疫活性を変えてそれらの抗原性を弱くし、これ
により本発明の酵素に対する暴露にかけられた人間を含
む動物においてアレルギー反応が生ずる危険性が低めら
れる。
発明の背景 種々のタンパク質、例えば酵素は工業及び家庭におい
てますます利用されてきている。タンパク質であること
で、それらは人間及び動物における免疫反応を刺激する
ことがあるであろう。
その他のタンパク質、例えばホルモンは病気及び疾患
の種々の症状の処置及び／又は診断のための医薬品にお
いてますます利用されており、これらのタンパク質は人
間を含む動物の免疫系に注射されるか、又は別の方法で
提供される。
提供の方法に依存して、この刺激は種々のタイプの抗
体の生産及び細胞応答をももたらしうる。これらの経由
のうち、少なくとも抗体の一タイプであるものは人間及
び動物に有害な作用を有しうる。
IgEそしておそらくIgG4の生産は例えば鼻炎、結膜炎
等の症状を示すアレルギー症状をもたらしうる。
このようなタンパク質の利用の増大に伴い、免疫学を
基礎としたその他の有害な反応が見い出されるであろう
ことを無視することはできない。
タンパク質の利用におけるこれらの欠点は長年知られ
ており、そして種々の解決案がこれらを解決するために
利用されてきた。
工業用酵素の分野において、製品に対する暴露に由来
するアレルギー反応による問題を回避するために最も頻
繁に利用されている方法は、この酵素を固定化、粒状化
及びコーティングすることによる種々の方法においてこ
の酵素を調合してきており、これによって通常の取扱い
及び保存の際のタンパク質材料の任意の放出を回避して
きた。
しかしながら、この解決案はこの酵素を、それが相互
作用することを意図する材料に接触させること、例えば
この酵素を溶液等になじませることを妨げ、そして更に
はこの酵素の若干の放出は暴露に対して感受性である対
象者におけるアレルギー反応の原因となりうる。
医薬品の分野において、数多くの利用されている方法
は、特に人間もしくは相当の動物起原のタンパク質、又
は少なくとも一次構造が人間（もしくは問題の動物）の
タンパク質と同じであるタンパク質を利用している。
これは数多くの状況において有効であると証明されて
いるが、しかしながら問題のタンパク質に対する動物の
同等物の存在を定着させることが常に可能であるわけで
はなく、又は一定の改質化タンパク質は天然タンパク質
と比べて一定の利点を有することが見い出されている。
かかる状況において、処置を受ける又は診断される対象
者においてアレルギー反応が生ずる危険性がある。
従って、タンパク質であってアレルギー反応をあまり
又は全っく発生させずに、それらの本来の活性が、それ
らが機能し続けられる程度にまで保持され、且つ、それ
ら本来の目的に従って利用されうるタンパク質の開発の
要望がある。
認識され、且つ、免疫学的に結合するタンパク質分子
の部分をエピトープと呼んでいる。例えば30000ダルト
ンの範囲における分子にとっては、12エピトープぐらい
あることがある。
エピトープは免疫学的細胞及び抗体に結合する。一定
のエピトープは他のものより重要であり、これらをマイ
ナーエピトープと対比させてメジャーのものと呼んでい
る。
これらのエピトープにおけるわずかなる変化はそれら
の結合における結合力に影響を及ぼしうることが見い出
されている（Walsh,B.J.とHowden,M.E.H.（1989）:A me
thod for the detection of IgE binding sequences of
allergens based on a modification of epitope mapp
ing,Journal of Immunological Methods,121,275−280;
Geysen,H.M.,Tainen,J.A.,Rodda,S.J.,Mason,T.J.,Alex
ander,H.,Getzoff,E.D.とLerner,R.A.（1987）:Chemist
ry of Antibody Binding to a Protein.Science.135,11
84−90;Geysen,H.M.,Mason,T.J.とRodda,S.J.（1988）:
Cognitive Features of Continuous Antigenic Determi
nants.Journal of molecular recognition.1,32−41。
これはおそらくはメジャーからマイナーなエピトープ
へと変換された重要性の低められたかかる変化したエピ
トープをもたらすことがあり、又はその結合力を高い可
逆性レベルにまで、即ち、有効でない結合にまで弱める
ことさえもある。この現象はエピトープロスと呼ばれる
ことがある。
上記の研究は全て、問題のエピトープを擬態する合成
ペプチド及びそれらの変異体に基づいて、研究されてい
るエピトープにおけるアミノ酸残基の相対的重要度を立
証するために実施されており、従ってこれらの研究はタ
ンパク質の三次構造においてのみ見い出せる現象、例え
ば折りたたみ又は塩架橋の樹立が機能する、完全タンパ
ク質の一部としてのその自然環境におけるエピトープの
あらゆる効果を実証してはいない。
発明の概要 本発明の目的は、低められた免疫応答を喚起するタン
パク質変異体を獲得するために、タンパク質のどのアミ
ノ酸配列を改質するかを選ぶための方法、及びこのよう
なタンパク質変異体の提供にある。
従って、本発明はその第一の観点において、親タンパ
ク質により喚起される応答と比べて、人間を含む動物に
おいて低められた免疫原応答を喚起するタンパク質変異
体を生産する方法に関する。
このため、このタンパクを免疫学及びタンパク質化学
方法を利用してエピトープ地図化し、そして種々のエピ
トープを決定及び特徴付けする。
これに続いて、前記エピトープの少なくとも１つを、
前記親タンパク質の発現についてコードするDNA分子の
突然変異を介して、又は前記変異タンパク質の発現をコ
ードするDNA分子の合成を介して変質させる。これはタ
ンパク質工学業界において知られるよく樹立された技術
を利用して実施される。
突然変異させた又は作製したDNA分子を次に適当な宿
主へのトランスフェクションの形質転換のためのベクタ
ーに挿入する。ここでこのベクターは機能的であり、こ
れにより前記の突然変異させた又は作製したDNA分子は
前記宿主のゲノムの中に機能的に組込まれ、そして注目
のタンパク質変異体はこの宿主の中で発現される。
最後にこのタンパク質変異体を回収し、そして精製す
る。
第二の観点において、本発明は上記の方法により生産
されたタンパク質に関する。この観点のもとで、工業用
酵素、例えば洗剤酵素、例えば、プロテアーゼ、リパー
ゼ、セルラーゼ、アミラーゼもしくはオキシダーゼ、処
理酵素、例えばアミラーゼ、リアーゼ、リパーゼもしく
はセルラーゼ、医薬タンパク質、例えばホルモン、例え
ばインスリン、HCGもしくは成長ホルモン、又は医薬酵
素、例えばＶ因子、VII因子、VIII因子、又はその他の
タンパク質、例えばインターロイキンもしくはインター
フェロンが特に注目される。
第三の観点において、本発明は第二の観点のタンパク
質を含んで成る組成物、例えば洗剤、又は人間を含む動
物身体における種々の症状の予防及び／もしくは緩和治
療及び／もしくは診断において利用するための組成物に
関する。
第四の観点において、本発明は人間を含む動物身体に
おける種々の症状の予防及び／又は緩和治療及び／又は
診断におけるかかる組成物の利用に関する。
図面の簡単な説明 本発明を、特定の実施例及び添付図面を含む本明細書
以下の部分において更に詳しく説明及び例示し、ここで 図１〜６は対照の抗血清に対する酵素変異体の結合数
の、その濃度の関数としてのプロットを示す。
発明の詳細な説明 本発明の第１の観点に従い、タンパク質において機能
的に存在している種々のエピトープを見つけ、そして特
徴付けするためにエピトープ地図化を利用する。その
後、このエピトープにおけるどのアミノ酸を変えるかを
選ぶためにこの情報を利用する。
現在よく樹立されている遺伝子工学の技術を介してこ
の変化が実行され、そしてタンパク質変異体が生産され
たら、この新しいタンパク質変異体を分析し、且つ、こ
の変化がメジャーからマイナーへのエピトープ性又はエ
ピトープロスへの変換をもたらすかを決定するために免
疫学及びタンパク質光学技術を利用する。
この情報は、生産したタンパク質変異体がそのタンパ
ク質に関して樹立されている要求に対応するか、又は何
らかのその他の変化が実行されたかどうかを明らかとす
るために用いる。
本発明を介して、問題のタンパク質に対する暴露にか
けられた環境及び動物に、低められた免疫性、例えばア
レルギー性、潜在的危険性を提供するであろう、タンパ
ク質、特に工業用酵素及び医薬タンパク質を生産するこ
とが可能となった。
従って本発明のタンパク質又は酵素の変異体は、製
造、使用に立ち合う人間（及び動物）並びに環境に対し
て低い危険性を提供するであろう。
タンパク質の地図化の実施において、注目のタンパク
質（対照タンパク質と呼ぶ）及び遺伝子工学又は化学改
質によって作ったその変異体を抗体の生産のために利用
する。抗体は抗原における種々のエピトープを認識し、
そしてその他のしばしば対応する抗原と交差反応するポ
リクローナル（抗血清のような）、単一の抗原を認識す
るモノ特異性、単一のエピトープを認識するエピトープ
モノ特異性、又は単一のエピトープを認識し、そして抗
体を生産する細胞と不死細胞、例えば癌細胞との融合を
介して生産されるモノクローナルであることができる。
ポリクローナル抗体はポリ特異的状態においてタンパ
ク質抗原と反応するであろう。即ち、抗原におけるそれ
ぞれのエピトープとそれぞれが反応する数多くの特異性
を有するか、又は異なる対応エピトープと異なる反応性
を示すであろう。更に、ポリクローナル抗体はしばしば
対応の抗原と交差反応するであろう。モノ特異性抗体は
一定の抗原に対するその特異性に従って単離されたポリ
クローナル抗体であり、かかるモノ特異性抗体は通常非
常に限定された数のエピトープにのみ特異的であり、そ
して通常１エピトープにのみ特異的である。
エピトープモノ特異性抗体は、一定のエピトープに対
するその特異性に従って単離したポリクローナル抗体で
ある。かかるエピトープモノ特異性抗体は１エピトープ
に対してのみ特異的であるが、しかしながらそれらはし
ばしばいくつかの種類の抗体生産細胞により生産される
ことがあり、従って同一ではない。
モノクローナル抗体は、抗体生産細胞と不死細胞との
細胞融合の現在よく樹立された技術によって生産された
エピトープ特異性抗体である。１クローンより生産され
たモノクローナル抗体は全て同一である。
生産された抗体は免疫用タンパク質抗原に結合するこ
とができる。更に、もし完全又は部分的に同一なエピト
ープが別のタンパク質の中に存在していると、この抗体
はそれらにも結合することが可能であろう。もし完全な
同一性があるなら、認識及び結合性は同じであろう。も
し部分的に同一なエピトープがあるなら、その認識性は
異なり、そして結合力は低いであろう。もしこのエピト
ープがないのなら、この抗体は結合しないであろう。
ポリクローナル抗体を利用する地図化は、２段階に分
けることができる： −ｉ）全ての注目のタンパク質に対する抗体調製物の反
応性の測定。
−ii）別のものと反応させた後の、ある抗原と反応する
のに残っているその反応性の測定。
（ｉ）由来の結果は、調べた変異体の免疫性及びアレル
ギー性能力についての情報を提供するであろう。これに
従い、低められた能力を示すいくつかの変異体は注目の
タンパク質変異体であると証明されることができ、そし
て増大した能力を示すその他のものは免疫学的見地から
注目に値しないと考えられる。
（ii）由来の結果は以下に関する情報を提供するであろ
う： −iia）どのエピトープが多かれ少なかれ免疫性／アレ
ルギー原であるかを示す、エピトープにおける変化。
−iib）エピトープのロス（たとえある抗原の最大濃度
でさえも、対照抗原に対する反応性を完全に撲滅しない
であろう）、又は −iic）新しいエピトープの樹立（たとえ対照抗原の最
大濃度でさえも、変異体に対する反応性を完全に撲滅し
ないであろう）。
この情報より、生産のためにどの変異体を利用できる
かが明らかにされうる。
特定のタンパク質変異体はタンパク質工学の業界にお
ける当業者に現在よく知られている方法により生産され
ることができ、そして莫大な数の刊行物、例えば国際公
開番号WO/06279（NOVO INDUSTRI A/S）及び国際特許出
願PCT/DK90/00164（NOVO INDUSTRI A/S）に記載されて
おり、どちらものその関連の章を、本明細書に参考とし
て組れている。
実施例 選んだ対照タンパク質抗原はアルカリホスファターゼ
の変異体、ズブチリシン309、SP436であり、その作製及
び生産はそれが示されている上記した国際公開番号WO/0
6279（NOVO INDUSTRI A/S）に詳しく記載されている
（ｉ）。SP436変異体は野生型ズブチリシン309に関して
アミノ酸において２つの変化、即ち、G195E＋M222Aを含
んで成る。国際特許出願PCT/DK90/00164（NOVO NORDISC
A/S）は遺伝子工学によって作った異なる変異体の生産
を示している。野生型酵素は通常の発酵によって生産さ
れ、そして抗体はラットに由来するポリクローナルであ
る。
SP436分子は269個のアミノ酸残基を含んで成るタンパ
ク質であり、そしてこれはよく知られているズブチリシ
ンBPN′と比べて６つの欠失を有している。種々のズブ
チリシンのアミノ酸配列についての更なる参考のため国
際公開番号WO/06279（NOVO INDUSTRI A/S）及び国際特
許出願PCT/DK90/00164（NOVO NORDISK A/S）を再度参照
されたい。ここではいくつかのプロテアーゼについての
アミノ酸配列、ズブチリシンBPN′の配列に基づくズブ
チリシン酵素についての番号付け、及びアミノ酸配列に
おける変化を示すための表示法が記載されている。それ
に由来する番号付け及び表示法を本明細書及び添付の請
求の範囲に採用する。
免疫 試験動物としてラットを選び、これはそれらが論文に
従って、ヒトIgEをそのマスト及び好塩基性細胞膜上に
結合させることができ、且つ、ヒトのマスト及び好塩基
性細胞膜上に結合するであろうIgEを同時に有する唯一
の正常な研究室動物であることの事実に基づく。
この動物を、３匹のラットづつの12のグループに分け
た。免疫のため、野生型（wt）ズブチリシン309及びそ
の11種の変異体を選んだ。これらを以下の表Ｉに示す。
注射量は常に30μg/動物／免疫とした。各動物は６回
の注射を受けた。
選ばれた12種のタンパク質全てをフロインドの完全ア
ジュバントにおいて１回、フロインドの不完全アジュバ
ントにおいて１回、そして0.9％のNaClにおいて４回注
射した。
各免疫の１週間後に血液を採取したが、ただし最終的
な全採血に関しては、最後の免疫の５日後に行った。
凝血後、各グループにおける３匹の動物全てに由来す
る血清をプールした。
本報告において記載する分析作業は、３回目の血液採
取の後の12種の血清プールに基づく。
分析作業は２シリーズの分析Ａ及びＤにおいて行い、
両方ともELISA技術である。
Ａシリーズ： １又は複数枚のプレートのウェルをコートするために
１種類のタンパク質を利用した。このタンパク質は天然
（野生型）又は変異体でありうる。
この分析において12種の異なる血清プールをこのコー
ト化ウェルの中でインキュベートする。この血清全ては
種々のタンパク質に対して喚起させてある。もし変異体
が類似であるなら、この血清はその反応パターンにおい
ても類似であると予測される。各血清プールをそれ自体
の一連のウェルの中で希釈系列において試験した。
ラットの抗体の潜在的な結合性は、ペルオキシダーゼ
ラベル化抗ラット抗体の結合を介して識別される。
もしラットの抗体がこの酵素コーティングに結合する
なら、それらはペルオキシダーゼラベル化抗ラット抗体
によって比例的な状況において結合されるであろう。
この手法における色の存在は、酵素特異性ラット抗体
の存在の比例的な識別及び測定可能な表示を提供する。
簡単な手順は以下の通りである： １）固相の酵素コーティング。
２）固相上の残留結合点のアルブミンブロッキング。
３）希釈系列における血清をインキュベートし、このコ
ート化酵素に酵素活性抗体を結合させる。
４）ペルオキシダーゼラベル化抗ラット（IgX）抗体。
５）発色。
６）測定。
12グループの血清を上記の手順に従って、１種類のタ
ンパク質（即ち、wt又は変異体）に対する反応性を調べ
た。種々のタンパク質を１つづつ、12グループの血清に
より試験した。
この応答を、特定のタンパク質、即ち、対照によりも
とから免疫された血清グループと比較した。
これらの結果は個々タンパク質の抗体認識能力に基づ
く情報を提供する。対照に対する３種類の反応性、即
ち、同じ／高い／低い反応性に分類することができた。
以下の表IIを参照のこと。このアッセイのデザインのた
め、エピトープロス及び／又はエピトープ変化（結合力
の低下を示す）の現象は互いに区別できなかった。
IgG応答（表II）は３通りの効果を示した： １）各血清グループ（抗−SP436を除く）は、その他の
いずれのものよりもそれ自体の免疫原と強く反応する。
特に血清no.12（抗−wt）はその他のタンパク質に対し
て劇的に低い応答を示す。
２）いくかつの血清は他のものよりも一般に高い応答を
示す。ここの後者の特徴はIgG及びIgE分布と共に非常に
重要となる。いづれにせよ、このことは応答性動物にお
けるある種の個性に属することを排除することができな
い。このような特徴はしばしば少ない動物の数の血清
（このケースのように３匹）のみをプールしたときに現
われる。
３）S023を除き、試験したタンパク質それぞれに異常な
効果があった。このことは、試験タンパク質でないある
タンパク質によって免疫された動物に由来する血清が、
この試験タンパク質により免疫された動物に由来する血
清よりも強く反応するであろうことを意味する（水平
値）。
これは、天然（大きな）タンパク質に対する抗体を生
産するために用いた小さな合成ペプチドによる研究にお
いても見い出させる特徴的な特色である。ここでは、天
然分子の好ましいコンホメーションにおける相異によっ
て説明する。
IgG応答（表II）は、IgG応答に関して述べた（１），
（２）及び（３）に匹敵する効果を示す。
ある免疫性タンパク質から別の類似のタンパク質への
変換は、SP436を除く全てに関して低いIgG及びIgE応答
を示した。SP436から別のものへの変換はこれを、非常
に顕著であるが、ただしその他のもので見い出せるもの
に匹敵するレベルまでにのみ増大させた。更にこれには
異常な効果があり、これは以下のＤシリーズに関連して
更に説明する。
Ａシリーズ： 特定の血清を各分析において全て同一の変異体により
試験した。固相コーティングのためにこの変異体を50μ
g/mlの濃度（リン酸緩衝液）で利用し、これはほぼ単層
の固相化をもたらす。この表層上の残留結合点を牛血清
アルブミン（BSA）によりブロックした。
希釈系列において血清を試験し、血清の強さに依存し
てまず20〜800倍に希釈し、次いで２倍の系列において
希釈した。リン酸緩衝液はブロッキング剤BSA及び清浄
剤を含む。
トレーシングは、抗変異体抗体と、ペルオキシダーゼ
にコンジュゲートされた抗ラット抗体（KemEn−Tecカタ
ログno.Y3300;血清に用いたのと同じ緩衝液において100
0xに希釈）との結合により実施する。
識別は、存在するラットの抗変異体抗体に比例して存
在しているペルオキシダーゼに比例して色調変化する、
OPD基質に対するペルオキシダーゼの酵素反応を介して
得られる。
反応に関して高い能力を有する血清は他のものよりも
高い反応を示すであろう。そしてこれは強さ及び可能な
相互反応性の判断をさせるであろう。
4.A.4 Ａシリーズ、分析２＋３ 以下の条件で前述の分析を行った。希釈率の考慮は同
等の応答を提供し、そして対照に対してこれらを「標準
化」させる（即ち、個々の血清のその免疫用変異体との
反応）。
低い数値は、その血清が対照ほど希釈することができ
なく、そして高い数値はその血清が対照より希釈するこ
とができることを意味する。従って、49とは対照の反応
の0.49倍のみに、例えば対照が1000倍に比べてそのサン
プルについては490倍しか希釈できないことを意味す
る。
これらの実験の結果を以下の表IIIに示す。
これらの結果の解説を以下の「推論事項」において詳
しく説明する。
Ｄシリーズ： ここでも１種のタンパク質をELISAプレートにおける
ウェルをコートするために用いた。更に、一種の血清プ
ールのみを対照として試験した。この血清は一希釈にお
いてのみ試験した。
コート化ウェルに血清を加える前に、それらを別の組
のウェルの中でタンパク質の野生型又は変異体とプレイ
ンキュベートした。
これらの別のウェルの中で、野生型又は変異体の希釈
系列を同じ濃度の対照とインキュベートした。従って、
各ウェルは血清と、希釈系列に由来する特定の希釈率の
野生型又は変異体のいづれかを含む。
タンパク質の濃度は、この希釈系列の一端において抗
原が過剰であり、そして他端において反応がほとんどな
いことを保障するように選んだ。従って、あるウェルに
おいてはこのタンパク質はもしそれが特異的に対応する
ならラットの抗タンパク質反応性の全てをブロックする
ことができる。別のウェルにおいてはより多くのラット
抗体が未反応のままであり続けるであろう。一緒にイン
キュベートしたタンパク質がラット抗体を作るのに用い
たものと非常に異なる場合、未反応の抗体が利用した濃
度に関係なく全てのウェルの中に残り続けるであろう。
血清と希釈タンパク質とのインキュベーションの後、
この反応混合物をコート化ウェルに移す。
もしラットの抗体活性が完全に残っているなら、これ
はウェル中のコート化タンパク質に結合し、そして事実
上このラット抗体にペルオキシダーゼラベル化抗ラット
（IgX）抗体が結合し、そしてＡシリーズに前記した通
り発色が行われるであろう。
このアッセイにおける結果は、一緒にインキュベート
したタンパク質がコート化のものに対応するかしないか
を示す。両者とも、エピトープ同一性（部分的又は完
全）又はエピトープの存在に対応する。
このシリーズにおいて用いた変異体を以下の表IVに示
す： 22のサブアッセイより成るアッセイ当り１グループの
血清を用いた。各サブアッセイにおいて、血清をwt又は
希釈系列における１種の変異体と共に液相に吸収させ
た。最後に、全く同じタンパク質に対して残っている抗
体を試験した。
これにより各サブアッセイは、抗体反応の除去及び何
が残っているかの判定をもたらす。この手順において、
１グループの血清を21種のタンパク質全てに吸収させ、
そして最後に免疫に用いたオリジナルのものと同じタイ
プのものにより試験した。
試験したタンパク質と比較した吸収させたタンパク質
におけるエピトープのロスとは、たとえ最大の濃度での
この吸収タンパク質によっても陽性の結果となることを
意味する。図１〜６に示す通り、かかる変異体に関する
プロットは水平となり、対照の絶対吸収において見られ
る完全な効果に達しない。
エピトープの変化は結合力の低下を意味する。従っ
て、このサブアッセイのプロットは濃度の軸において異
なって位置し、対照の絶対吸収に対する力価の相違を提
供するであろう。
今までのところ、SP436に対する抗血清しか試験して
いない。
図１〜６において、吸収の作用をプロットした。第１
ウェルは吸収すべき変異体又はwtを有さない、即ち、内
部コントロールである。以降のウェルは濃度の上昇する
吸収性タンパク質を含む。
基本的に２通りのタイプのプロットがある。一つは全
体的に値が低下するものである。他は水平となり、最大
濃度の吸収性タンパク質の存在にてさえもある程度の応
答を残すものである。第１のタイプのエピトープの変化
に対応し、そして第２のタイプはエピトープのロス（一
般に結合エネルギーを低め、抗体結合における高い度合
いの可逆性を付与する）に対応する。
図１〜６より、以下のＳ番号のものが「水平」とな
る:S003,S012,S019,S020,S022,S023,S024及びS026。S02
6は変異体E136Rを含み、そしてその位置において試験し
た唯一の変異体であり、従ってS026は判定の中に完全に
は含ませなかった。
表Ｖにおいて、３つの分類に分けた、対照SP436を含
む21種のタンパク質全てに関する吸収の効果を記載す
る。
第１分類はno.195及び222の位置におけるアミノ酸の
変化並びにその他の単独の位置の変化を組合せたものの
効果を示す。
第２分類は、試験したその他の変化全てと組合せたn
o.170の位置の変化を示す。
第３分類は、試験したその他の変化全てと組合せたn
o.251の位置の変化を示す。
この試験血清はグループno.1の血清である（抗−SP43
6）。
結果はある固定した読取り値での力価として測定し、
そして対照に対する吸収容量（パーセントにおける）へ
と再計算した。
Ｄシリーズの結果 表Ｖから一つ一つのアミノ酸変化を考慮し、吸収容量
を対照と比較した： これらの結果を、Ｃα間の原子間距離の列拳した表VI
におけるデーターと比べなくてはならない。
エピトープサイズは典型的には半径10〜15Åであり、
そしてアミノ酸はこの領域において暴露されがちであ
る。
この情報を３次元（3D）図と合わせることにより、ど
のアミノ酸が同じエピトープに属するか、そしてそれ故
同一の抗体が結合するであろうかを判断することが可能
となるであろう。
まず、no.120＋235は１つのエピトープの中、そしてn
o.195＋251は別のエピトープの中で協力し合うようであ
る。
更にno.89及び181は共にIgE及びIgGの両者のより高い
吸収を提供するであろう。no.251はわずかに多くの両者
を、そしてno.271はわずかに多くのIgGをもたらす。
アミノ酸no.170は挙げたno.の全てにおいて変化さ
れ、エピトープのロスをもたらす。これらのタンパク質
の最大の濃度にてさえも、この調製品から抗体を完全に
排除することはできないであろう。
単独のエピトープは反応性の約30％原因となり、従っ
てエピトープの総数が少ないことが予想されうる。
更に、位置136があたかもメジャーエピトープに対応
するようである（図４参照）。S026が、位置136が変化
された唯一の変異体であるため、完全な所見は異なる研
究を待たなくてはならない。
以下の表VIIに、ここで調べた位置の組が同一のエピ
トープに属している可能性を記載する。
以上より、ズブチリシン309の免疫学的能力に影響及
ぼすために以下のアミノ酸残基を変化させるように選ん
だ。
非極性:129,131,151,152,162,168,169,172,174,175,17
6,194,196, 極 性:127,128,130,153,154,161,163,167,171,173,19
3,195, 荷 電:136,170,186,197,247,251,261, 荷電アミノ酸残基における変化が、ズブチリシン309
の免疫学的能力の最大の効果を及ぼすであろうことが予
測される。
推論事項 Ａシリーズの「データー抽出」の項、表IIIには、両
方向のアミノ酸（AA）変換に由来する結果が記載されて
いる。即ち、表IIIにおいては両方向の変異体に対する
抗血清が記載され、そしてこれらはそれらの免疫原及び
同一の位置に変化を含むその他の変異体により試験され
ている。
WTから変異体に至る変化を観察することにより、以下
の効果が見い出せる： 以下において「必須」（essential）「臨界的（criti
cal）及び「存在」（present）なる語は特定の位置にお
けるアミノ酸に関して用いている。これらの表現はGeys
enらScience135（1987）1184−90に定義されている意味
を有する。
I.AA no.120はWTにおいて「必須」でないが、しかし変
異体においてはそうなる。
AA no.235は120と同じ！ AA no.271は120と同じ！ II.AA no.251はWTにおいて「必須」であるが、しかし変
異体においてはそうではない。
III.AA no.181は、変化D181Nにおいて異常な効果を示
し、そして逆行変化N181Dにおいて「必須」である。
IV.AA no.136は両方向の交換において応答に大きな影響
を示す。
AA no.170は136と同じ。
AA no.195は136と同じ。
以下の交換データーは少なくとも２グループ（それぞ
れ13及び11より成る）に分けることができる： V.列9,11,12,13,14,15,17,19,20,21,26,27及び32は、単
独突然変異において推測される累積効果より予測される
効果を示す。
VI.列10,16,18,22,23,24,25,28,29,30及び31は、単独突
然変異において推測される累積効果より予想されない効
果を示す。
Ｖ及びVIはAA no.36を含まずに推測したことに注目す
べきであり、なぜならここの変化において二方向データ
ーはありえないからである。従って、列24,25,27,29及
び32は、AA no.36の交換を含ませるその後の推測により
異なるようになることがありうる。
両方向のデーターを伴う全てのAAは一定はエピトープ
の中に関与してラインアップしている。それらの抗体に
よる認識及び結合への影響はかなり異なるが、しかし効
果を全く有さないものはない。
グループI.及びII.はどのAAが必須でないか、そして
同じ位置においてその他が必須であるかを例証する。
以上より、AA 120,235及び271における試験した変化
は必須AAをもたらすであろう（おそらくは変異体のエピ
トープにおいてさえも）。
更にno.251の変化は必須AAを排除するようである。
このことは人間において、野生型酵素に対する反応と
比べて低められたアレルギー反応をもたらしうる。変異
体分子に対する新規な抗体の生産の後、WT暴露移し戻す
（スイッチバック）によりそろって復活しうる低反応性
（抗−WT及び抗−変異体抗体による）があり続けること
がある。
最も興味深いグループは、no.181の変化が異常な効果
（即ち、抗−WT血清がそれ自体のWT免疫原よりもその変
異体とより強く反応すること）を示すIIIであり、そし
てこのAAは抗−変異体血清にとって必須のようである。
従って、これは非常に重要な位置のようであり、その
変化にもとづいて高められた応答を、第１期ベースにお
いて分子に暴露された個体のみでなく、変異体とより強
く反応することさえもあるWT酵素に対する抗体を既に有
している個体においても生じせしめることがある。
このことは、免疫学的見地よりこの位置は避けるべき
であることを意味する。
グループVIは、どちらの方向にてもそれ自体の免疫原
と最強に反応する抗血清を提供する変化を示す。両方向
における変化は低められた応答を示し、そしてこの応答
はそれ自体の免疫原に戻すことによって回復する。
このことは人間において、変異体への転換に基づく応
答の瞬時の低下を意味するが、しかしながら新たな抗変
異体抗体が出現すると、その応答は回復しうる。
免疫学的見地から、これらの変化は中立的又は有利で
さえもあると考えられる。
表IIIにおける残りの列は上記をある程度実証し、そ
して効果の単純な累積が多重AA変換変異体において予測
できないことを部分的に例証する。免疫学的効果の任意
の集積を確認するために更なる分析が必要である。
単独又はいくつかのアミノ酸が変化している分子を用
いることにより、以下の効果が見い出せる： 1. 特定の位置における一定のアミノ酸はエピトープに
とって必須でないことあり、そしてその他はそうである
ことがある。
2. 特定の位置においては、試験した全てのアミノ酸が
エピトープにとって必須でありうる。
3. あるアミノ酸の別のものへの交換は異常な効果をも
たらすことがある。更に、この新たなアミノ酸は「変異
体」分子にとって必須でありうる。
これらの発見から、以下の応答（症状を含む）が、も
との分子に対して既に感受性である個体が、改変分子に
暴露されたときに見られうる： ｉ 直ちには変化は認められないが、短期間後での強め
られた応答。もとの分子への暴露に移し戻すことに基づ
き、応答が復活する。
ii 変化に基づく応答の低下。もとの分子への暴露に移
し戻すことに基づいて応答は復活。
iii 変化に基づく応答の上昇。もとの分子への暴露に
基づき瞬時の低下が認られる。これは変異体への変化の
前にもとの応答の強さに最終的に戻る。
iv 初期の応答における低下（これは復活する）。もと
の分子への移し戻しによる、応答の低下（これは非常に
早く復活する）。
免疫学的見地より、好ましい変換はグループIIのタイ
プであろうが、しかしグループIVの変化のタイプも許容
される。
本発明を特定の態様に関して例証したが、本発明はこ
れらの態様に限定されることはなく、添付の請求の範囲
及び本明細書全体により規定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許3903068（ＵＳ，Ａ) 国際公開89／6279（ＷＯ，Ａ１) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ，1989 年，121，ｐ．275−280 Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，1990年, 91，ｐ．278−284 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 9/56 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトを含む動物において、その親ズブチリ
    シンにより惹起される免疫応答と比べて低められた応答
    を惹起せしめるズブチリシン309プロテアーゼの変異体
    を製造する方法であって、免疫学及びタンパク質化学方
    法を利用して前記完全なズブチリシンプロテアーゼをエ
    ピトープ地図化し、このエピトープ地図化は、ポリクロ
    ーナル抗体を用いて行ない、そして次の２つの相： （ｉ）注目の全てのタンパク質に対する前記抗体調製物
    の反応性測定し；そして （ii）或る抗原との反応の後にもう一方の抗原と反応す
    るために残された反応性測定する； に分けられ、エピトープを決定し、そして前記エピトー
    プの内の少なくとも１つを、前記完全な親タンパク質の
    発現をコードするDNA分子の変異により、又は前記変異
    体タンパク質の発現をコードするDNA分子の合成により
    変化させ、次に当該突然変異させた又は合成したDNA分
    子を、適当な宿主への形質転換又はトランスフェクショ
    ンのための機能的なベクター中に挿入するか、あるいは
    前記突然変異させた又は合成したDNA分子を宿主のゲノ
    ムの中に機能的に組込み、前記タンパク質変異体をこの
    宿主の中で発現させ、そして回収する、ことを含んでな
    る方法。
  2. 【請求項２】ズブチリシン309プロテアーゼに比べて免
    疫学的能力が低下しているズブチリシン309プロテアー
    ゼ変異体であって、この低下が位置151、174、176、193
    及び196の１又は複数におけるアミノ酸残基の欠失又は
    置換、或いは前記位置の１又は複数に隣接してのアミノ
    酸残基の挿入により達成されており、そして位置151、1
    74、176、193及び196からなる群から選択される位置を
    占めるアミノ酸に影響を与える少なくとも１つの変異を
    有する、ズブチリシン309プロテアーゼ変異体。
  3. 【請求項３】36＋209、89＋120、136＋170、36＋89、89
    ＋235、136＋195、181＋222、209＋222、及び235＋251
    の位置の組の群より選ばれる位置を占めるアミノ酸残基
    に影響を及ぼす少なくとも１又は複数の組の突然変異を
    有することを特徴とする、請求項２に記載のズブチリシ
    ン309プロテアーゼ変異体。
  4. 【請求項４】請求項２又は３に記載のズブチリシン309
    プロテアーゼ変異体を含んで成る組成物。
  5. 【請求項５】請求項２又は３に記載のズブチリシン309
    プロテアーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物。
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