CN1763190A - 重组细胞球蛋白（Cytoglobin)的生产方法及其用途 - Google Patents

重组细胞球蛋白（Cytoglobin)的生产方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种生产重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的方法，以及Cytoglobin的用途。Cytoglobin是由多种组织的成纤维细胞表达的六元球蛋白家族(hxHb)的新成员。本发明所涉及的Cytoglobin，包括重组人Cytoglobin，重组大鼠Cytoglobin，重组小鼠Cytoglobin。本发明所涉及的Cytoglobin，临床上可用于促进皮肤组织、角膜、胃、肺、气管上皮组织的生长，减缓衰老，抗氧化，抗炎症，加速烧伤、烫伤、溃疡创面修复及器官组织切除后的伤口愈合；在化妆品领域，可直接参与皮肤新陈代谢的生物学效应，促进皮肤的营养修复成膜和调理等功能，该蛋白的抗氧化，抗炎症，抗衰老功能，具有洁肤、护肤的美容效果。

Description

重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的生产方法及其用途
技术领域
本发明涉及分子药物学，生物技术和疾病防治，具体地，本发明涉及一种重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的生产方法，以及重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的用途。
技术背景
Cytoglobin是K Yoshizato于2000年研究肝星状细胞(HSCs)时发现的一种新型蛋白质，大鼠Cytoglobin的基因序列及氨基酸序列见图1。肝星状细胞在肝炎和纤维化的过程中发挥着重要作用。K Yoshizato发现在HSCs活化过程中，Cytoglobin及其mRNA的表达均明显地上调。K Yoshizato认为Cytoglobin是一种具有过氧化酶活性的血红素蛋白，其意义仅在于Cytoglobin可作为肝中静止期或激活期星状细胞的标志物。
我们的研究结果表明，Cytoglobin具有显著的抗炎，抗氧化，抗衰老和细胞坏死功能，可以刺激和控制表皮和上皮细胞的增殖，具有促进创伤愈合和防止器官纤维化的作用。
Cytoglobin还可以应用于化妆品，成为功能性和保护性防衰老、抗氧化化妆品的一员。
化妆品的发展可分为三个阶段，以合成化学原料组成的普通化妆品属第一代化妆品，以天然原料组成的化妆品属第二代化妆品，以生物活性为主组成的功能性化妆品属第三代化妆品。第一代化妆品主要缺点为易引起过敏。第二代化妆品克服了过敏问题，安全性好，但只能对皮肤提供保护作用，一般不能诱发皮肤的自身保护功能，不能调节皮肤的生理机能。第三代化妆品在满足皮肤组织亲和性及安全性的基础上，对原料，功能，效果和感性等方面进行了组合，将生物活性物质如表皮生长因子，透明质酸等引入化妆品，成为功能性化妆品。
在本专利申请前，未见有人公开或发表利用重组技术生产Cytoglobin，并应用于创伤愈合，防止细胞衰老和器官纤维化，以及美容的报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种生产Cytoglobin方法。
本发明的第二个目的在于提供一种所述重组Cytoglobin蛋白在医疗上的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种所述重组Cytoglobin蛋白在美容领域的应用。
在本发明中，采用基因工程等现代生物学技术和疾病防治方法，提供了编码Cytoglobin蛋白表达载体的构建、工程菌株的制备、纯化工艺方法及其应用。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的DNA序列及氨基酸序列。
图2是重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的重组质粒图谱。
图3是重组细胞球蛋白(Cytoglobin)的SDS-PAGE电泳图谱。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。
具体实施方式
实施例1
Cytoglobin表达载体的构建：
选用表达质粒为pBAD/g IIIA，B，C载体***(Invitrogen)。
pBAD/g IIIA质粒已XhoI和EcoRI双酶解后回收大片段，与合成的大鼠Cytoglobin cDNA片段连接过夜，得表达质粒pBAD/gIII/rCytoglobin，直接转化大肠杆菌，氨苄青霉素抗性筛选，得到阳性克隆株。小量制备质粒，用限制性内切酶鉴定无误。通过序列分析，证实克隆序列与设计序列完全一致。
Cytoglobin cDNA的设计序列见图1，表达质粒见图2。
表达培养：
将上述工程菌进行培养，目的蛋白Cytoglobin的表达量达发酵上清总蛋白的10％以上。
Cytoglobin的纯化：
发酵液4℃下5000rpm离心10min，得菌体。超声裂解，沉淀用1mol/L的尿素洗涤后，溶于6mol/L的盐酸胍中。在能使含6-his标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯和柱层析柱纯化Cytoglobin。采用ProBond Purification System(Invitrogen)纯化Cytoglobin。得到Cytoglobin的单体和双聚体。
用12％的SDS-PAGE电泳，鉴定表达蛋白的分子量，测得Cytoglobin的单体分子量为22kD，双聚体分子量为44kD。见图3。
实施例2
重组Cytoglobin的活性测定(总氧自由基清除能力TOSC)
TOSC测定原理：在密闭顶空瓶内，ABAP热解产生大量以碳为中心的氧自由基，KMBA在氧自由基的攻击下可氧化产生乙烯，用气相色谱法测定顶空气体中乙烯的含量；当反应体系中有抗氧化成分存在时，可与KMBA竞争结合氧自由基而使乙烯产生减少，从乙烯产生的减少量计算出所测样品的TOSC值。TOSC的计算公式：TOSC＝100-(∫SA/∫SC)×100。其中：∫SA、∫SC分别为样品和对照(PBS缓冲液)反应体系中产生的乙烯量(以色谱峰面积表示)。当样品完全无抗氧化能力时，样品与对照的乙烯色谱峰面积相同，∫SA/∫SC＝1，TOSC为0；相反，当样品抗氧化能力很强时，∫SA趋于0，此时TOSC接近100。一般地，根据组织氧化损伤程度的差异，样品TOSC值在0-100之间。
参照Winston建立的方法(Winston GW，RegoliF，Dugas AJ Jr，Fong JH，Blanchard KA.A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradicalscavenging capacity of antioxidants and biological fluids.Free Radic BiolMed.1998，24(3)：480-93)，以0.1mol/L磷酸钠缓冲液PBS(磷酸调pH7.4)配制0.2mol/L ABAP、0.25mmol/L KMBA(临配，4℃避光贮存)，按对照管(KMBA0.8ml，PBS0.1ml)、样品管(KMBA0.8ml，样液0.1ml)加入顶空瓶，加盖密封后用注射器注入0.1ml ABAP，使溶液终体积为1ml，ABAP和KMBA终浓度之比为100/1。每隔2-5min依次将顶空瓶放人35℃水浴振荡反应60min，立即抽取顶空气体0.6ml用于气相色谱分析，计算TOSC值。
不同批次样品的比活性见下表(n＝3)：
  样品批次   比活性(TOSC/mg)
  200201   183.5±45.91
  200202   196.4±64.1
  200203   114.6±25.79
  200204   264.8±42.55
  200205   106.3±21.62
  200206   185.3±9.57
实施例3
重组Cytoglobin凝胶的制备
重组Cytoglobin                  2mg
Carbopol 940                    4g
三乙醇胺                        8g
苯甲酯                          20mg
纯水                            至100
将重组Cytoglobin2mg和苯甲酯20mg溶于90ml水中，加Carbopol 940 4g分散均匀。用三乙醇胺调节pH至6.5-7.5，加水至100ml混合搅拌即得。
实施例4
重组Cytoglobin凝胶对创面愈合的疗效
实验采用动物为大耳白兔，体重2.0～2.5kg，由中国药科大学实验动物中心提供。于实验前一周购入，单笼喂养，自由饮水与摄食。实验当日禁食，在麻醉条件下用剃刀将动物背部净毛，面积为18cm×15cm。待消毒后用特制致伤器(打孔器，直径1.8cm)在兔背中部脊柱两侧各旁开1.5cm处，由前至后共切割3个圆形创面(左1个、右2个)，直径1.8cm，面积2.54cm，深至皮下并破坏少许肌组织，创面止血后备用。
每一动物分成含药凝胶组、不含药凝胶组和生理盐水组。伤后即开始用药，以后隔天换药一次，至伤后第16天。每次换药时将纱布揭开，创面无菌处理后，用注射器将凝胶或生理盐水均匀滴注于相应创面，待作用5min后用无菌纱布包扎，单笼喂养，自由饮水与摄食。
术后记录伤后第4、8、12、16天创面面积；用注水法测量伤腔容积；伤后第8、16天取创面组织，经***固定后常规染色，重点观察创面肉芽组织生长(包括毛细血管生长，胶原沉积)与再上皮化变化，以评价修复效果。
术后第1天伤口红肿，各组间无明显差异；在第8天和第12天，含药凝胶显示明显的加速创面面积缩小的作用(见下表)。
治疗后创面面积变化(cm2)
组别 第0天 第4天 第8天 第12天 第16天
  含药凝胶组  2.54   2.66±0.22   1.67±0.34   0.52±0.32   0.14±0.18
  不含药凝胶组  2.54   2.71±0.31   2.12±0.61   0.97±0.46   0.31±0.27
  生理盐水组  2.54   2.73±0.42   2.18±0.54   1.31±0.48   0.42±0.19
经不同治疗方法处理的各组创面伤腔容积随伤后时间延长而逐渐缩小。和生理盐水组相比，含药凝胶组显示明显的加速伤腔容积缩小的作用。
治疗后创伤容积变化(cm3)
组别 第4天 第8天 第12天
  含药凝胶组   0.66±0.12   0.33±0.10   0.08±0.04
  不含药凝胶组   0.61±0.11   0.42±0.11   0.17±0.06
  生理盐水组   0.63±0.12   0.48±0.14   0.19±0.08
HE染色切片后观察：经含药凝胶治疗的创面，伤后7天成纤维细胞生长活跃、数量多，其毛细血管胚芽与成纤维细胞数量显著多于对照组。伤后16天，重组Cytoglobin含药凝胶组的创面收缩与再上皮化明显，新生上皮向创面中心爬行较快。
实施例5
重组Cytoglobin抗皮肤衰老作用
3月龄清洁级雌性昆明种小鼠80只，平均体重25±2g，购自中国药科大学实验动物中心，标准饲料饲养1w后随机分为4组，每组20只，小鼠背部皮肤脱毛。正常组：每日颈背部皮下注射生理盐水0.2ml；D-半乳糖(衰老模型)组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖(1000mg/kg·d)；对照组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖(1000mg/kg·d)，同时皮肤涂布不含药凝胶；实验组：每日颈背部皮下注射D-半乳糖(1000mg/kg·d)，同时背部皮肤涂布含药凝胶。凝胶涂布厚度为0.5mm，给药面积为10cm2，连续给药10d。
10d后，所有小鼠摘眼球放血处死，测定小鼠背部皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化脂质(LPO)及代谢产物丙二醛(MDA)含量。结果见下表。
小鼠皮肤生化指标检测结果
  组别   CAT(U/g)   SOD(U/g)   MDA(nmol/g)
  正常组   16.8±10.5   157.6±25.4*   6.86±1.6
  D-半乳糖组   17.3±9.2   129.3±20.2   9.42±1.8
  对照组   17.9±9.7   130.6±24.8   9.53±1.4
  实验组   28.7±14.0*   155.3±20.7*   4.87±1.1*
与D-半乳糖组比较：*P＜0.05。
本实验结果证实，重组Cytoglobin凝胶具有显著的抗皮肤衰老作用，可显著提高D-半乳糖所致衰老模型小鼠皮肤中CAT、GSH-Px和SOD活力。
实施例6
重组Cytoglobin对肝硬化的预防作用
取体重180-200g大鼠40只，随机分为四组。四氯化碳组大鼠灌胃四氯化碳8周，形成肝纤维化模型，肝硬化造模后，肝脏中前胶原蛋白(PC-1)，TGF-1，TIMP-1，和GAPDH mRNA表达明显增加。对照组大鼠灌胃生理盐水8周，无肝损伤。预防组预防性肌肉注射重组Cytoglobin 10μg/kg，肝损伤明显减轻，PC-1，TGF-1，TIMP-1，和GAPDH的转录明显抑制。

Claims (7)

1、一种生产重组Cytoglobin的方法，其步骤包括：
构建表达Cytoglobin的表达质粒pCygb；
1)用表达质粒pCygb转化宿主细胞，得到工程菌株；
2)将工程菌株在合适的培养基中进行培养，表达Cytoglobin；
3)采用柱层析的方法进行重组Cytoglobin蛋白的纯化。
2、如权利要求1中所述的表达质粒pCygb，其编码的蛋白可以是人Cytoglobin，或大鼠Cytoglobin或小鼠Cytoglobin中的一种，或与所述三种蛋白具有至少90％的同源性。
3、如权利要求1中所述的宿主细胞，可以是大肠杆菌，或酵母，或真核细胞。
4、如权利要求1中所述Cytoglobin蛋白的柱层析纯化方法，可以采用亲和层析，或离子交换层析，或凝胶层析，或以上方法的组合，得到的Cytoglobin纯度为1-100％。
5、一种临床上可用于促进皮肤组织、角膜、胃、肺、气管上皮组织的生长繁殖，加速烧伤、烫伤、溃疡创面修复及器官组织切除后的伤口愈合的药物组合物，其抗氧化、抗炎症、抗衰老生物学特性有效地保护新陈代谢的正常进行，其特征在于包含Cytoglobin，其含量为0.001-2000μg/g。
6、一种化妆品，可直接参与皮肤新陈代谢的生物学效应，促进皮肤的营养修复成膜和调理等功能，其抗氧化、抗炎症、抗衰老特性，可以防止细胞的过早老化或死亡，加速皮肤细胞的增殖和生成，并促进新生细胞迅速代替衰老细胞，以达到洁肤、护肤的美容效果，其特征在于包含Cytoglobin，其含量为0.001-2000μg/g。
7、利用Cytoglobin进行防止细胞衰老或器官纤维化的药物治疗，给药途径包括静脉注射，肌肉注射，口服，粘膜，皮肤，呼吸道。
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