CN110664995A - 一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物，由活性物质和辅料组成，所述活性物质包括纤连蛋白、溶菌酶、精氨酸/赖氨酸多肽和三肽‑1铜。所述纤连蛋白、溶菌酶、精氨酸/赖氨酸多肽和三肽‑1铜的重量比为0.01~10：0.01~10：0.01~10：0.01~10。本发明的组合物在促进创面愈合平整、控油保水等方面功效显著。本发明的组合物复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。

Description

一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物
技术领域
本发明涉及到生物医药及化妆品领域，具体地说，涉及一种含有重组人纤连蛋白肽 （rhFnp）的组合物。
背景技术
皮肤的主要功能是保护机体免受外界环境中不利因素的影响。一般来说，皮肤屏障又可分为广义和狭义的皮肤屏障。广义的皮肤屏障包括物理屏障、色素屏障、神经屏障、免疫屏障；狭义的皮肤屏障主要指表皮尤其是角质层的物理性屏障作用，它是我们的身体面对外界环境的第一道天然防线。当皮肤受到损伤时，若不能及时愈合，会导致伤口表面出现大量的渗出液，阻碍表皮再生及伤口闭合，从而显著影响康复的进度。
皮肤创伤愈合是皮肤组织受到损伤后的修复过程，修复过程包括炎症反应、细胞增生和新生组织重塑等。特别是在诸如糖尿病溃疡等慢性创面修复过程中，由于细菌形成的生物膜的存在，会发生反复感染，创面长时间难以愈合的现象，如果加大药物剂量，会增加副作用，临床耐药菌的不断产生也增加了治疗的难度。因此研制出一种有效、长期使用后无耐受性、具有良好生物相容性和安全性的产品是该领域的发展方向和趋势。
纤维连接蛋白（简称纤连蛋白，FN）是一种位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质，其主要功能是在细胞纤维基质中发挥结构和粘附性作用。同时，纤连蛋白可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长时间等作用。FN分子中有多个功能结构域，其中的肝素结合域能与多种具肝素亲和力的产品如蛋白、多肽或者其它化合物结合，增强其活性。在此基础上，本发明基于自主研发的重组人纤连蛋白肽（发明专利申请201910949562.3）与精氨酸/赖氨酸多肽复配，产生的协同作用进一步促进了精氨酸/赖氨酸多肽对皮肤成纤维细胞增殖的能力，同时提高了组织修复功能。
创面愈合的第一个时期是炎症期，伤口形成后伤口或组织裂隙内为血凝块所充填，其周围组织发生急性炎症。在炎症过程中，一方面，细菌等有害物质聚集在伤口附近引发感染；另一方面血管通透性的增加，引起的组织水肿和化脓性溶解破坏，延迟伤口愈合。溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还能与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并增强抗生素和其他药物的疗效、改善组织基质的粘多糖代谢，从而有利于修复被炎症损伤的组织。人溶菌酶能激活血小板、改善局部组织循环障碍、增强局部防卫，从而更好地抗菌、消炎、止痛。
慢性创面指各种原因形成的体表创面，即皮肤组织缺损后不能规律有序地进行组织学修复，引起经久不愈创面，比如其他慢性病如糖尿病等。
重组纤连蛋白肽和溶菌酶复配后，一方面rhFnp与精氨酸/赖氨酸肽的协同作用进一步促进了皮肤新陈代谢、修复受损肌肤；另一方面，rhFnp组合物中的溶菌酶与精氨酸/赖氨酸多肽在伤口处可以破坏细菌形成的生物膜，从而抑制细菌进行聚集。复配效果显著优于单独使用。同时，本发明产品使用的纤连蛋白为包含但不限于通过基因重组技术表达得到含有纤连蛋白的发酵产物提取物，有效地解决该蛋白产量低、费用昂贵等难题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有促进创面愈合平整、控油保水功效的含有重组人纤连蛋白的组合物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物，由活性物质和辅料组成，所述活性物质包括纤连蛋白、溶菌酶和精氨酸/赖氨酸多肽。
作为优选的，在上述含有重组人纤连蛋白肽的组合物中，还含有三肽-1铜。
作为优选的，在上述含有重组人纤连蛋白肽的组合物中，所述纤连蛋白、溶菌酶、精氨酸/赖氨酸多肽和三肽-1铜的重量比为0.01~10：0.01~10：0.01~10：0.01~10。
作为优选的，在上述含有重组人纤连蛋白肽的组合物中，所述纤连蛋白为重组人纤连蛋白肽（rhFnp），其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明选择纤连蛋白与溶菌酶、精氨酸/赖氨酸多肽进行复配，三者发挥协同作用；在组合物中添加溶菌酶，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用，可有效抑制炎症的发生，利于伤口的修复。精氨酸/赖氨酸多肽具有抗皱功效。添加三肽-1铜和可以协同组合物其他组分促使皮肤上皮组织再生。所得组合物在促进创面愈合平整、控油保水等方面功效显著。更为优化的方案是截取人纤连蛋白氨基酸序列第12~14区域，得到了分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性的重组人纤连蛋白肽rhFnp，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平。本发明采用重组人纤连蛋白肽rhFnp片段，分子量小，易于吸收发挥作用。本发明的组合物复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。
附图说明
图1为rhFnp组合物对Hacat细胞的促粘附作用。
图2为rhFnp组合物对Balb/c-3T3细胞的促增殖活性。
图3 为rhFnp组合物对Hacat细胞的铺展、迁移及伤口愈合作用。
图4为rhFnp与精氨酸/赖氨酸多肽间相互作用试验。
图5 为rhFnp组合物对细菌（金黄色葡萄球菌）的抑菌作用。
图6为受试者使用含有rhFnp组合物（实施例3）变化；图中的标号A为对比例，B为实验组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明，但是本领域技术人员应该理解本发明并不限于这些具体的实施例。
实施例1：含有纤连蛋白的组合物的制备
一种含纤连蛋白的组合物，各组分质量浓度如表1：
表1
组分 质量浓度比
纤连蛋白 40μg/mL
溶菌酶 35 μg/mL
精氨酸/赖氨酸多肽 5μg/mL
三肽-1 铜 500μg/mL
水 1mL
将上述配方的各个物质按照比例混合均匀，溶胀或溶解于水即得。
实施例2：含有rhFnp的组合物的制备
一种含rhFnp和溶菌酶的组合物，各组分质量浓度如表2：
表2
组分 质量浓度比
rhFnp 40μg/mL
溶菌酶 35 μg/mL
精氨酸/赖氨酸多肽 5μg/mL
三肽-1 铜 500μg/mL
水 1mL
将上述配方的各个物质按照比例混合均匀，溶胀或溶解于水即得。
实施例3：含有rhFnp的组合物的制备
一种含rhFnp和溶菌酶的组合物，各组分质量浓度如表3：
表3
组分 质量浓度比
rhFnp 75μg/mL
溶菌酶 35 μg/mL
精氨酸/赖氨酸多肽 5μg/mL
三肽-1 铜 500μg/mL
水 1mL
将上述配方的各个物质按照比例混合均匀，溶胀或溶解于水即得。
实施例4：含有rhFnp的组合物的制备
一种含rhFnp和溶菌酶的组合物，各组分质量浓度如表4：
表4
组分 质量浓度比
rhFnp 100μg/mL
溶菌酶 35 μg/mL
精氨酸/赖氨酸多肽 5μg/mL
三肽-1 铜 500μg/mL
水 1mL
将上述配方的各个物质按照比例混合均匀，溶胀或溶解于水即得。
对比例1：含有溶菌酶的组合物的制备
一种用于抑菌、消炎的溶菌酶组合物，各组分质量浓度如表5：
表5
组分 质量浓度比
溶菌酶 35 μg/mL
精氨酸/赖氨酸多肽 5μg/mL
三肽-1 铜 500μg/mL
水 1mL
将上述配方的各个物质按照比例混合均匀，溶胀或溶解于水即得。
实施例5：含有rhFnp组合物水凝胶的制备
称取一定量的干燥的壳聚糖（CS）粉末，加入1%~3%的醋酸溶液中配置成1%~2%（w/v）的CS溶液，然后将实施例3中的组合物加入CS溶液中，混匀后加入56%-58%的β-甘油磷酸钠水溶液，搅拌混匀后，37℃水浴孵育一段时间后形成含有rhFnp组合物的水凝胶。
实施例6：含有rhFnp组合物纳米微球的制备
称取一定量的干燥的壳聚糖（CS）粉末，加入1%~3%的醋酸溶液中配置成1%~2%（w/v）的CS溶液，作为水相，4℃保存待用。取一定量的span80和液体石蜡，比例为1:30-35，配置成油相。用磁力搅拌器混匀后，取1mL的水相用5mL的注射器逐滴加入到25mL的油相中，边加边搅拌，搅拌速率700r/min。搅拌2h后，分三次加入1.5mL 25%戊二醛交联剂，继续搅拌4h。静置30min后，去掉上清，用石油醚，异丙醇，乙醇，超纯水洗涤后，冷冻干燥得到壳聚糖微球粉末。取含有rhFnp组合物的溶液，加入20mg壳聚糖微球中，然后摇床震荡，使rhFnp组合物吸附到壳聚糖微球上，之后离心去上清得到含有rhFnp组合物的纳米微球。
实施例7：含有rhFnp组合物纳米微球的制备
称取一定量的干燥的壳聚糖（CS）粉末，加入1%~3%的醋酸溶液中配置成1%~2%（w/v）的CS溶液，然后加入一定量的含有rhFnp组合物的溶液混匀后作为水相，4℃保存待用。取一定量的span80和液体石蜡，比例为1:30-35，配置成油相。用磁力搅拌器混匀后，取1mL的水相用5mL的注射器逐滴加入到25mL的油相中，边加边搅拌，搅拌速率700r/min。搅拌2h后，分三次加入1.5mL 25%戊二醛交联剂，继续搅拌4h。静置30min后，去掉上清，用异丙醇，乙醇，超纯水洗涤后，冷冻干燥得到含有rhFnp组合物的纳米微球。
实施例8：含有rhFnp组合物的脂质体的制备
称取一定量的卵磷脂和胆固醇，按照3~5:1的比例混合，然后加入乙醇，混匀后加入旋转蒸发仪。待乙醇挥发完后，用含有rhFnp组合物的溶液水合静置过夜，然后使用均质机均质，0.22μm滤膜过滤得到含有rhFnp组合物的纳米脂质体。
实施例9： rhFnp组合物细胞粘附活性测定
将Hacat细胞用含10％FBS的DMEM培养，37℃，CO 2 浓度5％；首先用 PBS清洗一次，然后添加0.25％的胰酶液进行消化，离心收集细胞；用 DMEM进行重悬，细胞密度控制在6.2×104个/mL，将细胞悬液分别接种到底层铺有rhFnp蛋白、实施例2、实施例3和实施例4的培养皿中，细胞密度控制在1.5×104个/mL。37℃培养5h，维持CO 2 浓度为 5％；用PBS冲洗掉没有贴壁的细胞；在相差显微镜下计数以及用MTT法比较各组细胞数。结果见图1，结果显示：在考察的浓度范围以内中间浓度rhFnp组合物给药组及阳性对照组细胞数高于control组及rhFnp，其中实施例3的rhFnp组合物的细胞数最高。结果表明rhFnp组合物具有促进细胞粘附贴壁的活性。
实施例10：rhFnp组合物增殖活性测定
将处于对数生长期的Balb/c-3T3 细胞用含10％FBS的1640培养基(购自美国Gibco公司)常规培养至 80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化，以2.0×105个/mL的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换含0.4%血清的1640培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入rhFnp、实施例2、实施例3和实施例4的rhFnp组合物(所有样品均用PBS稀释至0.5mg/mL)，每个组别设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养48h，加入20μL MTT(0.5mg/mL)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入100μL DMSO，振荡后于570 nm/630nm波长下检测吸光度OD值。该实验可以检测rhFnp组合物对Balb/c-3T3细胞的促增殖活性，结果见图2，结果显示，在考察的范围内，rhFnp组合物给药组细胞增殖速率高于rhFnp，表明rhFnp组合物具有促进Balb/c-3T3细胞增殖的活性。
实施例11：rhFnp组合物划痕实验
将处于对数生长期的Balb/c-3T3 细胞用含10％FBS的1640培养基(购自美国Gibco公司)常规培养至 80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜（数量少时可培养一段时间至铺满板底，确保细胞达到100%融合的密度）。细胞长满板底后，用100μl枪头垂直于孔板，沿板背面划线的相同位置制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。分别加入含rhFnp蛋白、实施例2、实施例3及实施例4的含1%血清的培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱培养24h取出拍照。
实施例12：rhFnp与精氨酸/赖氨酸多肽相互作用试验
将处于对数生长期的Balb/c-3T3 细胞用含10％FBS的1640培养基(购自美国Gibco公司)常规培养至 80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化，以2.0×105个/mL的细胞数目接种于96孔板，培养24h后，换含0.4%血清的1640培养基培养，24h后将培养基吸出后分别加入含精氨酸/赖氨酸多肽、rhFnp、rhFnp与精氨酸/赖氨酸多肽质量浓度比2:1、1:1、1:2的1640培养基培养，每个浓度设3个复孔，空白组为六个复孔。给药后放入培养箱继续培养48h，加入20μL MTT(0.5mg/mL)，培养箱中孵育4h后，吸出孔中溶液并加入100μL DMSO，振荡后于570 nm/630nm波长下检测吸光度OD值。该实验可以检测rhFnp组合物对Balb/c-3T3细胞的促增殖活性，结果见图4，结果显示，在考察的范围内，rhFnp与精氨酸/赖氨酸多肽质量浓度比为1:1时，细胞增殖速率高于单独精氨酸/赖氨酸多肽，表明rhFnp与精氨酸/赖氨酸多肽相互作用促进Balb/c-3T3细胞增殖的活性。
实施例13：rhFnp组合物（实施例3）对金黄色葡萄球菌的抑菌实验
将金黄色葡萄球菌（购自广东省微生物菌种保藏中心）在37℃厌氧发生罐中进行厌氧培养48h（肉汤培养基，购自广州威佳生物有限公司），用无菌生理盐水稀释至1x106CFΜ/ml。用肉汤培养基将实施例3 rhFnp组合物配成不同浓度的培养液，取菌液0.1ml到体积为1mL的不同浓度的无菌实施例3 rhFnp组合物的试管中。置厌氧罐中37℃培养48h，用氧气指示剂来指示厌氧罐内氧气含量（当氧气浓度大于0.5%时，氧气指示剂由紫色或***变成蓝色）。观察有无浑浊，以不出现浑浊的最低浓度为观察最小抑菌浓度（MIC）。
结果见图5。图4中1～6分别为空白对照（不含金黄色葡萄球菌）、对比例1、阴性对照（不含rhFnp组合物），总蛋白质量浓度为500、250、125μg/ml的实施例3 rhFnp组合物。结果显示250μg/ml的试管培养基出现浑浊，表明实施例3制得的rhFnp组合物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（MIC）为500μg/ml。
实施例14：rhFnp组合物（实施例3）修复皮肤损伤试验
受试者有效人数为18例；18~45岁；受试者手臂无瑕疵；受试部位近三个月没有参与皮肤治疗，美容或是其它皮肤测试；近半年没有进行化学剥脱或激光治疗，并签署知情同意书。
选择受试者一侧无瑕疵的前臂，用电动微针进行微创（深度2.0mm），在固定位置点50下，每次停留1秒，稍稍向下用力，以均匀发红微微渗血为度，尽量令所有点的损伤一致。
组合物的使用：
A：微针后不作处理，
B：微针后涂抹实施例3的组合物（每天4次）；
B在术后6天内相应时间点（8点、12点、16点、21点）涂抹对应的溶液，隔天CK检测。
正式测试在符合标准的房间内(温度：20℃～22℃，湿度：40%～60%）静坐30min，不能喝水和饮料。
使用CK皮肤测试仪对受试者使用前后的经皮水份流失率进行检测（TEWL），检测结果如表6，以及对微针处的红色素进行检测，检测结果如表7。
表6
时间点 A B
D1 24.93±6.95 25.5±9.38
D3 13.18±3.94**** 10.88±2.31****
D6 12.35±3.89**** 10.72±3.80****
D1<i>VS. </i>D3百分比 -47.13% -57.33%
D1<i>VS. </i>D6百分比 -50.48% -57.97%
差值D3-D1 -11.75 -14.62
差值D6-D1 -12.58 -14.78
VS.D1 ***P<0.001, ****P<0.0001
VS. A # P<0.05, ## P<0.01
表7
时间点 A B
D1 398.61±74.74 368.31±71.16
D3 342.17±64.67* 300.69±58.53**
D6 288.09±47.31**** 259.74±51.91****
D1<i>VS</i>D3百分比 -14.16% -18.36%
D1<i>VS</i>D6百分比 -27.73% -29.48%
差值D3-D1 -56.44 -67.62
差值D6-D1 -110.52 -108.57
VS.D1 ***P<0.001, ****P<0.0001
VS. A # P<0.05, ## P<0.01
如图6所示，可见对比例和使用实施例3的组合物，受试者的微针后TEWL值下降，实验组在Day 3时，TEWL下降明显，证明实施例3能保湿锁水；实验组使用实施例3组合物6d后红色素下降十分明显。
序列表
<110> 广州市暨达生物科技有限公司；广州暨南大学医药生物技术研究开发中心
<120> 一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Gly Thr His Met His His His His His His Pro Ala Pro Thr Asp Leu
1 5 10 15
Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro
20 25 30
Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu
35 40 45
Lys Thr Gly Pro Met Phe Val Ala Gln Cys His Pro Phe Ser Cys Ala
50 55 60
Arg Lys Phe His Gly Leu Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Val Ser Val
65 70 75 80
Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val
85 90 95
Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp
100 105 110
Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
115 120 125
Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro
130 135 140
Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly
145 150 155 160
Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Thr Val Gly Met Gln Trp Leu Asn Asp
165 170 175
Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp
180 185 190
Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu
195 200 205
Arg Tyr His Gln Arg Thr Asn Thr Asn Val Met Pro Trp Phe Val Pro
210 215 220
Val Thr Glu Gly Ala Glu Ala Leu Thr Ala Arg Val Asn Leu Asn Leu
225 230 235 240
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu
245 250 255
Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro
260 265 270
Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr Lys Leu
275 280

Claims (4)

1.一种含有重组人纤连蛋白肽的组合物，其特征在于由活性物质和辅料组成，所述活性物质包括纤连蛋白、溶菌酶和精氨酸/赖氨酸多肽。
2.如权利要求1所述的含有重组人纤连蛋白肽的组合物，其特征在于，还含有三肽-1铜。
3.如权利要求2所述的含有重组人纤连蛋白肽的组合物，其特征在于，所述纤连蛋白、溶菌酶、精氨酸/赖氨酸多肽和三肽-1铜的重量比为0.01~10：0.01~10：0.01~10：0.01~10。
4.如权利要求1所述的含有重组人纤连蛋白肽的组合物，其特征在于，所述纤连蛋白为重组人纤连蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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