KR102475936B1

KR102475936B1 - 펩타이드 ll-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102475936B1
Application number: KR1020200133748A
Authority: KR
Inventors: 이은정; 유정진; 김미선; 김민지; 이호준; 서상우; 강승현; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사; 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-12-09
Also published as: KR20220049982A

Abstract

항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따른 화장료 조성물은 피부 상처 및 감염에 의해서만 생성되는 LL-37을 발현하는 효모를 유효성분으로 함에 따라, 피부의 염증인자 발현을 억제하고, 상처 재생 또는 피부 재생을 촉진하여 건강한 피부를 가꾸는데 도움을 준다. 뿐만 아니라, 천연 소재인 항균펩타이드 LL-37을 효모에서 발현시켜, 생체 내에서 항염, 및 상처 재생 활성을 유지하면서도 내성이 적고 인체에 무해하여 피부 관련 상태의 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물{A cosmetic composition comprising yeast expressing peptide LL-37}

항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 유해물질의 침입을 방어하는 물리적 방어벽으로서, 화학적, 기계적, 생물학적 자극에 직접적으로 노출되어 미생물 감염, 상처, 및 면역반응과 관련된 염증반응이 빈번하게 일어난다. 이와 같은 피부 감염, 상처는 주로 무피로신, 퓨시드산, 겐타마이신, 네오마이신, 바시트라신 등의 성분을 함유하는 항생제로 치료하지만, 항생제의 경우 장기간 사용하는 경우 내성이 증가한다는 단점이 있다.

이에 대한 대안으로, 천연 소재로서 부작용이 거의 없는 항균펩타이드를 이용한 새로운 개념의 항생제 개발을 위한 연구가 진행되고 있다. 항균펩타이드 (Anti-microbial peptides: AMPs)는 자연계의 생물체에서 사용되는 방어기작 중 하나로, 10 내지 50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로서, 생물체가 병원균에 감염되었을 때 1차 방어물질로 작용한다. 인간 항균펩타이드로는 대표적으로 디펜신 (defensing)과 카세리시딘 (Cathelicidin) 등이 존재하며, 인간 항균펩타이드 LL-37은 사람에게서 밝혀진 유일한 카세리시딘 계 단백질이다.

한편, 상기 항균펩타이드 LL-37은 만성 상처에서는 약하게만 발현되며, 프로테아제 (protease)에 대한 충분한 안정성이 없어 세포 내에서 그 치료적 유용성이 제한된다. 따라서, 세포 내 환경에서도 항균펩타이드의 기존 항생제와 유사한 정도의 항염, 및 세포 재생력을 유지하여, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용할 수 있는 새로운 화장료 조성물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 생체 내에서 안정성을 가지면서도 항염, 및 상처 재생 효과가 우수한 화장료 조성물을 개발하기 위해 노력한 결과, 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모의 항염 및 피부 세포 재생 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 항염증 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 제조하는 단계; 및

상기 제조한 효모를 배양하여 배양액 또는 용해물을 수득하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

인간 항균펩타이드 LL-37은 인간유래 카세리시딘 계 단백질 (human cathelicidin peptide)로, 인체의 다양한 상피세포나 면역세포에서 분비된다. LL-37은 인체 내에서 항균성뿐만 아니라 내독소를 중화시키고, 염증 반응을 조절하는 등 다양한 기능성을 가짐에도 불구하고, 잠재적인 세포 독성이 존재하고, 생체 내 다양한 효소에 의해 가수분해 될 수 있어 그 사용에 어려움이 있다.

상기 인간 항균펩타이드 LL-37 단백질 서열에 대한 정보는, 이에 제한되지는 않으나, Uniprot의 데이터베이스로부터 제공받아 사용할 수 있고 (Duplantier et al. 2013 Frontiers in Immunology 4(143): 1-14; UniProt ID: P49913), 상기 LL-37은 상기 펩타이드 서열 정보로부터 합성하여 얻은 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 사용한 인간 항균펩타이드 LL-37 단백질 서열은 하기와 같다.

LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES (서열번호 1)

일 구체예에 있어서, 상기 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모는 상기 LL-37 유전자를 포함하는 발현 컨스트럭트 (construct)로 형질전환된 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 컨스트럭트"는 세포 내에서 단백질 발현을 위한 최소한의 구성 (element)만을 포함하는 핵산분자를 의미한다.

상기 발현 컨스트럭트는 재조합 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 용어, "벡터 (vector)"는 적합한 숙주, 특히 재조합 효모 내에서 목적하는 단백질을 발현할 수 있도록 하는 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 제작물 (construct)을 의미한다. 상기 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 명세서는 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

상기 재조합 벡터는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 프로모터, 형질전환용 핵산 또는 유전자, 제한효소 인식 염기서열, 전사 종결 서열, 항생제 내성 유전자 등이 작동 가능하게 연결된 벡터일 수 있고, 상기 각 구성 요소는 당업계에서 통상적으로 이용되는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결"은 발현 조절 서열이 형질전환용 핵산 등의 구성 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 의미하며, 프로모터를 포함하는 발현 조절 서열에 의해 코딩되는 형질전환용 핵산 등의 구성 요소가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 또한，본 명세서에서 용어 "항생제 내성 유전자"는 형질전환시에 외래 핵산의 삽입 여부를 판단하고 선별하기 위해 형질전환용 핵산과 연결하여 발현되도록 하는 구성 요소를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 당업자는 목적에 따라 적절한 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있다.

상기 발현 컨스트럭트를 효모 세포에 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 진핵 세포에 벡터를 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리 법, 유전자 밤바드먼트, 초산-리튬 DMSO법 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 형질전환 효모는 당업계의 통상의 방법에 따라 배양될 수 있다.

예를 들어, 배양 배지는 메탄올이 포함된 배지로 YPM (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v)) 배지, YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-glucose 2%(w/v)), 최소배지인 YNBD (YNB without amino acids 0.67%(w/v), amino acid mixture, D-glucose 2%(w/v)) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 YPM 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양 탄소원은 메탄올이 바람직하며, 상기 메탄올의 농도는 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 바람직하게는 2%(w/v) 내지 5 %(w/v), 보다 바람직하게는 2 %(w/v) 내지 4 %(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃, 보다 바람직하게는 35 내지 39℃ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게는 5.0 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.7 내지 6.3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양 교반 속도는 100 내지 300 rpm, 바람직하게는 150 내지 250 rpm, 보다 바람직하게는 180 내지 220 rpm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에 있어서, 상기 효모는 효모의 배양액, 파쇄액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물 형태일 수 있다.

본 명세서에서 용어"배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환하여 사용될 수 있고, 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 이는 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다.

상기 배양액은 효모를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액으로부터 효모를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.

상기 배양액은 효모를 배지에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.

상기 배양 상층액은 효모 배양액을 원심분리 하거나 여과시켜 효모를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 상기 농축물은 상기 효모 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

상기 효모를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 효모 자체에서 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 상기 "파쇄액"은 "파쇄물", "용해액", 또는 "용해물 (lysate)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 명세서에서 배양된 효모의 파쇄 방법은 효모 세포의 전체 파쇄물을 얻을 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 초음파 파쇄법 (sonication)에 의한 파쇄, 유리 비드 (glass beads)에 의한 파쇄, 계면활성제를 이용한 파쇄, 또는 이들의 조합을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "배양액의 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "효모"는 맥주, 포도주, 막걸리 등을 만드는 데 사용되는 미생물로서 곰팡이나 버섯 무리지만 균사가 없고 광합성능이나 운동성도 없는 단세포 생물의 총칭이다.

상기 효모는 사카로마이세스 과 (family) 미생물일 수 있고, 바람직하게는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속 (genus) 또는 피키아 (Pichia) 속 미생물일 수 있고, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버젠시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 서바지 (Saccharomyces servazzii), 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 효모는 효모의 배양액, 파쇄액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물 형태로 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 30 중량%로 포함될 수 있고, 바람직하게는 5 내지 25 중량%로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 10 내지 20 중량%로 포함될 수 있고, 보다 바람직하게는 13 내지 17 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 본 발명자들은 인간 각질형성세포에 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물을 처리 시 염증유도 사이토카인인 IL-1β, 및 IL-6의 발현이 억제됨을 통해 상기 용해물이 피부 염증 반응을 억제할 수 있으며, 나아가 섬유아세포의 이동을 빠르게 증가시켜 상처 회복, 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 가짐을 발견하였다.

따라서, 일 양상에 따른 화장료 조성물의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있다.

상기 피부 상태는 피부 상처, 피부 염증, 피부 노화, 피부 장벽, 피부 주름, 및 피부 탄력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.

본 명세서에서 용어 "피부 주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

상기 "피부 질환"은 피부에 발생하는 질환을 모두 포함하며, 상처 (wound), 여드름, 피부염 (dermatitis), 아토피성 피부염 (atopic dermatitis), 알레르기성 피부염, 접촉성 피부염, 여드름성 피부염, 땀띠, 피부 노화, 피부 주름 (skin wrinkle), 또는 피부 흉터일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.

상기 피부 장벽 개선은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 개선하는 것을 의미하며, 상기 피부 장벽 기능 저하는 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 여드름, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염 등을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 효모, 이의 배양액, 파쇄액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.

상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 피부 외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

또 다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 항염증 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

일 양상에 따른 약학적 조성물의 용도는 상처, 여드름, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 및 땀띠로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 개선 또는 치료 등을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

또 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부의 염증인자 발현 억제, 상처 재생, 피부 재생, 피부 장벽 강화, 또는 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

또 다른 양상은 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 제조하는 단계; 및 상기 제조한 효모를 배양하여 배양액 또는 용해물을 수득하는 단계를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.

일 양상에 따른 화장료 조성물은 피부 상처 및 감염에 의해서만 생성되는 LL-37을 발현하는 효모를 유효성분으로 함에 따라, 피부의 염증인자 발현을 억제하고, 상처 재생 또는 피부 재생을 촉진하여 건강한 피부를 가꾸는데 도움을 준다. 뿐만 아니라, 천연 소재인 항균펩타이드 LL-37을 효모에서 발현시켜, 생체 내에서 항염, 및 상처 재생 활성을 유지하면서도 내성이 적고 인체에 무해하여 피부 관련 상태의 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 인간 각질형성세포에서 염증반응인자인 IL-1β, 및 IL-6의 발현 정도를 확인한 그래프이다.
도 2는 인간 섬유아세포를 긁어낸 후 실시예 1의 항균 펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물, 및 비교예 1의 일반 효모 용해물을 처리한 세포의 상처 재생 및 회복 정도를 관찰한 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모의 제조

1-1. 형질전환 효모의 제조

효모 균주 발현벡터를 구축하고, 이를 효모 균주 내로 도입하여 인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 형질전환 효모를 제조하였다. 구체적으로, 실시예 1의 경우 효모 균주용 발현벡터에 발현 유도 프로모터 (inducible promoter), 인간 항균펩타이드 LL-37 서열 (LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES, 서열번호 1), 및 전사 종결 서열을 포함하도록 제작하였다. 제작한 벡터로 상업적으로 구매한 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 형질전환 (transformation) 시킨 뒤, 발현벡터를 가지는 균주 라인을 선별하고, 웨스턴 블랏으로 LL-37 펩타이드 발현을 확인하여 실험에 사용하였다.

비교예 1의 경우, 인간 항균펩타이드 LL-37 발현벡터를 도입하지 않은 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)를 사용하였다.

1-2. 형질전환 효모 용해물 제조

형질전환 효모는 아가 (agar) 1.5%가 첨가된 YPM 배지(Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), Methanol 3%(w/v))에서 30℃ 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 상기 YPM 배지는 메탄올을 제외한 성분들을 멸균한 후, 45℃까지 냉각한 뒤 여과 멸균된 메탄올을 혼합하여 사용하였다. 배양된 콜로니 (colony)를 25mL YPD (Bacto-peptone 2%(w/v), Bacto-Yeast Extract 1%(w/v), D-glucose 2%(w/v)) 배지액이 들어간 250mL 베플 플라스크 (baffled flask)에 접종한 후, 30℃에서 250rpm 조건으로 배양하였다. 배양은 균체의 현탁정도가 파장 600nm에서 OD 2~6이 될 때까지 12~16시간 동안 수행하였다. 그런 다음, 상기 배양액을 5분 동안 3000rpm으로 상온에서 원심분리하여 세포만을 회수하였다. 회수한 형질전환 효모 세포를 멸균된 최소배지인 YNBD (YNB without amino acids 0.67%(w/v), amino acid mixture, D-glucose 2%(w/v))으로 한 번 세척하고, 다시 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 초기 배양 세포의 농도가 파장 600nm에서 OD 0.5가 될 수 있도록 100mL YNBD 배양액이 들어있는 500mL 베플 플라스크에서 30℃, 250rpm 조건으로 배양하였다. 100% 메탄올을 최종 농도가 0.5% (v/v)가 되도록 24시간마다 첨가하였다. 48시간까지 배양한 배양액을 20분간 3000rpm으로 원심분리 후, 상등액을 제거하여 효모 세포만을 회수하였다. 획득한 효모 세포를 Q 700 초음파 분산기 (QSONICA, USA)를 이용하여 용해시켰다. 온도는 30℃ 미만으로 유지하고, 초음파의 출력은 100~500 와트, pulse on/off를 10s/10s로 설정하여 파쇄물을 수득하고, 상기 파쇄물 (형질전환 효모 용해물)을 이후 실험에서 사용하였다.

실험예 1. 항염 효과 확인

피부는 세균 감염이나 상처, 물리적 자극, 화학물질 등에 의해 피부 손상이 유발될 때 이를 방어하기 위해 염증반응 (inflammatory response)이 일어나며, 이 때 다양한 면역세포와 염증유도 사이토카인인 IL-1β(Interleukin-1β), IL-6 (Interleukin-6) 등이 관여한다.

항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물의 항염 효과를 확인하기 위해, 인간 각질형성세포 (Human keratinocyte)를 이용하여 염증반응에 관여하는 사이토카인인 IL-1β, 및 IL-6의 발현 정도를 mRNA 수준에서 측정하였다.

1-1. 인간 각질형성세포 배양

인간 각질형성세포인 HaCaT 세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지가 들어있는 100mm 디쉬에서 배양하였다. 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 시료를 0.2㎛ 시린지 필터 (Syringe filter)로 여과하여 준비하고, 세포 배양액에 상기 각 시료를 최종 농도가 10%(v/v)가 되도록 첨가하였다. 양성대조군으로는 염증억제작용이 있는 덱사메타손 (dexamethasone)을 사용하였다. 시료가 포함된 배양액을 37℃, 5% CO₂ 농도와 습도 95%가 유지되는 배양기에서 24시간 동안 배양한 후, 면역자극제인 Poly I:C 10 μg/ml를 처리하여 4시간 동안 배양하였다.

1-2. 염증유도 사이토카인의 발현 분석

상기 실시예 1-1에서 배양한 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액 (PBS)으로 세척하고 PureLink® RNA Mini Kit (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. 구체적인 RNA 추출은 제품과 같이 제공되는 매뉴얼에 따라 수행하였다. 유전자 발현 변화는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에서 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 결합하고 형광물질을 지속적으로 검출하는 qRT-PCR (quantitative real time PCR)로 측정하였다. 염증반응인자인 IL-1β, 및 IL-6 유전자의 발현을 정량하고자 SYBR 그린 (Thermo Fisher Scientific)을 통해 PCR 산물이 발산하는 형광 값을 측정하였다. PCR 튜브에 0.2 μM 프라이머, 50 mM KCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8 mM dNTP, 0.5U Extaq DNA 폴리머라제, 3 mM MgCl₂, 및 1ХSYBR 그린을 혼합하여 반응액을 제조하였다. PCR 기계를 이용하여 94℃ 에서 3분 동안 예비적 변성 (primary denaturation) 시킨 후 변성 (denaturation), 어닐링 (annealing), 중합 (polymerization)을 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 사이클을 수행하였고, 매 사이클이 종료된 후 형광강도를 측정하였다. IL-1β, 및 IL-6 유전자의 형광강도를 액틴 (actin) 값으로 표준화하여 대조군을 100% 환산한 뒤 그에 대한 차이를 비교하여 각 유전자 발현량을 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
IL-1β	5'-GTCATTCGCTCCCACATTCT-3'	5'-ACTTCTTGCCCCCTTTGAAT-3'
IL-6	5'-TACCCCCAGGAGAAGATTCC-3'	5'-TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT-3'
Actin	5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'	5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3'

도 1에 나타낸 바와 같이, Poly I:C 처리 시 무처리 구에 비해 염증반응인자인 IL-β1, 및 IL-6 유전자 발현량은 각각 3.5배, 11배 가량 증가하였으며, 실시예 1에 따른 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물 처리 시, IL-1β, 및 IL-6 발현이 현저하게 감소함을 확인하였다. 뿐만 아니라, 이는 일반 효모 배양물을 처리한 비교예 1, 덱사메타손을 처리한 양성대조군과 비교하더라도 IL-1β, 및 IL-6 발현이 유의하게 감소한 것임을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물은 높은 항염 효과를 나타내어, 피부 염증을 효과적으로 개선할 수 있음을 확인하였다.

실험예 2. 상처 재생 효과 확인

항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 화장료 조성물의 상처 재생 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주 (Human dermal fibroblast, Hs68)를 6-웰 플레이트에 4 x 10⁵의 밀도로 접종한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하여 100% 포화된 (confluent) 상태를 만들어 주었다. 이후 세포 스크래퍼 (cell scrapper)를 이용하여 배양된 세포 중심을 긁어 상처를 낸 후, 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 시료 (0.01% (w/w) 용해물)를 첨가하여 12시간 동안 추가로 배양하였다. 대조군으로는 효모 배양물을 처리하지 않은 세포를 사용하였다. 12시간 후, 시료를 포함하는 경우와 포함하지 않은 경우에서 세포에 임의로 낸 상처가 어느 정도 회복되었는지를 2시간 마다 형광현미경으로 촬영하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물 처리 시 비교예 1에 따른 시료를 처리한 세포, 무처리군과 비교하여 손상 부위로의 섬유아세포의 이동이 증가하여 상대적인 상처 밀도 (relative wound density)가 유의하게 증가함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모 용해물은 피부 섬유아세포의 이동을 빠르게 증가시켜 상처 회복에 효과적이고, 피부 재생을 촉진시키는 효과가 있음을 확인하였다.

<110> COSMAX, INC. <120> A cosmetic composition comprising yeast expressing anti-microbial peptide LL-37 <130> PN136147KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-microbial peptide LL-37 <400> 1 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35

Claims

인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서,
상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고,
상기 효모는 효모의 배양액, 파쇄액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물 형태이며,
상기 피부 상태는 피부 상처 또는 피부 염증인 것인, 화장료 조성물.
삭제
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삭제
청구항 1에 있어서, 상기 효모는 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 30 중량%로 포함되는 것인, 화장료 조성물.
삭제
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인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 피부 상태 개선용 의약외품 조성물로서,
상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고,
상기 효모는 효모의 배양액, 파쇄액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물 형태이며,
상기 피부 상태는 피부 상처 또는 피부 염증인 것인, 의약외품 조성물.
삭제
인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 포함하는 항염증용 약학적 조성물로서,
상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고,
상기 효모는 효모의 배양액, 파쇄액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물 형태인 것인, 약학적 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 상처, 여드름, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 및 땀띠로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 개선 또는 치료 용도인 것인, 약학적 조성물.
인간 항균펩타이드 LL-37을 발현하는 효모를 제조하는 단계; 및
상기 제조한 효모를 배양하여 배양액 또는 용해물을 수득하는 단계를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물의 제조방법으로서,
상기 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고,
상기 피부 상태는 피부 상처 또는 피부 염증인 것인, 제조방법.