CN111356471A - 包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了包括阿柏西普和赖氨酸盐张力调节剂的眼科制剂，其适于通过玻璃体内或局部给药治疗眼病症或疾病的方法。

Description

包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途
本申请要求于2017年11月20日向美国专利和商标局(the United States Patentand Trademark Office)提交的美国临时专利申请No.62/588,536的优先权。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，并且其通过引用整体并入本文中。所述ASCII副本创建于2018年10月26日，名为JUST0471_SL.txt，且大小为4,148字节。
发明背景
1.发明领域
本申请涉及适于眼科给药的阿柏西普融合蛋白药物制剂。
2.相关技术的论述
阿柏西普是一种重组融合蛋白，包括两种主要组分：与人IgG1的Fc部分融合的，来自人VEGF受体1和2的细胞外结构域的血管内皮生长因子(VEGF)结合部分。(参见Papadopoulos et al.,Modified chimeric polypeptides with improvedpharmacokinetic properties,WO 00/75319 A1；US 7070959B2)。在结构上，阿柏西普是一种二聚体糖蛋白，蛋白质分子量约为96.9千道尔顿(kDa)。它含有约15％的糖基化，给出约115kDa的总分子量。由一级序列预测的每个多肽链上的所有5个假定的N-糖基化位点都可以被碳水化合物占据，并表现出一定程度的链异质性，包括末端唾液酸残基的异质性。
美国食品和药物管理局(FDA)于2011年11月批准阿柏西普上市，且欧洲药品管理局(EMA)于2012年11月批准其上市。
阿柏西普的品牌名是
Figure BDA0002492606010000011
(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，被用作治疗眼病症或疾病的眼科剂，例如视网膜中央静脉阻塞继发黄斑水肿(CRVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力损伤、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者中的糖尿病视网膜病(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。
Ziv-阿柏西普的品牌名是
Figure BDA0002492606010000021
(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，被开发为治疗转移性结直肠癌的注射剂。
阿柏西普已知的制剂包括由Furfine et al.(Furfine et al.,VEGF antagonistformulations for intravitreal administration,US8092803；US9580489；EP2364691B1；WO2007149334A2)和Dix et al.(Dix et al.,VEGF Antagonistformulations,WO2006104852 A2；US8921316；US9636400)描述的那些。
仍然存在对具有增加的稳定性的阿柏西普制剂的需求，这可以通过本发明提供。
发明内容
本发明涉及阿柏西普的眼科制剂，所述制剂包括：(a)浓度为5-100mg/mL的阿柏西普；(b)5-50mM浓度的缓冲剂；(c)非离子表面活性剂；(d)作为张力调节剂(tonicifyingagent)的赖氨酸盐，该制剂具有约300mOsm/kg(即300±50mOsm/kg)的最终摩尔渗透压浓度；并且所述制剂的pH为约pH 5.0至约pH 6.5。本发明的眼科制剂适于玻璃体内或局部给药。本发明的包含阿柏西普的眼科制剂具有稳定性特性，例如显著降低的随时间的聚集性，且具有与阿柏西普其他已知的眼科制剂一样有利的特性，或相比阿柏西普其他已知的眼科制剂更有利的特性。本发明的制剂还可以根据需要被冻干及重构。
本发明的眼科制剂可用作治疗眼病症或疾病的方法中的药用眼科试剂，例如视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力损伤、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者中的糖尿病视网膜病(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。本发明的眼科制剂的给药可以为通过玻璃体内注射，或者在一些情况下，根据医学适当性通过向眼睛局部给药。本发明的制剂可用于治疗这些眼病症或疾病，以及用于治疗这些眼病症和疾病的药物的制备。
前述概述并非旨在限定本发明的每个方面，并且在其他章节中描述了另外的方面，如实施方式的详细描述章节中。整个文档旨在作为一个统一的公开内容进行关联，并且应该理解，考虑了本文所述特征的所有组合，即使特征的组合未一起存在于本文档的同一句子或段落或章节中。
除了前述内容之外，作为另外的方面，本发明包括以任何方式比由以上具体段落限定的变型范围更窄的本发明的所有实施方式。例如，被描述为类的本发明的某些方面，并且应当理解，类的每个成员分别是本发明的一个方面。同样，被描述为类的方面或选择类的成员应理解为包括该类的两个或更多个成员的组合。尽管申请人发明了本文所述的本发明的全部范围，但是申请人并不旨在要求保护他人的现有技术工作中所描述的主题。因此，如果专利局或其他实体或个人让申请人注意权利要求的范围内的法定现有技术，则申请人保留根据适用专利法行使修改权的权利，以重新限定此类权利要求的主题，来将此类法定现有技术或法定现有技术的明显变型排除在此类权利要求的范围之外。由此类修改的权利要求限定的本发明的变型也旨在作为本发明的方面。
附图说明
图1显示了如通过SE-HPLC测量的在30℃下储存的各种阿柏西普制剂中的HMW形成。(参见，表1的制剂缩写。)
图2显示了如通过SE-HPLC测量的在4℃下储存的各种阿柏西普制剂中的HMW形成。(参见，表1的制剂缩写。)
具体实施方式
本文使用的章节标题仅用于组织目的，且不应解释为限制所描述的主题。
定义
除非本文另有定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。因此，如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数所指对象，除非上下文另外明确指出。例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括多个细胞的群体。
本发明涉及适用于向患者经玻璃体内或局部给药的水性眼科制剂，所述制剂包括阿柏西普，其在商业上也被称为
Figure BDA0002492606010000041
阿柏西普是具有阿柏西普氨基酸序列(SEQ IDNO:1)的两条相同融合多肽链的组装体，通常通过重组DNA表达技术最方便地产生。阿柏西普氨基酸序列如下：
Figure BDA0002492606010000042
预计在SEQ ID NO:1的以下氨基酸位置处的半胱氨酸残基之间有二硫键(上述SEQID NO:1中显示的有下划线的半胱氨酸(C)残基)：
30-79(链内的)
124-185(链内的)
211-211(链间的)
214-214(链间的)
246-306(链内的)
352-410(链内的)。
阿柏西普的两条融合多肽链在SEQ ID NO:1的氨基酸位置211和214处通过二硫键共价连接。融合蛋白通常被糖基化，N-聚糖在SEQ ID NO:1的位置36、68、123、196和282处的天冬酰胺残基处共价连接(上述SEQ ID NO:1中显示的加粗/斜体的天冬酰胺(N)残基)。在本发明范围内的“阿柏西普”还包括这样的实施方式，其中融合多肽链中的一个或两个具有带有另外的羧基末端赖氨酸(K)残基的氨基酸序列SEQ ID NO:1，或两个都不具有带有另外的羧基末端赖氨酸(K)残基的氨基酸序列SEQ ID NO:1。本发明的眼科制剂中的阿柏西普的浓度为约20mg/mL至约80mg/mL，或约30mg/mL至约50mg/mL；例如，约40mg/mL的浓度可用于制剂的许多实施方式中。
“稳定的”制剂是其中的蛋白质在加工(例如超滤、渗滤、其他过滤步骤、小瓶填充)、运送和/或储存包含阿柏西普的药物物质和/或药物产品后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。制剂中蛋白质的物理、化学和生物学稳定性一起体现了蛋白质制剂，例如阿柏西普制剂的“稳定性”，这对于配制的药物产品(DP)所存储的条件是特定的。例如，在零以下温度下储存的药物产品预期在化学、物理或生物活性方面均不会有显著的变化，而在40℃下储存的药物产品预期其物理、化学和生物学活性会有变化，变化程度取决于药物物质或药物产品的储存时间。蛋白质制剂的构型也能够影响变化速率。例如，聚集体的形成受蛋白质浓度的影响很大，较高的蛋白质浓度可观察到较高的聚集速率。还已知赋形剂会影响药物产品的稳定性，例如，添加盐会增加一些蛋白质的聚集速率，而已知其他赋形剂诸如蔗糖会降低储存过程中的聚集速率。pH值也极大地影响不稳定性，取决于修饰的类型和pH依赖性，会导致较高和较低的降解速率。
用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且在例如Wang,W.(1999),Instability,stabilization and formulation of liquid proteinpharmaceuticals,Int J Pharm 185:129-188中进行了综述。可以在选定的温度下于选定的时间段内测量稳定性。为了进行快速筛选，例如，可以将制剂在40℃下保存2周至1个月，在该时间测量稳定性。如果要在2-8℃下储存制剂，通常制剂应在30℃下稳定至少1个月，或在40℃下稳定至少一周，和/或在2-8℃下稳定至少两年。
如果在目视检查颜色和/或澄清度后，或者如通过UV光散射或通过尺寸排阻色谱法或其他合适的方法测量的，蛋白质显示最小迹象的二级和/或三级结构(即，内在结构)改变或聚集和/或沉淀和/或变性，则蛋白质在药物制剂中“保持其物理稳定性”。蛋白质的物理不稳定性，即物理稳定性的丧失，可能是由低聚化引起的，产生二聚体和更高级的聚集体、亚可见和可见的颗粒形成以及沉淀。取决于目标降解物的类型，可以使用各种技术来确定物理降解的程度。可以使用尺寸排阻色谱法对二聚体和更高级的可溶性聚集体进行定量，而可以使用光散射、光遮蔽或其他合适的技术对亚可见颗粒进行定量。在一个实施方式中，根据溶液中阿柏西普单体蛋白质的百分比确定蛋白质的稳定性，其中降解的(例如，片段化的)和/或聚集蛋白质的百分比较低。“阿柏西普单体”是指两条具有阿柏西普氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的多肽链的组装体，在任何多肽链上具有或不具有另外的羧基末端赖氨酸残基。在“阿柏西普单体”中，两条阿柏西普多肽链通过序列的免疫球蛋白Fc结构域部分的连接和二硫键交联而组装，如上文中所述的。例如，包含稳定蛋白质的水性制剂可包括(以总蛋白质的百分比计)至少95％的阿柏西普单体、至少96％的阿柏西普单体、至少97％的阿柏西普单体、至少98％的阿柏西普单体或至少99％的阿柏西普单体蛋白质。可选地，本发明的水性制剂可包括(以总蛋白质的百分比计)约5％的聚集体和/或降解的阿柏西普蛋白质。
如果在给定时间的化学稳定性使得未形成或破坏导致蛋白质组分，例如阿柏西普的一级结构发生变化的共价键，则蛋白质在药物制剂中“保持其化学稳定性”。一级结构的改变可导致蛋白质的二级和/或三级和/或四级结构的修饰，并可导致聚集体的形成或已经形成的聚集体的逆转。典型的化学修饰可以包括异构化、脱酰胺基化、N端环化、主链水解、甲硫氨酸氧化、色氨酸氧化、组氨酸氧化、β消除、二硫键形成、二硫键加扰、二硫键裂解以及导致一级结构改变的其他变化，包括D-氨基酸形成。可以通过各种技术来探询化学不稳定性，即化学稳定性的丧失，包括离子交换色谱、毛细管等电聚焦、肽消化物分析和多种类型的质谱技术。可以通过检测和量化蛋白质的化学变化形式来评估化学稳定性。化学改变可能涉及尺寸改变(例如剪切)，其可以使用例如尺寸排阻色谱、SDS-PAGE和/或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来进行评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)，其可以通过基于电荷的方法来评估，诸如但不限于离子交换色谱、毛细管等电聚焦或肽图分析。
物理和/或化学稳定性的丧失可能导致生物学活性的改变，作为目标生物学活性的增加或降低，这取决于修饰和被修饰的蛋白质。如果蛋白质在给定时间的生物活性在制备药物制剂时展现的生物活性的约30％以内，则蛋白质在药物制剂中“保留其生物学活性”。如果活性小于其起始值的70％，则认为活性降低。生物学测定法可包括基于体内和体外的测定法，如配体结合、效力、细胞增殖或其生物药物活性的其他替代量度。例如，可以使用体外配体结合测定法，诸如通过ELISA测定对抗胎盘生长因子与PGF结合的抑制，或使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖测定法来评估阿柏西普的生物活性。
用于本发明的阿柏西普通常通过重组表达技术产生。术语“重组”表示材料(例如，核酸或多肽)已经通过人为干预而人工或合成(即，非天然)改变。可以在其天然环境或状态内或从其天然环境或状态移除来对材料进行改变。例如，“重组核酸”是通过例如在克隆、DNA改组或其他熟知的分子生物学程序中重组核酸而制成的。这样的分子生物学程序的实例可见于Maniatis et al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982)。“重组DNA分子”由通过这样的分子生物学技术的方式连接在一起的DNA片段组成。如本文所用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸的细胞。例如，Papadopoulos et al.,Modified Chimeric Polypeptides with ImprovedPharmacokinetic Properties,US 7,070,959B2；和WO 00/75319A1)描述了可用于表达阿柏西普融合蛋白的重组DNA分子。
本说明书中出现的与诸如多肽、核酸、宿主细胞等生物材料有关的术语“天然存在的”是指在自然界发现的材料。
术语“控制序列”或“控制信号”是指可以在特定宿主细胞中影响其连接的编码序列的表达和加工的多核苷酸序列。这样的控制序列的性质可能取决于宿主生物。在特定的实施方式中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。真核生物的控制序列可以包括启动子，其包含一个或多个转录因子识别位点、转录增强子序列或元件、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。控制序列可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。启动子和增强子由短的DNA阵列组成，该短的DNA阵列与参与转录的细胞蛋白发生特异性相互作用(Maniatis,et al.,Science 236:1237(1987))。已经从多种真核来源分离了启动子和增强子元件，包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。具体启动子和增强子的选择取决于用于表达目标蛋白的细胞类型。一些真核启动子和增强子具有广泛的宿主范围，而其他一些在有限的细胞类型子集中起作用(有关综述参见Voss,et al.,Trends Biochem.Sci.,11:287(1986)和Maniatis,et al.,Science 236:1237(1987))。
“启动子”是包括一位点的DNA的区域，在该位点处RNA聚合酶结合以起始一个或多个下游结构基因的信使RNA的转录。启动子位于基因的转录起始位点附近，在DNA的同一条链上，且在其上游(朝向有义链的5'区域)。启动子的长度通常约为100-1000bp。
“增强子”是DNA的短区域(50-1500bp)，其可以与一种或多种激活蛋白(转录因子)结合以激活基因的转录。
如本文所用的术语“以可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指以这样的方式连接核酸序列，其使得核酸分子能够指导给定基因的转录和/或产生所需蛋白质分子的合成。该术语还指以这样的方式连接氨基酸序列，其使得产生功能蛋白。例如，将与蛋白质编码序列“可操作地连接”的载体中的控制序列与其连接，从而在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且包括通过肽键共价连接的两个或更多个氨基酸的分子链。这些术语不涉及产品的具体长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白质、融合蛋白等包括在多肽的含义内。该术语还包括其中包括一种或多种氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸的分子，其可以使用已知的蛋白质工程技术重组表达。另外，融合蛋白可以按本文所述通过熟知的有机化学技术进行衍生化。
多肽(例如免疫球蛋白或抗体)的“变体”包含这样的氨基酸序列，其中相对于另一多肽序列，一个或多个氨基酸残基被***、缺失和/或替换到氨基酸序列中。变体包括融合蛋白。
例如关于阿柏西普，术语“融合蛋白”表示该蛋白包括来源于多于一种亲本蛋白或多肽的多肽组分。通常，融合蛋白由这样的“融合基因”表达，其中编码来自一种蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列同框附加，并且任选地与编码来自不同蛋白质的多肽序列的核苷酸序列通过连接子隔开。然后可以通过重组宿主细胞将融合基因表达为单一蛋白质。
“分泌的”蛋白质是指由于分泌的信号肽序列而能够被引导至内质网(ER)、分泌性囊泡或细胞外空间的那些蛋白质，以及释放到细胞外空间中的不一定包含信号序列的那些蛋白质。如果分泌的蛋白质被释放到细胞外空间中，则分泌的蛋白质可能会经历细胞外加工以产生“成熟”蛋白质。释放到细胞外空间中可以通过许多机制发生，包括胞吐作用和蛋白水解切割。在一些其他实施方式中，目标阿柏西普融合蛋白可以由宿主细胞合成为分泌性蛋白，其随后可以从细胞外空间和/或培养基中进一步纯化。
如本文所用的，当提及通过重组DNA技术在宿主细胞中产生的蛋白质时，“可溶的”是指存在于水溶液中的蛋白质；如果蛋白质包含双精氨酸信号氨基酸序列，则可溶蛋白质将被输出到革兰氏阴性细菌宿主中的周质空间，或由能够分泌的真核宿主细胞或由具有适当基因(例如，kil基因)的细菌宿主分泌到培养基中。因此，可溶性蛋白质是不存在于宿主细胞内的包涵体中的蛋白质。可选地，根据上下文，可溶性蛋白质是这样的蛋白质，未发现其整合在细胞膜内，或者在体外溶解，或在生理条件下能够溶解于水性缓冲液中，而当其于生理条件下，在没有其他蛋白质的情况下悬浮在目标水性缓冲液中时，不会形成大量不溶性聚集体(即形成的聚集体小于总蛋白的10％，且通常小于总蛋白的约5％)，这样的缓冲液不含有离子性去污剂或离液剂，诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。相反，不溶性蛋白质是以变性形式存在于宿主细胞中的细胞质颗粒(称为包涵体)中的一种蛋白质，或者再次地取决于上下文，不溶性蛋白质是这样的蛋白质，其存在于细胞膜，包括但不限于细胞质膜、线粒体膜、叶绿体膜、内质网膜等内，或者当其于生理条件下在没有其他蛋白质的情况下(在生理相容性温度下)悬浮在目标水性缓冲剂中时，在生理条件下在体外水性缓冲剂中形成大量的不溶性聚集体(即形成的聚集体等于或大于总蛋白的约10％)，这样的缓冲剂不含有离子型去污剂或离液剂，诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、盐酸胍或高氯酸锂。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括含有两个或更多个核苷酸残基的单链和双链核苷酸聚合物。包括在多核苷酸中核苷酸残基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰的形式。所述修饰包括碱基修饰诸如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物、核糖修饰诸如2',3'-二脱氧核糖，以及核苷酸间键合修饰诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。
术语“寡核苷酸”是指包括200个或更少的核苷酸残基的多核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸的长度为10-60个碱基。在其他实施方式中，寡核苷酸的长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如用于构建突变基因。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的标记物，包括放射性标记物、荧光标记物、半抗原或抗原性标记物。寡核苷酸可用作例如PCR引物、克隆引物或杂交探针。
本文可互换使用的“多核苷酸序列”或“核苷酸序列”或“核酸序列”是多核苷酸中核苷酸残基的主要序列，包括寡核苷酸、DNA和RNA、核酸或代表核苷酸残基主要序列的字符串，具体取决于上下文。从任何具体的多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补的多核苷酸序列。包括基因或合成来源的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，且代表有义或反义链。除非另有说明，否则本文论述的任何单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手侧方向被称为5'方向。新生RNA转录物从5'到3'的添加方向被称为转录方向；具有与RNA转录物相同序列的DNA链上的为相对于RNA转录物5'端的5'的序列区域被称为“上游序列”；具有与RNA转录物相同序列的DNA链上的为相对于RNA转录物3'端的3'的序列区域被称为“下游序列”。
如本文所用的，“分离的核酸分子”或“分离的核酸序列”是这样的核酸分子，其：(1)被从在核酸的天然来源中通常与其结合的至少一种污染核酸分子鉴定并分离，或者(2)被从背景核酸克隆、扩增、标记或以其他方式区别开来，从而可以确定目标核酸的序列。分离的核酸分子不是其天然发现的形式或处于其天然发现的环境中。然而，分离的核酸分子包括通常表达免疫球蛋白(例如抗体)的细胞中所含的核酸分子，其中例如该核酸分子处于与天然细胞不同的染色***置。
如本文所用的术语“编码…的核酸分子”、“编码…的DNA序列”和“编码…的DNA”是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿mRNA链的核糖核苷酸的顺序，也决定了沿多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。因此，DNA序列编码RNA序列和氨基酸序列。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能有关的任何核酸。基因通常包括编码序列和/或表达此类编码序列所需的调控序列。术语“基因”适用于特定的基因组或重组序列，以及该序列编码的cDNA或mRNA。基因还包括未表达的核酸片段，其例如形成其他蛋白质的识别序列。未表达的调控序列，包括与调控蛋白如转录因子结合的转录调控元件，导致邻近或附近序列的转录。
“基因的表达”或“核酸的表达”是指DNA转录成RNA(任选地包括RNA的修饰，例如剪接)、RNA翻译成多肽(可能包括随后的多肽的翻译后修饰)或转录和翻译二者，如上下文所示的。
表达盒是重组表达技术的典型特征。表达盒包括编码目标蛋白的基因，例如，编码阿柏西普融合蛋白序列的基因。真核“表达盒”是指能够在真核细胞如哺乳动物细胞中产生蛋白质的表达载体的一部分。其包括在真核细胞中可操作的用于mRNA转录的启动子、一个或多个编码目标蛋白的基因，以及mRNA终止和加工信号。表达盒可在编码序列中有用地包括用作选择标记的基因。在表达盒中，启动子可操作地连接至编码外源目标蛋白的开放阅读框的5'端；并且聚腺苷酸化位点可操作地连接至开放阅读框的3'端。只要表达盒保持可操作性，还可以包括其他合适的控制序列。开放阅读框可以任选地包括多于一种目标蛋白的编码序列。
当关于结构基因使用时，如本文所用的术语“编码区”或“编码序列”是指编码在由mRNA分子翻译而产生的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，编码区在5'侧由编码起始子甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”界定，且在3'侧则由明确终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的三个三联体之一界定。
重组表达技术通常涉及使用包含表达盒的重组表达载体。
术语“载体”是指用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
如本文所用的术语“表达载体”或“表达构建体”是指重组DNA分子，其包含所需的编码序列和用于在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的合适的核酸控制序列。表达载体可包括但不限于影响或控制转录、翻译，以及如果存在内含子，则可影响与之可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能地其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和聚腺苷酸化信号。分泌信号肽序列也可以任选地由表达载体编码，可操作地连接至目标编码序列，从而使表达的多肽可以被重组宿主细胞分泌，以便在需要时更容易地从细胞中分离目标多肽。这样的技术在本领域中是熟知的。(例如，Goodey,AndrewR.；et al.,Peptide and DNA sequences,第5,302,697号美国专利；Weiner et al.,Compositions and methods for protein secretion,第6,022,952号美国专利和第6,335,178号美国专利；Uemura et al.,Protein expression vector and utilizationthereof,第7,029,909号美国专利；Ruben et al.,27human secreted proteins,US 2003/0104400A1)。为了表达目标多亚基蛋白，可以使用合适数量和比例的单独表达载体来转化宿主细胞，每个表达载体均包含每个不同亚基单体的编码序列。在其他实施方式中，单个表达载体可以用于表达目标蛋白的不同亚基。
重组表达技术通常涉及包含重组表达载体的哺乳动物宿主细胞。
术语“宿主细胞”意指已经被核酸转化或能够被核酸转化并从而表达目标基因或编码序列的细胞。该术语包括亲代细胞的后代，无论后代在形态或遗传组成上是否与原始亲代细胞相同，只要存在目标基因即可。在本发明的实践中可以使用大量可用的和熟知的宿主细胞中的任何一种以获得阿柏西普。特定宿主的选择取决于本领域认可的许多因素。这些包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、肽的回收容易性、表达特性、生物安全性和成本。在理解并非所有宿主对于特定DNA序列的表达可能都同样有效的前提下，必须在这些因素之间取得平衡。在这些通用准则范围内，培养中有用的微生物宿主细胞包括细菌(诸如大肠杆菌(Escherichia coli sp.))、酵母(诸如酵母菌(Saccharomyces sp.))和其他真菌细胞、藻类或类藻细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物(包括人)细胞，例如CHO细胞和HEK-293细胞。也可以在DNA水平上进行修饰。可以将编码肽的DNA序列改变为与所选宿主细胞更相容的密码子。对于大肠杆菌(E.coli)，优化的密码子是本领域已知的。密码子可以被替换以消除限制位点或包括沉默的限制位点，这可能有助于所选宿主细胞中DNA的加工。接下来，培养并纯化转化的宿主。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，以便表达所需化合物。这样的发酵条件是本领域熟知的。
有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是中国仓鼠卵巢细胞，包括CHO-K1细胞(例如，ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44和中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；SV40转化的猴肾CVl系(COS-7,ATCC CRL1651)；人胚胎肾细胞系(293或293细胞，亚克隆用于在悬浮培养中生长(Graham et al,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝癌细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather etal.,Annals N.Y Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞或FS4细胞；或哺乳动物骨髓瘤细胞。
“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”通常可互换使用，并且本文中所有此类名称均包括细胞后代。例如，“来源”于从CHO细胞的细胞是中国仓鼠卵巢细胞的细胞后代，其可以从的原始原代细胞亲本通过任何数目的世代取出，并且还可以包括转化后代细胞。转化子和转化的细胞包括原代目标细胞和来源于其的培养物，而无需考虑转移次数。还应理解，由于故意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能不完全相同。包括具有与原始转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
用上述核酸或载体转化或转染宿主细胞以产生多肽(包括抗原结合蛋白，诸如抗体)，并在经适当修饰以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。另外，具有被选择标记分开的多拷贝转录单元的新颖的载体和转染细胞系对于多肽诸如抗体的表达特别有用。
术语“转染”意指细胞摄取外来或外源DNA，并且当将外源DNA引入细胞膜内部时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的，并在本文中公开。参见例如，Graham etal.,1973,Virology 52:456；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,同上；Davis et al.,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chuet al.,1981,Gene 13:197。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分引入合适的宿主细胞中。
术语“转化”是指细胞遗传特性的改变，并且当细胞被修饰以包含新的DNA或RNA时，细胞已经被转化。例如，通过经由转染、转导或其他技术引入新的遗传材料，细胞被转化，其中其从天然状态进行了遗传修饰。在转染或转导后，转化的DNA可以通过物理整合到细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为游离成分暂时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。当转化的DNA随细胞***而复制时，认为细胞已经“稳定转化”。
可以在多种培养基中培养用于产生可用于本发明的阿柏西普融合多肽的宿主细胞。诸如Ham's F10(Sigma)、最小必需培养基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基((DMEM),Sigma)的市售培养基都适合于培养宿主细胞。另外，在Hamet al.,Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利No.4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WO90103430；WO 87/00195；或美国专利Re.No.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GentamycinTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效的能量来源，使得在培养基中或培养基上的细胞的生理状况促进宿主细胞表达目标蛋白质；还可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件诸如温度(通常但非必须，约37℃)、pH(通常但非必须，约pH 6.5-7.5)、通氧等，是先前的所选宿主细胞表达目标蛋白质所用的那些，并且对于普通技术人员是显而易见的。培养基可以包括合适量的血清，诸如胎牛血清(FBS)，或者优选地，宿主细胞可以适于在无血清培养基中培养。在一些实施方式中，水性介质是液体，使得宿主细胞在液体介质内的细胞悬浮液中培养。宿主细胞可以有效地在分批培养或连续培养***中生长。
在其他实施方式中，哺乳动物宿主细胞可以在例如含有琼脂或琼脂糖的固体或半固体水性培养基上培养，以形成细胞粘附于其上并形成粘附层的培养基或底物表面。
培养宿主细胞后，重组多肽可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果第一步在细胞内产生多肽如阿柏西普，则例如通过离心或超滤除去颗粒碎片，即宿主细胞或裂解的片段。
可以使用例如羟磷灰石色谱、阳离子或阴离子交换色谱，或优选地使用目标抗原或蛋白A或蛋白G作为亲和配体的亲和色谱来纯化目标蛋白质诸如阿柏西普。蛋白A可用于纯化包括基于人γ1、γ2或γ4重链的多肽的蛋白(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白质G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附连的基质最经常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质诸如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许相比琼脂糖所能实现的更快的流速和更短的处理时间。如果蛋白质包含CH 3结构域，则Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，也可以使用其他蛋白质纯化技术，如乙醇沉淀、反相HPLC、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
关于孵育缓冲剂和免疫球蛋白或其他结合测定试剂的“在生理条件下”意指在允许发生生化反应如非共价结合反应的温度、pH和离子强度的条件下进行孵育。通常，温度是在室温或最高达约37℃的环境温度和pH 6.5-7.5下。
物质组合物的“生理上可接受的盐”，例如目标蛋白的盐，例如融合蛋白或免疫球蛋白，诸如抗体，或任何其他目标蛋白的盐，或氨基酸的盐，诸如但不限于，赖氨酸、组氨酸或脯氨酸盐意指已知的或后来发现可药用的任何一种或多种盐。药学上可接受的盐的一些非限制性实例是：药学上可接受的盐的一些非限制性实例是：醋酸盐；三氟醋酸盐；氢卤化物，诸如盐酸盐(例如一盐酸盐或二盐酸盐)和氢溴酸盐；硫酸盐；柠檬酸盐；马来酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；葡萄糖酸盐；琥珀酸盐；甲磺酸盐；苯磺酸盐；没食子酸酯的盐(没食子酸也称为3,4,5-三羟基苯甲酸)，诸如五加没食子酰基葡萄糖(PGG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、胆甾醇硫酸盐、双羟萘酸盐、单宁酸盐和草酸盐。
在本发明的眼科制剂中，赖氨酸盐可以包括L-赖氨酸形式和/或D-赖氨酸形式，只要赖氨酸盐是药学上可接受的赖氨酸盐形式即可。赖氨酸盐的实例包括但不限于(2S)-2,6-二氨基己酸；(2R)-2,6-二氨基己酸；L-赖氨酸一水合物；L-赖氨酸水合物；(S)-2,6-二氨基己酸水合物；(2S)-2,6-双(氮烷基)己酸水合物；L-赖氨酸醋酸盐；L-赖氨酸一醋酸盐；2,6-二氨基己酸；dl-赖氨酸醋酸盐；L-赖氨酸盐酸盐；L-赖氨酸一盐酸盐；(S)-2,6-二氨基己酸盐酸盐；D-赖氨酸盐酸盐；D-赖氨酸一盐酸盐；(D)-2,6-二氨基己酸盐酸盐；L-赖氨酸二盐酸盐；2,6-二氨基己酸二盐酸盐；L-赖氨酸乳酸盐；L-赖氨酸单(2-羟基丙酸盐)；L-赖氨酸单(+/-)-2-羟基丙酸盐)；L-赖氨酸琥珀酸盐；(S)-2,6-二氨基己酸(S)-2-氨基戊二酸；和L-赖氨酸L-谷氨酸盐。
“反应混合物”是包含允许在孵育的生理条件下发生体外目标生物化学反应，如共价或非共价结合反应的所有必需的试剂和因子的水性混合物。
多核苷酸的“结构域”或“区域”(在本文中可互换使用)是整个多核苷酸的任何部分，最高达并包括完整多核苷酸，但通常包含少于完整多核苷酸。结构域可以(但不必须)独立于多核苷酸链的其余部分折叠(例如，DNA发夹折叠)和/或与特定的生物学、生化或结构功能或位置诸如编码区或调控区相关。
蛋白质的“结构域”或“区域”(在本文中可互换使用)是完整蛋白质的任何部分，直至并包括完整蛋白质，但通常包含少于完整蛋白质。结构域可以(但不必须)独立于蛋白质链的其余部分折叠和/或与特定的生物学、生化或结构功能或位置相关(例如配体结合域或胞质、跨膜或胞外结构域)。
定量分析阿柏西普融合蛋白通常在跟踪蛋白质生产中或对于含有阿柏西普的药物物质或药物产品进行批量释放测定是有用或必需的。因此，特异性结合阿柏西普的抗体，特别是单克隆抗体，可用于这些目的。
术语“抗体”或可互换地“Ab”以最广义含义使用，并且包括包括上述的互补决定区(CDR)的完全组装的抗体、单克隆抗体(包括人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、单链抗体、双体)，只要它们显示所需的生物学活性即可。涵盖完整分子和/或片段的多聚体或聚集体，包括化学衍生的抗体。涵盖任何同种型类群或亚类的抗体，包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，或任何同种异型。不同的同种型具有不同的效应子功能；例如，IgG1和IgG3同种型具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。
“分离的”蛋白，例如阿柏西普融合蛋白，是一种已被鉴定并与其天然环境或生产细胞进行分泌的培养基的一种或多种组分分离的蛋白。在一些实施方式中，分离的蛋白质基本上不含在其天然或培养基环境中发现的会干扰其治疗、诊断、预防研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物。其天然环境或培养基的“污染物”成分是会干扰蛋白质，例如抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素以及其他蛋白质或非蛋白质(例如多核苷酸、脂质、碳水化合物)溶质。通常，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。在一些实施方式中，将目标蛋白，例如阿柏西普融合蛋白或抗体纯化(1)至大于按重量计95％的蛋白质，且最优选大于按重量计99％，或(2)在还原或非还原条件下，通过SDS-PAGE或其他合适的技术至均质化，任选使用染色，例如考马斯亮蓝或银染色。分离的天然存在的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为将不存在蛋白质天然环境的至少一种组分。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的目标蛋白质(例如，阿柏西普或抗体)。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体是相同的。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，作为抗原结合蛋白的单克隆抗体是针对单个抗原位点或表位的高度特异性结合剂。单克隆抗体的非限制性实例包括包含前述CDR的鼠、兔、大鼠、鸡、嵌合、人源化或人抗体、完全组装的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、可以结合抗原的抗体片段(包括Fab、Fab'、F(ab)2、Fv、单链抗体、双体)、大抗体(maxibodies)、纳米抗体和重组肽，只要它们表现出所需的生物学活性即可，或以上的变体或衍生物。
修饰语“单克隆”表示抗体的性质是从基本上同质的抗体群体中获得的，并且不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过首先由Kohler etal.,Nature,256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。还可以使用例如Clackson et al.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
术语“免疫球蛋白”涵盖包含两个二聚化重链(HC)的完整抗体，每个均与轻链(LC)共价连接；单个未二聚化的免疫球蛋白重链和共价连接的轻链(HC+LC)，或嵌合的免疫球蛋白(轻链+重链)-Fc异三聚体(所谓的“半抗体”)。“免疫球蛋白”是蛋白质，但不一定是抗原结合蛋白。
在“抗体”中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条约220个氨基酸的“轻”链(约25kDa)和一条约440个氨基酸的“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括约100-110个或更多个氨基酸的“可变”(“V”)区，主要负责抗原识别。每条链的羧基端部分限定一个恒定区，主要负责效应子功能。可变区在不同抗体之间不同。不同抗体之间的恒定区相同。在每个重链或轻链的可变区内，存在三个高变亚区，在抗体是抗原结合蛋白的情况下，其有助于确定抗体对抗原的特异性。高变区之间的可变结构域残基称为构架残基，且通常在不同抗体之间有些同源。免疫球蛋白可以根据其重链恒定结构域的氨基酸序列分为不同的类别。人轻链分为κ(.kappa.)轻链和λ(.lamda.)轻链。在轻链和重链中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区域连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区域。一般参见Fundamental Immunology,第7章(Paul,W.,ed.,第2版Raven Press,N.Y.(1989))。“抗体”还包括重组制备的抗体和糖基化的或缺乏糖基化的抗体。
术语“轻链”或“免疫球蛋白轻链”包括全长轻链及其具有足够赋予结合特异性的可变区序列的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基端。轻链包括κ链和λ链。
术语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括全长重链及其具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基端，且CH结构域在羧基端，其中CH3最接近多肽的羧基端。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)和epsilon(ε)，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链可以是任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。这些中的几个可以进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同的IgG同种型可能具有不同的效应子功能(由Fc区介导)，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。在ADCC中，抗体的Fc区与免疫效应子细胞如天然杀伤剂和巨噬细胞的表面上的Fc受体(FcγRs)结合，导致靶细胞的吞噬作用或裂解。在CDC中，抗体通过触发补体细胞表面处的补体级联反应而杀伤靶细胞。
“Fc区”或本文可互换使用的“Fc结构域”或“免疫球蛋白Fc结构域”包含两个重链片段，其在完整抗体中包含抗体的CH1和CH2结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及CH3域的疏水相互作用保持在一起。
术语“救助(salvage)受体结合表位”是指负责增加IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
对于抗体的结构和产生的详细描述，参见Roth,D.B.,和Craig,N.L.,Cell,94:411-414(1998)，其通过引入整体并入本文中。简而言之，产生编码重链和轻链免疫球蛋白序列的DNA的过程主要发生在发育中的B细胞中。在重新排列和连接各种免疫球蛋白基因区段之前，V、D、J和恒定(C)基因区段通常存在于单个染色体上的相对较近的位置。在B细胞分化过程中，V、D、J(或在轻链基因的情况下，只有V和J)基因片段的每个适当家族成员中的一个被重组，形成了重链和轻链免疫球蛋白基因的功能性重排可变区。该基因片段重排过程似乎是顺序性的。首先，制作重链D-至-J接头，然后制作重链V-至-DJ接头和轻链V-至-J接头。除了重新排列V、D和J片段外，在免疫球蛋白重链和轻链的主要组成部分中还通过轻链中的V和J片段连接及重链的D和J片段连接的位置处的可变重组的方式产生了更多的多样性。轻链的这种变化通常发生在V基因区段的最后一个密码子和J区段的第一个密码子内。在D和JH段之间的重链染色体上会出现类似的连接不精确现象，并且可能会延伸多达10个核苷酸。此外，可以在D和JH之间以及VH和D基因区段之间***几个不是由基因组DNA编码的核苷酸。这些核苷酸的添加被称为N区域多样性。可变区基因区段中这种重排和在这种连接过程中可能发生的可变重组的净效应是一级抗体库的产生。
术语“高变”区是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自互补决定区或CDR的氨基酸残基[即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)，如Kabat et al.,Sequences ofProteins of Immunological Interest,th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)中所述的]。尽管单个CDR与包含所有CDR的整个抗原结合位点相比亲和力低，但即使是单个CDR也可以识别并结合抗原。
来自超高变“环”的残基的替代定义如Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)所述，即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)。
“框”或“FR”残基是除高变区残基以外的那些可变区残基。
“抗体片段”包含完整全长抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体(Zapata et al.,ProteinEng.,8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
木瓜蛋白酶对抗体的消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点，以及一个残留的“Fc”片段，其包含恒定区。Fab片段包含所有的可变结构域，以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fc片段展示碳水化合物，并负责许多抗体效应子功能(诸如结合补体和细胞受体)，从而将一类抗体与另一类抗体区分开。
胃蛋白酶处理产生具有包括抗体的VH和VL结构域的两个“单链Fv”或“scFv”抗体片段的F(ab')2片段，其中这些结构域存在于单条多肽链中。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于，在重链CH1结构域的羧基端处包含一些另外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。优选地，Fv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽连接子，其使得Fv能够形成所需的抗原结合结构。有关scFv的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.1 13,Rosenburg和Moore eds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)。
“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，其包含VH结构域和CH1结构域，以及CH1和CH2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间的二硫键，从而形成F(ab')2分子。
“F(ab')2片段”包含两条轻链和含有CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分(使得在两条重链之间形成链间的二硫键)的两条重链。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，其通过两条重链之间的二硫键保持在一起。
“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价连接的一条重链和一条轻链可变结构域的二聚体组成。以此构型，每个可变结构域的三个CDR相互作用以限定VH VL二聚体的表面上的抗原结合位点。尽管相比整个结合位点亲和力更低，但是单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的一半Fv)具有识别和结合抗原的能力。
“单链抗体”是Fv分子，其中重链和轻链可变区已经通过柔性连接子连接以形成单个多肽链，其形成抗原结合区。单链抗体在国际专利申请公开No.WO 88/01649和美国专利No.4,946,778和No.5,260,203中有详细论述，其公开内容通过引用整体并入本文中。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中，并且任选地在VH和VL结构域之间包含使得Fv能够形成所需的抗原结合结构的多肽连接子(Bird et al.,Science 242:423-426,1988,和Huston et al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。“Fd”片段由VH和CH1结构域组成。
术语“双体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与同一条多肽链(VH VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短以至于不允许同一条链上两个结构域之间配对的连接子，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双体在例如EP 404,097；WO 93/11161和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中有更完整的描述。
“结构域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽连接子共价连接以产生二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
术语“抗原结合蛋白”(ABP)包括阿柏西普，或如本文定义的抗体或抗体片段，以及重组肽或其他化合物，其包含来源于具有所需抗原结合特性的CDR的序列，从而使其特异性结合目标靶抗原。
通常，抗原结合蛋白，例如阿柏西普或抗体或抗体片段，当在相似的结合测定条件下相比其与其他无关蛋白质的亲和力，其与目标抗原具有明显更高的结合亲和力且因此能够区分该抗原时，“特异性结合”该目标抗原。通常，当解离常数(KD)为10-8M或更低时，抗原结合蛋白被称为“特异性结合”其靶抗原。当KD为10-9M或更低时，抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合抗原，并且当KD为10-10M或更低时，以“非常高的亲和力”特异性结合抗原。
“抗原结合区”或“抗原结合位点”意指特异性结合特定抗原的蛋白质的部分。例如，抗原结合蛋白的包含与抗原相互作用并赋予抗原结合蛋白以其对抗原的特异性和亲和力的氨基残基的那部分被称为“抗原结合区”。抗原结合区通常包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区也包括一个或多个“框架”区(“FR”)。“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区可以帮助维持CDR的适当构象以促进抗原结合区和抗原之间的结合。在传统抗体中，CDR嵌入重链和轻链可变区的框架内，在其中它们构成负责抗原结合和识别的区域。免疫球蛋白抗原结合蛋白的可变区包含在框架区内(指定的框架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4，Kabat et al.,1991，同上；也参见Chothia和Lesk，1987，同上)的至少三个重链或轻链CDR，参见同上(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,Md.；也参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia et al.,1989,Nature 342:877-883)。
术语“抗原”是指能够被选择性结合剂如抗原结合蛋白(包括例如，阿柏西普，或者抗体或抗体的免疫功能片段)结合，并且另外能够在动物中使用以产生能够与该抗原结合的抗体的分子或分子的部分。抗原可以具有一个或多个能够与不同的抗原结合蛋白，例如抗体相互作用的表位。
术语“表位”是分子中被抗原结合蛋白(例如，阿柏西普或抗体)结合的部分。该术语包括能够特异性结合抗原结合蛋白，诸如抗体或T细胞受体的任何决定簇。表位可以是连续的或不连续的(例如，在单链多肽中，在多肽序列中彼此不连续但在分子范围内的氨基酸残基被抗原结合蛋白结合)。在某些实施方式中，表位可以是模拟的，因为它们包含与用于产生抗原结合蛋白的表位相似的三维结构，但不包含或仅包含在用于产生抗原结合蛋白的该表位中存在的一些氨基酸残基。表位最常位于蛋白质上，但在一些情况下可能位于其他种类的分子，诸如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原具有特异性的抗体将优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中靶抗原上的表位。
术语“同一性”是指如通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子的序列或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“同一性百分比”意指所比较分子中的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并且是基于所比较的最小分子的大小来计算的。对于这些计算，必须通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决比对中的间隙(如果有的话)。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:OxfordUniversity Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press；vonHeinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:AcademicPress；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.),1991,NewYork:M.Stockton Press；和Carillo et al.,1988,SIAM J.Applied Math.48:1073。例如，可以通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置中的相似性的标准方法确定序列同一性。使用计算机程序如BLAST或FASTA，对两条多肽或两条多核苷酸序列进行比对，以使其各自的残基最佳匹配(沿着一条或两条序列的全长，或沿着一条或两条序列的预定部分)。程序提供默认的开放罚分和默认的空位罚分，并且可以将计分矩阵如PAM 250[标准计分矩阵；参见Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷,补充材料3(1978)]与计算机程序结合使用。例如，然后可以将同一性百分比计算为：相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度与为比对两条序列而引入较长序列的空位数量之和。在计算同一性百分比时，以给出序列之间最大匹配的方式对比较的序列进行比对。
GCG程序包是可用于确定同一性百分比的计算机程序，该程序包包括GAP(Devereux et al.,1984,Nucl.Acid Res.12:387；Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin,Madison,Wis.)。计算机算法GAP用于比对要确定序列同一性百分比的两条多肽或两条多核苷酸。比对序列以使其各自的氨基酸或核苷酸最佳匹配(“匹配的范围”，如通过算法所确定的)。将以下与算法结合使用：空位开放罚分(其计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是使用的比较矩阵对角线的平均值；“对角线”是分配给通过特定的比较矩阵进行的每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及比较矩阵诸如PAM 250或BLOSUM 62。在某些实施方式中，算法也使用标准比较矩阵(参见，对于PAM 250比较矩阵为Dayhoff et al.,1978,Atlas of ProteinSequence and Structure 5:345-352；对于BLOSUM 62比较矩阵为Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:10915-10919)。
使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的推荐参数包括如下参数：
算法：Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.48:443-453；
比较矩阵：来自Henikoff et al.,1992,同上的BLOSUM 62；
空位罚分：12(但对于末端空位无罚分)
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两条氨基酸序列的某些比对方案可以导致仅两条序列的较短区域的匹配，并且即使在两条全长序列之间没有显著的关联，该较小的比对区域也可以具有非常高的序列同一性。因此，如果需要如此，可以调节所选择的比对方法(GAP程序)以产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。
当与目标蛋白质结合使用时，术语“修饰”包括但不限于一个或多个氨基酸改变(包括替换、***或缺失)；化学修饰；通过与治疗剂或诊断剂缀合来进行共价修饰；标记(例如，用放射性核素或各种酶)；共价聚合物附连，诸如PEG化(用聚乙二醇衍生化)，以及通过非天然氨基酸的化学合成进行***或替换。通过技术人员已知的方法，可以将蛋白质“工程化”或修饰以改善靶标亲和力、选择性、稳定性和/或可制造性，然后将“工程化的”蛋白质的编码序列包括在表达盒中。
当与诸如阿柏西普或抗体之类的目标蛋白质结合使用时，术语“衍生物”是指通过与治疗剂或诊断剂缀合、标记(例如，用放射性核素或各种酶)、共价聚合物附连如PEG化(用聚乙二醇进行衍生化)，以及通过化学合成非天然氨基酸进行***或替换而被共价修饰的蛋白质。
在本发明的范围内，阿柏西普蛋白质可以是用于治疗疾病，包括但不限于人类疾病或病症，例如眼睛疾病或病症的治疗性蛋白质或“生物制品”。“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”是旨在防止病症的发展或改变病症的病理而进行的干预。因此，“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施。需要治疗的那些包括已经患有病症的那些以及要预防病症的那些。“治疗”包括在减轻损伤、病理或病况方面取得成功的任何迹象，包括任何客观或主观参数，如消减；缓解；减轻症状或使损伤、病理或病况对患者更可耐受；退化或下降的速度减慢；使退化的最后点的衰弱性降低；改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数；包括医生，例如眼科医生或其他医疗保健提供者进行身体检查的结果，或患者自我报告的结果。
治疗剂的“有效量”通常是足以降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或根本原因、防止症状和/或其根本原因的发生和/或改善或修复眼睛病症或疾病造成的或与其相关的损害的量。在一些实施方式中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是这样的量，其足以修复疾病状态(例如，视网膜中央静脉阻塞(CRVO)继发黄斑水肿、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力损伤、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者中的糖尿病视网膜病(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)、移植排斥或GVHD、炎症、多发性硬化、癌症、心血管疾病、糖尿病、神经病、疼痛)或症状，特别是与疾病状态相关的状态或症状，或者在其他情况下以无论任何方式防止、阻碍、延迟或逆转与疾病相关的疾病状态或任何其他的不良症状的进展(即其提供“治疗功效”)。“预防有效量”是当给药对象时将具有预期的预防作用的药物组分的量。完全的治疗或预防作用不一定通过给药一次剂量就能发生，并且可能只在给药一系列剂量后才发生。因此，可以一次或多次给药来给药治疗或预防有效量。
克隆DNA
使用标准技术进行DNA的克隆(参见，例如，Sambrook et al.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Guide,第1-3卷,Cold Spring Harbor Press，其通过引用并入本文中)。例如，可以通过对多聚A+mRNA，优选与膜相关的mRNA进行逆转录来构建cDNA文库，并使用对人免疫球蛋白多肽基因序列具有特异性的探针筛选文库。然而，在一个实施方式中，聚合酶链式反应(PCR)被用于扩增编码目标免疫球蛋白基因区段(例如，轻链或重链可变区段)的cDNA(或全长cDNA的部分)。扩增的序列可以容易地克隆入任何合适的载体，例如表达载体、小基因载体(minigene vector)或噬菌体展示载体中。应当理解，所使用的特定克隆方法不是关键的，只要可以确定目标多肽的一些部分的序列，例如阿柏西普融合多肽序列的序列即可。
抗体核酸的一种来源是通过从用目标抗原免疫的动物中获得B细胞并将其融合到永生细胞中而产生的杂交瘤。替代地，可以从被免疫动物的B细胞(或整个脾脏)分离核酸。编码抗体的核酸的又一个来源是例如通过噬菌体展示技术产生的此类核酸的文库。可以通过标准技术如淘选来鉴定编码目标肽，例如具有所需结合特性的可变区肽的多核苷酸。
使用标准技术进行DNA的测序(参见，例如，Sambrook et al.(1989)MolecularCloning:A Laboratory Guide,第1-3卷,Cold Spring Harbor Press，和Sanger,F.et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467，其通过引用并入本文中)。通过将克隆的核酸的序列与公开的基因和cDNA序列进行比较，技术人员将很容易确定，具体取决于测序的区域。基因序列信息的一种来源是国家生物技术信息中心，美国国立卫生研究院国家医学图书馆，马里兰州贝塞斯达(the National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine,National Institutes of Health,Bethesda,MD)。
分离的DNA可以可操作地连接至控制序列或置于表达载体中，然后将其转染到不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，以指导重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。抗体的重组产生是本领域熟知的。
当核酸与另一核酸序列处于功能关联时，核酸可操作地连接。例如，如果将多肽的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其被可操作地将前序列或分泌前导序列的DNA连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其被可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则其被可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点连接来完成连接。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。
许多载体是本领域已知的。载体组分可包括以下一种或多种：信号序列(其可以例如直接分泌表达的蛋白质；复制起点、一个或多个选择性标记基因(其可以例如赋予抗生素或其他药物耐受性、补体营养缺陷型或供应培养基中无法获得的关键营养素)、增强子、启动子和转录终止序列，所有这些都是本领域熟知的。
水和其他成分的纯度。用于制造本发明的眼科制剂的水和所有其他成分的纯度水平应优选满足此类药物组分和药剂在目标管辖权内所要求的适用法律或药典标准，例如，美国药典(USP)、欧洲药典、日本药典或中国药典等。例如，根据USP，注射用水在肠胃外及其他必须控制产品内毒素含量的制剂的生产中，并且在其他制药应用，诸如清洁某些设备和非肠道产品接触组分中用作赋形剂；并且用于生产注射用水的来源或供水的最低质量是如美国环境保护署(EPA)、EU、日本或WHO定义的饮用水。
在对患者给药之前，本发明的制剂应满足此类药物组分和药剂在目标管辖权内关于无菌性、缺少内毒素或病毒污染物等所要求的适用法律或药典标准。
缓冲剂***
本发明的眼科制剂包括约5-50mM浓度范围的缓冲剂。本发明的眼科制剂的合适的缓冲剂***可选自磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、谷氨酸盐和乳酸盐，或者缓冲剂可以是这些缓冲剂***中的两种或更多种的组合。本发明的一些有用的实施方式具有约5mM至约20mM范围的缓冲剂浓度，并且其他的实施方式具有约5至约10mM的缓冲剂浓度。如果选择了组氨酸缓冲剂，则约5-20mM范围内的组氨酸浓度是优选的。
非离子表面活性剂
本发明的眼科制剂包括非离子表面活性剂，优选浓度为约0.001％(w/v)至约5.0％(w/v)。在一些实施方式中，非离子表面活性剂的浓度为约0.001％(w/v)至约2.0％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约1.0％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约0.10％(w/v)，或约0.001％(w/v)至约0.01％(w/v)。有用的非离子表面活性剂可以是聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、
Figure BDA0002492606010000291
(即聚乙二醇十二烷基醚)、泊咯沙姆(即聚乙二醇-聚丙二醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；聚(环氧乙烷-聚环氧丙烷共聚物))诸如泊咯沙姆188(即普郎尼克F68)或TritonTM X-100(即4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇))。还涵盖在用于实践本发明的目的的“非离子表面活性剂”内的是烷基糖或烷基糖苷(例如，由Aegis Therapeutics,LLC以商品名
Figure BDA0002492606010000301
销售的；参见例如，Maggio,StabilizingAlkylglycoside Compositions And Methods Thereof,US8,133,863B2)。例如，泊咯沙姆(例如，泊咯沙姆188)在约0.01％(w/v)至约1％(w/v)，优选约0.1％(w/v)至约1％(w/v)的浓度下通常是有用的。聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)在约0.001％(w/v)至约0.1％(w/v)的浓度下通常是有用的。
张力调节剂
本发明的眼科制剂包括张力调节剂，使得该制剂具有的最终摩尔渗透压浓度为约300mOsm/kg(即300±50mOsm/kg)。摩尔渗透压浓度是每单位水中溶解颗粒数量的度量。在溶液中，与水(溶剂)单位数成比例的溶质颗粒数目越少，溶液的浓度就越低，这是低渗透的。如果使用半渗透膜(仅对溶剂分子可渗透的膜)分离不同溶质浓度的溶液，则会发生一种被称为渗透的现象，其中溶剂分子从较低浓度穿过膜到较高浓度，以建立浓度平衡。驱动该运动的压力称为渗透压，且由溶液中溶质的“颗粒”数量决定。包含相同浓度的粒子并因此施加相等的渗透压的溶液称为等渗的。例如，红细胞(rbc)内的渗透压等于周围溶液，使得其既不会收缩也不会扩张。如果将rbc放入水中，由于仅水是低渗透的，它将破裂。如果将rbc放在高盐溶液，即大于0.9％(w/v)的氯化钠中，它会收缩，因为该溶液是高渗透性的。在这两个实例中，rbc均被损坏。对于任何生物细胞，如眼睛内部的那些细胞，也会发生同样的情况。如果将低渗或高渗溶液放在眼睛上，则其会造成损害，因此有必要为眼用药物使用等渗溶液。实际上，0.9％的氯化钠溶液是等渗的，且具有的浓度为270-300mOsm/kg。将所有溶液都与此标准进行比较，并且如果它们落入250-350mOsm/kg的扩展范围内，则认为是等渗的。以一定浓度添加用于稳定蛋白质的赋形剂，以产生等渗溶液。例如，诸如蔗糖和海藻糖等二糖在浓度为9.25％时是等渗的，诸如葡萄糖和甘露糖等单糖在浓度为5％时是等渗的，且诸如脯氨酸或赖氨酸(或其盐)等氨基酸在浓度为约2％-3％时是等渗的。可以从理论上或实验确定摩尔渗透压浓度。可以根据以下方程式确定理论计算：
摩尔渗透压浓度＝(g化合物/100mL溶液)*(化合物的E值)。
通过以下方程式确定化合物的E值：
E值＝(NaCl的MW/NaCl i值)*(化合物i值/化合物MW)。
i值是基于80％的理论解离度的来自化合物的离子数。对于不离解的化合物，即蔗糖，i值为1。对于离解为2个离子的化合物，即NaCl，i值为1.8，并且对于离解为3个离子的化合物，i值为2.6。由于摩尔渗透压浓度是溶液的依数性质，因此由于添加的溶质引起的冰点降低或蒸气压的降低与液体中溶质分子的总数直接相关。这些原理中的每一个在本领域中都已经被利用来开发测量摩尔渗透压浓度的有用的仪器。任一种或两种类型的仪器可用于生物样品。例如，含有10mM磷酸钠、40mM NaCl、5％蔗糖和0.03％w/v聚山梨醇酯20的溶液具有的理论摩尔渗透压浓度为263mOsm/kg。在我们的实验室中，如通过降低冰点测量的实际测量值为270mOsm/kg。这说明实验值与理论值密切匹配，进一步表明为了实施本发明的目的，理论值或实验值可用于基于其摩尔渗透压浓度确定溶液是否适合玻璃体内注射。
在本发明的眼科制剂中，张力调节剂是赖氨酸的药学上可接受的盐。典型地，赖氨酸盐张力调节剂的浓度在2％-4％(w/v)的范围内，具体取决于缓冲剂浓度和其他制剂赋形剂，并且在几个优选的实施方式中，赖氨酸盐为约2％(w/v)至约3％(w/v)。
另外的稳定剂
在本发明的眼科制剂的一些实施方式中，制剂还可以包含另外的氨基酸稳定剂。另外的氨基酸稳定剂可以是例如脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸或甲硫氨酸。氨基酸可以是L-氨基酸或D-氨基酸或盐形式，只要氨基酸是药学上可接受的，并且为药学上可接受的形式，例如，药学上可接受的盐形式。(参见，例如Falconer et al.,Stabilization of amonoclonal antibody during purification and formulation by addition of basicamino acid excipients,J Chem Technol Biotechnol(2011)86:942–948；Platts etal.,Control of Globular Protein Thermal Stability in Aqueous Formulations bythe Positively Charged Amino Acid Excipients,Journal of PharmaceuticalSciences 105(2016)3532-3536；Wang,W.,Instability,stabilization,and formulationof liquid protein pharmaceuticals,International Journal of Pharmaceutics 185(1999)129–188；Yin et al.,Effects of Antioxidants on the Hydrogen Peroxide–Mediated Oxidation of Methionine Residues in Granulocyte Colony-StimulatingFactor and Human Parathyroid Hormone Fragment 13-34,Pharmaceutical Research(2004)21(12):2377-2383；Lam et al.,Antioxidants for Prevention of MethionineOxidation in Recombinant Monoclonal Antibody HER2,Journal of PharmaceuticalSciences 86(11):1250-1255(1997)；Levine et al.,Methionine Residues asEndogenous Antioxidants in Proteins,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93(26):15036-15040(1996)；Maeder et al.,Local tolerance and stability up to 24 months of anew 20％proline-stabilized polyclonal immunoglobulin for subcutaneousadministration,Biologicals 39:43-49(2011)；Cramer et al.,Stability over 36months of a new liquid 10％polyclonal immunoglobulin product(IgPro10,
Figure BDA0002492606010000321
)stabilized with L-proline,Vox Sanguinis(2009)96,219–225；Bolli etal.,L-Proline reduces IgG dimer content and enhances the stability ofintravenous immunoglobulin(IVIG)solutions,Biologicals 38(2010)150–157；Truong,Combination of D-Amino Acids and Lipoteichoic Acid,EP2545909 A1；Stroppolo etal.,Pharmaceutical compositions containing the salts of S(+)-2-(4-isobutylphenyl)propionic acid with basic aminoacids,US5510385)。另外的氨基酸稳定剂的有用的浓度为约0.01％-3％(w/v)。然而，甲硫氨酸可以用作低浓度，即10 mM或更低活性氧种类的清除剂。
本发明的示例性的制剂
本发明的示例性的眼科制剂包括其中缓冲剂为磷酸盐缓冲剂的那些。在一个这样的实施方式中，(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；(b)磷酸盐缓冲剂浓度为约10mM；(c)非离子表面活性剂是浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯或浓度为约0.01％(w/v)至约1％(w/v)的泊咯沙姆；(d)张力调节剂是浓度为约2％(w/v)至约3％(w/v)的赖氨酸盐；并且制剂的pH为约pH 6.0至约pH 6.5。在该制剂的一些优选的实施方式中，阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。在该制剂的一些优选的实施方式中，非离子表面活性剂是浓度为约0.1％(w/v)至约1％(w/v)的泊咯沙姆(例如，泊咯沙姆188)。
本发明的示例性的眼科制剂还包括其中缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂的那些。在一个这样的实施方式中，(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；(b)组氨酸缓冲剂浓度为约10mM；(c)非离子表面活性剂是浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯或浓度为约0.01％(w/v)至约1％(w/v)的泊咯沙姆；(d)张力调节剂是浓度为约2％(w/v)至约3％(w/v)的赖氨酸盐；并且制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.5，或者在一些实施方式中，约pH 6.0至约pH6.5。在该制剂的一些优选的实施方式中，阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如，浓度为约40mg/mL。在该制剂的一些优选的实施方式中，非离子表面活性剂是浓度为约0.1％(w/v)至约1％(w/v)的泊咯沙姆(例如，泊咯沙姆188)。
本发明的其他示例性的眼科制剂包括其中缓冲剂是醋酸盐缓冲剂的那些。在一个这样的实施方式中，(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；(b)醋酸盐缓冲剂为约10mM；(c)非离子表面活性剂是浓度为约0.03％(w/v)的聚山梨醇酯或浓度约0.01％(w/v)至约1％(w/v)泊咯沙姆；(d)张力调节剂是浓度为约2％(w/v)至约3％(w/v)的赖氨酸盐；并且制剂的pH为约pH 5.0至约pH 5.5。在该制剂的一些优选的实施方式中，阿柏西普浓度为约30mg/mL至约50mg/mL；例如约40mg/mL的浓度。在该制剂的一些优选的实施方式中，非离子表面活性剂是浓度为约0.1％(w/v)至约1％(w/v)的泊咯沙姆(例如，泊咯沙姆188)。
通过进一步说明的方式，本发明涵盖以下编号的实施方式：
实施方式1：眼科制剂，其包含：
(a)浓度为5-100mg/mL的阿柏西普；
(b)5-50mM浓度的缓冲剂；
(c)非离子表面活性剂；
(d)作为张力调节剂的赖氨酸盐，其中所述眼科制剂具有约300mOsm/kg的最终摩尔渗透压浓度；并且
其中制剂的pH为约pH 5.0至约pH 6.5。
实施方式2：如实施方式1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
实施方式3：如实施方式1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是醋酸盐缓冲剂。
实施方式4：如实施方式1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂。
实施方式5：如实施方式1-4所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂选自磷酸盐、组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐和乳酸盐，或者是这些中的两种或更多种的组合。
实施方式6：如实施方式1-5所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂浓度为5-20mM。
实施方式7：如实施方式1-6所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、聚乙二醇十二烷基醚(即
Figure BDA0002492606010000341
)、泊咯沙姆(例如，泊咯沙姆188)、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇(即TritonTM X-100)、烷基糖和烷基糖苷。
实施方式8：如实施方式1-7所述的眼科制剂，还包含另外的氨基酸稳定剂。
实施方式9：如实施方式8所述的眼科制剂，其中所述另外的氨基酸稳定剂选自由以下组成的组：脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。
实施方式10：如实施方式1-2和实施方式5-9所述的眼科制剂，其中：
(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)磷酸盐缓冲剂浓度为约10mM，
(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆，
(d)作为张力调节剂的赖氨酸盐的浓度为约2％-3％(w/v)；
并且所述眼科制剂的pH为约pH 6.0至约pH 6.5。
实施方式11：如实施方式1-10所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
实施方式12：如实施方式1、3和5-9所述的眼科制剂，其中：
(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)所述醋酸盐缓冲剂浓度为约10mM，
(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆，
(d)所述作为张力调节剂的赖氨酸盐的浓度为约2-3％(w/v)；
并且所述眼科制剂的pH为约pH 5.0至约pH 5.5。
实施方式13：如实施方式1-12所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
实施方式14：如实施方式1、4和5-9所述的眼科制剂，其中：
(a)阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)组氨酸缓冲剂为约10mM；
(c)非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆；
(d)作为张力调节剂的赖氨酸盐的浓度为约2％-3％(w/v)；
并且所述制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.5。
实施方式15：如实施方式1-14所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
实施方式16：实施方式1-15所述的任何制剂用于治疗眼病症或疾病的用途。
实施方式17：如实施方式16所述的用途，其中所述眼病症或疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力损伤、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者中的糖尿病视网膜病(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。
实施方式18：如实施方式16-17所述的用途，其中其中所述眼科制剂通过玻璃体内注射给药至患有眼病症或疾病的患者。
以下工作实施例是说明性的，且不以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1.稳定性研究。
材料.使用行业标准的重组表达技术和纯化工艺生产VEGF特异性的阿柏西普融合蛋白拮抗剂。使用Millipore公司的实验室规模或台式规模的切向流过滤***，将纯化的药物物质对指定的制剂缓冲剂进行缓冲剂交换。通过用制剂缓冲剂稀释，将蛋白质浓度调节至最终目标浓度。用于制备所有制剂的水均通过
Figure BDA0002492606010000361
(Millipore公司)净水***进行纯化，该***包括一个离子交换滤芯。通过测量电导率来监测水的纯度，可接受的值为大于18.2MΩcm-1
Figure BDA0002492606010000363
用于制备制剂缓冲剂的所有赋形剂、缓冲剂和其他成分均为USP级或同等水平。
方法.
滴定：将以等摩尔量制备的酸和碱共轭物以适当的摩尔比混合在一起，以达到磷酸盐缓冲剂***所需的制剂pH。使用共轭方法或在
Figure BDA0002492606010000362
纯净水中添加冰醋酸，然后用氢氧化钠滴定以达到所需的最终pH值，来制备醋酸盐制剂。
外观：进行了定性视觉外观测试，以评估药物产品中的蛋白质颗粒或环境污染物。将等分试样(1.1mL)的蛋白质样品放入预先灭菌的1型玻璃小瓶中，并盖上13毫米的盖子。在环境光条件下，轻轻旋转样品并目视检查5秒钟，以检测可见颗粒。对于所有测试的样品，记录任何检测到的颗粒的数量和描述。
颜色.进行了定性视觉颜色评估，以监测产品稳定性期间的药物产品颜色。将来自Ricca Chemicals的市售EP 2.2.2棕黄色颜色标准品(BY1-BY7)等分到预先灭菌的1型玻璃小瓶中。将等分试样(1.1mL)的药物产品放入小瓶中，并针对等体积的每种棕黄色颜色标准进行比较，以确定颜色水平。在白色背景前检查所有样品，并记录每个样品的颜色水平。
减少体积的光遮蔽亚可见颗粒分析.使用配备有HRLD-150传感器的HIAC计数器(Beckman公司)通过光遮蔽来测量亚可见颗粒。使用范围为1-100μm的聚苯乙烯珠对传感器进行校准。在分析之前，将
Figure BDA0002492606010000371
水冲洗通过***，直到达到干净的基线，并使用15μm聚苯乙烯珠的标准溶液确认***适用性。将重复的样品在玻璃小瓶中合并至最终体积为1.1mL，并在75托下真空脱气2小时。对于每个样品，将仪器设置为抽取0.2毫升的五个等份试样，并测量大于10和25μm的颗粒。报告最后三项测量的平均值。
尺寸排阻色谱.使用Waters XBridge Protein BEH SEC 200A色谱柱进行尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析。在自然条件下使用磷酸盐、氯化钠运行缓冲剂实现分离。通过UV吸收检测峰洗脱，并将综合纯度结果报告为高分子量(HMW)组分、主成分(单体)和低分子量(LMW)组分相对于总校正面积的相对峰面积百分比。
CZE氯离子分析.使用在Beckman PA 800毛细管电泳仪上运行的MicrosolvTechnologies CElixirOA pH 5.4试剂盒进行氯离子分析。样品和标准品根据制造商的说明进行制备。通常，通过1psi的压力在50.2cm有效长度的裸露熔融毛细管上注射10秒。样品通过光电二极管阵列检测器(PDA)进行监测。通常，使用0.2mM至2mM氯离子的标准曲线的回归分析来定量每个样品中氯离子的浓度。
效力评价.在基于细胞的VEGF-A165依赖性增殖测定中评估了阿柏西普的效力。不存在生长因子的情况下，将人脐静脉内皮细胞与不同浓度的药物产品和100ng/mL VEGF-A165一起铺板在96孔板中。在添加荧光活力试剂之前，将测定板在37℃、5％CO下孵育约3天。通过绘制药物产品浓度相对于荧光的关系图，然后使用4参数拟合方程式进行拟合，来生成剂量反应曲线。通过评价测试样品和参考标准之间沿x轴的位移来测量相对效力。
基于质谱的多属性方法(MAM).将稳定性样品用6.8M胍变性，用10mM二硫苏糖醇(DTT)还原，并用20mM碘乙酸烷基化。通过基于尺寸排阻的脱盐柱除去过量的试剂。以1:10比例的酶与底物加入胰蛋白酶，并将样品在37℃下消化30分钟。通过RP-HPLC用甲酸/乙腈(FA/ACN)梯度在C18色谱柱上分离所得的肽，并使用Thermo Fisher Q-Exactive质谱仪通过质谱检测进行监测。使用Genedata's Expressionist软件对单个肽段进行鉴定和定量。
摩尔渗透压浓度测量.使用Advanced Instruments,Inc.冰点摩尔渗透压浓度计测量样品的摩尔渗透压浓度。在样品分析之前，使用290mOsm/kg ClinitrolTM 290参考溶液(Fisher Scientific)检查仪器校准。将来自样品的20μL等分子样品转移到样品管中，并放入仪器中进行冰点分析。以一式三份对这些子样本进行了分析，且报告的结果为这些值的平均值。
实施例2.稳定性研究
进行了本发明的制剂的各种实施方式中的阿柏西普稳定性的测试。表1包含了测试的阿柏西普(40mg/mL)制剂及其缩写词的列表。使用的氨基酸为L-异构构型。
表1.本文中的表2-11中使用的测试的阿柏西普(40mg/mL)制剂和相关的缩写词。
Figure BDA0002492606010000381
Figure BDA0002492606010000391
制剂的摩尔渗透压浓度.通过冰点摩尔渗透压浓度计测量阿柏西普制剂的摩尔渗透压浓度。所有摩尔渗透压浓度结果均在可接受的范围内(参见，表2)。
表2.制剂的摩尔渗透压浓度。*意指n＝1；否则n＝3。
Figure BDA0002492606010000392
阿柏西普的稳定性.使用在三(3)个不同批次中以不同的生产规模重组生产的阿柏西普评价了两种制剂。以三种不同规模生产的阿柏西普显示出相似的产品特性，包括所有批次中相似的糖基化水平。将10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐和0.1％(w/v)泊咯沙姆188(即P62LysPl-0.1)制剂与在10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖和0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2(即P62NaSuT)中配制的阿柏西普进行比较。使用SE-HPLC检查4℃和30℃下阿柏西普的HMW形成速率。4℃存储条件代表用于存储阿柏西普的标准“真实世界”条件，而30℃条件不是标准的存储条件，并被选择为在方便缩短的或者“加速的”研究期内模拟长期存储的方式。如表3和表4中所示的，阿柏西普的HMW形成速率明显存在轻微的批次间差异，然而，在所有情况下，当相比在10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖和0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2(即P62NaSuT)中配制的阿柏西普时，10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐和0.1％(w/v)泊咯沙姆188(即P62LysPl-0.1)制剂具有更低的HMW形成速率。还使用减小体积的光遮蔽亚可见颗粒分析检查了亚可见颗粒的形成。在4℃的存储期间，任何制剂中阿柏西普的亚可见颗粒的形成都没有显著的变化(表5)。
表3.如通过SE-HPLC测量的4℃下的HMW形成速率。
Figure BDA0002492606010000401
表4.如通过SE-HPLC测量的30℃下的HMW形成速率。
Figure BDA0002492606010000402
表5.如通过小体积HIAC分析测量的4℃下的亚可见颗粒形成
Figure BDA0002492606010000403
Figure BDA0002492606010000411
具有不同表面活性剂的赖氨酸制剂中阿柏西普的稳定性.在两种表面活性剂泊咯沙姆188或聚山梨醇酯80中的任何一种的存在下，使用SE-HPLC检查了阿柏西普在本发明的包含赖氨酸盐的制剂中的稳定性(分别见表6和表7)。当每种用聚山梨醇酯80或泊咯沙姆188配制时，与10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，pH 6.2相比，当在10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2中配制阿柏西普时高分子量(HMW)物质形成轻微降低。HMW物质的形成不受这些基于磷酸盐缓冲剂的制剂的表面活性剂的存在的影响。当每种用聚山梨醇酯80或泊咯沙姆188配制时，相比10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，pH6.2制剂中的阿柏西普，10mM醋酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 5.2中的阿柏西普显示更大的HMW形成速率。
表6.如通过SE-HPLC测量的30℃下的包含非离子表面活性剂泊咯沙姆188(0.1％(w/v))的阿柏西普制剂的稳定性。
Figure BDA0002492606010000412
表7.如通过SE-HPLC测量的30℃下的包含非离子表面活性剂聚山梨醇酯80(0.03％(w/v))的阿柏西普制剂的稳定性。
Figure BDA0002492606010000413
Figure BDA0002492606010000421
模拟运输后阿柏西普的稳定性和表面活性剂浓度的影响.经过模拟运输后，在具有各种表面活性剂和表面活性剂浓度的10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2制剂(即P62Lys)中表征阿柏西普的稳定性。模拟的运输方案旨在考虑可能会潜在地损坏产品并影响稳定性概况的多种运送方式。如通过SE-HPLC测量的(表8和图2中所示的)，于4℃下储存的在10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2制剂中的阿柏西普的HMW形成速率不依赖于存在的表面活性剂的类型或表面活性剂的浓度，并且低于10mM磷酸盐、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖、0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2制剂(即P62NaSuT)中的阿柏西普所观察到的HMW形成速率。另外，尽管30℃下HMW的形成速率快于4℃下的形成速率，但稳定性顺序并未改变，其中10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2最为稳定(参见表9和图1)。在模拟运输之后，通过减少体积光遮蔽亚可见颗粒分析测量的亚可见颗粒计数在所有制剂中均增加到相似的程度(参见表10；将0周对照的列与0周进行比较)。但是，亚可见颗粒计数似乎并不依赖于制剂。在4℃下的所有制剂中，颜色保持不变，颜色标准BY5和BY6之间的结果一直到52周的时间点。通过视觉外观测试，所有制剂基本不含可见颗粒。评估了制剂子集在13周和52周的时间点和储存温度下的产品效力(参见，表11)。未检测到10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2制剂和10mM磷酸盐、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖，pH 6.2制剂之间的％相对效力的差异，无论存在哪种非离子表面活性剂。这些结果表明，磷酸盐赖氨酸盐张力调节制剂稳定了蛋白质并保持了功能活性。
基于质谱的多属性方法(MAM).进行了MAM分析，以评价属性的翻译后修饰水平变化，属性诸如天冬氨酸残基的异构化、天冬酰胺的脱酰胺和甲硫氨酸的氧化。与-70℃对照样品相比，在4℃、30℃和40℃下储存3个月后评价了三种制剂的样品。在该分析中，将10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐，pH 6.2制剂、0.1％(w/v)泊咯沙姆188，pH 6.2和10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.2与阿柏西普商业制剂10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖、0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2进行比较。
当与-70℃对照样品相比时，在任何4℃样品中均未检测到翻译后修饰的显著增加。在升高的温度条件下，可观察到甲硫氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺和天冬氨酸异构化水平的可检测变化，然而，在所测试的三种制剂中的水平相似，并且在测量技术的误差范围内。这些结果表明，当在升高的温度下储存时，本发明的制剂10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐、0.1％(w/v)泊咯沙姆188，pH 6.2和10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸一盐酸盐、0.03％(w/v)聚山梨醇酯80，pH 6.2可提供与商用制剂10mM磷酸钠、40mM氯化钠、5％(w/v)蔗糖、0.03％(w/v)聚山梨醇酯20，pH 6.2相似的保护以免受自常见降解途径。
表8.如通过SE-HPLC测量的4℃下的HMW形成速率；*对照是指保持在4℃下的在运输研究期间，而未进行模拟的运送处理的材料。
Figure BDA0002492606010000431
表9.如通过SE-HPLC测量的30℃下的HMW形成速率；*对照是指保持在4℃下的在运输研究期间，而未进行模拟的运送处理的材料。
Figure BDA0002492606010000441
表10.如通过HIAC测量的4℃下的亚可见颗粒形成速率；*对照是指保持在4℃下的在运输研究期间，而未进行模拟的运送处理的材料。
Figure BDA0002492606010000442
表11.相对效力；*NT–所有温度均未通过效能测定进行测试；否则n＝3。
Figure BDA0002492606010000443
相比市售获得的
Figure BDA0002492606010000444
比较本发明的赖氨酸盐张力调节制剂中的重组产生的阿 柏西普。将30℃下的于10mM磷酸盐、2.75％(w/v)赖氨酸，pH 6.2、0.1％(w/v)泊咯沙姆制剂中的阿柏西普的稳定性与
Figure BDA0002492606010000453
(阿柏西普；Regeneron Pharmaceuticals,Inc.,Tarrytown,NY)的稳定性进行比较。阿伯西普由Just Biotherapeutics(Seattle,WA)重组生产用于这些研究，并配制为所述的制剂(参见，表12)。
Figure BDA0002492606010000454
是从欧洲市场购买的，并且稳定放置在其自己的容器中。在指定的时间点从小瓶中取出样品，并通过SE-HPLC测量以表征存在的HMW物质的量。数据表明，与
Figure BDA0002492606010000455
药物产品中的阿柏西普相比，由JustBiotherapeutics重组生产并配制为所示制剂的阿柏西普具有更低的％HMW和相似的HMW物质随时间的形成速率。
表12.30℃下的本发明的制剂的实施方式和市售获得的阿柏西普制剂
Figure BDA0002492606010000456
的HMW形成速率(SE-HPLC)的比较。
Figure BDA0002492606010000451
实施例3.兔中通过玻璃体内给药的安慰剂制剂的耐受性研究
为了确定打算与阿柏西普药物产品一起使用的本发明的制剂的一些实施方式的耐受性，在美国Charles River Laboratories,Inc.,640N.Elizabeth Street,Spencerville,OH 45887将安慰剂制剂的玻璃体内注射液以单剂量的形式给药至兔子，如表13中所示的。
表13.在雄性兔子中以单剂量形式测试的安慰剂制剂。
Figure BDA0002492606010000452
根据研究设计评估以下参数和终点：临床体征、体重、体重增加、食物消耗和眼科。
在该研究中的受试者兔子中，没有早期死亡，没有与处理有关的临床体征，且没有对体重、体重增加、食物消耗或任何眼科检查结果的影响。总之，通过玻璃体内注射所有安慰剂制剂的给药在兔子中耐受性良好。
序列表
<110> 济世发展生物药业有限公司（JUST-EVOTEC BIOLOGICS, INC.）
<120> 包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途
<130> PPI20010078US
<140>
<141>
<150> 62/588,536
<151> 2017-11-20
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /note="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr
195 200 205
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
225 230 235 240
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
245 250 255
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
260 265 270
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
275 280 285
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
290 295 300
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
305 310 315 320
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325 330 335
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340 345 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355 360 365
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370 375 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
385 390 395 400
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405 410 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430

Claims (18)

1.眼科制剂，其包含：
(a)浓度为5-100mg/mL的阿柏西普；
(b)5-50mM浓度的缓冲剂；
(c)非离子表面活性剂；以及
(d)作为张力调节剂的赖氨酸盐，其中所述眼科制剂具有约300mOsm/kg的最终摩尔渗透压浓度；
其中所述眼科制剂的pH为约pH 5.0至约pH 6.5。
2.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
3.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是醋酸盐缓冲剂。
4.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂是浓度为5-20mM的组氨酸缓冲剂。
5.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂选自磷酸盐、组氨酸、醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、谷氨酸盐和乳酸盐，或者是它们中的两种或更多种的组合。
6.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述缓冲剂浓度为5-20mM。
7.根据权利要求1所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、聚乙二醇十二烷基醚、泊咯沙姆、4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇、烷基糖和烷基糖苷。
8.根据权利要求1所述的眼科制剂，还包括另外的氨基酸稳定剂。
9.根据权利要求8所述的眼科制剂，其中所述另外的氨基酸稳定剂选自由以下组成的组：脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。
10.根据权利要求2所述的眼科制剂，其中：
(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)所述磷酸盐缓冲剂浓度为约10mM，
(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆，
(d)所述作为张力调节剂的赖氨酸盐浓度为约2％-3％(w/v)；
以及所述眼科制剂的pH为约pH 6.0至约pH 6.5。
11.根据权利要求10所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
12.根据权利要求3所述的眼科制剂，其中：
(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)所述醋酸盐缓冲剂浓度为约10mM，
(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆，
(d)所述作为张力调节剂的赖氨酸盐浓度为约2％-3％(w/v)；
以及所述眼科制剂的pH为约pH 5.0至约pH 5.5。
13.根据权利要求12所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
14.根据权利要求4所述的眼科制剂，其中：
(a)所述阿柏西普浓度为20-80mg/mL；
(b)所述组氨酸缓冲剂为约10mM；
(c)所述非离子表面活性剂是聚山梨醇酯或泊咯沙姆；
(d)所述作为张力调节剂的赖氨酸盐浓度为约2％-3％(w/v)；
以及所述制剂的pH为约pH 5.5至约pH 6.5。
15.根据权利要求14所述的眼科制剂，其中所述非离子表面活性剂是泊咯沙姆188。
16.治疗眼病症或疾病的方法，包括向需要治疗的患者给药治疗有效量的权利要求1、权利要求2、权利要求3或权利要求4所述的眼科制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述眼病症或疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞继发黄斑水肿(RVO)、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、视网膜分支静脉阻塞(BRVO)、新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、近视脉络膜新生血管引起的视力损伤、糖尿病性黄斑水肿(DME)、DME患者中的糖尿病视网膜病(DR)和新生血管年龄相关性黄斑变性(AMD)。
18.根据权利要求16所述的方法，其中通过玻璃体内注射给药所述眼科制剂。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116327963A (zh) 2016-11-21 2023-06-27 济世-伊沃泰克生物制品有限公司 一种眼科制剂及其用途
CN116585466A (zh) 2018-05-10 2023-08-15 瑞泽恩制药公司 含有高浓度vegf受体融合蛋白的制剂
JP2022552052A (ja) * 2019-12-06 2022-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆタンパク質組成物及びその製造方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140127227A1 (en) * 2011-10-28 2014-05-08 Byeong Seon Chang Protein formulations containing amino acids
CN104736175A (zh) * 2012-08-31 2015-06-24 拜尔健康护理有限责任公司 抗催乳素受体抗体制剂
US20150313996A1 (en) * 2012-11-27 2015-11-05 Alteogen Inc. Composition for stabilizing fusion protein in which protein and fc domain are fused
WO2016087677A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof for use in treating bone associated pain
WO2016208989A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Alteogen, Inc. A stable liquid formulation of fusion protein with igg fc domain

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30985A (en) 1860-12-18 Thomas l
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE68925893T2 (de) 1988-07-23 1996-08-08 Delta Biotechnology Ltd Sekretorische leader-sequenzen
ATE135397T1 (de) 1988-09-23 1996-03-15 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
IT1264855B1 (it) 1993-06-21 1996-10-17 Zambon Spa Composizioni farmaceutiche contenenti sali dell'acido s(+)-2-(4-isobutilfenil) propionico con amminoacidi basici
US6022952A (en) 1998-04-01 2000-02-08 University Of Alberta Compositions and methods for protein secretion
CA2350226C (en) 1998-11-20 2012-04-24 Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. Protein expression vector and utilization thereof
CA2368068A1 (en) 1999-03-18 2000-09-21 Steven M. Ruben 27 human secreted proteins
ATE417928T1 (de) 1999-06-08 2009-01-15 Regeneron Pharma Vegf-rezeptorchimären zur behandlung von augenkrankheiten, welche durch vaskuläre permeabilität charakterisiert sind.
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US6803046B2 (en) * 2002-08-16 2004-10-12 Bracco International B.V. Sincalide formulations
MXPA06014079A (es) * 2004-06-01 2007-02-15 Ares Trading Sa Metodo para estabilizar proteinas.
EP2586459B1 (en) 2005-03-25 2017-05-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
HUE053612T2 (hu) 2006-06-16 2021-07-28 Regeneron Pharma Intravitreális bevitelre alkalmas VEGF-antagonista készítmények
US7998927B2 (en) 2006-06-23 2011-08-16 Aegis Therapeutics, Llc Stabilizing alkylglycoside compositions and methods thereof
KR100784134B1 (ko) * 2006-10-09 2007-12-12 주식회사 대웅 상피세포성장인자를 함유하는 안정한 구내염 치료용 액상조성물
US20120294866A1 (en) * 2010-01-19 2012-11-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical formulation for proteins
EP2545909A1 (en) 2011-07-12 2013-01-16 Lunamed AG Combination of D-Amino Acids and Lipoteichoic Acid
CN104619335A (zh) * 2012-06-01 2015-05-13 奥普索特克公司 包含抗-pdgf适体和vegf拮抗剂的组合物
US20150297675A1 (en) * 2012-08-28 2015-10-22 Aaron Osborne Use of a vegf antagonist in treating ocular vascular proliferative diseases
CN105435222B (zh) * 2014-09-25 2018-05-29 信达生物制药(苏州)有限公司 重组融合蛋白制剂
WO2017046140A1 (en) * 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
JP6953433B2 (ja) * 2016-01-26 2021-10-27 フォーマイコン アーゲーＦｏｒｍｙｃｏｎ Ａｇ Ｖｅｇｆアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ
CN116327963A (zh) * 2016-11-21 2023-06-27 济世-伊沃泰克生物制品有限公司 一种眼科制剂及其用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140127227A1 (en) * 2011-10-28 2014-05-08 Byeong Seon Chang Protein formulations containing amino acids
CN104736175A (zh) * 2012-08-31 2015-06-24 拜尔健康护理有限责任公司 抗催乳素受体抗体制剂
US20150313996A1 (en) * 2012-11-27 2015-11-05 Alteogen Inc. Composition for stabilizing fusion protein in which protein and fc domain are fused
WO2016087677A1 (en) * 2014-12-05 2016-06-09 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Anti-trka antibodies with enhanced inhibitory properties and derivatives thereof for use in treating bone associated pain
WO2016208989A1 (en) * 2015-06-23 2016-12-29 Alteogen, Inc. A stable liquid formulation of fusion protein with igg fc domain

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TIMO RATH 等: ""Fc-fusion proteins and FcRn：structural insights for longer lasting and more effective therapeutics"", 《CRIT REV BIOTECHNOL》, vol. 35, no. 2, pages 235 *
WEI WANG 等: "《Aggregation of therapeutic proteins》", JOHN WILEY & SONS出版公司, pages: 145 *
张思远等: ""黄斑水肿治疗进展"", 《泸州医学院学报》, vol. 39, no. 3, pages 218 - 222 *

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Publication number Publication date
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