背景技术
雷公藤(Triptreygium wilfordii Hook.f.)为卫矛科(Celastraceae)雷公藤属(Triptreygium Hook.f.)植物,药用部位为根及茎。雷公藤对风湿性关节炎、红斑狼疮、肾炎、支气管炎、重症肝炎、白血病、器官移植等疾病的疗效显著,是一种优良的免疫抑制剂和抗炎剂,但它又是著名的有毒植物,它的主要有效成分为二萜,含量最高的为雷公藤甲素(又名雷公藤内酯醇,triptolide),雷公藤甲素的有效计量与中毒计量极为相近,其LD50为1.19+0.204mg/kg(口服),属于剧毒范围。因此,临床用药极不安全,如何减小雷公藤的毒性又保持一定的疗效(简称解毒持效),保持安全用药是当前极待解决的问题。
中国菌物学会庄毅教授在上世纪80年代起研究以药用真菌“槐耳”为发酵菌种,以农副产品为营养基质上进行固体发酵,其药用菌质称“槐耳菌质”,并根据真菌使药材发酵会引起其组织成分变化,导致性味功能改变的原理,在发酵基质中掺用一定量经特选的中药材作为药性基质,在一定条件下发酵后,获得称为“槐芪菌质”的药性菌质,其有关各项免疫指标均明显优于药用菌质,从而提出了药用真菌新型双向固体发酵工程的理论与方法(参见:抗癌新药槐耳冲剂的研究.中国药学杂志.1998,33(5),P273~275)。
不同种真菌分别去发酵同一种药材,所产生的菌质的成分的性、效不同,而用同一种真菌分别发酵不同中药材的后果也会不同。因此,不同真菌与不同药材可交叉组合形成大量“发酵组合”,可得到大量不同性质、效用的“药性菌质”。
药用真菌新型双向性固体发酵工程的理论基础、发酵组合的设计、菌质的药理筛选等内容可参见文献(庄毅,药用真菌新型(双向型)固体发酵工程.中国食用菌.2002,21(4):3~6)。
药用真菌新型(双向性)固体发酵工程(简称双向发酵)的关键是将发酵菌种和发酵基质所构成发酵组合内的基质部分,由以往仅用富含碳、氮等营养的农副产品(甘蔗渣、麦麸等)作为单向性的营养基质(其产品称药用菌质),改变为采用具有一定活性成分的中药材作为药性基质,它既能提供真菌生长所需营养又会受真菌的酶的作用而被改变组织成分,从而产生新的性味功能,故具有双向性,其产品称药性菌质,如兼用营养、药性两种基质则称为全性基质,产品也称药性菌质。药性菌质,有可能比该真菌或药性基质本身或两者简单相加有更良好的药效,主要表现在增效、扩大应用、解毒等方面(参见:药用真菌新型固体发酵工程与槐芪菌质的研制.中国药学杂志,2004,39(03),P175~178)。
药用真菌新型(双向性)固体发酵工程为中药研究开发开辟了一个新的领域,即菌物药(参见:庄毅.中药的一个新领域.中药新药与临床药理.1992,3(2)49~51)。目前尚无文献报导将药用真菌新型(双向性)固体发酵工程技术用于雷公藤处理,以实现雷公藤的解毒持效,从而提高雷公藤的应用范围和开发前景。
发明内容
本发明的目的是提供药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用。
本发明的技术方案是将药用真菌双向性固体发酵工程技术运用到雷公藤解毒持效中,即通过选用一定的药用真菌作为发酵菌种接种于雷公藤药材(药性基质)上,构成一组合理有效的发酵组合,在一定条件下进行双向性固体发酵,将所获药性菌质即为解毒持效的雷公藤药性菌质。其理论基础是根据中药材如被空气中有害杂菌如青霉、毛霉、曲霉等真菌侵染后在一定条件下会发酵、霉变,这是基于这些真菌所进行生理活动,在酶的作用下会使药材的组织成分发生变化,从而导致其性味功能的改变。
本发明所称双向性固体发酵是指真菌(发酵菌种)在含有特定中药材的固体药性基质上生长发酵时一方面会接受中药材中特定成分对真菌本身产生影响,另一方面也会对特定中药材的组织成分产生影响,其作用表现为双向。即药性基质在提供真菌所需碳、氮等营养物质促进菌体生长的同时,真菌的如酶也可分解药材的组织成分,从而产生新的成分并具有新的性味功效,因此称为“双向发酵”。
本发明所称的药性菌质是指药用真菌(发酵菌种)在含中药材的药性基质中生长发酵而获得的菌质。
本发明所称的药性基质是指中药材作为发酵基质。
本发明所称的菌质是指真菌经固体发酵后的产物,包含菌体及次生代谢物质,这些次生代谢物质有的存在于菌体细胞内,有的分泌到细胞外存在于发酵后的基质内,所生长的大量真菌丝体与发酵后的基质间无法分离,故统称为菌质。
本发明所称的基质是指能提供真菌生长所必需成分的物质。其中只含有农副产品的基质称为营养基质,只含有中药材的基质称为药性基质,同时具有营养基质和药性基质时称为全性基质。
本发明的目的是通过下列措施来实现的:
药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用。
所述的药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用,该应用的具体方法是:发酵基质雷公藤的处理;发酵菌种处理;将发酵菌种接种于发酵基质,在一定的发酵条件下进行双向固体发酵;收集药性菌质。
所述的药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用,其中发酵基质处理方法是对发酵基质进行粉碎,加适量水,灭菌。
所述的药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用,其中发酵菌种是灵芝、槐耳、云芝、红栓、硫磺菌或树舌。
所述的药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用,其中发酵菌种的处理是将发酵菌种进行活化并进行扩增培养;扩增培养的方法是采用液体培养液摇瓶培养或采用固体培养基培养。
所述的药用真菌双向性固体发酵工程技术在雷公藤解毒持效中的应用,其中发酵条件为温度范围为26-28℃,发酵基质含水量为按基质干重加120-150%的水量,发酵天数为30-60天。
灵芝菌[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.]、云芝菌[Coriolus versicolor(L.exFr.)Quel.]、槐耳菌[Trametes robiniophila Murr.]、红栓[Pycnoporus cinnabarirus(jacq)karst]、硫磺菌[Laetiporus sulphureus(Fr.)Murrill]、树舌[Ganoderma applanatumm(Pers)Pat]。
本发明也可以对其他有毒中药材进行解毒。
本发明的有益效果:
本发明可实现对雷公藤的解毒持效,从而提高雷公藤的应用范围和开发前景。
本发明药效学实验结果:
实验药物:
雷公藤原药材清膏和药性菌质清膏,由中国药科大学提供,其中雷公藤原药材清膏编号为CK1、CK2(CK1为雷公藤生药未灭菌,CK2为雷公藤基质已灭菌(0天),作为对照组),雷公藤药性菌质清膏编号为G1、G2、G3、G4、T1、T2、T3(编号中英文代表菌种,T代表槐耳菌,G代表灵芝菌,数字代表发酵天数(1为30天,2为40天,3为50天,4为60天),发酵条件与实施例1、2中所用的发酵条件相对应,除了发酵天数不同外无其他差别),分别配成20%的蒸馏水混悬液。
环磷酰胺,上海华联制药有限公司产品。
醋酸***片,天津药业有限公司产品。
2,4,6-三硝基氯苯(PC),上海华联制药有限公司产品。
都氏液(氰化高铁血红蛋白试剂),南京建成生物工程研究所提供。
绵羊红细胞(SRBC),豚鼠血清,江宁卫生防疫站提供。
实验动物:ICR小鼠,雌雄各半,体重18-22g;豚鼠,雌雄兼用,体重300-350g,由中国药科大学实验动物中心提供。
一、免疫作用
1、雷公藤药性菌质对小鼠体液免疫抑制作用(对血清溶血素的影响)
小鼠随机分组,每组10只,雌雄各半,阳性对照组给予环磷酰胺10mg/kg,其他给药组分别给予雷公藤,剂量为其LD50/10,空白对照组给予同容积水,ig,每日一次,连续6天,第1天各组给药30min后均ip绵羊红细胞免疫。
免疫6天后,小鼠摘眼球取血,放置30min使血清充分渗出。以2000rpm离心10min,取血清25ul,再加975ul生理盐水。
在上述血清制品0.5ml中加入4×108绵羊红细胞0.25ml,冰浴中冷却试管,向试管中加入补体(豚鼠血清制品)0.5ml。将试管移至37℃恒温水浴中,保温15min,随即置入冰浴中5min以终止反应。以3000rpm离心10min,取其上清液。在上清液0.5ml中加入都氏液1.875ml,振摇,放置10min,于540nm比色。结果见表2。
表2 雷公藤药性菌质对血清溶血素的影响(mean±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
OD(540nm) |
空白对照组 |
- |
10 |
0.197±0.016 |
环磷酰胺组 |
0.01 |
10 |
0.182±0.010* |
CK1 |
0.21 |
10 |
0.172±0.020** |
CK2 |
0.5 |
10 |
0.189±0.021 |
G1 |
0.5 |
10 |
0.181±0.011* |
G2 |
0.5 |
10 |
0.188±0.012 |
G3 |
0.5 |
10 |
0.182±0.015* |
G4 |
0.5 |
10 |
0.199±0.013 |
T1 |
0.5 |
10 |
0.208±0.031 |
T2 |
0.5 |
10 |
0.205±0.021 |
T3 |
0.5 |
10 |
0.223±0.032* |
与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
结果表明,环磷酰胺、CK1、G1、G3能显著性抑制小鼠体液免疫功能,T3则显著性增强小鼠体液免疫功能。
2、雷公藤药性菌质对小鼠细胞免疫抑制作用(对2,4,6-三硝基氯苯(PC)诱导小鼠迟发性***反应的影响)
小鼠随机分组,每组10只,雌雄各半。各鼠腹部去毛,范围3×3cm2左右,用微量进样器取1%PC无水乙醇溶液100ul,均匀涂在去毛区致敏,30min后,阳性对照组给予醋酸***7.5mg/kg,其他各给药组给雷公藤,剂量为LD50/10,空白对照组给予同容积水,ig,每日一次,连续6天。
致敏第7天,将1%PC橄榄油溶液30ul均匀涂抹于每鼠右耳(两面)进行攻击,抗原攻击24h后,将小鼠脱臼处死,沿耳廓基线剪下左右耳壳,用打孔器于同一部位分别取下直径8mm的耳片,以左右耳片重量之差/左耳重作为肿胀度。结果见表3。
表3 雷公藤药性菌质对小鼠细胞免疫功能的影响(mean±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
肿胀度 |
空白对照组 |
- |
10 |
0.321±0.168 |
醋酸***组 |
0.0075 |
10 |
0.138±0.055* |
CK1 |
0.21 |
10 |
0.243±0.121 |
CK2 |
0.5 |
10 |
0.169±0.083* |
G1 |
0.5 |
10 |
0.236±0.105 |
G2 |
0.5 |
10 |
0.113±0.077** |
G3 |
0.5 |
10 |
0.247±0.116 |
G4 |
0.5 |
10 |
0.145±0.190** |
T1 |
0.5 |
10 |
0.152±0.099* |
T2 |
0.5 |
10 |
0.227±0.116 |
T3 |
0.5 |
10 |
0.154±0.072* |
与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
结果表明,醋酸***、CK2、G2、G4、T1、T3能显著性抑制小鼠细胞免疫功能。
二、毒性实验
1、急毒实验LD50
预试验:小鼠随机分组,每组10只,雌雄各半,以受试物5g/kg为给药剂量,每鼠灌胃0.5ml/20g的相同体积。每日观察一次,记录死亡数,连续7天。若动物无一死亡,且未出现任何因受试物引起的反应,则初步确定该受试药物的LD50值大于5g/kg;若出现死亡或有药物反应,则进行以下正式试验。
正式试验:取小鼠随机分组,每组10只,雌雄各半,以该受试药预试验结果选择适当的剂间比,各组小鼠灌胃0.5ml/20g体重的不同浓度的药物,每日观察一次,记录死亡数,连续7天,最后计算出该受试药的LD50值。结果见表4。
表4 雷公藤各提取物清膏急性毒性试验结果
发酵编号 |
雷公藤甲素含量(1/百万) |
LD50(g/kg) |
CK1 |
13.17 |
2.061 |
CK2 |
9.64 |
>5 |
G1 |
7.97 |
>5 |
G2 |
3.24 |
>5 |
G3 |
3.51 |
>5 |
G4 |
2.88 |
>5 |
T1 |
2.25 |
>5 |
T2 |
1.07 |
>5 |
T3 |
0.96 |
>5 |
结论:雷公藤药性菌质与雷公藤原药材相比,毒性降低,但具有较强的体液免疫和细胞免疫抑制作用。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
发酵基质雷公藤(药性基质)的处理:雷公藤带皮的根晒干或60-80℃烘干劈成段,用切片机切成厚度1-2mm药材片,粉碎机粉碎成小米至绿豆大颗粒,按每瓶180g装于固体发酵瓶,加入适量水分(按基质干重加130%的水量),盖瓶塞,121℃灭菌2小时。
发酵菌种准备:取灵芝菌接种PDA培养基28℃进行活化培养,过夜。制作菌种培养液,成分为:葡萄糖30g,KH2PO4 2.25g,酵母粉7.5g,MgSO4 1.125g,CaCO3 3.75g,维生素B1 0.15g,水1500ml。成分充分溶解后分别装入500ml三角瓶中,每瓶250ml,121℃灭菌30分钟。取活化后的菌丝体无菌操作接种培养液,130转/分摇床,28℃摇培约一周,使之产生大量菌球,得菌球液(即摇培后所获得的液体菌种)。
固体发酵:无菌操作,每个固体发酵瓶内接种菌球液8-10ml,27±1℃发酵室内进行发酵,据设定的不同发酵周期(分别设定30天、40天、50天、60天,获得的药性菌质经提取制备的清膏对应为G1、G2、G3、G4)进行发酵,形成药性菌质。
菌质后处理:将瓶内药性基质雷公藤定期发酵后形成的湿药性菌质称重,用60℃电热烘干,保存备用。
成分提取:将所获得的药性菌质分别用40%乙醇提取,制备成清膏(即G1、G2、G3、G4)进行毒性、药效试验(详见本发明有益效果部分)。
实施例2
发酵基质雷公藤(药性基质)的处理:雷公藤带皮的根晒干或60-80℃烘干劈成段,用切片机切成厚度1-2mm药材片,粉碎机粉碎成小米至绿豆大颗粒,按每瓶180g装于固体发酵瓶,加入适量水分(按基质干重加130%的水量),盖瓶塞,121℃灭菌2小时。
发酵菌种准备:取槐耳菌接种PDA培养基28℃进行活化培养,过夜。制作菌种培养液,成分为:葡萄糖30g,KH2PO4 2.25g,酵母粉7.5g,MgSO4 1.125g,CaCO3 3.75g,维生素B1 0.15g,水1500ml。成分充分溶解后分别装入500ml三角瓶中,每瓶250ml,121℃灭菌30分钟。取活化后的菌丝体无菌操作接种培养液,130转/分摇床,28℃摇培约一周,使之产生大量菌球,得菌球液(即摇培后所获得的液体菌种)。
固体发酵:无菌操作,每个固体发酵瓶内接种菌球液8-10ml,27±1℃发酵室内进行发酵,据设定的不同发酵周期(分别设定30天、40天、50天,获得的药性菌质经提取制备的清膏对应为T1、T2、T3)进行发酵,形成药性菌质。
菌质后处理:将瓶内药性基质雷公藤定期发酵后形成的湿药性菌质称重,用60℃电热烘干,保存备用。
成分提取:将所获得的药性菌质分别用40%乙醇提取,制备成清膏(即T1、T2、T3)进行毒性、药效试验(详见本发明有益效果部分)。
实施例3
发酵基质雷公藤(药性基质)的处理:雷公藤带皮的根晒干或60-80℃烘干劈成段,用切片机切成厚度1-2mm药材片,粉碎机粉碎成小米至绿豆大颗粒,按每瓶180g装于固体发酵瓶,加入适量水分(按基质干重加120%的水量),盖瓶塞,121℃灭菌2小时。
发酵菌种准备:取云芝菌接种PDA培养基28℃进行活化培养,过夜。制作菌种培养液,成分为:葡萄糖30g,KH2PO4 2.25g,酵母粉7.5g,MgSO4 1.125g,CaCO3 3.75g,维生素B1 0.15g,水1500ml。成分充分溶解后分别装入500ml三角瓶中,每瓶250ml,121℃灭菌30分钟。取活化后的菌丝体无菌操作接种培养液,130转/分摇床,28℃摇培约一周,使之产生大量菌球,得菌球液(即摇培后所获得的液体菌种)。
固体发酵:无菌操作,每个固体发酵瓶内接种菌球液8-10ml,27±1℃发酵室内进行发酵,据设定的不同发酵周期(30-60d)进行发酵,形成药性菌质。
菌质后处理:将瓶内药性基质雷公藤定期发酵后形成的湿药性菌质称重,用60℃电热烘干,保存备用。
成分提取:将获得的药性菌质分别用稀醇(40%乙醇)提取,制备成清膏进行化学、毒性、药效试验。
实施例4
发酵基质雷公藤(药性基质)的处理:雷公藤带皮的根晒干或60-80℃烘干劈成段,用切片机切成厚度1-2mm药材片,粉碎机粉碎成小米至绿豆大颗粒,按每瓶180g装于固体发酵瓶,加入适量水分(按基质干重加150%的水量),盖瓶塞,121℃灭菌2小时。
发酵菌种准备:取树舌菌接种PDA培养基28℃进行活化培养,过夜。制作菌种培养液,成分为:葡萄糖30g,KH2PO4 2.25g,酵母粉7.5g,MgSO4 1.125g,CaCO3 3.75g,维生素B1 0.15g,水1500ml。成分充分溶解后分别装入500ml三角瓶中,每瓶250ml,121℃灭菌30分钟。取活化后的菌丝体无菌操作接种培养液,130转/分摇床,28℃摇培约一周,使之产生大量菌球,得菌球液(即摇培后所获得的液体菌种)。
固体发酵:无菌操作,每个固体发酵瓶内接种菌球液8-10ml,27±1℃发酵室内进行发酵,据设定的不同发酵周期(30-60d)进行发酵,形成药性菌质。
菌质后处理:将瓶内药性基质雷公藤定期发酵后形成的湿药性菌质称重,用60℃电热烘干,保存备用。
成分提取:将获得的药性菌质分别用稀醇(40%乙醇)提取,制备成清膏进行化学、毒性、药效试验。