CN101138579B - 一种黄芪发酵液及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药加工及生物发酵领域，特别涉及中药黄芪的发酵方法以及通过这种方法得到的发酵产物的应用。本发明以大型食用真菌平菇作为中药发酵出发菌种，以中药材黄芪为发酵培养基主料，通过添加少量的菌种生长繁殖所必需的营养物质，对中药黄芪进行发酵。动物实验显示中药黄芪发酵液具有明显的耐缺氧和抗凝血功效。本发明的应用是指通过此方法得到的中药黄芪发酵液可以在制备抗缺氧、抗凝血药物中应用，也可在制备相应的保健品、食品中应用。
Description
技术领域：
本发明涉及中药加工及生物发酵领域，特别涉及中药黄芪的发酵方法，及通过这种方法得到的发酵产物的应用。
背景技术：
黄芪，为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.及内蒙黄芪A.membranaceus Bge.varmongholicus(Bge.)Hsiao的根，产于东北、西北、华北等地[1]。黄芪被《神农本草经》列为上品，为常用药之一，是重要的补气药，有补气开阳、益胃固表、托毒生肌、利水退肿的功效[2]。药理实验证明，黄芪有抗菌，增强机体免疫能力，扩张外周血管，增进末梢循环，改进局部营养状态等作用[1]。此外，黄芪尚有耐缺氧，抗疲劳，抗炎，抗肿瘤，利尿等作用[3-6]。黄芪多糖能使动物脾脏增大，脾内浆细胞增生；黄芪γ-氨基丁酸具有降压作用；黄芪皂甙有抗血栓形成和降压作用，并可升高血浆中cAMP量与促进小鼠再生肝的DNA合成[1，7]。
中药的发展与应用有着悠久的历史，是中华民族的瑰宝，在社会发展过程中有着举足轻重的作用。然而，不论是我国传统的中药炮制方法，还是现代大企业的提取工艺，都是采用水煮或大量的有机溶剂设法将中药有药用价值的成分与无药用价值的结构物质分开，其局限是有效成分提取不充分或只针对某个或某些成分的提取，而使疗效降低，有限的中药资源大量浪费，同时还会产生大量的剩余残渣和有害溶剂，对环境造成危害。因此，利用生物发酵的方法对中药进行加工，已成为中药现代化的研究热点之一[8]。中药发酵是利用微生物强大的分解转化物质的能力，产生丰富的次生代谢产物，从而达到浓缩有效成分，改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症的目的。由于中药发酵在中药现代化研究开发方面具有的独特优势，因此发展前景广阔。
然而就目前已有的技术看，中药发酵研究还存在一些缺陷和不足：
首先，从发酵培养基看，有的研究单纯就是为了培养药用真菌，发酵培养基中并没有添加中药成分；有的添加了中药成分，也只是作为辅料加入的。如专利申请号为200510068284.9，名称为“一种添加苦瓜的鸡腿蘑液体发酵工艺及发酵产品”的专利，其工艺方法就是以鸡腿蘑为出发菌种，在液体发酵培养基中加入了少量的中药苦瓜，其目的是大规模液体培养鸡腿蘑，添加中药苦瓜则是为了提高发酵液的活性。又如有人在发酵培养基中加入了一定量的中药黄芪，接入预先培养好的液体灵芝菌种，经过一段时间的发酵后，通过测定灵芝多糖的含量，研究黄芪对生产灵芝多糖的影响[9]。上述研究将药用真菌置于主导地位，中药则处于从属地位，在发酵产物的药效检测上以药用真菌为标准，而没有考虑发酵培养基中的中药。
其次，从中药发酵菌种来说，因为细菌具有繁殖周期短，种类繁多，代谢方式多样等特点，所以有不少研究采用细菌作为中药发酵的出发菌种，并且对中药发酵取得了不错的效果。然而，大部分作为发酵菌种的细菌因为其对营养物质要求较高，以及中药对细菌生长所提供的营养物质有限。一些研究为了利于发酵菌种的生长使发酵能够顺利进行，在中药发酵培养基中加入了较多的促进细菌生长繁殖的营养物质，这样就降低了中药在发酵培养基中的相对比例，减少了细菌对中药的代谢作用，进而影响中药的发酵效果。如专利申请号为03117590.2，名称为“增效红花溶栓制剂”专利，其发酵出发菌种就是一株芽孢杆菌，它在中药红花的发酵培养基中加入了除红花之外多达六种的营养物质，以促进菌种的生长繁殖。这样不仅升高了生产成本，并且给发酵产物的后续处理增加了难度和程序。
大型食用真菌如平菇、金针菇、草菇、凤尾菇、香菇、双胞菇等，作为人们餐桌上美味可口的营养食物，并不具有药用价值，其在生长繁殖中产生的生物活性物质不会对培养基中中药的作用机理研究产生不利影响。大型食用真菌的菌丝体具有生长繁殖能力强，对营养物质要求低，易于培养的优点，并且在生长繁殖过程中会产生丰富的酶系，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等，具有较强的木质纤维素、半纤维素、木质素、果胶等物质的分解利用能力。利用大型食用真菌的这些特性，其可以被用来对中药进行发酵。
针对现有技术的缺陷，本发明以大型食用真菌平菇为例，对中药黄芪进行了发酵处理。
在现有文献中尚未发现以大型食用真菌作为中药发酵出发菌种、以中药材为发酵培养基主料，利用大型食用真菌丰富的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等，将中药材中木质纤维素、半纤维素、木质素、果胶等物质进行分解，将中药材的活性成分充分释放在发酵水溶液中方面的研究。
参考文献：
(1).苏中武，乔传卓.生药学.上海：上海医科大学出版社，1989.pp129-132.
(2).成都中医学院.生药学.上海：上海科学技术出版社，1978.pp288-289.
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(4).李卫平，明亮，张艳，王翠芳，方明，刘晓颖.黄芪多糖耐缺氧作用的实验研究.安徽医科大学学报，1995，30(3)：184-185.
(5).全宏勋.黄芪水煎液对环磷酰胺抗肿瘤活性与毒性的影响.中药材，1995，18(7)：356-358.
(6).周钦，李荣亨.黄芪对肾小球疾病物质代谢紊乱的调节作用.中草药，1999，30(5)：386-388.
(7).高建，徐先祥，徐先俊，倪受东.黄芪总皂苷抗血栓形成作用实验研究.中成药，2002，24(2)：116-118.
(8).吴炳新，牛纪江，孙筱林，董立山.中药发酵制药技术.山东中医杂志，2001，20(3)：179-180.
(9).王玉红，丁重阳，徐鹏，章克昌.中药黄芪对发酵生产灵芝多糖的影响.食品与生物技术学报，2005，24(2)：38-40.
发明内容：
本发明的目的是利用大型食用真菌，如平菇、金针菇、草菇、凤尾菇、香菇、双胞菇等，对中药材中的纤维素、半纤维素、木质素、果胶等无药用价值物质的分解利用能力，以中药材为培养基中的主要成分配制成适合食用真菌生长的液体培养基，在合适的发酵条件及适当的发酵周期下进行发酵。在此过程中，黄芪中无药用价值的物质被大型食用真菌所产生的酶系，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等所降解，有效成分得以充分释放。另一方面，在大型食用真菌的代谢作用下，以黄芪中的某些有效成分为前体，形成新的化合物，或者大型食用真菌在生长繁殖过程中产生的大量次生代谢产物与黄芪中的某些成分发生相互作用形成新的化合物。这样就达到了在水溶液中充分释放中药材中的有效成分或产生新的有药用价值成分的目的。
本发明涉及利用大型食用真菌发酵中药材的方法，以及通过这种方法得到的发酵产物的应用。本发明的具体技术内容如下：
黄芪发酵方法，其特征是：利用大型食用真菌来发酵黄芪。
本发明所用的发酵菌种是大型食用真菌平菇。发酵培养基组成成分(单位：g/L)：黄芪30～90，麸皮10～20，石膏0.5～1.5，蒸馏水。黄芪粉碎至60目的粉末；麸皮煮汁过滤得滤液；石膏粉碎至60目的粉末。500mL三角瓶分装培养基120～170mL，高压灭菌后接种液体发酵菌种，接种量为5～15％，于25～28℃、130～180r/min条件下摇床振荡培养，培养时间为6～10d，得到黄芪发酵液。黄芪发酵液经3500～5000r/min离心得上清液，该上清液可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。
本发明是采用摇瓶的方法进行的，如果进行放大生产，可根据本发明的基本原理采用槽处理、柱处理、罐处理、发酵罐处理以及微生物固定化处理等方式进行党参发酵处理，这是本领域的研究人员所能理解的。
本发明可以使中药黄芪的药效得到增强，由于本发明采用食用真菌作为发酵的出发菌种，可以将中药黄芪中部分无药用价值的纤维素、半纤维素、木质素、果胶等物质代谢利用或转化成小分子的糖等；并可以使小分子蛋白质、游离氨基酸等生物活性物质的含量大大增加；活性物质充分释放；有效成分会更加适合人体吸收，提高疗效。另外，本发明在整个过程中都不会产生废气、废液等，与传统中药加工方法相比产生的固体废渣更少，有利于减少对环境的危害。本发明提供的发酵方法同样适合于其他单方或复方中药，对于推进中药发展、提高中药现代化水平具有重大意义。
具体实施方式：
实施例一：黄芪发酵液的制备。
本发明所用的发酵菌种是大型食用真菌平菇。发酵培养基组成成分(单位：g/L)：黄芪30～90，麸皮10～20，石膏0.5～1.5，蒸馏水。黄芪粉碎至60目的粉末；麸皮煮汁过滤得滤液；石膏粉碎至60目的粉末。500mL三角瓶分装培养基120～170mL，高压灭菌后接种液体发酵菌种，接种量为5～15％，于25～28℃、130～180r/min条件下摇床振荡培养，培养时间为6～10d，得到黄芪发酵液。黄芪发酵液经3500～5000r/min离心得上清液，该上清液可直接作为食品、保健品及药品使用，或者用于制备食品、保健品及药品的原料。
实施例二：黄芪发酵上清液的抗缺氧活性。
实验动物：健康雄性昆明种小鼠，体重20±2g。
实验药物：按照实施例1制备的上清液配制成大、中、小三个浓度剂量，其原始生药含量分别为0.412g/mL、0.206g/mL和0.052 g/mL。不接菌种对照组上清液原始生药含量为0.206g/mL。水煎液对照组上清液原始生药含量为0.206g/mL。
动物实验：
①、急性脑缺血性缺氧实验：
将60只小鼠随机分为6组，每组10只，分为黄芪发酵组大、中、小3个剂量，黄芪不接菌对照组，黄芪水煎组和空白对照组，空白对照组给予无菌水。每10g小鼠灌胃给药0.2ml，每天给药一次，连续灌胃10d。于末次灌胃后1h，用剪刀在小鼠双耳连线处快速断头，秒表立即记录小鼠断头后至张口喘气停止时间。
②、常压耐缺氧实验：
动物分组和灌胃方法同上。于末次灌胃后1h，将各组小鼠分别放入盛有7g钠石灰的250ml磨口瓶内(每瓶放1只小鼠)，用凡士林涂抹瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，直至小鼠呼吸停止，记录小鼠在密闭磨口瓶内的存活时间。
③、亚硝酸钠中毒缺氧实验：
动物分组和灌胃方法同上。在末次灌胃后1h，各组动物均按220mg/kg腹腔注射亚硝酸钠溶液，记录小鼠存活时间。
实验数据以x±s表示，统计学检验采用SPSS13.0软件进行处理。
实验结果
表1黄芪发酵上清液的抗缺氧活性(x±s)
| 组别 | 剂量g/kg/d | 急性脑缺血性缺氧断头呼气t/s | 常压缺氧存活t/min | 亚硝酸钠中毒存活t/min |
| 蒸馏水对照水煎不接菌对照发酵小剂量发酵中剂量发酵大剂量 | -4.124.121.044.128.24 | 18.9±1.720.3±1.5*19.3±2.020.2±1.220.6±1.1*20.9±1.6** | 19.7±3.323.2±3.1*19.8±2.922.9±5.024.1±6.3*25.0±3.7** | 15.2±2.217.0±2.615.8±2.416.5±2.717.8±2.7*18.2±3.0* |
表1显示，与蒸馏水对照组相比，大剂量黄芪发酵液能显著延长(P＜0.01)急性脑缺血性缺氧小鼠断头呼气时间及常压缺氧小鼠存活时间，中剂量次之(P＜0.05)，小剂量可以使时间延长，但无统计学意义；与蒸馏水对照组相比，大、中剂量黄芪发酵液能明显延长(P＜0.05)小鼠亚硝酸钠中毒存活时间，小剂量亦可以使时间延长，但无统计学意义。
实施例三：黄芪发酵上清液的抗凝血活性：
实验动物、实验药物、动物分组、灌胃方法等皆同实施例二。
①、黄芪发酵上清液对小鼠凝血时间影响(玻片法)：
在末次灌胃后1h，小鼠尾部取血，检测并记录血滴自流出到出现纤维蛋白丝的时间，即为凝血时间。
②、黄芪发酵上清液对小鼠出血时间的影响：
在末次灌胃后1h，将小鼠固定，用利剪从小鼠尾尖1cm处横断后，待血液自动溢出时开始记时，每隔20s用滤纸吸去尾尖血滴，直至血液自然停止流出为止(滤纸吸时无血)，记录出血时间。
实验数据以x±s表示，统计学检验采用SPSS13.0软件进行处理。
实验结果
表2黄芪发酵上清液的抗凝血活性(x±s)
| 组别 | 剂量g/kg/d | 凝血时间t/min | 出血时间t/min |
| 蒸馏水对照水煎不接菌对照发酵小剂量发酵中剂量发酵大剂量 | -4.124.121.044.128.24 | 4.2±1.35.2±0.8*4.1±1.45.5±0.6*6.8±0.9**△7.5±0.8**△ | 18.7±3.222.5±2.6*19.5±2.622.1±3.3*23.0±3.4*23.7±4.4** |
表2显示，与蒸馏水对照组相比，大、中剂量黄芪发酵液能显著延长(P＜0.01)小鼠凝血时间，小剂量次之(P＜0.05)。与蒸馏水对照组相比，大剂量黄芪发酵液能显著延长(P＜0.01)小鼠出血时间，中、小剂量次之(P＜0.05)。
表2显示，与水煎组相比，大、中剂量黄芪发酵液能显著延长(P＜0.01)小鼠凝血时间，小剂量虽能延长凝血时间，但差异不显著。与水煎组相比，大、中剂量黄芪发酵液可以延长小鼠出血时间，但差异不显著(P＞0.05)。
Claims (3)
1.一种具有抗缺氧和抗凝血功效的黄芪发酵液的制备方法，其特征在于：
a. 生产菌株为食用真菌平菇（ Pleurotus ostreatus ）；
b. 每l L发酵培养基组成为30-90g黄芪，10-20g麸皮，0.5- 1. 5g石膏，蒸馏水，其中麸皮煮汁得滤液；
c. 将平菇（ Pleurotus ostreatus ）液体发酵菌种接种于装有120ml-170ml发酵培养基的500ml三角瓶中，接种量5%-15%，在温度为25oC-28oC，130-180rpm的条件下培养6-10天，即可得到培养液；
d. 将上述培养液在转速3500-5000rpm下离心得到上清液，即得到黄芪发酵液。
2.一种具有抗缺氧和抗凝血功效的黄芪发酵液，其特征在于：该发酵液是经过如权利要求1所述的一种具有抗缺氧和抗凝血功效的黄芪发酵液的制备方法制备得到。
3.如权利要求2所述一种具有抗缺氧和抗凝血功效的黄芪发酵液在制备抗缺氧和抗凝血食品、保健品或药物中的应用。
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| 杨志荣.灵芝与中药共发酵产物的药理学初步研究.《2006中国微生物学会第九次全国会员***暨学术年会论文摘要集》.2006,253. |
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