CN104894204A - 微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其是以曲霉菌微生物发酵得到的酶液与廉价的人参皂苷Rb3、Rc、Rb2、Rd等含量高的人参或者西洋茎叶原二醇类皂苷/或者三七参茎叶皂苷反应，制备高活性的人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K混合物和其单体的方法，成本低、工艺简单、无污染；产品可用于人参制品、功能食品、化妆品。
Description
技术领域
本发明涉及一种人参稀有皂苷的制备方法，尤其是一种利用曲霉菌微生物发酵得到的粗酶，酶转化人参皂苷Rb3、Rc、Rb2、Rd等含量高的人参茎叶皂苷，制备高活性人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K等的方法。
背景技术
人参历史悠久，具有良好的补身、治疗功能。目前产量高的人参主要为人参（Panax ginseng C.A.Mayer）、西洋参（P. quinguefolus L.）和三七参（P. notoginseng (burk)）。人参的主要活性成分是人参皂苷（Ginsenoside, ginseng saponin），主要为三萜类的四环三萜达玛烷型和五环三萜齐墩果酸皂苷，其中四环三萜达玛烷型皂苷为主。四环三萜达玛烷型皂苷分为原人参二醇类皂苷（Protopanaxadiol type ginsenoside, PPD）和原人参三醇类皂苷（Protopanaxatriol type ginsenoside，PPT），五环三萜齐墩果酸皂苷为人参皂苷Ro。
原人参二醇类皂苷结构如下：
人参、西洋参和三七参根部的原人参二醇类皂苷，主要以Rb1为主，含有Rb2、Rc、Rb3、Rd皂苷；人参、西洋参和三七参茎叶的原人参二醇类皂苷，主要以Rc、Rb2、Rb3和Rd为主，Rb1皂苷含量较低。人参皂苷具体分类如下：
| 人参皂苷 | R1 | R2 （S, R型异构体） |
| Rb1 | Glc-(1→2)-Glc- | Glc-(1→6)-Glc- (S) |
| Rb2 | Glc-(1→2)-Glc- | Ara(p)-(1→6)Glc- (S) |
| Rb3 | Glc-(1→2)-Glc- | Xyl-(1→6)-Glc- (S) |
| Rc | Glc-(1→2)-Glc- | Ara(f)-(1→6)-Glc- (S) |
| Rd | Glc-(1→2)-Glc- | Glc- (S) |
| Gyp17 | Glc- | Glc-(1→6)-Glc- (S) |
| C-O | Glc- | Ara(p)-(1→6)Glc- (S) |
| C-Mx1 | Glc- | Xyl-(1→6)-Glc- (S) |
| C-Mc1 | Glc- | Ara(f)-(1→6)-Glc- (S) |
| F2 | Glc- | Glc- (S) |
| Gyp75 | H- | Glc-(1→6)-Glc- (S) |
| C-Y | H- | Ara(p)-(1→6)Glc- (S) |
| C-Mx | H- | Xyl-(1→6)-Glc- (S) |
| C-Mc | H- | Ara(f)-(1→6)-Glc- (S) |
| Rg3 | Glc-(1→2)-Glc- | H- (R, S) |
| Rh2 | Glc- | H- (R, S) |
| C-K | H- | Glc- (S) |
注：Glc, β-D-吡喃葡萄糖基；Arap, α-L-吡喃***糖基；Araf, α-L-呋喃***糖基；Xyl，β-D-吡喃木糖基。
糖基数量多的人参皂苷，如带四个糖基的Rb1、Rb2、Rb3、Rc，带三个糖基的Rd、Gyp17、C-O、C-Mx1、C-Mc1等，难吸收、活性低，即口服人参皂苷后，糖基数量多的皂苷必需在肠道微生物酶的作用下转化为低糖基的皂苷，才能被吸收、起药效；糖基数量少的C-K、Rh2、Rg3、C-Mx、C-Mc、C-Y等人参皂苷，容易吸收、活性高。但是人参植物中，低糖基的皂苷含量很低。
因此，人们均致力于从含量高、糖基数量多的皂苷制备高活性的、低糖基人参皂苷。如PCT/CN00/00744专利，利用人参皂苷酶I，酶转化人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等，得到Rd→F2→C-K（或Rh2）等；人参皂苷酶II，将人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc等转化为Rg3等；人参皂苷酶III，将人参皂苷Rd转化为C-K；人参皂苷酶IV、将人参皂苷Re和Rg2等转化为Rg1和Rh1。还有转基因克隆得到的人参皂苷酶（ J. Microbiol. Biotechnol. 2012; 22, 343~351）水解人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd的3-O-糖基的酶动力学报道。但是迄今为止还没有提出制备C-Mx、C-Mc、C-Y等人参稀有皂苷的方法。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种利用曲霉菌微生物发酵得到的粗酶，酶转化人参皂苷Rb3、Rc、Rb2、Rd等含量高的人参茎叶皂苷，制备高活性人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K等的方法。
本发明的技术解决方案是：一种微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于是以曲霉菌微生物发酵得到的酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应，制备人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K。
所述曲霉菌是黑曲霉（Aspergillus niger）或米曲霉（Aspergillus oryzae）菌。
所述曲霉菌微生物发酵得到的酶是以曲霉菌微生物液态发酵制备，液态发酵培养基中酶的诱导物是人参茎叶皂苷、西洋参茎叶皂苷、三七参茎叶皂苷、人参茎叶粉、西洋参茎叶粉、三七参茎叶粉或槐花粉，加量为液态培养基质量0.01～0.1%；发酵温度27～35℃，培养发酵时间3～9天；收集发酵液，离心除渣，取上清液用硫酸铵、甲醇或乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀；将所收集蛋白沉淀溶解于1/5～1/20发酵液体积的0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5的醋酸、柠檬酸或磷酸缓冲液，即为酶液。
所述曲霉菌微生物发酵得到的酶是以曲霉菌微生物固态发酵制备，固态发酵培养基中酶的诱导物是人参茎叶粉、西洋参茎叶粉、三七参茎叶粉或槐花粉，加量为固态培养基质量1～25%；发酵温度27～35℃，培养发酵时间3～9天；以0.5~2倍固体原料体积的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液浸出发酵液并收集发酵液，离心除渣，取上清液用硫酸铵、甲醇或乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀；将所收集蛋白沉淀溶解于1/5～1/20发酵液体积的0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5的醋酸、柠檬酸或磷酸缓冲液，即为酶液。
所述酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应是先用0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5醋酸缓冲液或0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5柠檬酸或者磷酸缓冲液溶解人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷，然后再与酶液进行反应，反应的底物浓度为0.5～7%，反应温度为35～60℃，反应时间为14～68小时；用大孔树脂吸附皂苷法分离酶和反应产物皂苷，再用水、乙醇分别洗脱吸附皂苷的大孔树脂，收集乙醇洗脱液、脱色、减压浓缩、干燥得到反应产物，即混合皂苷。
用硅胶柱或者树脂柱层析法，将所得到的混合皂苷进行单体分离，分离得到酶反应产物C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K人参稀有皂苷单体。
本发明是以曲霉菌微生物发酵得到酶与廉价的人参皂苷Rb3、Rc、Rb2、Rd等含量高的人参或者西洋茎叶原二醇类皂苷/或者三七参茎叶皂苷反应，制备高活性的人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K混合物和其单体的方法，成本低、工艺简单、无污染；产品可用于人参制品、功能食品、化妆品。
具体实施方式
实施例1：
从三七茎叶皂苷（主要含Rb3、C-Mx1和Rc、Rb2皂苷；还含有少量的Rb1、Rd皂苷）酶转化制备人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K。
1）酶的制备：黑曲霉（Aspergillus niger）菌酶发酵制备是常用的方法进行的。将黑曲霉菌（Aspergillus niger g.48菌，从大曲中分离得到，文献：刘春莹等 Process Biochemistry 2014. 49, 813-820，大连工业大学已经保藏并公开对外提供）接种于5%麦芽汁、含有0.03%的三七茎叶皂苷的培养基中，28～32℃培养、通风搅拌发酵4～5天，离心除渣；其上清中加入75%饱和度的硫酸铵粉，在4℃过夜，沉淀酶蛋白，收集酶蛋白沉淀；用0.01摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液透析，再加入0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液至10分之一的发酵液体积，即成粗酶液。
液态培养基中酶的诱导物、三七茎叶皂苷的添加量0.01～0.1%范围内，有较好的酶活力。
2）三七茎叶皂苷的酶转化：50克的市销的三七茎叶皂苷（主要含Rb3、C-Mx1、Rc、Rb2皂苷，还含有少量的Rb1、Rd皂苷）溶解于500毫升0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，与1000毫升的粗酶液混合，在45℃搅拌反应36小时，用TLC法检测反应产物，确认反应程度，停止搅拌反应，得到酶反应液，。
得到的酶反应液，经预先处理好的700毫升体积的AB-8大孔树脂（HP-20大孔树脂）柱吸附皂苷；用500毫升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液洗大孔树脂，收集酶液，再加入硫酸铵或者甲醇或者乙醇沉淀酶蛋白，离心收集沉淀，再向沉淀中加入0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液至70%体积的原酶液，即为回收酶液，可重复使用。
其吸附皂苷的大孔树脂柱，用6倍体积的去离子水洗脱糖类等杂质，然后用5~6倍柱体积的80-85%乙醇洗脱皂苷，脱色，减压浓缩，干燥，得32克反应产物，用TLC方法检测，反应产物为主要含稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K的混合皂苷。
3）采用常规的硅胶柱法从酶反应产物—稀有皂苷混合物，分离C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K单体皂苷。将上述32克反应产物皂苷溶解于氯仿-甲醇中，与70克的80-100目硅胶粉混合，干燥，装入到预先装有550克的硅胶粉（300-400目）柱的上层；用不同比例的氯仿和甲醇（氯仿和甲醇比，开始9：1，中间8.5：1.5）洗脱皂苷；每瓶收集250毫升，用薄层层析（TLC）法测定皂苷，洗下来的皂苷顺序是C-K、C-Mc、C-Y、C-Mx皂苷；分别合并单体皂苷馏分、减压浓缩干燥得到11克C-Mx、2.8克的C-Mc、1.2克的C-Y、5.2克的C-K；经HPLC检测，其稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K均为单峰，其单体皂苷含量90%以上。
如果上述酶反应延长时间，其C-Mx、C-Y和C-Mc产量减少，相应的C-K产量增高。酶反应在35～60℃、pH 4.5～6.5范围内，搅拌反应14～68小时范围内，均生成C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K人参稀有皂苷。
由此可见，酶反应中，三七茎叶皂苷中的Rb3和C-Mx1基本转化为稀有皂苷C-Mx；Rb2转化为C-Y；Rc转化为C-Mc；底物中的Rb1和Rd皂苷、少量的C-Mc、C-Y和C-Mx等转化为C-K。
反应产物混合皂苷、C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K单体人参稀有皂苷，可用于人参制品、功能食品和化妆品、药物开发。
实施例2：
市销的人参茎叶二醇类皂苷（主要含Rc、Rb2、Rd皂苷，含少量的Rb1皂苷）酶转化制备稀有皂苷C-Mc、C-Y、C-K。
1）酶的制备：将米曲霉菌（Aspergillus oryzae sp.39g，从大曲中分离得到，文献：***、鱼红闪等 Process Biochemistry 2012, 47, 133-138，大连工业大学已经保藏并公开对外提供）接种于装有灭菌过的水分50%的1公斤麦麸的曲匣中（含50克人参茎叶粉），在28～32℃、培养4～7天（每天搅拌4～6次），然后用5升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液浸出酶；酶液离心，其上清液用硫酸铵固体沉淀酶蛋白；离心收集沉淀，溶解于1000毫升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液；即为粗酶液。
2）酶反应及产物分离
60克的市销的人参茎叶二醇类皂苷（主要含Rc、Rb2、Rd皂苷，含少量的Rb1皂苷）溶解于1000毫升0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，与1000毫升的上述酶液混合，在45℃反应24小时；
其酶反应液，按实施例一的方法，分离酶与反应产物；其酶液回收使用，回收量为70%以上。按实施例1的方法，分离得到35.3克的反应物混合皂苷，经硅胶柱分离得到3.6克C-Y、7.8克的C-Mc、11.2克的C-K单体，经HPLC检测，基本单峰，其单体皂苷含量90%以上。
如果上述酶反应时间延长，C-Y和C-Mc产量减少，相应的C-K产量增高。
实施例3：
市销的西洋参茎叶二醇类皂苷（主要含Rc、Rb3、Rd皂苷）酶转化制备稀有皂苷C-Mc、C-Mx、C-K。
1）酶的制备：黑曲霉菌（Aspergillus niger g.48菌，从大曲中分离得到，文献：刘春莹等 Process Biochemistry 2014. 49, 813-820，大连工业大学已经保藏并公开对外提供），接种于装有灭菌过的水分50%的1公斤麦麸的曲匣中（含100槐花粉），在28～32℃、培养6～8天（每天搅拌4～6次）；然后用5升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液浸出酶，收集酶液，酶液离心得上清；将上清液减压浓缩至5分之一体积，用甲醇沉淀酶蛋白；离心收集沉淀，溶解于800毫升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，即为可用的粗酶液。
2）酶反应：30克的市销的西洋参茎叶二醇类皂苷（主要含Rb3、Rc、Rd）溶解于500毫升0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，与500毫升的酶液混合，在45℃反应32小时；经预先处理好的500毫升体积的AB-8大孔树脂吸附皂苷；用500毫升的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液洗大孔树脂，收集酶液、甲醇沉淀酶、溶解于350毫升0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液，重复使用，酶回收率70%以上。
吸附反应皂苷的大孔树脂用6倍体积的去离子水洗脱糖类等杂质，然后用5～7倍体积的80～85%乙醇洗脱皂苷，脱色，减压浓缩，干燥得16.1克的反应物混合皂苷。
其反应产物皂苷，按照实施例1的硅胶柱方法，分离得到2.8克的C-Mx、2.7克的C-Mc、7.9克的C-K，经HPLC检测，其C-K，C-Mc、C-Mx皂苷单峰，单体皂苷含量均90%以上。
上述实施例中的菌种：
1）黑曲霉菌（Aspergillus niger g.48菌）文献：CY Liu, YH Jin, HS Yu, CK Sun, P Gao, YK Xiao, TY Zhang, LQ Xu, WT Im, FX Jin：Biotransformation pathway and kinetics of the hydrolysis of the 3-O- and 20-O-multi-glucosides of PPD-type ginsenosides by ginsenosidase type I. Process Biochemistry. 2014. 49, 813-820.
2）米曲霉菌（Aspergillus oryzae sp.39g）文献：DM wang, Yu HS, Song JG, Xu YF, FX Jin: Enzyme kinetics of ginsenosidase type IV hydrolyzing 6-O-multi-glycosides of protopanaxatriol type ginsenosides. Process Biochemistry. 2012, 47, 133-138
如果上述酶反应时间延长，C-Mx和C-Mc产量减少，C-K产量增高。
实施例1、2、3所用的测定方法如下：
1）薄层层析（TLC）测定人参皂苷：
层析板，硅胶板Silica Gel 60 F254（德国Merck产品）；展开剂，氯仿：甲醇：水 = 7.5：2.5：0.5。人参稀有皂苷在TLC板上展开后，吹干、喷10%硫酸、110℃显色；
2）高效液相色谱（HPLC）法测定人参皂苷：
色谱仪，美国Waters2695高效液相色谱分析仪，Waters2996光电二极管阵列（PDA）检测器及Empower色谱工作站；色谱柱：Knauer C18柱（5μm，φ3mm×250mm）；流动相：乙腈（A）-水（B）：0-20min,20%A等度；20-31min，20%A-32%A线性梯度，31-40min,32%A-43%A线性梯度；40-70min，43%A-100%A线性梯度；进样量：10μL；柱温：35℃；体积比流速：0.6mL/min；检测波长：203nm。
3）核磁共振法（NMR）测定酶反应得到的人参稀有皂苷的结构：
仪器是瑞士Bruke AVANCE 600 超导核磁共振波普仪；探头，5mm BBO；溶剂，Pyridine-D5 (氘代吡啶)。用核磁共振法测定：酶转化得到的单体人参稀有皂苷的一维1H NMR、13C NMR、DEPT图谱；二维氢谱 COSY、二维碳谱HSQC和HMBC；一维1H NMR谱的观测频率为600 MHz，13C NMR谱的观测频率为150 MHz条件下。将分别测定得到的、四种人参稀有皂苷的1H NMR、13C NMR、DEPT 45、DEPT90、DEPT 135、COSY、HSQC、HMBC核磁共振图谱，与参考文献1和2的数据比对，确认酶转化得到的人参稀有皂苷的结构。
将上述实施例1、2、3酶转化得到的人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K合并，对四种人参皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K分别进行了一维1H NMR、13C NMR、DEPT 45、DEPT90、DEPT 135，二维的氢谱COSY、碳谱HSQC和HMBC等核磁共振检测，其图谱数据和参考文献中人参皂苷核磁数据比对。
其C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K四种人参皂苷的13C NMR碳谱数据及其结构归属，如下表所示。
表：酶转化得到的人参皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K的13C NMR数据及其结构归属（化学位移单位：ppm）
| 碳号 | C-Mx | C-Mc | C-Y | C-K | 碳号 | C-Mx | C-Mc | C-Y | C-K |
| C-1 | 39.55 | 39.60 | 39.75 | 39.72 | 20-O-Glc | ||||
| C-2 | 28.41 | 28.41 | 28.40 | 28.41 | C-1' | 98.22 | 98.25 | 98.25 | 98.40 |
| C-3 | 79.50 | 79.40 | 79.45 | 79.43 | C-2' | 75.00 | 75.19 | 75.03 | 75.27 |
| C-4 | 39.70 | 39.75 | 39.61 | 39.58 | C-3' | 78.20 | 78.29 | 78.29 | 78.40 |
| C-5 | 56.51 | 56.57 | 56.58 | 56.53 | C-4' | 71.23 | 72.28 | 71.25 | 71.80 |
| C-6 | 18.91 | 18.97 | 18.97 | 18.93 | C-5 | 78.10 | 76.69 | 77.04 | 78.22 |
| C-7 | 35.32 | 35.37 | 35.38 | 35.34 | C-6' | 70.20 | 68.67 | 69.36 | 63.04 |
| C-8 | 40.22 | 40..26 | 40.27 | 40.24 | 20-Ara(p) | ||||
| C-9 | 50.47 | 50.49 | 50.52 | 50.47 | C-1'' | — | — | 105.95 | — |
| C-10 | 37.90 | 37.55 | 37.55 | 37.52 | C-2'' | — | — | 71.68 | — |
| C-11 | 31.05 | 31.00 | 31.04 | 31.10 | C-3'' | — | — | 74.28 | — |
| C-12 | 70.27 | 70.46 | 70.37 | 70.35 | C-4'' | — | — | 68.76 | — |
| C-13 | 49.67 | 49.62 | 49.67 | 49.65 | C-5'' | — | — | 67.13 | — |
| C-14 | 51.55 | 51.62 | 51.61 | 51.59 | 20-Ara(f) | ||||
| C-15 | 30.89 | 60.94 | 30.97 | 30.95 | C-1'' | — | 110.28 | — | — |
| C-16 | 26.79 | 26.84 | 26.85 | 26.81 | C-2'' | — | 83.47 | — | — |
| C-17 | 51.75 | 51.86 | 51.84 | 51.79 | C-3'' | — | 79.01 | — | — |
| C-18 | 16.49 | 16.55 | 16.54 | 16.53 | C-4'' | — | 86.19 | — | — |
| C-19 | 16.47 | 16.55 | 16.54 | 16.50 | C-5'' | — | 62.84 | — | — |
| C-20 | 83.98 | 83.61 | 83.67 | 83.46 | 20-Xyl | ||||
| C-21 | 25.75 | 26.02 | 26.03 | 25.94 | C-1'' | 106.0 | — | — | — |
| C-22 | 36.34 | 36.36 | 36.38 | 36.32 | C-2'' | 74.97 | — | — | — |
| C-23 | 23.28 | 23.35 | 23.34 | 23.37 | C-3'' | 77.06 | — | — | — |
| C-24 | 126.2 | 126.22 | 126.21 | 126.12 | C-4'' | 71.77 | — | — | — |
| C-25 | 131.1 | 131.23 | 131.31 | 131.07 | C-5'' | 67.11 | — | — | — |
| C-26 | 22.41 | 22.53 | 22.45 | 22.52 | |||||
| C-27 | 18.08 | 18.10 | 18.16 | 17.94 | |||||
| C-28 | 28.83 | 28.91 | 28.90 | 28.86 | |||||
| C-29 | 16.21 | 16.25 | 16.27 | 16.19 | |||||
| C-30 | 17.58 | 17.60 | 17.64 | 17.56 |
上述核磁数据与如下参考文献比对：
1）In Tanaka, O. and Kasai, R.：Saponins of ginseng and related plants,Progress in the chemistry of organic natural products. 1984, Volume 46, 1-76.
2）He KJ, Liu Y, Yang Y, Li P, Yang L. A Dammarane Glycoside Derived from Ginsenoside Rb3. Chem Pharm Bull 2005;53:177-179.
参考文献的人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K核磁数据，与本发明酶转化制备的C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K核磁数据相符，其C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K皂苷结构如下所示：
。
Claims (6)
1.一种微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于是以曲霉菌微生物发酵得到的酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应，制备人参稀有皂苷C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K。
2. 根据权利要求1所述的微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于所述曲霉菌是黑曲霉（Aspergillus niger）或米曲霉（Aspergillus oryzae）菌。
3. 根据权利要求2所述的微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于所述曲霉菌微生物发酵得到的酶是以曲霉菌微生物液态发酵制备，液态发酵培养基中酶的诱导物是人参茎叶皂苷、西洋参茎叶皂苷、三七参茎叶皂苷、人参茎叶粉、西洋参茎叶粉、三七参茎叶粉或槐花粉，加量为液态培养基质量0.01～0.1%；发酵温度27～35℃，培养发酵时间3～9天；收集发酵液，离心除渣，取上清液用硫酸铵、甲醇或乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀；将所收集蛋白沉淀溶解于1/5～1/20发酵液体积的0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5的醋酸、柠檬酸或磷酸缓冲液，即为酶液。
4. 根据权利要求2所述的微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于所述曲霉菌微生物发酵得到的酶是以曲霉菌微生物固态发酵制备，固态发酵培养基中酶的诱导物是人参茎叶粉、西洋参茎叶粉、三七参茎叶粉或槐花粉，加量为固态培养基质量1～25%；发酵温度27～35℃，培养发酵时间3～9天；以0.5~2倍固体原料体积的0.02摩尔、pH5.0的醋酸缓冲液浸出发酵液并收集发酵液，离心除渣，取上清液用硫酸铵、甲醇或乙醇沉淀酶蛋白，收集沉淀；将所收集蛋白沉淀溶解于1/5～1/20发酵液体积的0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5的醋酸、柠檬酸或磷酸缓冲液，即为酶液。
5. 根据权利要求3或4的微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于：所述酶液与人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷反应是先用0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5醋酸缓冲液或0.005～0.1摩尔、pH为4.5～6.5柠檬酸或者磷酸缓冲液溶解人参茎叶原二醇类皂苷或西洋参茎叶原二醇类皂苷或三七参茎叶皂苷，然后再与酶液进行反应，反应的底物浓度为0.5～7%，反应温度为35～60℃，反应时间为14～68小时；用大孔树脂吸附皂苷法分离酶和反应产物皂苷，再用水、乙醇分别洗脱吸附皂苷的大孔树脂，收集乙醇洗脱液、脱色、减压浓缩、干燥得到反应产物，即混合皂苷。
6. 根据权利要求5所述的微生物酶转化人参茎叶皂苷制备人参稀有皂苷的方法，其特征在于：用硅胶柱或者树脂柱层析法，将所得到的混合皂苷进行单体分离，分离得到酶反应产物C-Mx、C-Mc、C-Y、C-K人参稀有皂苷单体。
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