CN105648021A

CN105648021A - 人参稀有皂苷c-k、f1及四种异构体人参皂苷元的制备方法

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Publication number: CN105648021A
Application number: CN201610081555.2A
Authority: CN
Inventors: 鱼红闪; 刘春莹; 金凤燮
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2036-02-05
Also published as: CN105648021B

Abstract

本发明公开一种人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参二醇皂苷元和参三醇皂苷元的制备方法。以人参为原料，提取人参二醇类皂苷（混合物）、人参三醇类皂苷（混合物）和人参自身皂苷酶复合物。人参二醇类皂苷和三醇类皂苷，分别与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，分别与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应，几乎没有其他副产物皂苷，分别得到人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1；反应后酶可回收、重复使用。所得到的C-K或F1皂苷与人参自身皂苷酶复合物分别反应（适当加入有机酸），分别得到四种异构体人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元。操作简单、收率高，成本低，适合大批量生产；所得产品可用于药物开发、人参制品、保健品和化妆品。

Description

人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法

技术领域

本发明涉及一种人参稀有皂苷和四种异构体人参皂苷元的制备方法，尤其是一种操作简单、成本低、得率及纯度高、适合大批量生产的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法。

背景技术

我国目前产量高的人参主要为人参（PanaxginsengC.A.Mayer）、西洋参（P.quinguefolusL.）和三七参（P.notoginsengburk）。人参根的主要皂苷为Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1；西洋参的主要皂苷以Rb1和Re为主，还含Rb2、Rc、Rd、Rg1皂苷；三七参的主要皂苷以Rb1和Rg1为主，还含Rd、Re、R1皂苷；其他皂苷含量较低。

人参主要原人参二醇类（PPD）皂苷结构如下：

注：Glc,β-D-吡喃葡萄糖基；Arap,α-L-吡喃***糖基；Araf,α-L-呋喃***糖基；Xyl，β-D-吡喃木糖基。

红参中存在四种异构体的人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元（文献：LarsP.Christensened.Ginsenosides:Chemistry,Biosynthesis,Analysis,andPotentialHealthEffects.AdvancesinFoodandNutritionResearch.(2009)Volume55,p.1-99.ElsevierInc.）。

红参中存在的四种异构体的人参二醇皂苷元为20(S)-人参二醇皂苷元[20(S)-PPDol]，20(R)-人参二醇皂苷元[20(R)-PPDol]，20-羟基脱的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H₂O)-20(21),24-diene]，20-羟基脱水的20(22),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H₂O)-20(22),24-diene]；

人参稀有皂苷C-K和四种异构体的人参二醇皂苷元结构如下：

人参主要原人参三醇类（PPT）皂苷结构如下：

注：Glc,β-D-吡喃葡萄糖基；Rha，α-L-吡喃鼠李糖基；Xyl，β-D-吡喃木糖基。

红参中存在的四种异构体的人参三醇皂苷元为20(S)-人参三醇皂苷元[20(S)-PPTol]，20(R)-人参三醇皂苷元[20(R)-PPTol]，20-羟基脱水人参三醇皂苷元-20(21),24-二烯[PPTol(-H₂O)-20(21),24-diene]，20-羟基脱水人参三醇皂苷元-20(22),24-二烯[PPTol(-H₂O)-20(22),24-diene]。上述人参皂苷元异构体，红参中极其微量存在。

人参稀有皂苷F1和四种异构体的人参三醇皂苷元结构如下：

四种异构体的人参二醇皂苷元和四种异构体的人参三醇皂苷元的生理活性远高于人参皂苷。

人参口服后在肠道菌的作用下人参二醇类皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd）转化为C-K，人参三醇类皂苷（Re、Rg1）转化为F1，继而被吸收、起药效；因此，人参皂苷C-K和F1是吸收率高、生理活性高的人参稀有皂苷（文献：MKanaoke,TOkao,KKobashi.JTradMed.199411,241-245）。

因此，大量制备高活性人参稀有皂苷C-K和F1、四种异构体的人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元，对人参制品、保键食品和化妆品以及药物开发意义很大。

为了得到高活性、容易吸收的的人参稀有皂苷，国际专利申请PCT/CN00/00744（中国ZL0082112.9、欧洲EP1354944、美国发明专利US7,759,101B2、日本JP-4953547；文献2）等，公开了从人参中含量高的Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1酶转化制备Rh2、Rg3、C-K、Rg2和Rh1等；所公开的人参皂苷酶来自细菌、霉菌、酵母菌、麦芽、人参植物、动物肝，按照水解皂苷糖基位置不同，分为四种人参皂苷酶：人参皂苷酶I型，能水解人参二醇皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等的3-O-（第三碳）糖基和20-O-糖基，逐步得到Rd→F2→C-K（或Rh2）等皂苷；人参皂苷酶II型，能水解人参二醇皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等20-O-糖基，逐步生成Rd和Rg3；人参皂苷酶III型，能水解人参皂苷Rd的3-O-糖基，生成C-K；人参皂苷酶IV型，能水解人参皂苷Re和Rg2的6-O-糖基，生成Rg1和Rh1。

如上所述可利用人参皂苷酶III型转化Rd单体皂苷制备C-K，但是Rd单体和人参皂苷酶III纯酶成本太高，产业化难度大；其他二醇皂苷酶反应，虽然产生C-K皂苷，但反应物有很多其他皂苷副产物，不仅C-K转化率低，而且还增加了产物中分离C-K的步骤，操作麻烦。

论文（J.Microbiol.Biotechnol.2011,21(10),1057–1063）报道，来自米曲霉的人参皂苷酶IV水解Re和R1皂苷的6-O-鼠李糖和木糖基变成Rg1，进一步水解Rg1的6-O-葡萄糖基变成F1皂苷，Rg2转化为Rh1和20(S)-人参三醇苷元。

论文（J.Microbiol.Biotechnol.2012;22,343~351；论文PLOSONE，2014，(9),1-16,e96914(PosOne:June2014/Volume9/Issue6/e96914，文献5)报道，很多新发现的微生物的酶、转基因克隆得到的人参皂苷酶，能水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1的生成相应的低糖基稀有皂苷F2、C-K、F1、20(S)-Rg2、20(S)-Rg3、20(S)-Rh1、20(S)-Rh2；但是这些酶反应产生很多副产物。

日本小桥等（文献：MKanaoke,TOkao,KKobashi.JTradMed.199411,241-245）报道，人参口服后在肠道菌的作用下人参二醇类皂苷Rb1等逐渐转化为Rd，F2，C-K、20(S)-二醇皂苷元；人参三醇类皂苷Re等逐渐转化为Rg1、F1、20(S)-三醇皂苷元被吸收，但其转化微弱。

因此，现有技术所公开的酶转化法水解人参二醇类皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd制备C-K皂苷或酶转化法水解人参三醇类皂苷Re、R1、Rg1制备F1皂苷，均存在着副产物多，稀有皂苷C-K或F1转化率低等缺点，且需要从众多副产物中分离提纯，操作麻烦、难度大；而且上述酶反应只能微量地生成20(S)-人参二醇皂苷元和20(S)-人参三醇皂苷元，无法生产四种异构体的皂苷元。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低、得率及纯度高、适合大批量生产的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：

a.以人参为原料，提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物；

具体可如下：

将人参、西洋参或三七参切碎，用8～10倍（重量/体积）甲醇或者70～80%乙醇在常温或者30～50℃提取6～24小时，重复提取3次，合并提取液，减压浓缩至波美度20～24（回收有机溶剂），得到浓缩液；将浓缩液用30～50%体积的石油醚脱脂2～3次，脱脂后人参提取液加3～5倍体积的水稀释，大孔树脂柱（柱体积为人参重量的2倍体积）中反复吸附皂苷，用5～8倍体积的去离子水洗脱除糖等杂质；然后用乙醇-水梯度洗脱树脂柱：乙醇浓度梯度为30%～84%，洗脱剂总体积为柱体积的7～10倍。用TLC方法检测皂苷，分别收集原人参三醇类皂苷洗脱液部分和原人参二醇类皂苷洗脱液部分；再分别减压浓缩（回收乙醇）、干燥，分别得到原人参三醇类（PPT）皂苷和原人参二醇类（PPD）皂苷。

从人参提取的原人参二醇类皂苷经HPLC方法检测，主要含Rb1、Rb2、Rc、Rd，少量含Rb3，原人参三醇类皂苷主要含Re和Rg1；从西洋参提取的原人参二醇类皂苷主要含Rb1、Rb2、Rc、Rd，原人参三醇类皂苷主要含Re和Rg1；从三七参提取的原人参二醇类皂苷主要含Rb1、Rd，原人参三醇类皂苷主要含Rg1、Re、R1。

b.分别以人参二醇类皂苷混合物或人参三醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，再将底物溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应；

c.分别提取反应液中皂苷，得到人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1。

所述底物溶液中缓冲液的pH为4.5～6.0，浓度为0.01～0.05M，有机溶剂的质量浓度为5～40%，人参二醇类皂苷混合物或人参三醇类皂苷混合物的质量浓度为0.5～8%；所述缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，所述有机溶剂为丙醇、丙酮、乙醇或甲醇。

所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液态发酵或者固态发酵，酶发酵培养基的产酶诱导物是人参粉、人参总皂苷或槐花粉；对发酵酶液或者固态发酵酶提取液离心除渣，收集酶蛋白沉淀，将酶蛋白沉淀溶解于缓冲液中即可。

具体可按如下方法：液态培养基的产酶诱导物加量为培养基质量的0.005～0.1%；固态培养基的产酶诱导物加量为培养基质量的1～25%；发酵培养温度27～35℃，培养发酵时间3～9天。对发酵酶液或者固态发酵酶提取液离心除渣，上清用硫酸铵、甲醇或者乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀，其酶蛋白沉淀溶解于0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5的醋酸、柠檬酸或者磷酸缓冲液；溶解酶蛋白沉淀的缓冲液用量：液态发酵发酵液的1/5～1/20体积；固态发酵发酵时，0.5～2倍固体原料的重量体积，即为可用的粗酶液。

所述底物溶液与粗酶液反应是将底物溶液与粗酶液混合，在35～60℃反应16～48小时；所述底物溶液与粗酶液的体积比为1：0.1~1。

所述c步骤提取反应液中皂苷如下：加入反应液2～4倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，得上清液，经脱色大孔树脂柱脱色、减压浓缩及回收有机溶剂得浓缩液，再将所得浓缩液经大孔树脂柱反复吸附皂苷，用5～8倍柱体积的去离子水洗脱杂质，再用4～6倍柱体积的质量浓度为80～96%的有机溶剂洗脱皂苷，浓缩、结晶及干燥洗脱液，得到人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1。所沉淀的酶蛋白，溶解于70～80%原酶液体积的缓冲液中，得到回收酶液，可重复使用；即，酶不用固定化，重复使用。

可以将所得到的人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自身皂苷酶复合物反应，在60～85℃反应1.5～10小时，分别提取反应液中皂苷，得到由20(S)-人参二醇皂苷元、20(R)-人参二醇皂苷元、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元和20(22),24-二烯人参二醇皂苷元的四种异构体组成的人参二醇皂苷元；或者得到20(S)-人参三醇皂苷元、20(R)-人参三醇皂苷元、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元和20(22),24-二烯人参三醇皂苷元的四种异构体组成的人参三醇皂苷元。

所述人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自身皂苷酶复合物的质量比是1：0.1～10，所述反应体系中加有反应体积0.1～50%的甲酸、乙酸或柠檬酸，人身稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1反应质量浓度0.1～10%。

所述人参自身皂苷酶复合物按如下方法制备：在所述a步骤提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物后的人参渣中，加入人参渣干重的5～6倍水，在55～75℃搅拌2～3小时，离心收集上清，在65℃以下高真空浓缩至波美度20～25，即为人参自身皂苷酶复合物。

本发明是以曲霉菌微生物发酵得到的粗酶与人参二醇类皂苷（Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd皂苷的混合物）或人参三醇类皂苷（Re、Rg1、R1皂苷的混合物）反应，反应中加入有机溶剂并控制反应温度，可高效制备人参稀有皂苷C-K和F1；所制备的人参稀有皂苷C-K或F1与人参自身皂苷酶复合物反应，可分别制备四种异构体的人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元。本发明产物得率及纯度高（均90%以上），几乎没有副产物皂苷，无需进一步分离，操作简单、成本低，适合大批量生产；所得产品可用于药物开发、人参制品、保健品和化妆品。

附图说明

图1是本发明实施例3制备的人参二醇皂苷元异构体HPLC图。

图2是本发明实施例4制备的人参三醇皂苷元异构体HPLC图。

图3是本发明实施例5所分离得到的人参二醇皂苷元HPLC图。

图4是本发明实施例6所分离得到的人参三醇皂苷元HPLC图。

具体实施方式

实施例1：

a.以人参为原料，提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物：

人参（带须根）1公斤，切片（2～4毫米厚），加入8升甲醇浸泡，在35～40℃，搅拌提取6～12小时，分离提取液，重复三次；过滤、合并提取液，减压浓缩（回收甲醇）至比重波美度20，加入500毫升石油醚、搅拌脱脂1小时，分离油脂层，重复2次。将脱脂后的人参提取液加3～5倍体积的水稀释，经1.5升体积的大孔树脂（AB-8树脂或者HP-20树脂）柱中反复吸附皂苷，用7.5～10升的去离子水洗脱柱，除糖等杂质；其吸附皂苷的大孔树脂柱，用乙醇-水梯度洗脱：乙醇浓度梯度为30%～84%，洗脱剂总体积11升，每300毫升分部收集：用TLC方法检测皂苷，其洗脱液前部分中含有原人参三醇类皂苷，洗脱液后部分中含有原人参二醇类皂苷；其原人参三醇类皂苷部分、原人参二醇类皂苷部分，分别合并、分别减压浓缩（回收乙醇）、干燥，得到20.3克人参三醇类（PPT）皂苷，31.7克人参二醇类（PPD）皂苷。

同样的方法，甲醇或者70～80%的乙醇浸泡西洋参或者三七参，可分离提取原人参二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷。

从人参或者西洋参根部中可提取4～8%的原人参二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷；从三七参根中可提取8～11%原人参二醇类皂苷和原人参三醇类皂苷。

b.以人参二醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，再将底物溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应：

所述粗酶液按照如下常规方法制备：

将黑曲霉菌Aspergillusnigerg.848菌（从大曲中分离得到的；文献，刘春莹等JGinsengResearch2015,39,221-229。大连工业大学菌种保藏所，保藏号：Aspergillusnigerg.848菌）接种于含0.03%的人参总皂苷的5%麦芽汁培养基中，28～33℃培养、通风搅拌发酵4～6天，离心除渣；在上清液中加入75%饱和度的硫酸铵粉，在4℃过夜，沉淀酶蛋白，收集酶蛋白沉淀；用0.01摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液透析，再加入0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液至十分之一的发酵液体积，即成粗酶液。

上述所制备的人参原二醇类皂苷30克中加入90毫升甲醇和210毫升0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，搅拌溶解，再加入300毫升上述制备的粗酶液，在45℃搅拌反应30小时。用TLC法检测，反应液中没有其他皂苷，90%以上为C-K皂苷。

c.提取反应液中皂苷，得到人参稀有皂苷C-K：

在反应液中加入2000毫升的甲醇混合，静止过夜使酶蛋白沉淀，离心分离酶蛋白沉淀，加入210毫升缓冲液，即成回收酶，重复使用，酶回收率可达70～90%以上。

酶蛋白沉淀分离得到的上清液，经预先处理好的700毫升体积的D-280大孔脱色树脂柱脱色，再用1500毫升质量浓度80%的甲醇液洗脱树脂柱内的皂苷，其脱色液减压浓缩（回收甲醇）后用300毫升水稀释，再经700毫升体积的大孔树脂柱（AB-8或HP-20树脂）反复吸附皂苷，用4200毫升的去离子水洗脱柱中的糖类等杂质，然后用3500毫升的质量浓度85～90%甲醇洗脱皂苷，减压浓缩，结晶、干燥，得16克反应产物人参稀有皂苷C-K，HPLC检测，其纯度90%以上。

上述反应中：从人参或者西洋参或者三七参根提取的人参二醇类皂苷（PPD）利用含有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）的缓冲液（醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液），配制成人参二醇类皂苷的底物溶液；底物溶液的缓冲液pH为4.5～6.0，浓度为0.01～0.05M，有机溶剂质量浓度为5～40%；人参二醇类皂苷底物质量浓度为0.5～8%；将底物溶液与粗酶液按照体积比1：0.1~1混合，在35～60℃反应16～40小时；所得产物几乎都是C-K皂苷，加入反应液2～4倍体积的有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）沉淀酶蛋白、离心收集酶蛋白，溶解在原酶液质量浓度70～80%的pH5的醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中，即为粗酶液可重复使用。

离心分离酶蛋白的上清，经脱色大孔树脂柱（柱体积，PPD皂苷原料重量的20倍体积）脱色、减压浓缩、回收有机溶剂，其浓缩液经大孔树脂柱（柱体积，PPD皂苷原料重的20倍体积）反复吸附皂苷，用5～8倍柱体积的去离子水洗脱糖等杂质；再用4～6倍柱体积的质量浓度80～96%的有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）洗脱皂苷，浓缩、结晶、干燥、同样得到纯度90%以上的人参稀有皂苷C-K。

实施例2：

a.以人参为原料，提取人参三醇类皂苷混合物同实施例1；

b.以人参三醇类皂苷混合物为原料，与有机溶剂及缓冲液配制成底物溶液，再将底物溶液与曲霉菌微生物发酵得到的粗酶液反应：

所述粗酶液按照如下常规方法制备：

米曲霉菌Aspergillusoryzaesp.39g（从大曲中分离得到；文献，***、鱼红闪等ProcessBiochemistry2012,47,133-138。大连工业大学菌种保藏所，保藏号：Aspergillusoryzaesp.39g）接种于装有灭菌过的水分50%的1公斤麦麸的曲匣中（含50克人参粉），在28～32℃、培养4～7天（每天搅拌4～6次），然后用5升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液浸出酶；酶液离心，其上清液用硫酸铵固体沉淀酶蛋白；离心收集沉淀，溶解于500毫升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液；即为粗酶液。

取实施例1所制备的20克从三七参中提取的原人参三醇类皂苷（主要含Rg1、Re、R1皂苷）中加入30毫升乙醇和270毫升0.02摩尔、pH5.0的柠檬酸缓冲液，搅拌溶解，加入上述制备的粗酶液300毫升，在45℃搅拌反应48小时，用TLC法检测，反应液中主要为F1皂苷；

c.提取反应液中皂苷，得到人参稀有皂苷F1：

在反应液中加入1800毫升的乙醇混合，静止过夜使酶蛋白沉淀，离心分离酶蛋白沉淀，加入210毫升缓冲液，即成回收酶，如上所述可重复使用。

分离酶沉淀得到的酶反应上清液，经预先处理好的700毫升体积的D-280脱色大孔树脂脱色，再用1500毫升质量浓度75%的乙醇液洗脱柱内的皂苷、其脱色液减压浓缩（回收乙醇），用300毫升水稀释、经大孔树脂柱（AB-8或HP-20树脂）反复吸附皂苷，用4200毫升的去离子水洗脱柱中的糖类等杂质，然后用3500毫升的质量浓度85%乙醇洗脱皂苷，减压浓缩，结晶、干燥，得11克反应产物F1，HPLC检测，其纯度90%以上。

上述反应中，从人参或者西洋参根或者三七参根提取的人参三醇类皂苷，利用含有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）的缓冲液（醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液），配制成人参三醇类皂苷（PPT）的底物溶液；底物溶液中缓冲液pH为4.5～6.0，浓度为0.01～0.5M，有机溶剂含量为质量浓度5～40%，人参三醇类皂苷（PPT）底物含量为质量浓度0.5～8%。其底物溶液粗酶液按照体积比1：0.1~10混合，在35～60℃反应16～48小时，产物几乎都是F1皂苷。加入反应液2～4倍体积的有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇），同样沉淀酶蛋白、离心收集酶蛋白，溶解在原酶液质量浓度70～80%的pH5的缓冲液（醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液）中，酶可重复使用。

分离酶蛋白的离心上清，经脱色大孔树脂柱（柱体积，PPT皂苷原料重量的20倍体积）脱色、减压浓缩、回收有机溶剂，其浓缩液经大孔树脂柱（柱体积，PPT皂苷原料重的20倍体积）反复吸附皂苷，用5～8倍柱体积的去离子水洗脱糖等杂质；再用4～6倍柱体积的质量浓度80～94%的有机溶剂（丙醇、丙酮、乙醇或甲醇）洗脱皂苷，浓缩、结晶、干燥、同样得到纯度90%以上的F1稀有皂苷。

实施例3：

人参自身皂苷酶复合物制备：取1公斤实施例1所述人参提取皂苷后的渣中加入6升的去离子水，在55～65℃搅拌2～3小时，离心收集上清，高真空浓缩（品温65℃以下）至波美度25（大约500毫升左右），即为人参自身皂苷酶复合物。

将所得到的人参自身皂苷酶复合物与实施例1所得到C-K反应，在反应体系中加入反应体积0.1～50%的甲酸、乙酸或柠檬酸降低pH反应，可制备四种异构体的人参二醇皂苷元。

具体如下：取20克实施例1的产物C-K皂苷、50克的人参自身皂苷酶复合物、去离子水350毫升、柠檬酸25克混合，在70～75℃反应2小时。用TLC法检测，反应彻底后，加入400毫升水饱和正丁醇萃取皂苷反应物，重复三次，合并正丁醇层，用600毫升的去离子水洗涤正丁醇3～4次，减压浓缩（回收正丁醇）、干燥，得到12～14克人参二醇皂苷元。经HPLC检测，其苷元是四种异构体组成，具体如图1及表1所示：

表1四种异构体人参二醇皂苷元的HPLC数据

从图1中可以看到，所制备的人参二醇皂苷元是由四种异构体组成，经核磁共振法测定结构，四种异构体为20(S)-人参二醇皂苷元[20(S)-PPDol]、20(R)-人参二醇皂苷元[20(R)-PPDol]、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H2O-20(21),24-diene]和20(22),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H2O-20(22),24-diene]；各皂苷元在总皂苷元中的含量比32.4：16.7：23.3：27.6，产物中总皂苷元的质量含量为90%以上。

上述结果，人参皂苷C-K水溶液和人参自身酶复合物酶（人参根干品原料计算）的比例（重量）是1：0.1～10倍；甲酸、乙酸或柠檬酸的加量为反应体积的0.1～50%；反应液中人参皂苷C-K质量浓度为0.1~10%，在60～85℃反应1.5～10小时内，得到同样的结果；产品经HPLC检测，四种异构体人参二醇皂苷元含量为总苷元至质量的90%以上，其中20(S)-人参二醇皂苷元和20(R)-人参二醇皂苷元在总皂苷元的含量比例为质量20~80%之间。

实施例4：

人参自身皂苷酶复合物制备同实施例3。

将所得到的人参自身皂苷酶复合物与实施例2所得到F1反应，在反应体系中加入反应体积0.1～50%的甲酸、乙酸或柠檬酸降低pH反应，可制备四种异构体的人参三醇苷元。

具体方法可如下：

10克的F1皂苷、50克的人参自身皂苷酶复合物、去离子水120毫升、醋酸（乙酸）30毫升混合，在70～75℃反应2小时；用TLC法检测，反应彻底后，加入200毫升水饱和正丁醇萃取皂苷反应物，重复三次，合并正丁醇层，用300毫升的去离子水洗涤正丁醇3～4次，减压浓缩（回收正丁醇）、干燥，得到6克人参三醇皂苷元。经HPLC检测，其苷元是四种异构体组成：如图2及表2所示：

表2四种异构体人参三醇皂苷元的HPLC数据

从图2及表2中可以看到，所制备的人参三醇皂苷元是由四种异构体组成，经核磁共振法测定结构，四种异构体为20(S)-人参三醇皂苷元[20(S)-PPTol]、20(R)-人参三醇皂苷元[20(R)-PPTol]、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元[PPTol(-H2O-20(21),24-diene]和20(22),24-二烯人参三醇皂苷元[PPTol(-H2O-20(22),24-diene]；各皂苷元在总皂苷元中的含量比26.5：22.4：14.4：36.7；产物中总皂苷元的质量含量为90%以上。

上述结果，人参皂苷F1水溶液和人参自身酶复合物（人参根干品原料计算）的比例（重量）是1：0.1～10倍；甲酸、乙酸或柠檬酸的加量为反应体积的0.1～50%；反应液中人参皂苷F1质量浓度为0.1~10%，在60～85℃反应1.5～10小时内，得到同样的结果；既产物中四种异构体的人参三醇苷元质量含量为90%以上，其中20(S)-人参三醇皂苷元和20(R)-人参三醇皂苷元在总皂苷元的含量比例是20~80%之间。

实施例5：

实施例3所制备的四种异构体人参二醇皂苷元的各皂苷元单体分离：采用常用的市销的高效液相制备色谱仪（任何产品均可用）、用C18制备色谱柱、乙腈-水梯度洗脱分离。

取10克实施例3所得人参二醇皂苷元，用C18制备色谱柱、乙腈-水梯度洗脱分离，依次分别得到2.5克的20(S)-人参二醇皂苷元，1.2克的20(R)-人参二醇皂苷元，1.6克的20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元，1.8克的20-羟基脱水的20(22),24-二烯人参二醇皂苷元；经HPLC检测，其四种皂苷元纯度均为90%以上。

如图3所示：1，20(S)-人参二醇皂苷元；2，20(R)-人参二醇皂苷元；3，20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元；4、20-羟基脱水的20(22),24-二烯人参二醇皂苷元。

实施例6：

实施例4所制备的四种异构体人参三醇皂苷元的各皂苷元单体分离：采用常用的市销的高效液相制备色谱仪（任何产品均可用）、用C18制备色谱柱、乙腈-水梯度洗脱分离。

取10克的实施例4制备的人参三醇皂苷元，用C18制备色谱柱、乙腈-水梯度洗脱分离，依次分别得到1.4克的20(S)-人参三醇皂苷元，1.2克的20(R)-人参三醇皂苷元，0.9克的20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元，2.2克的20(22),24-二烯人参三醇皂苷元；经HPLC检测，各皂苷元的纯度为90%以上。

如图4所示：

1，20(S)-人参三醇皂苷元；2，20(R)-人参三醇皂苷元；3，20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元；4、20-羟基脱水的20(22),24-二烯人参三醇皂苷元。

为了确认实施例所制备的产物分别是人参皂苷C-K和人参二醇皂苷元的四种异构体，人参皂苷F1和人参三醇皂苷元的四种异构体，用瑞士BrukeAVANCE600超导核磁共振波谱仪，探头为5mmBBO，溶剂为Pyridine-D₅(氘代吡啶)，测定了上述所制备的C-K和人参二醇皂苷元四种异构体单体，人参皂苷F1和人参三醇皂苷元的四种异构体单体结构：其¹³C-NMR数据，如表3所示：

表3.人参皂苷C-K和人参二醇皂苷元四种异构体，人参皂苷F1和人参三醇皂苷元四种异构体13C-NMR数据（ppm）

表3的人参皂苷C-K和人参二醇皂苷元四种异构体，人参皂苷F1和人参三醇皂苷元四种异构体的测定数据与参考文献：

1）InTanaka,O.andKasai,R.：Saponinsofginsengandrelatedplants,Progressinthechemistryoforganicnaturalproducts.1984,Volume46,1-76,theIV.ModernTechniquesUsedinStructureDetermination,p22-36.(2.¹³C-NMRSpectroscopyofDammaraneTypeTriterpenes,p23-26;3.GlycosylationShiftsin¹³C-NMRSpectra,p26-35)

2）李亚平（主编）.人参皂苷NMR标准图谱.化学工业出版社，北京，2012。

经比较，与参考文献一致。证明所制备的产物为人参皂苷C-K和人参二醇皂苷元四种异构体：

20(S)-人参二醇皂苷元[20(S)-PPDol]，

20(R)-人参二醇皂苷元[20(R)-PPDol]，

20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H₂O-20(21),24-diene],

20(22),24-二烯人参二醇皂苷元[PPDol(-H₂O-20(22),24-diene]；

其结构与背景技术所述一致。

同时证明所制备产物为人参皂苷F1和人参三醇皂苷元四种异构体为：

20(S)-人参三醇皂苷元[20(S)-PPTol];

20(R)-人参三醇皂苷元[20(R)-PPTol];

20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元[PPTol(-H₂O-20(21),24-diene]，

20-羟基脱水的20(22),24-二烯人参三醇皂苷元[PPTol(-H₂O-20(22),24-diene]；

其结构与背景技术所述一致。

本发明实施例中采用的人参皂苷测定方法：

1）薄层层析（TLC）测定人参皂苷：

人参PPD皂苷和PPT皂苷测定：层析板，硅胶板SilicaGel60F254（德国Merck产品）；展开剂，正丁醇：乙酸乙酯：水=4：1：2。人参稀有皂苷在TLC板上展开后，吹干、喷10%硫酸、110℃显色；

酶反应生成C-K、F1的测定：层析板，硅胶板SilicaGel60F254（德国Merck产品）；展开剂，氯仿：甲醇：水=7.5：2.5：0.5。人参稀有皂苷在TLC板上展开后，吹干、喷10%硫酸、110℃显色；

C-K、F1转化得到人参二醇苷元和人参三醇苷元的测定：层析板，硅胶板SilicaGel60F254（德国Merck产品）；展开剂，氯仿：甲醇：水=7.5：2.5：0.5。人参稀有皂苷在TLC板上展开后，吹干、喷10%硫酸、110℃显色。

2）高效液相色谱（HPLC）法测定人参皂苷：

人参皂苷、C-K和F1的测定：色谱仪，美国Waters2695高效液相色谱分析仪，Waters2996光电二极管阵列（PDA）检测器及Empower色谱工作站；色谱柱：KnauerC18柱（5μm，φ3mm×250mm）；流动相：乙腈（A）-水（B）：0-20min,20%A等度；20-31min，20%A-32%A线性梯度，31-40min,32%A-43%A线性梯度；40-70min，43%A-100%A线性梯度；进样量：10μL；柱温：35℃；体积比流速：0.6mL/min；检测波长：203nm。

四种异构体人参二醇皂苷元和人参三醇皂苷元的测定：色谱条件：色谱仪，Waters2695高效液相色谱分析仪，Waters2996光电二极管阵列（PDA）检测器及Empower色谱工作站；色谱柱：UnitaryC18柱（5μm，φ4.6mm×250mm）；流动相：乙腈（A）-水（B）：0-5min,20%A-40%A等度；5-10min，40%A-60%A线性梯度，10-70min，60%A-100%A线性梯度；进样量：10μL；柱温：35℃；体积比流速：0.6mL/min；检测波长：203nm。

3）核磁共振法（NMR）测定酶反应得到的人参稀有皂苷C-K和F1、各皂苷元的结构：

仪器是瑞士BrukeAVANCE600超导核磁共振波普仪；探头，5mmBBO；溶剂，Pyridine-D5(氘代吡啶)。用核磁共振法测定：酶转化得到的单体人参稀有皂苷的一维¹HNMR、¹³CNMR、DEPT图谱；二维氢谱COSY、二维碳氢相关谱HSQC和HMBC；一维¹HNMR谱的观测频率为600MHz，¹³CNMR谱的观测频率为150MHz条件下。将分别测定得到的、人参稀有皂苷C-K和F1、各皂苷元的¹HNMR、¹³CNMR、DEPT45、DEPT90、DEPT135、COSY、HSQC、HMBC核磁共振图谱，与参考文献1和2的数据比对，确认酶转化得到的人参稀有皂苷C-K和F1、各皂苷元的结构。

Claims

1.一种人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特

征在于按照如下步骤进行：

a.以人参为原料，分离提取人参二醇类皂苷混合物、人参三醇类皂苷混合物；

2.根据权利要求1所述人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述底物溶液中缓冲液的pH为4.5～6.0，浓度为0.01～0.05M，有机溶剂的质量浓度为5～40%，人参二醇类皂苷混合物或人参三醇类皂苷混合物的质量浓度为0.5～8%；所述缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，所述有机溶剂为丙醇、丙酮、乙醇或甲醇。

3.根据权利要求2所述人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述粗酶液是采用黑曲霉菌或者米曲霉菌液态发酵或者固态发酵，酶发酵培养基的产酶诱导物是人参粉、人参总皂苷或槐花粉；对发酵酶液或者固态发酵酶提取液离心除渣，收集酶蛋白沉淀，将酶蛋白沉淀溶解于缓冲液中即可。

4.根据权利要求3所述人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述底物溶液与粗酶液反应是将底物溶液与粗酶液混合，在35～60℃反应16～48小时；所述底物溶液与粗酶液的体积比为1：0.1~1。

5.根据权利要求1、2、3或4所述人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述c步骤提取反应液中皂苷如下：加入反应液2～4倍体积的有机溶剂沉淀酶蛋白，得上清液，经脱色大孔树脂柱脱色、减压浓缩及回收有机溶剂得浓缩液，再将所得浓缩液经大孔树脂柱反复吸附皂苷，用5～8倍柱体积的去离子水洗脱杂质，再用4～6倍柱体积的质量浓度为80～96%的有机溶剂洗脱皂苷，浓缩、结晶及干燥，得到人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1。

6.根据权利要求1的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于将所得到的人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自身皂苷酶复合物反应，在60～85℃反应1.5～10小时，分别提取反应液中皂苷元，得到由20(S)-人参二醇皂苷元、20(R)-人参二醇皂苷元、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参二醇皂苷元和20(22),24-二烯人参二醇皂苷元的四种异构体组成的人参二醇皂苷元；或者得到20(S)-人参三醇皂苷元、20(R)-人参三醇皂苷元、其20-羟基脱水的20(21),24-二烯人参三醇皂苷元和20(22),24-二烯人参三醇皂苷元的四种异构体组成的人参三醇皂苷元。

7.根据权利要求6所述的人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述人参稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1与从人参根中提取的人参自身皂苷酶复合物的质量比是1：0.1～10，所述反应体系中加有反应体积0.1～50%的甲酸、乙酸或柠檬酸，人身稀有皂苷C-K或人参稀有皂苷F1反应质量浓度0.1～10%。

8.根据权利要求7所述人参稀有皂苷C-K、F1及四种异构体人参皂苷元的制备方法，其特征在于所述人参自身皂苷酶复合物按如下方法制备：在所述a步骤提取人参二醇类皂苷混合物和人参三醇类皂苷混合物后的人参渣中，加入人参渣干重的5～6倍水，在55～75℃搅拌2～3小时，离心收集上清，在65℃以下高真空浓缩至波美度20～25，即为人参自身皂苷酶复合物。