CN1982438A - 一株芽孢杆菌及用其制备单糖链人参皂苷及苷元的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株芽孢杆菌及用其制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，该方法简单方便、安全可靠、成本低。该芽苞杆菌A8经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为1703。用A8酵解人参皂苷制备C－K、PPD及PPT混合物的方法中，酵解温度25－45℃，pH值5.0－7.0，酵解时间2h－15d，转化液为水溶液，人参皂苷与微生物菌株A8的比例为4∶1－8∶1；收集过程是将反应产物经0.2－0.45μm微孔滤膜去除微生物后，注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱，将80－90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至干，得到C－K、PPD及PPT混合物，收率70－90％。

Description

一株芽孢杆菌及用其制备单糖链人参皂苷及苷元的方法

技术领域：

本发明涉及由微生物转化(水解)人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法。特别是涉及一株芽孢杆菌A8[(Bacillus sp.)，保藏日期：2006年04月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号：1703，分类命名：芽孢杆菌属(Bacillus sp.)]转化人参皂苷大量制备单糖链人参皂苷20(S)原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[20(S)-protopanaxadiol-20-O-β-D-glucopyranoside，人参皂苷Compound-K简称C-K]、原人参二醇苷元[20(S)-protopanaxadiol，简称PPD]及原人参三醇苷元[20(S)-protopanaxatriol，简称PPT]的方法。

背景技术：

人参皂苷是人参、西洋参、三七等五加科人参属植物的主要活性成分，人参皂苷中的Rh₁、-Rh₂、C-K、PPD和PPT为人参、西洋参、三七等五加科人参属植物中存在的微量稀有次生皂苷。研究表明这些稀有人参皂苷均具有显著的抗肿瘤活性。

早在1979年日本学者Odashima等人就发现人参皂苷Rh₂能抑制肺癌细胞3LL(小鼠)、莫里斯肝细胞(兔子)、BA-16恶性肿瘤(小鼠)和HELA细胞(人)的增殖，并证明人参皂苷能引起癌细胞向正常细胞转化。1991年，日本学者Kikuchi等报道，给裸鼠口服人参皂苷Rh₂可明显抑制人类卵巢癌细胞(Human ovarian cancer cells HRA)的增生，小鼠的生存率显著上升^[3]。1996年夏丽娟利用体外实验方法研究了-Rh₂对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用，结果表明：-Rh₂在10μg0.mL-L的浓度下对B16细胞有较强的分化诱导作用，表现为黑色素生成能力明显增加；形态向上皮样细胞分化；细胞呈网状结构；黑色素颗粒增多，生长变缓慢^[20]。Kim等^[21]的研究也显示，人参皂苷Rh₂和-Rh₃能诱导HL-60细胞向粒细胞的分化，可使HL-60细胞阻断在G1/S期。由-Rh₂引起的HL-60细胞的分化可使蛋白酶激活剂C(PKC)的活性增加。同年Park等^[22]报道，人参皂苷Rh₁和-Rh₂对人纤维肉瘤细胞的增殖有明显抑制作用，与世界公认的最有效的抗HRA药CDDP(Cis-diamminedichloroplatinum)相比，-Rh₂抑制肿瘤生长的作用与CDDP相似，但没有副作用，而CDDP却有明显的副作用。-Rh₂还有较强的增加自然杀伤癌细胞活性的能力，并能显著延长生命，这些特性在使用CDDP时并没有发现。

1995-1996年，日本学者Kitagawa等报道，人参皂苷Rg₃可以抑制由Bomesin所致大鼠肠癌腹腔内转移的作用。Azuma等报道了人参皂苷Rg₃、-Rb₂在体内、体外均对B16-BL6肿瘤细胞在肺部的转移有抑制作用。国内学者富力、鲁岐通过多年的研究，改进了从红参中提取人参皂苷20(R)-Rg₃的方法，首次实现了工业化生产，经过由中国中医研究院广安门医院牵头，大连医科大学附属第一医院、南京八一医院全军肿瘤中心等8家大单位符合GCP要求的为中心临床研究，现已获得国家一类新药证书，正式药名为参一胶囊。研究机理表明，-Rg₃在肿瘤转移中可抑制肿瘤增值生长、着床、浸润、粘附以及新生血管形成等五个关键环节。

另据研究表明，C-K无论在体内、体外均具有良好的抑制癌细胞生长作用和抗转移作用，无论对实体或流体癌细胞株均有显著效果，如：抗浸润和转移作用，利用多种体内外转移模型如路易斯肺癌细胞LLC、人纤维肉瘤HT1080、小鼠黑色素瘤B16细胞的易转移亚型B16-F10细胞等研究C-K对肿瘤细胞浸润和转移的影响，结果发现：C-K虽不直接抑制肿瘤块形成，但具有明显的抗转移作用；诱导肿瘤细胞凋亡作用，C-K在与B16-BL6和LLC两种肿瘤细胞共同孵育时，15min后即出现在肿瘤细胞的核内，24h之内诱导出现形态学上的细胞凋亡表现；抗肿瘤血管新生作用，研究表明：无毒剂量的C-K即可抑制CM-L5所致的HSE细胞的增殖和管腔形成活性，并对肿瘤诱导的心血管形成产生抑制^[28]；抗致突变和预防癌变作用，C-K有抗苯并芘诱导的致突变作用，其作用具备药理学的量效关系。此外，C-K还可降低苯并芘引起中国仓鼠肺纤维母细胞(Chinesehamster lungfibmbl～tcells CHL)的染色体畸变，说明C-K可以作为突变预防剂。

Wakabayashi报道，-Rg₁，-Re及其肠道细菌代谢物20(S)-PPT口服后具有很强的抗肿瘤细胞转移活性。

人参次生稀有皂苷-Rg₃、-Rh₂和C-K具有显著的抗肿瘤活性，但作为天然药物人参、西洋参、三七等发挥药效活性的物质基础，它们在天然植物中的含量极低。例如：-Rg₃在白参中的含量仅为0.0003％，在红参中的含量约为0.03％；而-Rh₂在红参中含量仅为0,001％、人参茎叶中的-Rh₂含量较红参高10倍、西洋参茎叶中分离得到-Rh₂含量为0.001％-0.0043％。C-K在天然人参中并不存在，为人参皂苷的微生物代谢产物，在三七中的含量仅为0.032％。因此，如何提高这些微量次生活性皂苷的含量，是目前天然药物领域中的研究热点。

而就天然植物资源来说，某种植物中除少数活性成分外，大部分都是低活性成分，但这些成分往往都是生源关系相近或者结构类似。以人参中的单体皂苷为例，如-Rb、-Re、-Rg、-Rh，它们分子结构的母核是相同的，都是相对稳定的达玛烷型四环三萜皂苷，不同的是它们在母核的特定位置上连接的支链糖(葡萄糖、鼠李糖、***糖等)不同，或支链上糖的数量不同，或羟基与糖链的连接位置不同，再者就是它们的空间立体构型不同(空间立体旋转构型)，总之，它们的结构都是十分相近的。但由于支链的不同，它们所具有的药理活性也完全不同。-Rb₁、-Rb₂、-Rc、-Rd和-Re等由于支链上连接的糖太多，使得分子量庞大，药理活性很低；而-Rg₃、-Rh₂和-Rh₁等，支链上的葡萄糖较少，但却被证实是具有不同药理活性的小分子活性物质。因此，只要能把分子量很大的低活性皂苷支链上的糖水解掉，尽量减少糖的个数，或者改变皂苷的空间构型，都能得到预期的高活性皂苷。

目前常用的水解皂苷的方法有酸水解法、碱水解法和生物转化法。研究发现皂苷的水解方式有两种，一种是皂苷一次彻底水解，生成苷元和糖，另一种是皂苷分步水解，即部分糖先被水解，或双皂苷中先水解一条糖链形成次生苷或前皂苷元。

酸水解反应的机理是：苷键原子首先质子化，然后苷键断裂生成苷元和糖的氧碳离子中间体，在水中氧碳离子经溶剂化，再脱去氢离子而形成糖分子，酸催化水解的难易是与苷原子的碱度、苷原子上的电子云密度以及它的空间环境密切相关的。有资料显示因为连接在苷元C20叔醇基上的糖易被50％的HAC部分水解得到次级苷，所以单体皂苷用HAC部分水解后，人参皂苷Ra₁、-Ra₂、-Rb₁、-Rb₂、-Rb₃、-Rc和-Rd均得相同次级苷，人参皂苷Re部分水解得-Rg₁，人参皂苷Rg₁经部分水解得-Rh₁。另外有资料显示：经过酸全水解可得到苷元和糖。

在用碱进行水解时，苷键对碱性试剂应该相对稳定，不易被碱催化水解，但是某些皂苷中因为含有烯键，遇碱也会起反应。例如近年来从人参中发现的一些新化合物大多是原人参二醇或三醇型侧链的衍化或糖部分的乙酰化或丙二酰化。

虽然这两种方法都可以使皂苷水解，但是它们的水解条件都十分剧烈，不易控制，而且由于在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、双键位移、取代基位移、构型转化等变化，使水解的副产物增多，目标产物很难得到^[2]。更重要的是这两种方法从原料到反应过程均向环境中排放了大量的有机溶剂、酸和碱等污染物，对环境造成很大程度上的危害；而且酸和碱对操作人员本身也会有腐蚀性的伤害，所以需要寻找新的转化技术和方法，即能更有效的将低活性、高含量的植物皂苷转化成高活性、天然含量低的单体皂苷，又能做到不给环境造成负担的转化技术和方法，这是提高天然药物利用率、实行清洁生产、使中药走向世界，建立绿色中药产业的必由之路。

在最近发展起来的各种新技术中，尤以生物转化技术最为引人注目。生物转化(Biotransformation或Bioconversion)是利用生物体系将加入到反应***中的外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值的不同化学产物的工艺。这里的生物转化强调的是外源底物与产物之间通过一步反应完成，其实质是一种酶的催化反应。由于植物细胞内含有催化氧化、还原、羟基化、乙酰化、酯化、葡萄糖基化、异构化、甲基化、去甲基化、环氧化等反应的酶类，因此它们具有将外源底物转化成有用化合物的能力。生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和、操作简便、成本较低、公害少，且能完成一些化学合成难以进行的反应，受到有机化学家、药物化学家和微生物学家们的极大重视。生物转化的范围很广，几乎包括各种类型的化学反应，如水解、缩合、酰基转移、氧化还原等等。因此利用生物对植物皂苷进行转化既克服了传统酸、碱水解方法的缺陷，又减少了污染物的产生，符合从末端治理向源头控制转化的新型现代生产模式，因而越来越受到重视，生物转化法已成为当前的研究热点。

由于微生物本身来源于自然，转化活性较高，而且生产成本低廉，仅为直接用工业化酶转化的1/100，甚至更低。菌株一旦分离、纯化后还可以永久使用、保藏。此法在生产过程中对操作人员完全无害，整个过程从原料到产物，对环境都不会造成污染，而且反应后剩余的菌体残液，经过重新培养，仍然可以作为反应物再次进行实验，因此这种具有革命性的创新生产工艺，完全符合21世纪的新型环保理念，是当之无愧的“绿色工艺”。

人参皂苷的生物转化方法研究现状

微生物的生物转化反应，实际上就是利用一种或几种微生物含有的一种或几种酶的专一催化功能，对用作底物的某个有机化合物的分子结构的特定位置作用，使其转化成结构相似的更有价值的新化合物。随着当代生物技术的发展，将固相醇(固定化细胞)、酶膜反应器、溶剂工程、原生质体及其融合、诱变和基因重组等新技术引入酶催化反应体系，不仅可使微生物转化的效率成倍增长，而且可使整个生产过程连续、自动化，为微生物转化应用于有机合成展现了广阔的前景。

微生物转化的应用，开始于50年代甾体药物的临床应用之后，但是在30年代就已发现微生物具有转化某些化合物的能力。近年来，由于国内外学者的重视，微生物转化技术也有了新的突破，例如：蛋白饲料的生产、以再生纤维素为底物生物转化生产木糖醇等，都已成为当今的热点。

目前，国内外学者对植物皂苷进行生物转化的研究主要集中在三个方面，一是利用菌种库储存的菌株对植物皂苷进行微生物转化；二是利用肠内菌对单体皂苷进行代谢转化；三是利用酶对植物皂苷进行转化。

长春中医学院的马吉胜等人用购自中国科院微生物菌种保藏中心的10种真菌分别对-Rb₁和人参二醇系皂苷(PDS)进行生物转化，结果表明其中6种真菌经转化后有代谢活性，并随时间的延长，相继有四种代谢产物出现，分别为-Rd、C-K、PPD和-Rg₃。北京大学的董阿玲等人曾用购买的几种单菌株对人参中的单体皂苷Rb₁、-Rb₃和Rd等进行生物转化，研究发现，经菌株转化后的人参皂苷都发生了不同程度的转化。

利用肠内菌对单体皂苷进行代谢的研究目前较为广泛。肠内菌群对具有苷键的药物进行水解是因为糖类化合物是肠道内细菌重要的碳源。近年来，我国和日本学者对肠内菌代谢研究证明，人参皂苷Rb₁和-Rg₁被人和大鼠口服后在肠道中肠内菌的作用下，可被转化成多种代谢产物，-Rb₁在肠内菌的作用下代谢模式为-Rb₁→-Rd→F₂→C-K→PPD，-Rg₁在肠内菌的作用下代谢模式为-Rg₁→-Rh₁/F₁→原人参三醇(PPT)。长春中医学院的陈昕等人在1999年就对人参皂苷Rb₁的肠内菌代谢进行了研究，结果表明-Rb₁被离体培养的人肠内菌代谢，随时间的延长，相继出现4种代谢产物，其R_f值分别与标准品-Rd、-Rg₃、-Rh₂、PPD值相同；而-Rb₁被大鼠肠内菌代谢后的代谢产物与离体培养的人肠内菌对-Rb₁的代谢产物相同，但是，大鼠肠内菌对-Rb₁代谢48小时后的代谢产物中已经检测不到-Rd和-Rg₃，只有-Rh₂和PPD。2000年王毅等人对人参皂苷Rg₁的肠内菌代谢进行研究，发现在人体内-Rg₁被肠内菌代谢为-Rh₁及PPT，-Rh₁被吸收入血，并由尿液排除体外；而-Rg₁被大鼠肠内菌群代谢为-Rh₁，F₁及PPT。

酶法转化植物皂苷是近几年才发展起来的新技术。大连轻工学院的赵立亚等人用从储存菌株中分离的粗酶液对人参总皂苷进行转化，结果显示酶法能够改变人参二醇皂苷的糖基，-Rh₂和-Rg₃皂苷的第20碳上的羟基容易失去水形成-Rh₃和-Rg₅，-Rh₁是由人参二醇类皂苷混有的少量的-Re、-Rg₁生成的，并且酶法的反应产物中主要产物为人参皂苷Rh₂，副产物为人参皂苷Rg₃、-Rg₅、-Rh₁、-Rh₃和人参二醇类皂苷元。金风燮等人进行了利用人参皂苷糖基酶制备人参皂苷Rh₂的研究，并申请了专利。刘珂利用酶法将人参总皂苷进行生物转化并得到了C-K，酶解过程如下：总皂苷→二醇组皂苷→加酶进行生物转化→C-K。另外，田晶等人发现用酶法还可以改变大豆皂苷的糖基，水解皂苷变成低糖皂苷产物及苷元。鱼红闪等人还对用酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度进行了研究。

人参皂苷抗肿瘤活性成分的研究

人参皂苷是人参、西洋参、三七等五加科人参属植物的主要活性成分，人参皂苷中的Rh₁、-Rh₂、C-K、PPD和PPT为人参、西洋参、三七等五加科人参属植物中存在的微量稀有次生皂苷。研究表明这些稀有人参皂苷均具有显著的抗肿瘤活性。

人参果是植物人参的成熟果实，色泽鲜红，内有两颗半圆形种子。在采集人参的过程中，种子与果实同时采集，种子用于繁殖后代，果浆往往作为废物丢掉，既污染了环境又占用土地。后经学者研究证实，在人参果实的果皮和果肉中含有的人参果苷，除与人参根中的有效成分-人参皂苷具有相似的作用外，还有其独特的作用。经我国药学专家检测，人参果肉中的人参皂苷含量是人参根的4倍，含人参皂苷Re为人参根的30倍，20(R)-Rg₃、20(R)-Rh₂的含量明显高于红参和人参茎叶中-Rh₂的含量。因此，对人参果的开发和利用引起了国内外学者的广泛重视。目前，已从人参果中分离鉴定出人参皂苷Rb₁、-Rb₂、-Rc、-Rd、-Re、-Rg₁、20(S)-Rg₂、20(R)-Rg₂、20(R)-Rg₃、20(S)-Rh₁、20(R)-Rh₁、20(R)-Rh₂和20(R)-原人参三醇、胡萝卜苷、β-谷甾醇等成分。

我们在前人研究的基础上对人参果化学成分进行了研究，并比较了人参果和西洋参果皂苷提取物中具有抗肿瘤活性的人参皂苷Rg₃、20(R)-人参皂苷Rg₃和人参皂苷Rh₂的含量，为进一步开发利用人参果这一廉价的药用资源提供理论依据，同时也为研发天然的抗癌新药打下基础。

发明内容：

本发明提供了一种从栽培人参的土壤中筛选出一株芽孢杆菌A8，及其酵解人参皂苷制备单糖链人参皂苷C-K及苷元PPD和PPT混合物的方法。本发明能够将人参属植物包括人参、三七、西洋参等植物的根、茎叶和果实中提取纯化的总皂苷，或经分离纯化后的单体皂苷，经微生物转化(水解)作用，获得单糖链人参皂苷C-K及苷元PPD和PPT的混合物。C-K及苷元PPD和PPT的化学结构如下：

I   人参皂苷C-K的化学结构

II  PPD的化学结构

III PPT(R₁＝R₂＝OH)的化学结构

III PPT(R₁＝R₂＝OH)的化学结构

为了简单、方便、低成本、大批量的制备单糖链人参皂苷C-K、及苷元PPD和PPT混合物，本发明首先提供了一种微生物菌株A8酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法。并且提供了一种从栽培人参的土壤中筛选菌株A8的方法。

本发明用微生物转化(水解)人参属植物制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，所用的微生物菌株为A8。

本发明A8酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，菌株培养条件粗旷，可生长于实验中常用的马丁氏培养基。

本发明A8酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，酵解温度25-45℃，pH值5.0-7.0，酵解时间2h-15d，转化(水解)液为水溶液。

本发明用微生物转化(水解)人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，人参皂苷与微生物菌株A8的比例为4-8∶1，以6∶1最为经济；一般来说，水解15d后，再延长水解时间，混合物的产量增加极少，因此，无需加长水解时间。

本发明A8酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，可以通过酵解天然人参总皂苷及各单体皂苷，得到C-K、PPD及PPT混合物。

本发明用微生物转化(水解)人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，收集过程是反应产物去除微生物后注入到大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱。将80-90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至干，得到C-K、PPD及PPT混合物，收率70-90％。

收集过程中反应产物注入到大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，洗液与母液合并，浓缩后再次用于微生物转化(水解)。

实施以上操作过程，本发明所提供的A8还可以用于酵解其他糖苷类化合物如包括人参、三七、西洋参、绞股蓝等植物的根、茎叶和果实中提取纯化的总皂苷(茎叶/果总皂苷)、苦瓜苷、胡芦巴苷、芍药苷、柴胡皂苷、黄芩苷、黄芪苷、去羟子苷等，制备相应的微生物酵解产物。

本发明所用的A8是将其转入含有人参皂苷的培养基中，经传代培养、驯化、筛选得到的能够酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的菌株。A8菌落光滑，湿润；幼小期呈圆型，长大后单个菌体在显微镜下呈长椭圆型，比普通细菌菌落大。

本发明的优点是：本发明采用环境友好型技术——生物转化技术，为利用人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物提供了一种来源方便、价格低廉的微生物菌株芽孢杆菌A8。用该菌株制备抗肿瘤活性成分单糖链人参皂苷C-K、苷元PPD及PPT的方法简单方便、安全可靠、成本低、产物回收率高；转化产物稳定单一，易于分离；同时减少了污染物的排放和对生态环境的破坏。使用本方法制备的C-K、PPD及PPT混合物的转化率为20％-60％，收率70-90％。

附图说明：

附图1 A8菌体对数与吸光度的相关曲线

附图2 A8的对数生长曲线

附图3 pH对A8生长的影响

菌种保藏日期：2006年04月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市海淀区中村北一条13号，保藏编号：1703，分类命名：芽孢杆菌属Bacillus sp.

具体实施方式：

一、微生物菌株A8的分离与纯化过程

(一)、土壤微生物富集法分离微生物

(1)微生物的富集：利用无菌器皿取栽培人参的土样1g，加入10mL无菌生理盐水，震荡片刻，制成土壤悬液，取1mL悬液分别放入盛有25mL富集培养基1的三角瓶中。生化培养箱中30℃，48h。

(2)菌株的初筛：用稀释平板涂布法将富集培养基1中生长的微生物分别接入到初筛培养基2中，每种稀释浓度接3个平行样，接种量为0.2mL。将接种后的平面皿先正置于28-30℃的培养箱中24h，后在倒置于培养箱中培养3-4天。

(二)、土壤液稀释法分离微生物

菌株的初筛：用稀释平板分离法将不同浓度的土壤稀释液分别接入到初筛培养基2中，每种稀释浓度接3个平行样，接种量为1mL。将接种后的平面皿倒置于28-30℃的培养箱培养3-4天。

(三)、菌种的分离、纯化培养

将初筛平板上的单菌落进行分离、纯化(编号)。用平板划线分离法将各个单菌落分别接种于分离培养基3中，倒置于28-30℃的培养箱培养3-4天。待菌株生长比较旺盛时，再将分离、纯化获得纯菌株接入液体分养基4中，30℃、160r/min摇床中培养2-3天。

(四)、菌种的复筛

将液体分离培养基4中生长的菌体分别转移到复筛培养基5中，30℃、160r/min摇床中培养2-3天，观察菌体的生长情况及对三七皂苷的转化作用。选择生长情况良好且具用较高转化作用的菌株作为实验菌，将其命名为A8，进一步对该纯菌株进行鉴定，初步确定A8为芽孢杆菌属的微生物。

(五)、微生物对三七叶皂苷的转化

将以上复筛后的微生物分别接种于液体接种培养基6中，接种量均为2％，接种后于30℃、160r/min摇床中培养，待菌株生长比较旺盛时，加入转化培养基8，并随时间的增加观察三七叶皂苷成分的含量变化。

一部分纯化后的微生物接种于固体接种培养基7中，4℃冰箱保存。

表1  筛选与培养A8时使用的培养基

培养基名称	培养基的成分	培养基的用途	备注
				富集培养基1	葡萄糖4.0g，三七茎叶皂苷6.0g，KH2PO4 1.0g，CMC 10.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，青霉素G钠0.1g，蒸馏水1000mL，灭菌。	微生物的富集	4℃冰箱保存
初筛培养基2	牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.6。灭菌后，倒斜面或平板。	初步筛选微生物	混匀
				分离培养基3	牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.6。灭菌后，倒斜面或平板。	分离纯化微生物	划线分离
液体分离培养基4	牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.6，灭菌。	增加分离纯化微生物的数量	4℃冰箱保存
				复筛培养基5	三七茎叶皂苷5.0g，蛋白胨3.0g，KH2·PO4 1.0g，NaCL5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，蒸馏水1000mL，pH 7.6，灭菌。	进一步筛选微生物	4℃冰箱保存
液体接种培养基6	称取16.5g马丁培养基，加入1000mL蒸馏水溶解，自然pH，灭菌。	制备种子液	现用现配
				固体(斜面或平板)接种培养基7	液体接种培养基10中加入2-3％的琼脂，灭菌后，倒斜面或平板。	菌种保存	3个月传代一次

液体转化培养基8

称量三七茎叶总皂苷50g，加入蒸馏水1000mL，超声混匀，使三七茎叶总皂苷的浓度为50mg/mL。

对底物进行转化

现用现配

二、A8最佳培养条件的确定

用RF-5000型分光光度计测的A8的最大吸收波长为384.4mn，因此选定最大吸收波长为380nm，以此波长作为A8的测定波长。首先，以吸光度(A)为横坐标，菌体对数[logN(个·mL^-1)]为纵坐标，确定菌体对数logN与吸光度A的线性回归方程，如下：

logN＝0.8187A+7.2293  r＝0.997             (1)

则：原液中的菌体数为N`(个·mL^-1)＝n10^logN  (2)

logN`＝logn+logN                           (3)

其中：N`为菌体总数；n为稀释倍数。

用721分光光度计λ＝380nm，分别在A8培养0h、1h、2h、4h、8h、24h、36h、48h、72h、96h测定吸光度值，再按以上3个方程计算菌体的对数增长值，不同时间菌体对数增长的实验结果见图2。

由图2可知：细菌A8的生长过程经历了延缓期(8h以内)、对数增长期(8h-36h)、静止期(36h-96h)等三个阶段。根据实验结果，细菌A8的最佳培养时间为48h。改变转化培养基初始pH、培养温度等单条件，再根据公式(3)计算，确定菌体的生长情况。结果表明细菌A8的最佳初始pH为6.0(结果见图3)，最佳培养温度为30℃，最佳摇床转速为160r/min。

三、最佳转化条件的确定

A8转化人参皂苷生成C-K、PPD及PPT混合物的时间选择1～15d，转化温度15、20、25、30、35、40℃，摇床转速120、140、160、180、200 r·min^-1，转化pH值4.0、5.0、自然pH值(pH＝5.5)、6.0、7.0、8.0。根据TLC检测表明，细菌A8的最佳转化时间为13d、最佳转化温度为30℃、最佳摇床转数为160r·min^-1、最佳转化pH值为自然pH值。转化率为20-60％。

实施例1

A8对三七茎叶皂苷的转化

将在最佳培养条件下培养的A8接种到含有10g三七茎叶皂苷(含量＞80％)的水溶液中，在温度30℃、摇床转数为160r·min^-1、自然pH值条件下转化(水解)。3d后开始取样。TLC的结果表明：与对照组比较，随着时间的延长，C-K、PPD及PPT斑点逐渐增大、颜色加深，而三七茎叶皂苷中Rf值较大的Rb、Rd和Rg的含量相应减少。经过13d的转化作用，将反应产物经0.2μm-0.45μm微孔滤膜去除微生物后，注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱。将80-90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至于，得到C-K、PPD及PPT混合物4.7g，转化率为47％。

实施例2

A8对人参果苷的转化

将在最佳培养条件下培养的A8接种到含有1g人参果苷(含量＞60％)的水溶液中，在温度30℃、摇床转数为160r·min^-1、自然pH值条件下转化(水解)。经过13d的转化作用，将反应产物经0.2μm微孔滤膜去除微生物后，注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱。将80-90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至干，得到C-K、PPD及PPT混合物0.24g，转化率为24％。

实施例3

A8对西洋参皂苷的转化

将在最佳培养条件下培养的A8接种到含有2g西洋参皂苷(含量＞90％)的水溶液中，在温度30℃、摇床转数为160r·min-1、自然pH值条件下转化(水解)。经过13d的转化作用，将反应产物经0.2μm微孔滤膜去除微生物后，注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱。将80-90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至干，得到C-K、PPD及PPT混合物1.16g，转化率为58％。

实施例4

转化产物的分离

硅胶按比例装柱，向其中缓缓注入展开剂(氯仿-甲醇***)，用玻璃棒顺时针搅拌至无气泡产生，注入到的层析柱中，沉降12小时。待用。

将C-K、PPD及PPT混合物1.0g与按1∶2比例与活化好的硅胶混匀湿法上柱。从加入样品开始计算流量，至洗脱液到30mL时，开始接流分。以展开剂[氯仿∶甲醇(v/v)]梯度洗脱，共接收38个流分。经薄层考察，合并相同流分。

将4-14流分所得产物，浓缩得化合物I粗品。经制备薄层分离纯化后，得一白色粉末化合物I，收率30.74％；TLC检定和标准品对照确定化合物I为PPD。

将18-23流分所得产物，浓缩得化合物II粗品。经制备薄层分离纯化后，得一无定型白色粉末化合物II，收率20.62％；TLC检定和标准品对照确定化合物II为PPT。

将26-35流分所得产物，浓缩得化合物III粗品。经制备薄层分离纯化后，得一无定型白色粉末化合物III，收率41.16％；TLC检定和标准品对照确定化合物III为C-K。

Claims (8)

1.一株芽孢杆菌，其特征在于：由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的芽苞杆菌，保藏编号为CGMCC1703，保藏日期为2006年04月26日。

2、一种如权利要求1所述的芽孢杆菌的培育方法，其特征在于：

一、土壤微生物富集法分离微生物

a、微生物的富集：利用无菌器皿取栽培人参的土样1g，加入10mL无菌生理盐水，震荡片刻，制成土壤悬液，取1mL悬液分别放入盛有25mL富集培养基1的三角瓶中。生化培养箱中30℃，48h；

b、菌株的初筛：用稀释平板涂布法将富集培养基1中生长的微生物分别接入到初筛培养基2中，每种稀释浓度接3个平行样，接种量为0.2mL。将接种后的平面皿先正置于28-30℃的培养箱中24h，后在倒置于培养箱中培养3-4天；

二、土壤液稀释法分离微生物

菌株的初筛：用稀释平板分离法将不同浓度的土壤稀释液分别接入到初筛培养基2中，每种稀释浓度接3个平行样，接种量为1mL。将接种后的平面皿倒置于28-30℃的培养箱培养3-4天；

三、菌种的分离、纯化培养

将初筛平板上的单菌落进行分离、纯化(编号)。用平板划线分离法将各个单菌落分别接种于分离培养基3中，倒置于28-30℃的培养箱培养3-4天。待菌株生长比较旺盛时，再将分离、纯化获得纯菌株接入液体分离培养基4中，30℃、160r/min摇床中培养2-3天；

四、菌种的复筛

将液体分离培养基4中生长的菌体分别转移到复筛培养基5中，30℃、160r/min摇床中培养2-3天，观察菌体的生长情况及对三七皂苷的转化作用。选择生长情况良好且具用较高的转化作用的菌株作为实验菌，将其命名为芽孢杆菌，进一步对该纯菌株进行鉴定，初步确定A8为芽孢杆菌属的微生物，芽孢杆菌落光滑，湿润；幼小期呈圆型，长大后呈长椭圆型，比普通细菌菌落大。

3、根据权利要求2所述的芽孢杆菌的培育方法，其特征在于：菌种可生长于实验中常用的马丁氏培养基。

4、用芽孢杆菌转化人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，其特征在于：用微生物转化人参属植物制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，所用的微生物菌株为芽孢杆菌A8。

5、根据权利要求4所述的用芽孢杆菌转化人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，其特征在于：A8酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，酵解温度25-45℃，pH值5.0-7.0，酵解时间2h-15d，转化液为水溶液，人参皂苷与微生物菌株A8的比例为4∶1-8∶1；收集过程是将反应产物经0.2-0.45μm微孔滤膜去除微生物后，注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，再用乙醇梯度冲洗树脂柱，将80-90％乙醇洗脱液浓缩，挥发至干，得到C-K、PPD及PPT混合物，收率70-90％。

6、根据权利要求4或5所述的用芽孢杆菌转化人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，其特征在于：A8菌种酵解人参皂苷制备C-K、PPD及PPT混合物的方法中，可以通过酵解天然人参总皂苷及各单体皂苷，得到C-K、PPD及PPT混合物。

7、根据权利要求4或5所述的用芽孢杆菌转化人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，其特征在于：所提供的A8菌种还可以用于酵解其他糖苷类化合物人参、三七、西洋参、绞股蓝植物的根、茎叶和果实中提取纯化的总皂苷、苦瓜苷、胡芦巴苷、芍药苷、柴胡皂苷、黄芩苷、黄芪苷、去羟子苷，制备相应的微生物酵解产物。

8、根据权利要求4或5所述的用芽孢杆菌转化人参皂苷制备单糖链人参皂苷及苷元的方法，其特征在于：收集过程中反应产物注入到D101大孔吸附树脂柱内，用水冲洗至无色，洗液与母液合并，浓缩后再次用于微生物转化。