CN1735683A

CN1735683A - 在酵母中生产d－乳酸的方法与材料

Info

Publication number: CN1735683A
Application number: CNA038172941A
Authority: CN
Inventors: V·赖格里亚; C·A·敦东; S·奥尔松; P·索米宁; B·豪斯
Original assignee: Cargill Dow LLC
Current assignee: NatureWorks LLC
Priority date: 2002-05-30
Filing date: 2003-05-30
Publication date: 2006-02-15
Anticipated expiration: 2023-05-30
Also published as: CN1735691B; EP1513923A2; ZA200409530B; AU2003243366B2; US8828707B2; CA2488196A1; ES2642928T3; EP2878675A1; DE60315028T2; JP4318638B2; US20040043444A1; ES2290466T3; EP2878675B1; US20030228671A1; WO2003102152A3; EP1513939B1; ZA200409529B; JP2005528111A; US7939298B2; UA88437C2

Abstract

本发明涉及生物催化剂，它们是细胞，最好是Crabtree阴性表型的细胞，含有编码对该细胞而言异源的基因之表达载体，能够提高有机产物的产量。更具体而言，本发明涉及遗传修饰的克鲁维酵母细胞，制备该克鲁维酵母细胞的方法，以及它们在生产有机产物，特别是D－乳酸中的用途。

Description

在酵母中生产D-乳酸的方法与材料

本申请要求对2002年5月30提交的美国临时专利申请系列号60/384,333的优先权。

本发明得到了政府的支持，合同号为DE-FC36-00GO10598，由能源部资助。政府在本发明中有一定的权利。

发明背景

乳酸是一种有机分子，能够通过化学合成或者在微生物中通过发酵方法生产(生物合成)。在生产有机产物方面，生物合成法可能优于化学合成法的优点包括更高效的产物产率、更快的产生、同质纯度和更低的成本。

D(或R-)乳酸是生产生物活性物质(包括除草剂和药物)中的构件。然而，降低D-乳酸成本的新方法使其能够进入并且广泛应用于更大的化学市场中，包括，例如塑料。D-乳酸能够被转化为D-丙交酯(D-乳酸的环状缩合物)，具有许多可能的用途，包括胶片、纤维和其它聚合物的生产等用途。D-丙交酯能够被聚合为聚(D-丙交酯)(D-PLA)，即特性类似于聚(L-丙交酯)(L-PLA)的一种聚合物，它可用于多种聚合物用途。目前Cargill Dow生产的高度结晶的PLA主要含有L-立体异构体。这种高L-异构体树脂最常用于PLA纤维市场，因为它能够提高纤维的韧性，抗皱，并且当对它施加高应力时，将它的使用温度提高到L-PLA玻璃转化温度之上。一种类似的富含D-异构体的聚合物预计具有类似的特性。此外，一种高D-异构体聚合物能够与一种高L-异构体聚合物混合，形成一种立体复合物，其具有明显较高的熔解温度(可达约230℃)。这种较高的熔解温度可使PLA用于需要更好的耐热性的用途。这种用途的一个例子是某些服装用途，其中生产可熨织物需要提高熔解温度。

D-乳酸也是在除草剂和制药用途中使用的一种有用的工业化学中间体。例如，D-乳酸是生产苯氧基丙酸和芳氧基苯氧基丙酸除草剂中的一种中间体。

已知的生产乳酸的生物合成方法具有某些限制。例如，天然产乳酸生物，如乳杆菌，在发酵条件下能够产生大量的L-乳酸。然而，这些生物需要复杂的发酵培养基才能高效生产。发酵培养基的复杂性提高了原材料的成本，并且使得从培养基中分离乳酸更加困难且昂贵。此外，使用这些生物的发酵方法易于被其它非产乳酸种感染。还没有经济的方法用来选择性清除不希望的菌株。

当使用这些生物时，必须保持发酵培养液的pH，因为细菌本身内和培养液中的低pH环境能够抑制细菌增殖或者致使细胞死亡。实现方法是向发酵培养液中添加中和剂(如碳酸钙)以形成乳酸钙。为了回收乳酸，必须用强酸(如硫酸)处理乳酸钙，这种强酸与乳酸钙反应，形成乳酸和石膏(硫酸钙)。因此，这些生物在低pH下无功能造成原材料和处理不希望的副产物(石膏)的额外费用。

在日本专利申请公开号2002-136293A中公开了一种遗传工程酵母，据称它可产生D-乳酸。该酵母宿主是一个特殊的类型，它能够“积累”丙酮酸(根)，即产生不被进一步代谢的大量丙酮酸(根)。

因此，本领域仍然需要用一种生物生产D-乳酸的生物合成方法，该方法：1)允许以高产量和生产率生产D-乳酸；2)优选地只需要简化的发酵培养基；3)优选地可以使用低pH和/或高温发酵培养基，它能够清除不希望的微生物菌株的污染。

发明概述

一方面，本发明提供来自一个不能自然积累丙酮酸(根)的种的重组酵母细胞，它含有整合到其基因组内的至少一个外源D-乳酸脱氢酶基因，其中该D-乳酸脱氢酶基因与功能启动子和终止子序列有效连接。

本发明也提供编码与功能启动子和终止子序列有效连接的D-乳酸脱氢酶基因的重组核酸。本发明的重组核酸允许D-乳酸脱氢酶基因在重组酵母细胞中表达。

另一方面，本发明提供一种生产D-乳酸的方法，包括在用于D-乳酸生物合成的条件下发酵本发明的细胞。

转化的酵母细胞能够以商业上显著的产量产生D-乳酸。当发酵培养液含有显著浓度的D-乳酸时，这些细胞能够良好地耐受D-乳酸的存在，并且能够继续高效地生产。这种效应是出人意料的，因为L-乳酸和D-乳酸都倾向于抑制某些微生物的生长和存活(参见Lett.Appl.Microbiol.2002；35(3)：176-80；大肠杆菌O157和非O157分离株对乳酸盐的敏感性。McWilliam Leitch EC，Stewart CS.Appl.Environ.Microbiol.2002年9月；68(9)：4676-8)。在某些情况下，真核和细菌细胞显示对D-乳酸与对L-乳酸的反应不同(参见Uribarri J，Oh MS，CarrollHJ，Medicine(Baltimore)1998年3月；77(2)：73-82，“D-乳酸性酸中毒：临床表现、生物化学特征和病理生理机制综述”；参见Leitch等人，同上)。

根据以下某些优选实施方案的更详细描述和权利要求书，本发明的具体优选实施方案将易于理解。

附图简述

图1是pNC2的质粒图谱，它包含PGK启动子和GAL10终止子，均来源于酿酒酵母。

图2是pNC4的质粒图谱，它包含PDC1启动子和GAL10终止子，均来源于酿酒酵母。

图3a是一条1.235kb序列的NotI限制性酶切片段的图谱，该序列来源于PCR扩增的酿酒酵母染色体DNA，其中包含PGK启动子和GAL10终止子(酿酒酵母)，和位于启动子与终止子之间的一个多克隆位点。

图3b是一条1.235kb序列的NotI限制酶切片段的图谱，该序列来源于PCR扩增的酿酒酵母染色体DNA，其中包含PDC1启动子和GAL10终止子(酿酒酵母)，和位于启动子与终止子之间的一个多克隆位点。

图4是pVR24的质粒图谱，它包含与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)L-LDH。

图5是pVR22的质粒图谱，它包含与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性标记。

图6是pNC7的质粒图谱，它包含与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的来自巨大芽孢杆菌的LDH基因。

图7A-B是：A)pSO21的质粒图谱，它包含来源于马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)的PDC1；和B)pSO27的质粒图谱，它包含PDC1(马克斯克鲁维酵母)的一条3.3kb片段，其含有PDC1基因座的5′上游区；图8是pSO28的质粒图谱，它在pSO21所含PDC1编码区中有一个缺失，并且含有与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性基因。

图9是pSO29的质粒图谱，它在pSO21所含PDC1编码区中有一个缺失，并且含有与来源于酿酒酵母的TEF1启动子和Tcyc1终止子功能连接的zeocin抗性基因(来自于pTEF1/Zeo；Invitrogen)。

图10是pPS1的质粒图谱，它包含与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的来源于大肠杆菌的潮霉素抗性基因(hph)。

图11a是pVR43的质粒图谱，其含有来源于瑞士乳杆菌(L.helveticus)的D-LDH基因。

图11b是pVR44的质粒图谱，其含有来源于瑞士乳杆菌的D-LDH基因，在该基因的5’和3’端分别含有XbaI和BamHI位点。

图12是pVR47的质粒图谱，其含有与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的来源于瑞士乳杆菌的D-LDH基因。

图13是pVR48的质粒图谱，其含有与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的来源于瑞士乳杆菌的D-LDH基因，以及与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的hph抗性基因。

图14是pCA50的质粒图谱，其包含插PDC1基因座(马克斯克鲁维酵母)的3’与5’侧翼区之间的一个表达盒，含有与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的来源于瑞士乳杆菌的D-LDH基因，以及与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的hph抗性基因。

图15是pVR29的质粒图谱，其含有与来源于酿酒酵母的PGK启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性标记。

图16a是pBH5a的质粒图谱，其包含PDC1基因座(马克斯克鲁维酵母)的5’侧翼区，以及单独的，与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性基因。

图16b是pBH5b的质粒图谱，其包含PDC1基因座(马克斯克鲁维酵母)的5’和3′侧翼区，以及单独的，与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性基因。

图16c是pBH5c的质粒图谱，其包含来源于马克斯克鲁维酵母的PDC1基因座。

图17是pBH6的质粒图谱，其包含位于PDC1基因座(马克斯克鲁维酵母)的5’与3′侧翼区之间的来源于瑞士乳杆菌的D-LDH基因，以及单独的，与来源于酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接的G418抗性基因。

发明详述

本发明提供的酵母细胞来源于一个种，在如此处所述重组之前，它不能积累丙酮酸(根)。“不积累”丙酮酸(根)是指当该种根据日本专利申请公开号2000-78996的实施方案5所述的方法培养时，不产生至少10g/L的丙酮酸。当一种酵母细胞天然含有可将丙酮酸(根)代谢为不同代谢产物(如乙醇或乙酸盐或生物质)的活性代谢途径时，通常不积累丙酮酸(根)。这些酵母细胞足够快地代谢丙酮酸(根)，以致在任一时间细胞内只存在极少的丙酮酸(根)，并且细胞只分泌极少的丙酮酸(根)。优选的酵母细胞天然含有一种或多种活性丙酮酸脱羧酶(PDC)基因，该基因产生丙酮酸脱羧酶蛋白质，它将丙酮酸转化为乙醇。更加优选的酵母细胞是显示Crabtree阴性表型的酵母细胞，其中细胞的需氧代谢途径(呼吸和TCA循环)不被高浓度葡萄糖的存在所抑制。合适的酵母细胞的例子包括来源于下列属的酵母细胞：假丝酵母属(Candida)、酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉森酵母属(Hansenula)。来自假丝酵母属和克鲁维酵母属的细胞是特别优选的。特别优选的细胞是C.sonorensis、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)、耐热克鲁维酵母(K.theromotolerans)和马克斯克鲁维酵母。最优选的细胞是C.sonorensis和马克斯克鲁维酵母。

本发明的重组酵母细胞含有至少一种整合到其基因组内的外源D-LDH基因。瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是含有适当D-乳酸脱氢酶的菌株，它们尤其能够通过此处使用的重组遗传技术获得。一种优选的D-乳酸脱氢酶基因是瑞士乳杆菌D-乳酸脱氢酶。该细胞可能含有多种外源LDH基因，即至少两种这样的基因，优选地约2-10种这样的基因，更优选地2-5种这样的基因。***的LDH基因可以都是同一种基因，或者可以由两种或两种以上的不同类型的LDH基因组成。

对于本发明，如果一种基因、启动子或终止子(1)未在未修饰细胞的基因组内发现，并且(2)与未修饰细胞的基因组内存在的遗传物质不同源，则认为它们是“外源的”。如此处所用的基因、终止子或启动子如果在该酵母种的未修饰细胞的基因组内发现(除了不影响其功能的个体-个体突变之外)，则它们对于该酵母种是“天然的”。

外源D-LDH基因与功能启动子和终止子序列有效连接。“有效连接”在本发明内是指启动子或终止子在整合到酵母基因组内后，视情况而定，可以分别控制D-LDH基因转录的启动和终止。

如此处所用的术语“启动子”是指一种非转录的序列，其位于结构基因的翻译起始密码子的上游(即5′)(通常在约1-1000bp以内，优选地在1-500bp以内，特别是1-100bp以内)，控制结构基因的转录起始。启动子对于宿主细胞可以是天然的或是是外源的。启动子可以是控制参与中心碳代谢的基因表达的启动子，例如糖酵解启动子或TCA循环基因启动子。合适的启动子包括来自下列酵母基因的非限制性实例：磷酸甘油酸激酶(PGK)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH)、丙酮酸脱羧酶(PDC1)、磷酸丙糖异构酶(TPX)、转录增强因子-1(TEF-1)、嘌呤-胞嘧啶通透酶(PCPL3)和醇脱氢酶(ADH)。本发明优选的启动子包括TEF-1(酿酒酵母)、PGK(酿酒酵母)和PDC1(酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母)启动子。

在希望将D-LDH基因整合到酵母细胞基因组的靶向基因座处的实施方案中，启动子序列与靶向***的基因的启动子序列同源。靶向基因优选地是丙酮酸脱羧酶(PDC)基因。其它合适的靶基因包括醇脱氢酶(ADH)、乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶(ura3)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)。

类似地，术语“终止子”是指一种非转录序列，它位于结构基因的翻译终止密码子的下游(即3′)(通常在约1-1000bp以内，更一般地在1-500个碱基对以内，特别是在1-100个碱基对以内)，控制该结构基因的转录的终止。对于酵母种而言，终止子可以是外源的或天然的。合适的外源终止子包括来源于酿酒酵母或其它酵母种的GAL10和CYC-1终止子。

对于启动子，在某些实施方案中，终止子序列与靶向基因的终止子序列同源。

一种基因、启动子、终止子或其它基因组物质，如果在核苷酸序列上与其它遗传物质相同，即具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或约99％的同一性，或者如果不同，而是与之足够相似从而保持其功能，则认为该基因、启动子、终止子或其它基因组物质与其它遗传物质“同源”。因此，甚至如果遗传物质例如由于点突变、碱基对的缺失或添加而含有不同，只要这些突变、缺失或添加不影响该遗传物质的功能，则认为它们是“同源的”。对于侧翼序列，如果该序列与天然基因的侧翼序列足够相似，以致侧翼序列均能够参与与天然基因侧翼序列的单交换事件，则同源性确定。

如本领域所知的术语“同一性”是指两种或多种多肽分子或两种或多种核酸分子的序列之间的关系，通过比较它们的序列确定。在本领域中，“同一性”也指核酸分子或多肽之间的序列相关性(relatedness)程度，视情况不同，根据两种或多种核苷酸串或两种或多种氨基酸序列之间的匹配确定。“同一性”决定两种或多种序列中的较小序列与通过具体数学模型或计算机程序(即“算法”)进行的缺口比对(如果有的话)之间相同匹配的百分比。

术语“相似性”在本领域中用于一种有关的概念，但是与“同一性”不同，“相似性”是指相关性的量度，包括相同的匹配和保守性置换匹配。如果两种多肽序列例如有10/20相同的氨基酸，并且其余的都是非保守置换，则百分同一性和相似性都是50％。如果在同一实施例中，有5个以上的位点是保守置换，则百分同一性仍为50％，但是百分相似性将是75％(15/20)。因此，在保守置换的情况下，两种多肽之间的百分相似性将高于这两种多肽之间的百分同一性。

相关核酸和多肽的同一性和相似性能够用已知的方法容易地计算。这些方法包括但不限于以下所述：《计算分子生物学》(Lesk，A.M.编著)，1988，Oxford University Press，New York；《生物计算：信息学和基因组计划》(Smith，D.W.编著)，1993，Academic Press，New York；《序列数据的计算机分析》，第1部分(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著)，1994，Humana Press，New Jersey；von Heinje，G.，《分子生物学中的序列分析》，1987，Academic Press；《序列分析引物》(Gribskov，M.和Devereux，J.编著)，1991，M.Stockton Press，New York；Carillo等人，1988，SIAMJ.Applied Math.，48：1073；Durbin等人，1998，《生物序列分析》，Cambridge University Press。

确定同一性的优选方法用来获得所测序列之间的最大匹配。确定同一性的方法在可以公开获得的计算机程序中描述。测定两种序列之间同一性的优选计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包，包括GAP(Devereux等人，1984，Nucl.Acid.Res.，12：387；遗传学计算机小组(Genetics Computer Group)，University of Wisconsin，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.，215：403-410)。BLASTX程序可以从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST手册，Altschul等人.NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等人，1990，同上)公开获得。也可以利用众所周知的Smith Waterman算法确定同一性。

用于比对两种氨基酸或多核苷酸序列的某些算法可以使两种序列只有一个短区匹配，这个小比对区可能具有极高的序列同一性，尽管这两个全长序列之间没有明显的关系。因此，在某些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)将使比对覆盖靶多肽的至少50个连续氨基酸。在某些实施方案中，这种比对能够包含靶多肽的至少60、70、80、90、100、110或120个氨基酸。如果利用GAP比对多核苷酸，则这种比对能够覆盖至少约100、150或200个核苷酸，它们可以是连续的。

例如，利用计算机算法GAP(遗传学计算机小组，University ofWisconsin，Madison，WI)，比对将要测定百分序列同一性的两种多肽的各自氨基酸的最佳匹配(“匹配范围”，取决于算法)。在某些实施方案中，开放空位罚分(计算为平均对角线的三倍；其中“平均对角线”是使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过具体比对矩阵归属每个完美氨基酸匹配的得分或数字)和延伸空位罚分(通常为开放空位罚分的十分之一)，以及比较矩阵，如PAM250或BLOSUM 62，与该算法一起使用。在某些实施方案中，该算法也使用一种标准比较矩阵(关于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等人，1978，Atlas of Protein Sequence andStructure，5：345-352；关于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci USA，89：10915-10919)。

在某些实施方案中，一种多肽序列比较的参数包括下列参数：

算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.，48：443-453；

比较矩阵：BLOSUM 62，来自Henikoff等人，1992，同上；

空位罚分：12

空位长度罚分：4

相似性阈值：0

GAP程序可以使用上述参数。对于核苷酸序列，参数可能包括50的空位罚分和3的空位长度罚分，每个空位中每个符号的罚分为3。在某些实施方案中，上述参数是利用GAP算法进行多肽比较(每个空位无罚分)的缺省参数。

酵母细胞的天然基因组可能含有多种其它的修饰。例如，酵母细胞可能含有多种选择性标记基因，如下所述，以及相关的启动子和/或终止子序列。酵母细胞还可进一步含有缺失的PDC基因或PDC基因的破坏。删除PDC以及在PDC基因的基因座处***D-LDH基因的一种方法在下文更详细地描述。下列文献中描述了删除或破坏PDC活性的其它一些方法：Porro，“用于生产乳酸的代谢工程酿酒酵母细胞的研发”，Biotechnol.Prog.1995 May-Jun；11(3)：294-8；Porro等人，“为了由工程酵母大规模生产乳酸，一种代谢途径的替换”，App.Environ.Microbiol.1999 Sep：65(9)：4211-5；Bianchi等人，“用异源LDH基因转化的丙酮酸利用缺陷的乳酸克鲁维酵母株的高效同型乳酸发酵”，App.Environ.Microbiol.2001 Dec；67(12)5621-5和WO 99/14335。

通过***含有与启动子序列有效连接的D-LDH基因的核酸片段，能够制备本发明的重组酵母细胞。该片段一般形成重组核酸的一部分，它能够且优选地也含有其它元件，包括(a)终止子序列；(b)一个或多个选择性标记基因(包括有关的启动子和终止子)；(c)一个或多个同源侧翼序列，用于将该片段***宿主细胞基因组中一个具体基因座处；(d)一个或多个限制性酶切位点，使其能够被酶切，形成含有LDH基因、其启动子和侧翼序列、标记基因和有关启动子和终止子等的线性片段，用于***酵母细胞基因组内；和/或(e)骨架部分。术语“重组核酸”在此是指用来向宿主细胞内转移蛋白质编码信息的任何分子(例如核酸、质粒或病毒)。转化细胞的方法在本领域公知，可包括如电穿孔、基于氯化钙或乙酸锂的方法等非限制性实例。转化中使用的DNA能够用具体限制性内切酶酶切或者不酶切。

如此处所用的术语“选择性标记基因”是指编码一种蛋白质的遗传物质，该蛋白质是在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和/或生长所必需的。典型的选择性标记基因编码的蛋白质(a)为宿主细胞提供对抗生素或其它毒素如zeocin的抗性(来自印度斯坦链异壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)的shble基因)、G418(Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(来自大肠杆菌的氨基糖甙类抗生素抗性基因)、氨苄青霉素、四环素或卡那霉素；(b)补充细胞的营养缺陷和/或提供无法从简单培养基中获得的重要养分，如亮氨酸缺陷(马克斯克鲁维酵母Leu2基因)；或马克斯克鲁维酵母ura3基因，它为核苷乳清酸-5′-磷酸脱羧酶阴性细胞提供尿嘧啶。优选的选择性标记包括Zeocin抗性基因、G418抗性基因和潮霉素抗性基因等非限制性实例。

骨架部分从可以作为商品获得的酵母载体中方便地获得。

转化酵母细胞以***一个外源LDH基因的适当方法在WO00/71738A1和WO 02/42471A1中描述。此处所述的方法通常适用于制备本发明的重组酵母细胞，其中如此处所述用D-LDH基因置换L-LDH基因。

如此处所用的术语“转化”是指细胞遗传特征的一种变化，当一种细胞被修饰而含有新的核酸时，该细胞被转化。因此，当一种细胞由其天然状态遗传修饰时，它被转化。例如，在转染后，转化DNA优选地通过物理整合到细胞染色体内与细胞基因组DNA重组。此外，至少是瞬时地(即在细胞转化48-96小时内)，核酸能够作为一种附加体元件短暂保持，而不复制，或者可以作为质粒独立地复制。当DNA整合到染色体内并且随着细胞***复制时，则认为该细胞已经被稳定地转化。

术语“转染”用来指细胞摄取外来或外源DNA，当外源DNA被导入细胞膜内时，该细胞被“转染”。本领域公知大量转染技术。参见，例如：Graham等人，1973，Virology 52：456；Sambrook等人，2001，《分子克隆，实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratories；Davis等人，1986，《分子生物学基本方法》，Elsevier；Chu等人，1981，Gene 13：197。这些技术能够用来将一种或多种外源DNA种导入适当的宿主细胞内。

多种D-LDH基因能够通过多次转化整合。然而，能够构建含有多个D-LDH基因的一种重组核酸，从而使得多个LDH基因能够一步***。

特别重要的一种转化方法将D-LDH基因的***定向于一种天然存在的靶基因的基因座处。靶基因是希望用LDH基因替换的任何基因。一种优选的靶基因是丙酮酸脱羧酶基因，因为替换该基因可破坏产生乙醇的一个竞争性途径。另外，丙酮酸基因在酵母种中倾向于具有活性，因此在PDC启动子和终止子控制下向基因组内***LDH基因有助于产生一种良好地表达LDH的突变体。其它优选的靶基因有ADH、Leu2和Ura3。

优选地，本发明的酵母细胞用本发明的重组核酸转化，并且通过在选择性培养基中生长筛选，其中重组核酸中的选择性标记允许转化子优先生长。转化的细胞优选地在筛选后在非选择性条件下生长。在这些条件下，获得含有外源D-LDH基因的重组酵母细胞，该基因中含有整合到酵母染色体靶基因的基因座内的重组核酸。如根据本发明的方法获得的，这些细胞已经删除了靶基因，并且向靶基因的基因座内***整合的外源D-LDH基因，使其与靶基因的表达控制序列(如启动子和终止子序列)有效连接，并且处于后者的转录控制下。当靶基因是PDC基因时，发生PDC删除的细胞在厌氧条件下不能良好地生长。因此，通过将其暴露于厌氧条件能够筛选鉴定并选择的细胞的菌落。不能生长的菌落被鉴定为发生PDC删除的菌落。类似地，根据与每种靶基因缺失有关的表型能够鉴定向其它任何靶基因内的定向整合。

产生的酵母细胞丢失了靶基因，含有整合到酵母细胞基因组内靶基因基因座处的外源D-LDH基因。LDH基因处于与靶基因的启动子和终止子序列同源的启动子序列和终止子序列的转录控制下。

D-LDH启动子和终止子序列可以是在用来转化细胞的重组核酸所含侧翼序列中存在的序列，或者可以是最初存在于细胞基因组整合位点处的序列。靶基因终止子保留而整合载体中存在的终止子序列缺失也是可能的。

侧翼序列可以与D-LDH基因直接相邻，或者与该基因分开一段适中的碱基对序列，如1-1000个，优选地1-100个碱基对。本发明的重组核酸中使用的侧翼序列优选地与靶基因的相应侧翼序列同源。侧翼序列长度一般为约50-约4000个碱基对，优选地约100-约2000个碱基对，特别是可达约1200个碱基对。侧翼序列优选地含有一个与靶基因同源的启动子(对于下游侧翼序列为终止子)序列。在优选实施方案中，对于天然酵母，侧翼序列分别与启动子和终止子序列同源或者包含后者。最优选地，重组核酸向酵母基因组染色体DNA中靶基因的基因座内的整合使得它们编码的外源D-LDH基因处于包含该侧翼序列的天然基因表达调节序列的转录控制之下。

合适的侧翼序列能够如下获得：鉴定酵母细胞基因组中的预期整合位点，克隆位于该位点侧翼的序列(使用任何一种适当的方法)，将该序列连接到重组核酸中希望的位点内。

该重组核酸优选地还含有一个或多个选择性标记基因，更优选地在其自身启动子和终止子序列的转录控制之下。在这个实施方案中，标记基因的启动子和终止子序列优选地不是靶基因的启动子和终止子序列。选择性标记基因及其各自的启动子和终止子优选地不打断重组核酸的上游侧翼序列-LDH基因-下游侧翼序列的序列。选择性标记基因及其各自的启动子和终止子优选地位于重组核酸上上游侧翼序列的上游(5’)。

靶基因是希望用LDH基因替换的任何一种基因。一种优选的靶基因是丙酮酸脱羧酶基因，因为替换该基因可以破坏产生乙醇的一种竞争性途径。另外，丙酮酸基因倾向于在酵母种中具有活性，因此在PDC启动子和终止子控制下向基因组内***LDH基因有助于产生一种良好表达LDH的突变体。其它优选的靶基因包括乙醇脱氢酶(ADH)、核苷乳清酸-5′-磷酸脱羧酶(ura3)和3-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)。

产生的酵母细胞丢失了靶基因，含有整合到酵母细胞基因组内靶基因的基因座处的一个外源D-LDH基因。该D-LDH基因处于分别与靶基因的启动子和终止子序列同源的启动子序列和终止子序列的转录控制下。

在该实施方案中，LDH启动子和终止子序列可以是在用来转化细胞的重组核酸中存在的序列，或者可以是最初存在于细胞基因组内整合位点处的序列。在第一次交换事件后，***的D-LDH基因与整合载体中存在的启动子和终止子序列有效连接。在第二次交换事件后，这些启动子和终止子序列之一或两者可以用天然PDC启动子和/或终止子替换。例如，天然PDC启动子可以保留，而整合载体提供的启动子序列缺失。天然PDC终止子保留而整合载体中存在的终止子序列缺失也是可能的。

转化的本发明的酵母细胞可以用来通过发酵过程由糖生产D-乳酸。该细胞优选地不含功能L-LDH基因，或者如果它含有一种功能L-LDH基因，则其活性使得该细胞产生的乳酸至少90％、优选地至少95％、更优选地至少99.0％、更优选地至少99.5％为D-异构体。

发酵能够用任何适当的发酵方法进行。一般为细胞提供一种能够代谢为丙酮酸(根)的碳水化合物，并且暴露于可发生发酵的条件下。发酵培养基也含有提高细胞生存力的养分(如氮、磷、硫、痕量无机物等的来源)。

能够使用的具体碳水化合物取决于具体的宿主细胞，以及该宿主细胞是否工程改造为能够将任何一种具体碳水化合物代谢为丙酮酸(根)。优选己糖，如葡萄糖和果糖，葡萄糖寡聚体，如麦芽糖、异麦芽糖、麦芽三糖、淀粉和蔗糖，麦芽糊精和木糖(一种戊糖)。次优选的碳水化合物包括半乳糖、甘露糖和***糖。

发酵过程中的温度可以是从大约室温，更优选地从大约30℃，更优选地从大约35℃，到大约55℃，更优选地大约50℃，更优选地大约45℃。最高温度在一定程度上取决于具体的宿主细胞。例如，当宿主细胞是马克斯克鲁维酵母时，重组细胞能够耐受相对较高的温度(如40℃以上，可达50℃，特别是可达45℃)。另外一种优选的宿主种是C.sonorensis，它能够耐受可达约40℃的温度。这种高温耐受提供了在较高温度下进行发酵的可能性(从而降低了冷却成本)，而没有明显的生产率损失。良好的高温耐受的另一个优点是，如果发酵被一种不希望的微生物污染，则在许多情况下，能够通过将发酵培养基加热到40℃或以上，特别是45℃或以上，选择性地杀死这种不希望的微生物，而不会明显损伤本发明希望的细胞。

在发酵过程中，发酵培养基中的细胞浓度一般是约1-150，优选地约3-10，更优选地约3-6克干细胞/升发酵培养基。

在发酵的生产阶段，在某些情况下优选地可以微需氧操作，而不是严格厌氧操作。能够为每种微生物建立最佳通气条件，方法是测量比氧吸收速度(OUR)，并将该速度与收率、底物消耗率和希望的发酵产物的生产率相关联。在许多情况下，在具体OUR范围内优化收率和生产率。对于具有PDC破坏的酵母，最佳OUR值倾向于在约0.8-约3.5mmol O₂/干重细胞/小时的范围内。OUR是指发酵过程中细胞消耗氧气的速度，表示为每单位时间每细胞干重的氧气单位(摩尔或克)，如mmol O₂/干重细胞/小时。通过测量向发酵中导入的氧气以及从发酵中排出的氧气，可以方便地测定耗氧量。为了使OUR保持在对于具体生物最佳的范围内，能够利用OUR测量作为在发酵的生产阶段控制通气条件(特别是通气速度、搅拌、通气气体中氧的比例等)的基础。同时培养液中溶解氧的浓度保持在不到饱和量的1％，特别是不到10微摩尔O₂/L。在一个特别优选的方法中，进行发酵的生长阶段，使得培养液中溶解氧的浓度减少至不到饱和量的1％，特别是不到10微摩尔O₂/L，保持一段时间，如大约15-90分钟，之后开始生产阶段(即从生长阶段的需氧条件转换为生产阶段的微需氧条件)。

当生产D-乳酸时，发酵培养基的pH趋于降低，除非加入一种碱来中和形成的全部或部分酸。在发酵方法的一个实施方案中，向培养液中加入中和剂，如碳酸钙、氢氧化钙、碳酸钠、氢氧化钠、氨、氢氧化铵等，使pH保持在希望的范围内，一般是约5.0-约8.0，特别是约5.5-约7.5。当加入这种碱时，形成相应的乳酸盐。因此，乳酸的回收包括再生游离乳酸。实现方法一般包括分离细胞，并用强酸(如硫酸)酸化发酵培养液。形成盐副产物(如果钙盐是中和剂，硫酸是酸化剂，则为石膏)，它与乳酸分离。然后通过如液液提取、蒸馏、吸附等技术回收乳酸，如下所述：T.B.Vickroy，《综合生物技术》，第3卷，第38章(M.Moo-Young编著)，Pergamon，Oxford，1985；R.Datta等人，FEMSMicrobiol.Rev.，1995；16：221-231；美国专利号4,275,234、4,771,001、5,132,456、5,420,304、5,510,526、5,641,406和5,831,122和国际专利申请号WO 93/00440。

此外，细胞产生乳酸也可以使发酵的pH降低。因此，由于乳酸的产生，发酵培养液的pH可以处于约1.5-约5.0，优选地约1.5-约4.2，更优选地约1.5-约3.86(乳酸的pKa)，特别是约2.0-不到3.86的范围内。如果达到可以接受的生产率和产量，则这样进行发酵可能具有几个好处。中和剂的成本降低或消除。如果发酵pH(在发酵结束时)低于乳酸的pKa，则乳酸主要以酸的形式存在。这可以取消酸化步骤，从而可以省略其它加工步骤，节约了酸化成本和盐副产物的处理成本。因此，一种特别优选的方法包括继续发酵，直到发酵培养液的pH下降到3.86以下。能够利用如WO 99/19290公开的方法，从获得的发酵培养液中分离乳酸。

细胞耐受低pH环境的能力提供了另外一种机制，通过这种机制能够清除不希望的微生物的污染。可以将含有本发明的细胞的培养物置于降低的pH条件下，如约1.5-4.2，优选地约2.0-3.86的pH，保持足以杀死不耐酸的污染微生物的一段时间。

为了在商业上有用，本发明的重组酵母应当显示几个特征。该酵母应当能将相当比例的碳水化合物转化为乳酸(即产生高产量的产物)。它应当显示高比生产率，即每单位时间每细胞重量大量的乳酸产物。它优选地能够耐受低于约5.0、优选地约1.5-4.2、特别是2.0-3.86的发酵pH，而在这些条件下达到良好的收率和生产率。在5.0-8.0的pH值，优选地1.5-5.0、优选地1.5-4.2、特别是2.0-3.86的pH值下，该细胞优选地也能耐受高浓度的D-乳酸和/或D-乳酸盐。这最后一个特性可以使该发酵方法使用高浓度的起始碳水化合物。

通常希望使用本发明的重组细胞的发酵方法具有下列某些或全部特征：

A.产量至少为每克碳水化合物30克乳酸，优选地至少40克乳酸，更优选地至少60克乳酸，更优选地至少75克乳酸。希望的理论收率为100％，但是收率的实际上限约为98％(g/g)。

B.比生产率至少为0.1，优选地至少0.3，更优选地至少约0.4，特别是至少约0.5克D-乳酸/克细胞/小时。比生产率希望尽可能高。

C.滴度(D-乳酸的最大浓度)至少为15克/升发酵培养基，优选地至少20g/L，更优选地至少40g/L，更优选地至少80g/L，可达150g/L，优选地可达约120g/L。发酵培养基的温度在一定程度上影响容易达到的滴度的上限，因为高度浓缩的乳酸溶液(即高于约150g/L)在低于约35℃的温度下倾向于变得极为粘稠或者成为凝胶。使用较高的发酵温度，如约35-50℃，可以获得更高的滴度，而不会凝胶化或有不当的粘性发生(build-up)。

已经发现，当用于对葡萄糖进行中性(pH5.0-8.0)发酵时，本发明的重组细胞可以达到高达92-98％的收率，1.5-2.2g/L/小时的容积生产率，和81-90g/L的滴度。在使pH下降至约3.0的低pH发酵时，发现本发明的细胞达到80％或更高的收率，和1.2-3.3g/L的滴度。在所有情况下，不需优化发酵条件即可获得这些结果。

另外，本发明的发酵方法优选地达到高容积生产率。容积生产率表示为每单位时间每单位体积发酵培养基产生的产物量，一般是克产物/升培养基/小时。至少1.5g/L/小时，优选地至少2.0g/L/小时，更优选地至少2.5g/L/小时的容积生产率是希望的。在可达3-6克细胞/升发酵培养基的优选细胞密度时，最大生产率趋于可达约5.0g/L/小时，更一般地可达约4.0g/L/小时。非常优选的是进行发酵，使得当培养基的pH、温度或这两者都处于上段所述范围内时，达到这些容积生产率。

根据本发明生产的乳酸可以用来生产丙交酯，即两个乳酸分子的一种环酐。根据乳酸的立体异构体不同，丙交酯可以是D-丙交酯(由两个D-乳酸分子组成)、L-丙交酯(由两个L-乳酸分子组成)或D-L-丙交酯(由L-乳酸和D-乳酸分子各一个组成)。由乳酸生产丙交酯的一种适当的方法是通过聚合/解聚方法，如授予Gruber等人的USP 5,142,023所述。

丙交酯又特别可以作为一种单体用来生产聚丙交酯聚合物(PLA)和共聚物。制备这些聚合物的方法在授予Gruber等人的USP 5,142,023中也有描述。优选的PLA产物是如授予Gruber等人的USP 5,338,822所述的熔解稳定的聚合物。PLA可以是半晶体或非晶体。

下列实施例用来说明本发明的某些实施方案，并非限制其范围或精神。

实施例

实施例1A：基于酿酒酵母PGK启动子的表达质粒pNC2和基于酿酒酵母PDC1启动子的表达质粒pNC4的构建

表达质粒pNC2(图1)通过在pGEM5Z(+)(Promega，Wisconsin)骨架载体上组合酿酒酵母PGK1启动子和酿酒酵母GAL10终止子产生。酿酒酵母PGK1启动子和GAL10终止子由一个多接头区隔开，该接头区含有限制酶切位点XbaI、EcoRI和BamHI，用于在酵母启动子与终止子之间***将要表达的具体基因。

使用酿酒酵母PGK1启动子，其具有下列序列：

5’-GCGGCCGCGG ATCGCTCTTC CGCTATCGAT TAATTTTTTT TTCTTTCCTC

TTTTTATTAA CCTTAATTTT TATTTTAGAT TCCTGACTTC AACTCAAGAC

GCACAGATAT TATAACATCT GCACAATAGG CATTTGCAAG AATTACTCGT

GAGTAAGGAA AGAGTGAGGA ACTATCGCAT ACCTGCATTT AAAGATGCCG

ATTTGGGCGC GAATCCTTTA TTTTGGCTTC ACCCTCATAC TATTATCAGG

GCCAGAAAAA GGAAGTGTTT CCCTCCTTCT TGAATTGATG TTACCCTCAT

AAAGCACGTG GCCTCTTATC GAGAAAGAAA TTACCGTCGC TCGTGATTTG

TTTGCAAAAA GAACAAAACT GAAAAAACCC AGACACGCTC GACTTCCTGT

CTTCCTATTG ATTGCAGCTT CCAATTTCGT CACACAACAA GGTCCTAGCG

ACGGCTCACA GGTTTTGTAA CAAGCAATCG AAGGTTCTGG AATGGCGGGA

AAGGGTTTAG TACCACATGC TATGATGCCC ACTGTGATCT CCAGAGCAAA

GTTCGTTCGA TCGTACTGTT ACTCTCTCTC TTTCAAACAG AATTGTCCGA

ATCGTGTGAC AACAACAGCC TGTTCTCACA CACTCTTTTC TTCTAACCAA

GGGGGTGGTT TAGTTTAGTA GAACCTCGTG AAACTTACAT TTACATATAT

ATAAACTTGC ATAAATTGGT CAATGCAAGA AATACATATT TGGTCTTTTC

TAATTCGTAG TTTTTCAAGT TCTTAGATGC TTTCTTTTTC TCTTTTTTAC

AGATCATCAA GGAAGTAATT ATCTACTTTT TACAACAAAT CTAGAATT-3′

(SEQ ID No.1)

它作为质粒pBFY004的一条限制酶切片段获得。此外，也能够以酿酒酵母染色体DNA为模板，使用根据下列序列设计的引物，通过PCR扩增获得：

使用的酿酒酵母GAL10终止子具有下列序列：

5’-GTAGATACAT TGATGCTATC AATCCAGAGA ACTGGAAAGA TTGTGTAGCC

TTGAAAAACG GTGAAACTTA CGGGTCCAAG ATTGTCTACA GATTTTCCTG

ATTTGCCAGC TTACTATCCT TCTTGAAAAT ATGCACTCTA TATCTTTTAG

TTCTTAATTG CAACACATAG ATTTGCTGTA TAACGAATTT TATGCTATTT

TTTAAATTTG GAGTTCAGTG ATAAAAGTGT CACAGCGAAT TTCCTCACAT

GTAGGGACCG AATTGTTTAC AAGTTCTCTG TACCACCATG GAGACATCAA

AAATTGAAAA TCTATGGAAA GATATGGACG GTAGCAACAA GAATATAGCA

CGAGCCGCGG ATTTATTTCG TTACGC-3’(SEQ ID No.2)

该序列作为质粒pBFY004的一条限制酶切片段获得。此外，也能够以酿酒酵母染色体DNA为模板，使用根据下列序列设计的引物，通过PCR扩增获得：

构建质粒pNC4，其含有基于酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子的表达盒，用该质粒作为一种通用表达载体。许多标记基因已经在该启动子下表达。pNC4质粒在图2中显示。

pNC4的质粒骨架是pGEM5Z(+)(Promega Corporation；Madison，WI)。使用引物PSPDCS1(5′-CCA TCG ATA ACA AGC TCATGCAAA GAG-3′；SEQ ID No：3)和PSPDCAS2(5′-GCT CTA GATTTG ACT GTGTTA TTT TGCG-3′；SEQ ID No：4)，以来源于酿酒酵母GY5098株的染色体DNA为模板，PCR扩增酿酒酵母PDC1启动子。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行热循环：94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，最后在72℃下温育7min。

酿酒酵母GAL10终止子如上所述获得。图3A SEQ ID NO 41和3BSEQ ID NO 42显示了含有PGK1启动子和GAL10终止子以及多克隆位点，和含有PDC1启动子和GAL10终止子以及多克隆位点的片段。

实施例1B：pVR24的构建，其含有在酿酒酵母PGK1启动子控制下的巨大芽孢杆菌L-LDH

编码L-LDH基因的巨大芽孢杆菌如下分离。巨大芽孢杆菌从美国模式培养物保藏中心获得(ATCC保藏号6458)，在标准条件下培养。使用Invitrogen的“Easy-DNA”试剂盒，按照厂商方案，从这些细胞中纯化基因组DNA。以可从Genbank获得的巨大芽孢杆菌L-LDH的序列(Genbank保藏号M22305)为基础设计引物。使用Perkin Elmer缓冲液II(1.5mM MgCl₂)和AmpliTaq Gold聚合酶进行PCR扩增反应。每个反应体系含有浓度为6ng/μL的巨大芽孢杆菌基因组DNA、浓度均为0.2mM的4种dNTP和浓度均为1μM的两种扩增引物BM1270和BM179，其中这些引物含有序列：

BM1270：5′-CCT GAG TCC ACG TCA TTATTC-3′；SEQ ID No：5和

BM179：5′-TGA AGC TAT TTA TTC TTGTTAC-3′；SEQ ID No：6

根据下列热循环条件进行反应：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用琼脂糖凝胶电泳纯化并分离一种强产物片段(1100bp)，克隆，测序。获得的序列能够被翻译为一种多肽，该多肽显示与已知的L-LDH编码基因(例如Genbank保藏号M22305)有极高的同源性。

巨大芽孢杆菌LDH编码基因的编码序列与一个来自磷酸甘油酸酯激酶(PGK)基因的启动子和一个来自GAL10基因的转录终止子(它们均来自酿酒酵母)有效连接。为了向该基因编码序列的末端引入限制酶切位点，根据该序列设计两种寡核苷酸引物，Bmeg5′和Bmeg3′：

Bmeg5′：5′-GCT CTA GAT GAA AAC ACA ATT TAC ACC-3；SEQ ID No：7和

Bmeg3′：5-ATGG ATC CTT ACA CAA AAG CTC TGT CGC-3′；SEQ ID No：8

使用上述dNTP和引物浓度，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，在厂商提供的缓冲液中进行该扩增反应。热循环如下进行：开始时95℃温育3min，随后95℃30sec，50℃30sec，72℃60sec，共30个循环，最后72℃温育9min。产物用限制性内切酶XbaI和BamHI消化，连接到质粒pNC2的XbaI和BamHI位点内。这种连接使得PGK启动子和GAL10终止子与巨大芽孢杆菌LDH编码序列有效连接，确定为pVR24(图4)。

实施例1C：pVR22的构建，其含有与PDC1启动子和GAL10终止子(酿酒酵母)有效连接的G418抗性盒

将G418抗性标记克隆到酿酒酵母PDC1启动子下，该构建体被命名为pVR22(图5显示)。该质粒使用酿酒酵母GAL10终止子作为G418抗性基因的终止子。以质粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)为模板，使用引物5′-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGA AAC(5′G片段；SEQ ID No：9)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AAC TCATCG AGC ATC(3′G片段；SEQ ID No：10)，使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene)，PCR扩增G418抗性基因。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育5min，然后95℃30sec，49℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育10min。PCR产物用BamHI和XbaI消化，分离到一条821bp的片段，将其与pNC2的4303bp的BamHI-XbaI片段连接。获得的质粒含有与G418抗性基因功能连接的PGK启动子和GAL10终止子，命名为pVR22，在图5中显示。

实施例1D：质粒pNC7的构建，其用于在复制质粒pKD1上表达巨大芽孢杆菌L-LDH基因

质粒pNC7(图6)如下构建。从pVR24中作为NotI片段分离含有在PGK启动子和GAL10终止子(酿酒酵母)转录控制下的巨大芽孢杆菌-LDH基因的表达盒，将其连接到NotI酶切的质粒pNC3内，产生pNC7。pNC3的构建方法是，将SphI线性化的整个pKD1质粒(参见，Wesolowski-Louvel等人，《生物技术中的非常规酵母》；“乳酸克鲁维酵母”，pp.139-201；K.Wolf编著；Springer-Verlag，Berlin，1996)连接到pTEF1/Zeo(Invitrogen)的唯一SphI位点内；pNC3的结构在图？？中显示。

实施例1E：马克斯克鲁维酵母NC39株的构建

利用标准方法，用质粒pNC7转化野生型马克斯克鲁维酵母(CD21株)，产生重组株NC39，它在一个多拷贝pKD1质粒上含有巨大芽孢杆菌L-LDH基因。

实施例1F：用于破坏PDC1破坏载体的质粒pSO28和pSO29的构建

使用引物SO-M2 5′-CTT CCA GTC CAG CAG GTC GACCAG-3′；SEQ.ID No：11，和SO-M1 5′-GTC CAG CAT GTC GACCAG-3′；SEQ.ID.No：12构建质粒pSO21。以来自马克斯克鲁维酵母(CD21株)的基因组DNA为模板，使用上述引物，利用常规PCR方法获得一条5.5kb的片段，该片段由马克斯克鲁维酵母PDC1基因以及它的启动子、终止子和该基因上游和下游的大区域组成。将这个5.5kb片段克隆到pCRII(Invitrogen)质粒内，产生质粒pSO21(图7a)。使用引物SO-M4 5′-GAA CGA AAC GAA CTT CTCTC-3′；SEQ ID No：13，和SO-M5 5′-CTT GGA ACT TCT TGT CAG TG-3′；SEQ ID No：14，利用常规PCR方法，通过PCR扩增来自pSO21的3.3kb PDC1片段(PDC1基因，启动子)，合成质粒pSO27(图7b)。利用凝胶电泳纯化并分离获得的片段，随后将其连接到pCRII(Invitrogen)内，产生pSO27。

pSO28(图8)如下构建：用BbsI消化携带PDC1的pSO27，从PDC1编码区中删除417bp。产生的核苷酸突出端用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)补平。将该片段(约2.9kb)连接到来自pVR22(实施例1C)的Pfu平端NotI片段内，其中含有酿酒酵母PGK启动子和G418抗性基因，随后是酿酒酵母GAL10终止子。

类似地，pSO29(图9)如下构建：用BbsI消化pSO27，从PDC1编码区中删除417bp。核苷酸突出端用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)补平。将该片段连接到来源于pTEF1/Zeo(Invitrogen)的Pfu平端XhoI/XbaI片段内，其中含有酿酒酵母TEF1启动子和zeocin抗性基因，随后是酿酒酵母CYC1终止子。

为了用不同的整合选择基因设计可用来产生含有pdc1无效基因型的马克斯克鲁维酵母株的不同整合盒，制备这些构建体。首先筛选这些转化子，以证实该构建体在PDC1基因座处的***，然后根据不能产生乙醇以及在厌氧条件下不能生长进行筛选。优选的重组事件是在基因组上PDC1处的双交换。然而，也能够发生单或双重组事件，或者能够发生DNA***诱变事件。

实施例1G：利用Pdc表型，根据pdc1无效基因型，对马克斯克鲁维酵母的转化和筛选：CD181、CD186、CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD219、CD220和CD221株的构建

选择NC39株作为转化宿主，因为它在宿主中含有质粒pNC7作为复制质粒，它在pKD1骨架上含有L-LDH，它的存在能够提高PDC1处缺失的可能性(参见Chen XJ等人，Curr.Genet.，1989Aug；16(2)：95-8)。

为了保留pNC7质粒，NC39在含有100μg/mL zeocin(Invitrogen)的选择YPD中生长过夜，按照下列酵母化学转化方案进行转化。细胞在30℃和250rpm振摇下在5mL YPD培养基中生长过夜。培养物用50mL YPD稀释到起始OD₆₀₀约为0.2。培养物然后在30℃和250rpm下生长，直到OD₆₀₀约为3.0。然后以2500rpm离心5分钟收获细胞，将其重悬浮于50mL无菌水中。以2500rpm离心5分钟收获细胞。重悬浮离心重复一次。该步骤之后，将细胞沉淀重悬浮于1.0mL 10mMTris，pH7.5，1mM EDTA，20mM乙酸锂，pH7.5中。向微量离心管中加入：4.0μg线性pSO28DNA片段，它用SacI/ApaI酶切，含有G418选择性标记和侧翼PDC1区，加入25μL载体DNA(Colette-10mg/mLsand solicited)和500μL制备的NC39细胞，振荡混合。向其中加入3mL40％PEG、10mM Tris，pH7.5、1mM EDTA、20mM乙酸锂，pH7.5，振荡混合。该混合物然后在30℃和250rpm振摇下温育30分钟。温育后，加入350μL DMSO，通过颠倒试管混合。然后使细胞在42℃下热休克15分钟，随后在冰上快速冷却约3分钟。以14,000rpm离心10秒钟沉淀细胞，除去上清液。将细胞重悬浮于1mL YPD中。通过在30℃和250rpm振摇下温育4小时回收细胞。在回收阶段后，沉淀细胞，除去上清液。此时，将细胞重悬浮于终体积约为500μL的YPD中。将一等份(20μL)细胞悬液接种于一块选择平板上，将100μL等份接种于另外6块选择平板上。接种的细胞在30℃下温育，直到观察到菌落生长。

此转化使用的平板含有300μg/mL选择剂(G418)。然后将这些原板上生长的转化子分批接种(patch-plated)到含有相同浓度选择剂的次级板上。利用常规方法，通过PCR筛选在这些次级板上生长的菌落，对于PDC1处的整合事件，使用位于整合片段下游和外部的3′引物(SO4549 5′-CCA TCC GAA GAA GTC GAT CTC-3′；SEQ ID No：15)和位于G418抗性基因内的5′引物(SO285 5′-CTT GCC ATC CTA TGGAAC TGC-3′；SEQ ID No：16)。根据此PCR分析，200个菌落中只有1个是阳性。另外一种PCR分析使用常规PCR方法和用于从pSO27中删除BbsI片段的PDC1引物(-SO2740 5′-GAA GGC TGG GAA TTGAGT GA-3′；SEQ ID No：17，和SO2444 5′-GCT CCA TCT GAA ATCGAC AG-3′；SEQ ID No：18)，利用该方法证实完整野生型PDC1的存在。

单阳性转化子作为一个单菌落分离，用来产生甘油贮存液，鉴定为CD181。然后通过不施加选择压力地培养，随后将培养的细胞接种于含有G418(300μg/mL)的YPD琼脂平板上，使该菌株恢复pNC7质粒。挑取4个菌落，检测其zeocin敏感性和L-乳酸产生的缺乏。所有4个菌落都显示zeocin敏感性，并且丧失产生L-乳酸的能力。选择一个单菌落，用来产生甘油贮存液，鉴定为CD186。

为了产生具有PDC表型的马克斯克鲁维酵母株(不产生乙醇，在厌氧条件下不生长)，CD186的另外一种转化是必要的。按照上述方案，用6.8μg线性化pSO29DNA片段转化CD186，该片段用NheI/NotI酶切，含有zeocin选择性标记和PDC1区中的缺失。

用产生的转化子接种含有300μg/mL zeocin的YPD琼脂平板上。在这些原板上生长的转化子分批接种含有300μg/mL G418和300μg/mL zeocin的次级板。对于PDC1基因座处的整合，通过PCR筛选在这些次级板上生长的菌落，检测野生型的PDC1的缺乏，该PCR使用存在于从pSO27上删除的BbsI片段上的引物，-SO2740 5′-GAA GGCTGG GAA TTG AGT GA-3′；SEQ ID No：17，和SO2444 5′-GCT CCATCT GAA ATC GAC AG-3′；SEQ ID No：18。

发现8个菌落在PDC1中含有缺失。这通过PCR分析证实，该分析显示预期地从野生型PDC1上删除和PDC表型(无乙醇产生或厌氧生长)。分离这8个转化子的单菌落，加入Cargill Dow培养物保藏中心。这8个马克斯克鲁维酵母pdc1无效株被命名为CD214、CD215、CD216、CD217、CD218、CD219、CD220和CD221。通过将一个菌落接种到250摇瓶中的50mL YPD培养基中，检测CD215的乙醇产生。培养物在30℃和70rpm振摇下温育，样品的HPLC分析未检测到任何乙醇。

实施例1H：质粒pPS1的构建，其中潮霉素抗性基因与酿酒酵母的PDC1启动子和GAL10终止子功能连接

如下制备重组核酸，它使转化的酵母细胞具有潮霉素抗性，允许筛选含有重组核酸构建体的酵母细胞转化子，该构建体编码可用于合成一种有机产物的蛋白质。克隆潮霉素抗性标记(大肠杆菌hph)，使其在酿酒酵母PDC1启动子的转录控制下。

以质粒pRLMex30为模板，使用引物5′HYGXBA1(5′-AAG CTCTAG ATG AAA AAG CCT GAA CTC AC-3′；SEQ ID No：19)和3′HYGBAMH1(5′-CGC GGA TCC CTA TTC CTT TGC CCT CGGAC-3′；SEQ ID No：20)，PCR扩增提供潮霉素B抗性的大肠杆菌hph基因(参见，例如Mach等人.1994，Curr.Genet.25，567-570；Rajgarhia等人，美国专利申请号10/154,460，2002年5月23日提交，在此全文引用作为参考)。也能够以大肠杆菌染色体DNA为模板，使用相同的引物，获得hph基因。使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Stratagene)进行热循环：94℃1min，56℃1min，72℃3min，共30个循环，最后72℃温育7min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，分离到1026bp的产物。PCR产物用XbaI和BamHI消化，将其连接到XbaI和BamHI酶切的质粒pNC4中，产生质粒pPS1(参见图10)。

实施例1I：含有瑞士乳杆菌D-LDH的pVR43的构建

如下从瑞士乳杆菌中分离D-LDH。瑞士乳杆菌细胞从美国典型培养物保藏中心获得(ATCC保藏号10797)，并在标准条件下生长。使用下列方案从这些细胞中纯化基因组DNA：

1.用单菌落或5μL乳酸菌甘油贮存液的接种250mL无菌摇瓶中的2×50mL无菌MRS培养液。培养物在37℃和170rpm搅拌下生长48小时。

2.将培养物转移到50mL无菌蓝帽试管中，以3000rpm离心10分钟。将细胞沉淀重悬浮于50mL 12.5％w/v蔗糖溶液中，再次以3000rpm离心10分钟。重悬浮沉淀，在来自Falcon的50mL无菌蓝帽试管(目录号29050)中与5mL 12.5％w/v蔗糖混合。向细胞悬液中加入5mLTES溶液(TES为：10mM Tris(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，50mMNaCl，无菌过滤)。加入另外5mL 25％w/v蔗糖溶液，然后混合。向悬液中加入溶菌酶粉末(300mg)，振荡混合。一旦充分混合，即向混合物中加入25μL变溶菌素溶液(贮存浓度为2.2mg/mL)。悬液在37℃下温育过夜(～10-12小时)。

3.在温育过夜后，加入2.5mL 20％SDS溶液和168μL蛋白酶K溶液(贮存浓度为28mg/1.4mL)。通过颠倒而非振荡混合试管。试管在50℃下温育1小时。此时细胞膜物质出现破裂，溶液变为半透明。加入足量的NaCl，达到0.15M的溶液浓度。通过颠倒充分混合该溶液。

4.将该混合物转移到一个50mL Oakridge管(BeckmanInstruments Inc.，Palo Alto，CA)中，或者平分到两个管中，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液处理。搅拌该混合物，以10,000rpm离心10分钟。

5.将水上清液吸到一个清洁的Oakridge管中，加入等体积的氯仿。通过振荡混合该溶液，以5000rpm离心10分钟。

6.吸出上清液，置入一个新试管中。向上清液中加入25μL RNAse(贮存浓度为100mg/mL)，颠倒混合。试管在37℃下温育15分钟。加入过量的不含DNAse的RNAse，以快速降解RNA。

7.最后，通过沿试管壁小心倒入，向混合物中加入2.5倍体积的EtOH。EtOH层不混合。利用一个玻璃吸管收集在液体界面处形成的DNA，在70％EtOH中洗涤。使DNA风干，在微量离心管中重悬浮于10mM Tris-HCl，pH8.5中(大多数Qiagen试剂盒中的洗脱缓冲液)。试管在50℃下温育，直到DNA进入溶液。

根据Genbank中可以获得的瑞士乳杆菌D-LDH的序列(Genbank保藏号U07604或X66723(SEQ ID No.43))设计引物。使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，WI，USA)进行PCR扩增反应。每个反应体系含有浓度为500ng的瑞士乳杆菌基因组DNA，浓度均为0.2mM的4种dNTP，和浓度均为1μM的扩增引物VR150 5′-GGT TGG ATT TAT GACAAA GGT TTT GCTT-3′；SEQ ID No.21)和VR153 5′-AAT TAA AACTTG TTC TTG TTC AAA GCA ACT-3′；SEQ ID No.22)。按照下列循环条件进行反应：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，51℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用常规方法凝胶纯化一条1027bp的强产物片段，将其TA克隆到PCR-BluntII topo克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。测序获得的质粒，将其命名为pVR43(如图11a所示)。获得的序列能够被翻译为一种多肽，该多肽显示与Genbank中已知的瑞士乳杆菌D-LDH编码基因序列(保藏号U07604或X66723)有极高的同源性。

实施例1J：pVR47的构建，其含有处于酿酒酵母PGK1启动子和GAL10终止子控制下的瑞士乳杆菌D-LDH

设计引物，以在D-LDH基因的5′和3′端引入XbaI和BamHI位点，便于克隆到pNC2内。PCR扩增反应使用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene，Wisconsin，USA)进行。每个反应体系含有pVR43(携带瑞士乳杆菌D-LDH)(5ng)，浓度均为0.2mM的4种dNTP，和浓度均为1μM的扩增引物VR165 5′-CGT CTA GAT TTA TGA CAA AGG TTTTGCT-3′；SEQ ID No.23和VR166 5′-GCG GAT CCT TAA AAC TTGTTC TTG TTC AA-3′；SEQ ID No.24。按照下列循环条件进行反应：开始时95℃温育10min，随后95℃30sec，55℃30sec，72℃60sec，共35个循环。利用常规方法凝胶纯化一条1027bp的强产物片段，利用PCR-BluntII topo克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行TA克隆。测序获得的质粒，将其命名为pVR44(见图11b)。该序列能够被翻译为一种多肽，该多肽显示与已知的瑞士乳杆菌D-LDH编码基因有极高的同源性，并且在D-LDH基因的5′和3′端含有XbaI和BamHI位点。

质粒pNC2用XbaI和BamHI消化。线性化pNC2的5′-磷酸末端用河虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics，USA)按照厂商所述方案去磷酸化。pVR44也用XbaI和BamHI消化，通过凝胶电泳(0.8％琼脂糖凝胶)分离1027bp的瑞士乳杆菌D-LDH基因。连接这两条片段，获得的质粒被命名为pVR47(见图4)，对其测序。pVR47质粒含有与瑞士乳杆菌D-LDH基因功能连接(即在酵母细胞中具有转录活性)的酿酒酵母PGK启动子和GAL10终止子，如图12所示(SEQ ID NO 43)。

D-LDH基因的序列

5′-ATGACAAAGGTTTTTGCTTACGCTATTCGAAAAGACGAAGAACCATTCTTGAATGAATGG

AAGGAAGCTCACAAGGATATCGATGTTGATTACACTGATAAACTTTTGACTCCTGAAACT

GCTAAGCTAGCTAAGGGTGCTGACGGTGTTGTTGTTTACCAACAATTAGACTACACTGCA

GATACTCTTCAAGCTTTAGCAGACGCTGGCGTAACTAAGATGTCATTACGTAACGTTGGT

GTTGACAACATTGATATGGACAAGGCTAAGGAATTAGGTTTCCAAATTACCAATGTTCCT

GTTTACTCACCAAACGCTATTGCTGAACATGCTGCTATTCAGGCTGCACGTGTATTACGT

CAAGACAAGCGCATGGACGAAAAGATGGCTAAACGTGACTTACGTTGGGCACCAACTATC

GGCCGTGAAGTTCGTGACCAAGTTGTCGGTGTTGTTGGTACTGGTCACATTGGTCAAGTA

TTTATGCGTATTATGGAAGGTTTCGGTGCAAAGGTTATTGCTTACGATATCTTCAAGAAC

CCAGAACTTGAAAAGAAGGGTTACTACGTTGACTCACTTGACGACTTGTACAAGCAAGCT

GATGTAATTTCACTTCACGTACCAGATGTTCCAGCTAACGTTCACATGATCAACGACAAG

TCAATCGCTGAAATGAAAGACGGCGTTGTAATTGTAAACTGCTCACGTGGTCGACTTGTT

GACACTGACGCTGTAATCCGTGGTTTGGACTCAGGCAAGATCTTCGGCTTCGTTATGGAT

ACTTACGAAGACGAAGTTGGTGTATTTAACAAGGATTGGGAAGGTAAAGAATTCCCAGAC

AAGCGTTTGGCAGACTTAATTGATCGTCCAAACGTATTGGTAACTCCACACACCGCCTTC

TACACTACTCACGCTGTACGTAACATGGTTGTTAAGGCATTCAACAACAACTTGAAGTTA

ATCAACGGCGAAAAGCCAGATTCTCCAGTTGCTTTGAACAAGAACAAGTTTTAA-3′

实施例1K：pVR48的构建，其含有彼此相邻的瑞士乳杆菌D-LDH基因和潮霉素抗性标记

用SphI消化pPS1，利用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离2.259kbp片段，其含有在酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子控制下表达的潮霉素抗性基因。用SphI消化pVR47，线性化质粒的5′-磷酸末端用河虾碱性磷酸酶(Roche Diagnostics，USA)按照厂商所述方案去磷酸化。连接这两条片段，测序获得的质粒，将其命名为pVR48(如图13所示)。该质粒含有彼此相邻的瑞士乳杆菌D-LDH基因和潮霉素抗性标记盒。

实施例1L：编码瑞士乳杆菌D-LDH基因的DNA通过随机整合向马克斯克鲁维酵母基因组内的引入

通过用SstI和ApaI消化pVR48，从该质粒中分离一条4.54kbp的片段，该片段含有瑞士乳杆菌D-LDH:HPH抗性基因盒。在0.8％琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离该片段。利用如下所述的电穿孔方案，用该片段转化pdc1无效突变的马克斯克鲁维酵母(CD215；参见实施例1F、1G)：

用马克斯克鲁维酵母的一个单菌落在250mL带挡板的摇瓶中接种50mL YPD(含有10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖和2％琼脂)，使OD₆₀₀为0.1。培养物在30℃和250rpm下生长16小时，直到终OD₆₀₀为10。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(EB；10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH7.5)洗涤一次。将细胞重悬浮于温育缓冲液(IB；YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。然后离心收集细胞，用EB洗涤一次。将细胞重悬浮于1mL EB中，将400μL这些细胞转移到一个0.4cm的电穿孔杯(BioRad；Hercules，CA)中。

向杯中加入2μg来自pVR48的4.54kbp SstI/ApaI片段，细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm下温育4小时，之后选择性接种于含有200μg/mL潮霉素的YPD上。这些转化子在37℃下生长3天。将潮霉素抗性转化子在含有200μg/mL潮霉素的新鲜选择性平板上重新划线。

PCR分析：

使用两组PCR引物证实该片段向马克斯克鲁维酵母CD21基因组内的整合：

1.一组引物设计为与瑞士乳杆菌D-LDH基因同源，一条反向引物与潮霉素抗性基因同源。设计引物VR161 5′-AGT TGG TGT ATT TAACAA GG-3′；SEQ ID No.25和VR142 5′-GTG ACA CCC TGT GCACGG CGG GAG ATG-3′；SEQ ID No.26，用来在含有该盒的菌株中扩增位于瑞士乳杆菌D-LDH与潮霉素抗性基因之间的1.748kb产物，而在不含该盒的菌株中应当不能扩增任何片段。使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，43℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。

2.第二组引物设计为与PGK启动子区同源，一条反向引物与瑞士乳杆菌D-LDH同源。设计引物VR173 5′-GCG ACG GCT CAC AGGTTT TG-3′；SEQ ID No.27和VR170 5′-CTT GTC TTG ACG TAATAC ACG TGC AGC-3′；SEQ ID No.28，用来在含有该盒的菌株中扩增位于PGK启动子与瑞士乳杆菌D-LDH基因之间的0.75kb产物，而在不含该盒的菌株中应当不能扩增任何片段。使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，USA)对转化子菌落进行热循环：开始时反应混合物94℃温育2min，随后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35个循环，最后72℃温育7min。在所分析的转化子中，有19个产生预期的PCR产物。

D-乳酸的酶学和GC证实：

转化子产生的D-乳酸的光学纯度用Boehringer Mannheim的D-乳酸检测试剂盒(Roche Diagnostics，USA)测定。按照厂商方案进行，显示19个转化子中有6个产生0％的L-乳酸。

对转化子上清液的气相色谱(GC)分析表明，这些菌株产生超过99％的D-乳酸。

GC分析方法

乳酸的“D”和“L”对映体的分离与定量利用一种手性气相色谱法实现。建立的这种方法包括在甲醇中碱催化样品的水解，随后用硫酸酸化，以催化酯化，随后将乳酸甲酯对映体抽提到二氯甲烷内。然后使用一种火焰电离检测器(FID)[Hewlett Packard 6890，配有分流/无分流注射器，设置为分流模式，自动注射，和一个FID检测器]，通过气相色谱(GC)分析有机层。乳酸甲酯对映体的分离用一种手性毛细管柱[内径30m×0.25mm β-Dex325毛细管柱(0.25μm膜厚度)，Supelco.(#24308)]实现。由该方法获得标准化的“D”和“L”乳酸的相对百分比。

用于GC分析的样品如下制备：称量一定量的样品(1.000g)，加入一个20mL玻璃瓶内，向其中加入4mL甲醇。这个小瓶盖上帽，缓慢加入150μL浓硫酸。将小瓶置于65℃的Reati-therm加热器/搅拌器中10分钟。然后向小瓶中加入去离子水(5mL)，随后加入10mL二氯甲烷。这个小瓶盖上帽，剧烈振荡。使用配有针管滤器(tube-tipped filter)的一次性塑料注射器，除去一部分底部有机层，将剩余的底部有机层转移到一个2mL GC小瓶中，以向GC内注射。

实施例1M：在缓冲条件下，在YPD+葡萄糖培养基中，马克斯克鲁维酵母摇瓶培养物的D-乳酸产生，该酵母携带整合到基因组内的瑞士乳杆菌D-LDH基因

产生光学纯的D-乳酸的6个转化子被命名为CD554、CD555、CD556、CD557、CD558和CD559。这些菌株在250mL带挡板的摇瓶中培养，其中含有补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD，由YPD琼脂平板接种。培养物在30℃和250rpm振摇下生长16小时，至OD₆₀₀为0.1。在确定每个摇瓶中还有剩余的葡萄糖，并且细胞处于对数生长期后，离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了约100g/L葡萄糖和55g/L CaCO₃的50mL YPD。将培养物置于30℃和70rpm下。以不同时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC(如下所述)分析培养上清液的葡萄糖、D-乳酸盐、丙酮酸(根)和乙醇。

HPLC分析方法

下列实验中使用的HPLC方法使用一种Bio-Rad Fast Acid分析柱，联合一种Rezex Fast Fruit分析柱，均含有氢形式的苯乙烯二乙烯苯树脂。用异丁酸作为内部标准，用与220nm紫外线检测器组合的折射率检测器定量有机成分。通过称出已知量的样品，并在一种内部标准存在下稀释，制备样品。将获得的溶液注射到一个HPLC***中，用已知的标准定量。

在这些培养条件下，CD554、CD555、CD556、CD557、CD558、CD559株在30℃下产生超过99％的D-乳酸，基于葡萄糖的收率为92-98％，D-乳酸滴度为82-90g/L，容积生产率大于2.2g/L/小时。

实施例2A：PDC1编码序列缺失、瑞士乳杆菌D-LDH基因利用一步置换法整合到PDC1基因座处的菌株的构建

质粒pCA50如下构建：将来自质粒pVR48(实施例1K)的4.7kbNgoMIV/PsiI片段连接到用MscI和SgrAI酶切的质粒pBH5c(在实施例3B；图16c中描述)的骨架内。pVR48片段含有瑞士乳杆菌D-LDH基因，该基因受酿酒酵母PGK启动子的控制，随后是酿酒酵母GAL10转录终止子序列。该表达盒与潮霉素抗性基因(hph)相邻，后者受酿酒酵母PDC1启动子控制，随后是GAL10终止子(酿酒酵母)。将pVR48片段连接到pBH5c骨架内，产生质粒pCA50，其中D-LDH:hph构建体的侧翼为马克斯克鲁维酵母PDC1基因座直接上游和下游的序列(图14)。

质粒pCA50用SbfI和BseRI消化，产生一条6272bp的片段。通过凝胶电泳分离并纯化2.5μg该片段，用于转化。使用实施例1M公开的电穿孔方案，用纯化的片段转化野生型马克斯克鲁维酵母(CD21)。将转化的细胞接种于含有150μg/m潮霉素的YPD选择平板上，筛选pCA50随机整合到基因组内或者野生型PDC1基因座被该片段同源置换的细胞。在30℃生长3天后分离菌落，在含有150μg/mL潮霉素的新鲜YPD上划线，以证实其表型。

为了鉴定野生型PDC1基因座被同源置换为pCA50片段的菌落，通过PCR测定这些菌落。将细胞重悬浮于PCR反应体系中，以提供模板DNA。设计5′引物oCA85 5′-GGA CCG ATG GCT GTG TAG AA-3′；SEQ ID No.29，用来扩增hph基因的3′端。设计3′引物oCA80 5′-TCGCTT ACC TCG GTA CAG AA-3′；SEQ ID No.30，用来扩增马克斯克鲁维酵母PDC1基因座下游的序列，该序列不存在于pCA50构建体中。用来探查靶序列的扩增测定使用Taq聚合酶(Qiagen)和下列PCR反应条件：开始时95℃10min的熔解步骤，随后95℃30sec，55℃30sec，72℃3min，共40个扩增循环，随后72℃10min。

含有同源置换事件的转化细胞产生2.5kb的PCR产物。使用oCA85和oCA80引物的随机整合事件不产生PCR产物。对于这种2.5kb PCR产物，CD597-CD601株为阳性。

实施例2B：在复杂CaCO₃缓冲培养基中，马克斯克鲁维酵母微需氧摇瓶培养物的D-乳酸产生，通过一步置换法，该酵母含有整合到PDC1基因座内的单拷贝D-LDH

将两步置换事件产生的pdc1Δ∷Lh-D-LDH CD587株(来自实施例3E)与一步置换事件产生的pdc1Δ∷Lh-D-LDH CD597、CD599和CD600株(来自实施例2A)相比较，以确定这些菌株是否产生相似的乳酸滴度，而与生产方法无关。

通过在37℃和225rpm搅拌下在YPD+100g/L葡萄糖+50g/LCaCO₃中生长过夜，在带挡板的摇瓶中产生生物质。生产摇瓶接种来自过夜生物质摇瓶的2g/L细胞干重。生产条件是YPD培养基+100g/L葡萄糖+50g/L CaCO₃，在带挡板的摇瓶中以70rpm振摇，35℃。在不同时间点采样：过滤除去生物质和CaCO₃，通过HPLC分析滤液的葡萄糖、乳酸(盐)、EtOH和丙酮酸(盐)(实施例1M)。

54小时后，CD587、CD589和CD590消耗了85-88g/L葡萄糖，产生81g/L乳酸(盐)和2.5g/L丙酮酸(盐)。这些乳酸盐滴度代表微需氧过程中92-95％的基于葡萄糖的乳酸(盐)收率，和大于1.5g/L的容积生产率。这些结果表明，D-LDH转化子能够产生D-乳酸。这些菌株产生的乳酸的酶分析显示，乳酸超过99％是对映体纯的D-乳酸。

这些结果显示，使用一步基因置换策略产生的D-LDH转化子(CD597、CD599和CD600)能够与两步置换菌株CD587相似地产生D-乳酸。

实施例3A：pVR29质粒的构建，其含有与酿酒酵母PGK启动子和GAL10终止子(pVR29)功能连接的G418抗性基因

将G418抗性标记(pVR22；实施例1C)克隆到pNC2(实施例1A)内，该构建体被命名为pVR29(图15)。用酿酒酵母PGK启动子和酿酒酵母GAL10终止子表达G418抗性基因。以质粒pVR22(实施例1C)为模板，使用引物5′-GCT CTA GAT GAG CCA TAT TCA ACG GGAAAC(5′G片段；SEQ.ID NO.9)和5′-ATG GAT CCT TAG AAA AACTCA TCG AGC ATC(3′G片段；SEQ.ID NO.10)，用Pfu聚合酶(Stratagene，Madison，WI)PCR扩增G418抗性基因。此外，质粒pPIC9K(Invitrogen，Carlsbad，CA)也能够作为模板。热循环如下进行：开始时反应混合物95℃温育5min，然后95℃30sec，49℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育10min。PCR产物用BamHI和XbaI消化，分离一条821bp的片段，将其与pNC2的4303bpBamHI-XbaI片段连接。产生的质粒pVR29(图15)含有与G418抗性基因有效连接(即在酵母细胞中具有转录活性)的PGK启动子和GAL10终止子。

实施例3B：用于将DNA定向整合到马克斯克鲁维酵母PDC1基因座内的质粒

将位于马克斯克鲁维酵母PDC1基因侧翼的DNA序列克隆到质粒pVR29(实施例3A，图15)内，产生一种重组核酸，该核酸用于在PDC1基因座处进行定向DNA整合。产生的构建体被命名为pBH5a(图16a)。pBH5a含有一个SbfI限制酶切位点，该位点使克隆的基因与PDC1启动子有效连接。

以质粒pSO21(图7B，实施例1F)为模板，使用引物5′-CAA GAAGGT ACC CCT CTC TAA ACT TGA ACA-3′(5′-侧翼5′；SEQ ID No.31)和5′-GTA ATT CCT GCA GGT GCA ATT ATT TGG TTT GG-3′(5′-侧翼3′；SEQ ID No.32)，PCR扩增PDC1直接上游的DNA的1254bp片段。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃温育7min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离1254bp的PCR产物。PCR产物与pVR29(图15a)均用KpnI和SbfI消化。将消化的PCR产物与5067bp pVR29连接，产生6315bp pBH5a(见图11A)。产生的质粒含有一个与酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子有效连接的G418抗性基因，和与PDC1基因直接上游的DNA同源的DNA的一个1240bp片段。

以质粒pSO21(图7A)为模板，用引物5′-CCA AGC CCT GCAGGA GAG GGA GAG GAT AAA GA-3′(3′-侧翼5′；SEQ ID No.33)和5′-CTC GTA ACGCGT GTA CAA GTT GTG GAA CAA-3′(3′-侧翼3′：SEQ ID No.34)，PCR扩增位于PDC1直接下游的DNA的535bp片段。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec，共35个循环，最后72℃温育4min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，分离到535bp的产物。PCR产物用SbfI和MluI消化。该529bp片段与pBH5a的SbfI-MluI片段连接，产生质粒pBH5b。pBH5b含有PDC1直接上游的1.2kb DNA和直接下游的0.5kb DNA，在侧翼pdc1序列之间有一个唯一的SbfI位点，也含有与酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子有效连接的一个选择性G418抗性基因，如图16b所示。

也将PDC1(马克斯克鲁维酵母)基因座的一部分亚克隆到商品质粒pUC19(Invitrogen)内，产生pBH5c，如下所述。质粒pSO21用NheI和NdeI消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后分离到3339bp DNA片段，其含有位于PDC1直接上游的486bp DNA，PDC1的完整序列，和位于PDC1直接下游的1157bp DNA。用XbaI和NdeI消化pUC19，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离后分离到2452bp DNA片段。消化的pUC19和PDC1基因座连接在一起，产生5791bp pBH5c，如图16c所示。

实施例3C：用于将瑞士乳杆菌D-LDH基因定向整合到马克斯克鲁维酵母PDC1基因座内的质粒

将来自pVR48(实施例1K)的D-LDH基因克隆到pBH5b的SbfI位点内，产生一种重组核酸，该核酸能够将D-LDH整合到马克斯克鲁维酵母PDC1基因座内，并且在内源PDC1启动子和终止子的控制下表达D-LDH。

以pVR47(实施例1J)为模板，使用引物5′-TTT TTA CCT GCAGGC TAG ATT TAT GAC AAA GG-3′(Lh-D-LDH 5′；SEQ ID No.35)和5′-TCT ACC CCT GCA GGA AAA CTT GTT CTT GTTCA-3′(Lh-D-LDH 3′；SEQ ID No.36)，PCR扩增D-LDH基因。使用Failsafe PCR***(Epicentre，Madison，WI)进行热循环：94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，共30个循环，最后72℃温育4min。在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物，分离到1028bp的产物。PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离，分离1028bp产物。PCR产物用SbfI消化，将其与SbfI消化的6844bp pBH5b连接，产生7872bp质粒pBH6。pBH6含有与PDC1启动子和终止子有效连接的D-LDH基因，以及与酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子有效连接的G418抗性标记，如图17所示。

实施例3D：pBH6向PDC1基因座内的整合，产生马克斯克鲁维酵母CD588株

用含有D-LDH的整合质粒pBH6转化野生型马克斯克鲁维酵母(CD21)。将整个质粒整合到PDC1基因座内，方法是最初在pBH6D-LDH基因直接上游的侧翼PDC1DNA与染色体上PDC1基因直接上游的DNA之间进行单同源重组。产生的菌株含有PDC1的野生型拷贝以及在PDC1基因座处整合的单拷贝pBH6。

在250mL带挡板的摇瓶中，用CD21接种补充有100g/L葡萄糖的50mL YPD，至OD₆₀₀为0.1。培养物在30℃和250rpm下生长16小时，至终OD₆₀₀为12。从10mL培养物中离心收集细胞，用电穿孔缓冲液(EB；10mM Tris-Cl，270mM蔗糖，1mM MgCl₂，pH7.5)洗涤一次。将细胞重悬浮于温育缓冲液(YPD+25mM DTT，20mM HEPES，pH8.0)中，在30℃和250rpm下温育30分钟。离心收集细胞，用EB洗涤一次。将细胞重悬浮于1mL EB中，将400μL该悬液转移到一个0.4cm电穿孔杯中。向杯中加入总体积为50μL的12μg未酶切的pBH6，细胞以1.8kV，1000Ω，25μF电穿孔。将细胞转移到50mL螺帽Falcon管中的1mL YPD中，在30℃和250rpm振摇下温育4小时，之后选择性接种于含有300μg/mL G418的YPD上。这些转化子在37℃下生长2天。将生长的转化子在新鲜选择平板上划线。

通过pBH6D-LDH基因直接上游的侧翼PDC1DNA与马克斯克鲁维酵母染色体上PDC1基因直接上游的DNA之间的单同源重组，pBH6向PDC1基因座内的适当整合，使用下列引物证实：5′-AAG CAC CAAGGC CTT CAA CAG-3′(PDC1染色体5′；SEQ ID No.37)和5′-CTTGTC TTG ACG TAA TAC ACG TGC AGC-3′(D-LDH3′；SEQ ID No.38)，这些引物设计用来扩增一种2.7kb产物，该产物位于PDC1基因上游的且掺入pBH6中的同源区外部的染色体DNA与D-LDH基因之间。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，共35个循环，最后72℃温育7min。所分析的10个转化子中有7个产生预期2.7kb的PCR产物。使用用来扩增PDC1基因座的引物，5′-CGC AAA GAA AAG CTC CACACC-3′(PDC1 5′；SEQ ID No.39)和5′-CCC ATA CGC TTA TAATCC CCC-3′(PDC13′；SEQ ID No.40)，PCR分析产生两种产物：对应于PDC1的1.7kb带，和对应于D-LDH的1.0kb带。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共30个循环，最后72℃温育5min。使用检测G418抗性基因的探针进行Southern印迹分析，进一步证实单拷贝整合事件。所分析的7个转化子中有1个显示与整合一个pBH6拷贝相一致的适当带型。在PDC1基因座处含有一个pBH6拷贝的菌株通过PCR和Southern分析证实，被命名为CD588。

这些结果证实，转化的pBH6DNA向野生型马克斯克鲁维酵母CD21的PDC1基因座内的定向整合通过PDC1启动子序列之间的单同源重组发生。这些结果也证实，pBH6作为单拷贝存在于CD588株中。

实施例3E：CD588中pBH6质粒骨架和PDC1基因的丢失，产生马克斯克鲁维酵母CD587、CD589和CD590株

CD588在非选择性培养基上繁殖几轮，以促进整合的pBH6的PDC1终止子序列与天然PDC1终止子之间的第二次同源重组。终止子序列中的第二次同源重组事件产生PDC1基因被替换为D-LDH基因的菌株。由于第二次重组事件丢失了G418基因以及PDC1基因，该菌株不含G418抗性标记基因。获得的PDC1被替换为D-LDH的菌株显示G418敏感表型以及不能厌氧生长。

将CD588平板接种于YPD琼脂平板上，37℃培养过夜。将一个菌落拭子转移到新鲜的YPD琼脂平板上。重复4次。在YPD琼脂平板上第5轮非选择性培养后，用第5轮非选择性平板接种产生的CD588细胞接种6×250mL带挡板的摇瓶至OD₆₀₀＝0.1，其中含有补充了100g/L葡萄糖和42g/L CaCO₃的50mL YPD。摇瓶在30℃和250rpm下生长16小时。然后稀释培养物，将单菌落接种于YPD琼脂平板上。另外，将来自第5轮非选择性生长平板的菌落拭子悬浮于1mL PBS(磷酸缓冲液)中，随后稀释，用单菌落接种YPD琼脂平板。将这轮平板接种产生的单菌落接种于YPD琼脂上，置于厌氧培养室中。在37℃下生长2天后，打开厌氧培养室，标记厌氧生长的菌落。平板在37℃下再温育数天，将需氧而不是厌氧生长的菌落转移到三份平板上进行筛选。使用这些筛选条件的平板是YPD平板(需氧)、YPD平板(厌氧)和补充了300μg/mLG418的YPD平板。鉴定了三个转化子具有希望的表型，具有G418敏感性，不能厌氧生长。这些转化子被命名为CD587、CD589和CD590。

以来自CD587、CD589和CD590的染色体DNA为模板，使用用来扩增PDC1基因座的引物5′-CGC AAA GAA AAG CTC CAC ACC-3′(PDC15′；SEQ ID No.39)和5′-CCC ATA CGC TTA TAA TCC CCC-3′(PDC13′；SEQ ID No.40)，证实PDC1被D-LDH的置换。热循环如下进行：开始时反应混合物94℃温育2min，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，共35个循环，最后72℃温育5min。所有这三个菌株的染色体DNA都产生对应于D-LDH的一种1.0kb PCR产物。使用可与G418基因杂交的探针进行的Southern印迹分析表明不含G418基因。此外，使用PDC1编码区的探针进行的Southern分析不显示任何条带。用来与PDC1直接上游和下游区域杂交的探针产生大小与PDC1被D-LDH置换相一致的带。

这些结果证实，通过在CD588的PDC1基因座处存在的两个pdc1终止子之间发生的第二次同源重组事件，CD588的染色体上丢失了PDC1基因以及pBH6质粒骨架，后者含有与酿酒酵母PDC1启动子和GAL10终止子有效连接的G418抗性标记。这第二次重组事件产生一种菌株，其中PDC1基因被侧翼为SbfI位点的D-LDH基因正确地替代。

实施例3F：在复杂CaCO₃缓冲培养基中，单拷贝D-LDH已经整合到PDC1基因座内的马克斯克鲁维酵母微需氧摇瓶培养物的D-乳酸产生

在由YPD琼脂平板接种为OD600＝0.1后，Pdc+Lh-D-LDH CD588株和Pdc-Lh-D-LDH CD587、CD589、CD590株在250mL带挡板的摇瓶中培养，30℃和250rpm下16小时，摇瓶中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO₃的50mL YPD。在确定每个摇瓶中还有剩余的葡萄糖且细胞处于对数生长期后，离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/LCaCO₃的50mL YPD。将培养物置于30℃和70rpm下。以不同的时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、乳酸(盐)、丙酮酸(盐)和乙醇(如上实施例1M所述)。

23小时后，Pdc+Lh-D-LDH CD588株消耗了127g/L葡萄糖，产生33g/L乳酸盐、37g/L乙醇和0.2g/L丙酮酸(根)。Pdc-Lh-D-LDHCD587、CD589、CD590株消耗了40-43g/L葡萄糖，产生36-39g/L乳酸(盐)和1.0-1.3g/L丙酮酸(盐)。

54小时后，CD587、CD589、CD590消耗了85-88g/L葡萄糖，产生了81g/L乳酸(盐)和2.5g/L丙酮酸(盐)。这些乳酸滴度代表微需氧生产阶段92-95％的基于葡萄糖的收率，和大于1.5g/L/小时的容积生产率。54小时后，由于培养物中产生的高水平D-乳酸(盐)，形成一种不可溶的乳酸钙(“结块”)，妨碍了进一步的分析。根据实施例1L的酶学和GC分析显示，产生的99％以上的乳酸(盐)是D-乳酸(盐)。在CD587、CD589、CD590培养物中未检测到乙醇，这与PDC1被LDH替换相一致。

这些结果显示，D-LDH转化子能够产生D-乳酸。含有功能PDC1的乳酸产生使得乳酸和乙醇的产量大致相等，证明了D-LDH能够与天然PDC1竞争丙酮酸(盐)。通过将PDC1置换为来自瑞士乳杆菌的D-LDH，乳酸滴度提高两倍，获得接近理论最大值的高滴度和收率。此外，这些菌株不能产生乙醇，证实PDC1被D-LDH替换。这些菌株产生的乳酸的酶学分析显示，超过99％的乳酸是对映体纯的D-乳酸。

实施例3G：在高温下在复杂CaCO₃缓冲培养基中，马克斯克鲁维酵母株的微需氧摇瓶培养物的D-乳酸产生

野生型马克斯克鲁维酵母CD21、PDC+Lh-D-LDH CD588株和Pdc-Lh-D-LDH CD558和CD587株由YPD琼脂平板接种为OD₆₀₀＝0.1，在250mL带挡板的摇瓶中生长，33℃和250rpm下16小时，摇瓶中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO₃的50mL YPD。在确定每个摇瓶中还有剩余的葡萄糖且细胞处于对数生长期后，离心收集4g/L细胞干重当量，将其重悬浮于250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了100g/L葡萄糖和50g/L CaCO₃的50mL YPD。培养物在37℃、42℃或50℃和70rpm下生长。以不同的时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC法分析培养上清液的葡萄糖、乳酸(盐)、丙酮酸(盐)、乙酸(盐)、甘油和乙醇(参见实施例1M)。

23小时后，在37℃下发酵的PDC+Lh-D-LDH CD588株消耗了115.5g/L葡萄糖，产生了16.2g/L乳酸(盐)、37.6g/L乙醇，7.6g/L甘油，2.6g/L乙酸(盐)和0.2g/L丙酮酸(盐)。47小时后，PDC-Lh-D-LDH CD558株和CD587株已经消耗了99-105g/L葡萄糖，产生了90-99g/L乳酸盐，2.7-3.5g/L丙酮酸(盐)和1.2-1.4g/L乙酸(盐)。相反，野生型CD21株消耗了115.5g/L葡萄糖，主要产生乙醇(43.5g/L)和少量的乳酸(盐)(1.7g/L)。

23小时后，在42℃下发酵的PDC+Lh-D-LDH CD588株消耗了115.5g/L葡萄糖，产生12.8g/L乳酸(盐)，34.7g/L乙醇，6.9g/L甘油，3.0g/L乙酸(盐)和0.3g/L丙酮酸(盐)。在42℃下47小时后，PDC-Lh-D-LDH CD558株和CD587株消耗了80g/L葡萄糖，产生了75g/L乳酸(盐)，2.5g/L乙醇和1.5g/L乙酸(盐)。相反，野生型株CD21消耗了115.5g/L葡萄糖，主要产生乙醇(39.7g/L)和少量的乳酸盐(1.0g/L)。

47小时后，在50℃下发酵的PDC+Lh-D-LDH CD588株消耗了49.6g/L葡萄糖，产生了6.8g/L乳酸(盐)，9.5g/L乙醇，4.5g/L甘油和1.8g/L乙酸(盐)。在50℃下47小时后，PDC-LhD-LDH CD558株和CD587株消耗了15g/L葡萄糖，产生10g/L乳酸(盐)，1.2-1.4g/L丙酮酸(盐)和1.6-1.7g/L乙酸(盐)。相反，野生型CD21株消耗了70.5g/L葡萄糖，主要产生乙醇(13.6g/L)和少量乳酸(盐)(0.5g/L)。

这些结果证明，在高达50℃的温度下，D-Ldh+转化子能够产生D-乳酸。通过酶学分析测定，这些菌株产生的乳酸99％以上是对映体纯的D-乳酸。尽管随着温度升高总葡萄糖消耗和乳酸盐生产率下降，但是对于PDC-Lh-D-LDH CD558和CD587株，由葡萄糖产生乳酸(盐)的收率仍然为88-100％。

实施例3H：在未缓冲的复杂培养基中，单拷贝瑞士乳杆菌D-LDH已经整合到染色体内的马克斯克鲁维酵母株的微需氧摇瓶培养物的D-乳酸产生

野生型马克斯克鲁维酵母CD21株、PDC+Lh-D-LDH CD588株和PDC-Lh-D-LDH CD558和CD587株从YPD琼脂平板接种为OD₆₀₀＝0.1，在250mL带挡板的摇瓶中生长，在30℃和250rpm振摇下16小时，摇瓶中含有额外补充了100g/L葡萄糖的50mL YPD。在确定每个摇瓶中还有剩余的葡萄糖且细胞处于对数生长期后，离心收集4g/L细胞干重当量，将其一式两份重悬浮于250mL带挡板的摇瓶中，其中含有补充了40g/L葡萄糖的50mL YPD。将培养物置于37℃和70rpm下。以不同的时间间隔采样，过滤除去细胞。通过HPLC分析培养上清液的葡萄糖、乳酸(盐)、丙酮酸(盐)、乙酸(盐)、甘油和乙醇。

23小时后，PDC+Lh-D-LDH CD588株消耗了58.9g/L葡萄糖，产生了0.9g/L乳酸(盐)、0.2g/L丙酮酸(盐)、2.6g/L甘油和0.6g/L乙酸(盐)。培养物的终pH为4.6。乙醇是这种发酵的主要产物，为24-24.7g/L。23小时后，PDC-Lh-D-LDH CD558和CD587株消耗了4.1g/L葡萄糖，产生2.5g/L乳酸(盐)、1.0g/L丙酮酸(盐)、0.8g/L甘油和0.4g/L乙酸(盐)。CD587和CD558株培养物的终pH为3.31-3.65。乳酸(盐)是这种发酵的主要产物，水平为1.2-3.3g/L。野生型CD21株在23小时内消耗了58.9g/L葡萄糖，主要产生乙醇(12.8-20.4g/L)，以及少量乳酸(盐)(1.2-1.3g/L)，终pH为4.65。

这些结果显示，在低至3.31的pH值时，D-Ldh+转化子产生D-乳酸。这些菌株产生的乳酸的酶学分析显示，99％以上的乳酸是对映体纯的D-乳酸。

实施例3I：菌株中由D-木糖产生D-乳酸

分析3种工程马克斯克鲁维酵母株与CD21(野生型)相比，由D-木糖产生D-乳酸，包括CD558(含有随机整合的瑞士乳杆菌D-LDH的PDC1无效)、CD587(PDC1∷Lh-D-LDH)和CD588(含有瑞士乳杆菌D-LDH)。下列结果证实，这些工程菌株能够由非葡萄糖底物产生D-乳酸。

CD21、CD558、CD587和CD588株的细胞在YPD+20g/L D-木糖琼脂平板上生长，用来接种含有100mL培养基的带挡板的摇瓶，该培养基中含有20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、17g/L CaCO₃和50g/LD-木糖。接种的摇瓶在35℃和250rpm振摇下温育。从摇瓶中采样，测量OD_600nm，以监测培养物的生长和糖利用。大约36小时后，离心收集细胞，称量每个培养物的细胞干重(CDW)。向含有20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和50g/L D-木糖的两个带挡板的摇瓶中加入来自每个菌株的3.0g/L CDW细胞。摇瓶在35℃和70rpm振摇下温育。在不同时间点采样，进行HPLC分析和培养基成分定量，包括木糖、D-乳酸(盐)、木糖醇和乙醇。

CD558和CD587株产生的主要有机成分是D-乳酸，达到13.7g/kg的平均最高滴度。这使得由D-木糖产生D-乳酸的收率约为33％。CD21株产生的主要有机成分是木糖醇，达到25.0g/kg的平均最高滴度。这使得由D-木糖产生木糖醇的收率约为50％。CD588株产生的主要有机成分是木糖醇，达到19.6g/kg的平均最高滴度。这使得由D-木糖产生木糖醇的平均收率约为44％。在所有菌株中，HPLC分析无法检测到任何甘油、柠檬酸、丙酮酸(盐)、琥珀酸或乙酸的产生。

实施例4：用于表达巨大芽孢杆菌D-LDH以及将转化的DNA定向整合到PDC1基因座内的质粒

含有向C.sonorensis PDC1基因座内定向整合的巨大芽孢杆菌D-LDH基因的质粒如下制备：

质粒pMI257(加拿大申请)用NcoI线性化，其5′突出端用DNA聚合酶I Klenow片段和dATP、dCTP和dTTP的混合物部分补平，该反应中省略dGTP。随后用绿豆核酸酶处理去除单链延伸。然后用BamHI消化该DNA，在电泳分离后从0.8％琼脂糖凝胶中分离到9200bp片段。含有巨大芽孢杆菌D-LDH的质粒pVR47(实施例1J)由巨大芽孢杆菌基因组DNA产生，如图12所示。通过XbaI消化，随后用DNA聚合酶IKlenow片段和全部4种dNTP补平5′突出端，以及BamHI消化，从pVR47上切下含有巨大芽孢杆菌LDH的1023bp片段。连接来自pMI257的9200bp NcoI(平端)-BamHI片段和来自pVR47的976bpXbaI(平端)-BamHI片段，获得的质粒被命名为pMIXXX，如图18所示。pMI1000依次含有C.sonorensis PDC1启动子、与酿酒酵母MEL5基因有效连接的C.sonorensis PGK1启动子、与巨大芽孢杆菌D-LDH有效连接的C.sonorensis PGK1启动子和C.sonorensis PDC1终止子。用NotI消化PMI1000，切下7300bp的片段，该片段含有MEL5和LDH表达盒，其侧翼为PDC1 5′和3′区。用这个7500bp片段转化C.sonorensis(假丝酵母文档filing)，在补充了浓度为40μg/mL的X-α-gal的YPD平板上筛选这些转化子。这些转化子在补充了X-α-gal(40μg/mL)的YPD琼脂平板上生长。

应当理解，上述公开内容强调了本发明的某些具体实施方案，与之相当的所有修饰和改变都在如权利要求书所述的本发明的精神和范围之内。此处引用的所有参考文献均全文引用作为参考。

序列表

<110>Cargill Dow Polymers LLC

Rajgarhia，Vineet

Aslesorn，Catherine

Olson，Stacey

Suominen，Pirkko

<120>在酵母中生产D-乳酸的方法和材料

<130>00-1237-Q

<150>US 60/384,333

<151>2002-05-30

<160>43

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>848

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>1

gcggccgcgg atcgctcttc cgctatcgat taattttttt ttctttcctc tttttattaa 60

ccttaatttt tattttagat tcctgacttc aactcaagac gcacagatat tataacatct 120

gcacaatagg catttgcaag aattactcgt gagtaaggaa agagtgagga actatcgcat 180

acctgcattt aaagatgccg atttgggcgc gaatccttta ttttggcttc accctcatac 240

tattatcagg gccagaaaaa ggaagtgttt ccctccttct tgaattgatg ttaccctcat 300

aaagcacgtg gcctcttatc gagaaagaaa ttaccgtcgc tcgtgatttg tttgcaaaaa 360

gaacaaaact gaaaaaaccc agacacgctc gacttcctgt cttcctattg attgcagctt 420

ccaatttcgt cacacaacaa ggtcctagcg acggctcaca ggttttgtaa caagcaatcg 480

aaggttctgg aatggcggga aagggtttag taccacatgc tatgatgccc actgtgatct 540

ccagagcaaa gttcgttcga tcgtactgtt actctctctc tttcaaacag aattgtccga 600

atcgtgtgac aacaacagcc tgttctcaca cactcttttc ttctaaccaa gggggtggtt 660

tagtttagta gaacctcgtg aaacttacat ttacatatat ataaacttgc ataaattggt 720

caatgcaaga aatacatatt tggtcttttc taattcgtag tttttcaagt tcttagatgc 780

tttctttttc tcttttttac agatcatcaa ggaagtaatt atctactttt tacaacaaat 840

ctagaatt 848

<210>2

<211>376

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>2

gtagatacat tgatgctatc aatccagaga actggaaaga ttgtgtagcc ttgaaaaacg 60

gtgaaactta cgggtccaag attgtctaca gattttcctg atttgccagc ttactatcct 120

tcttgaaaat atgcactcta tatcttttag ttcttaattg caacacatag atttgctgta 180

taacgaattt tatgctattt tttaaatttg gagttcagtg ataaaagtgt cacagcgaat 240

ttcctcacat gtagggaccg aattgtttac aagttctctg taccaccatg gagacatcaa 300

aaattgaaaa tctatggaaa gatatggacg gtagcaacaa gaatatagca cgagccgcgg 360

atttatttcg ttacgc 376

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PSPDCS1引物

<400>3

ccatcgataa caagctcatg caaagag 27

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PSPDCAS2引物

<400>4

gctctagatt tgactgtgtt attttgcg 28

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BM1270引物

<400>5

cctgagtcca cgtcattatt c 21

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>BM179引物

<400>6

tgaagctatt tattcttgtt ac 22

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Bmeg5′引物

<400>7

gctctagatg aaaacacaat ttacacc 27

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Bmeg3′引物

<400>8

atggatcctt acacaaaagc tctgtcgc 28

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′G片段引物

<400>9

gctctagatg agccatattc aacgggaaac 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′G片段引物

<400>10

atggatcctt agaaaaactc atcgagcatc 30

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO-M2引物

<400>11

cttccagtcc agcaggtcga ccag 24

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO-M1引物

<400>12

gtccagcatg tcgaccag 18

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO-M4引物

<400>13

gaacgaaacg aacttctctc 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO-M5引物

<400>14

cttggaactt cttgtcagtg 20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO4549引物

<400>15

ccatccgaag aagtcgatct c 21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO285引物

<400>16

cttgccatcc tatggaactg c 21

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>-SO2740引物

<400>17

gaaggctggg aattgagtga 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SO2444引物

<400>18

gctccatctg aaatcgacag 20

<210>19

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′HYGXBA1引物

<400>19

aagctctaga tgaaaaagcc tgaactcac 29

<210>20

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′HYGBAMH1引物

<400>20

cgcggatccc tattcctttg ccctcggac 29

<210>21

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR150引物

<400>21

ggttggattt atgacaaagg ttttgctt 28

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR153引物

<400>22

aattaaaact tgttcttgtt caaagcaact 30

<210>23

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR165引物

<400>23

cgtctagatt tatgacaaag gttttgct 28

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR166引物

<400>24

gcggatcctt aaaacttgtt cttgttcaa 29

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR161引物

<400>25

agttggtgta tttaacaagg 20

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR142引物

<400>26

gtgacaccct gtgcacggcg ggagatg 27

<210>27

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR173引物

<400>27

gcgacggctc acaggttttg 20

<210>28

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VR170引物

<400>28

cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc 27

<210>29

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>oCA85引物

<400>29

ggaccgatgg ctgtgtagaa 20

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>oCA80引物

<400>30

tcgcttacct cggtacagaa 20

<210>31

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′-侧翼5′引物

<400>31

caagaaggta cccctctcta aacttgaaca 30

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>5′-侧翼3′引物

<400>32

gtaattcctg caggtgcaat tatttggttt gg 32

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′-侧翼5′引物

<400>33

ccaagccctg caggagaggg agaggataaa ga 32

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>3′-侧翼3′引物

<400>34

ctcgtaacgc gtgtacaagt tgtggaacaa 30

<210>35

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Lh-D-LDH 5′引物

<400>35

tttttacctg caggctagat ttatgacaaa gg 32

<210>36

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Lh-D-LDH 3′引物

<400>36

tctacccctg caggaaaact tgttcttgtt ca 32

<210>37

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1 Chromosome 5′引物

<400>37

aagcaccaag gccttcaaca g 21

<210>38

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>D-LDH 3′引物

<400>38

cttgtcttga cgtaatacac gtgcagc 27

<210>39

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1 5′引物

<400>39

cgcaaagaaa agctccacac c 21

<210>40

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PDC1 3′引物

<400>40

cccatacgct tataatcccc c 21

<210>41

<211>1235

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>41

ggccgcggat cgctcttccg ctatcgatta attttttttt ctttcctctt tttattaacc 60

ttaattttta ttttagattc ctgacttcaa ctcaagacgc acagatatta taacatctgc 120

acaataggca tttgcaagaa ttactcgtga gtaaggaaag agtgaggaac tatcgcatac 180

ctgcatttaa agatgccgat ttgggcgcga atcctttatt ttggcttcac cctcatacta 240

ttatcagggc cagaaaaagg aagtgtttcc ctccttcttg aattgatgtt accctcataa 300

agcacgtggc ctcttatcga gaaagaaatt accgtcgctc gtgatttgtt tgcaaaaaga 360

acaaaactga aaaaacccag acacgctcga cttcctgtct tcctattgat tgcagcttcc 420

aatttcgtca cacaacaagg tcctagcgac ggctcacagg ttttgtaaca agcaatcgaa 480

ggttctggaa tggcgggaaa gggtttagta ccacatgcta tgatgcccac tgtgatctcc 540

agagcaaagt tcgttcgatc gtactgttac tctctctctt tcaaacagaa ttgtccgaat 600

cgtgtgacaa caacagcctg ttctcacaca ctcttttctt ctaaccaagg gggtggttta 660

gtttagtaga acctcgtgaa acttacattt acatatatat aaacttgcat aaattggtca 720

atgcaagaaa tacatatttg gtcttttcta attcgtagtt tttcaagttc ttagatgctt 780

tctttttctc ttttttacag atcatcaagg aagtaattat ctacttttta caacaaatct 840

agaattcgga tccggtagat acattgatgc tatcaatcaa gagaactgga aagattgtgt 900

aaccttgaaa aacggtgaaa cttacgggtc caagaccctc tacagatttt cctgatttgc 960

cagcttacta tccttcttga aaatatgcac tctatatctt ttagttctta attgcaacac 1020

atagatttgc tgtataacga attttatgct attttttaaa tttggagttc agtgataaaa 1080

gtgtcacagc gaatttcctc acatgtagga ccgaattgtt tacaagttct ctgtaccacc 1140

atggagacat caaagattga aaatctatgg aaagatatgg acggtagcaa caagaatata 1200

gcacgagccg cggatttatt tcgttacgca tgcgc 1235

<210>42

<211>1314

<212>DNA

<213>酿酒酵母

<400>42

ggccgcggat cgctcttccg ctatcgataa caagctcatg caaagaggtg gtacccgcac 60

gccgaaatgc atgcaagtaa cctattcaaa gtaatatctc atacatgttt catgagggta 120

acaacatgcg actgggtgag catatgttcc gctgatgtga tgtgcaagat aaacaagcaa 180

ggcagaaact aacttcttct tcatgtaata aacacacccc gcgtttattt acctatctct 240

aaacttcaac accttatatc ataactaata tttcttgaga taagcacact gcacccatac 300

cttccttaaa aacgtagctt ccagtttttg gtggttccgg cttccttccc gattccgccc 360

gctaaacgca tatttttgtt gcctggtggc atttgcaaaa tgcataacct atgcatttaa 420

aagattatgt atgctcttct gacttttcgt gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat 480

ttatgaattt gagaacaatt ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa 540

ttgaggattt tatgcaaata tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc 600

ataattgcat aatattgtcc gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg 660

ctatcgttca acaccacctt attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct 720

tatggtgatg gcacattttt gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa 780

atatataaac aaggctcttt cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt 840

ttcatatttc ttgtcatatt cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa 900

aataacacag tcaaatctag aattcggatc cggtagatac attgatgcta tcaatccaga 960

gaactggaaa gattgtgtag ccttgaaaaa cggtgaaact tacgggtcca agattgtcta 1020

cagattttcc tgatttgcca gcttactatc cttcttgaaa atatgcactc tatatctttt 1080

agttcttaat tgcaacacat agatttgctg tataacgaat tttatgctat tttttaaatt 1140

tggagttcag tgataaaagt gtcacagcga atttcctcac atgtagggac cgaattgttt 1200

acaagttctc tgtaccacca tggagacatc aaaaattgaa aatctatgga aagatatgga 1260

cggtagcaac aagaatatag cacgagccgc ggatttattt cgttacgcat gcgc 1314

<210>43

<211>1014

<212>DNA

<213>瑞士乳杆菌

<400>43

atgacaaagg tttttgctta cgctattcga aaagacgaag aaccattctt gaatgaatgg 60

aaggaagctc acaaggatat cgatgttgat tacactgata aacttttgac tcctgaaact 120

gctaagctag ctaagggtgc tgacggtgtt gttgtttacc aacaattaga ctacactgca 180

gatactcttc aagctttagc agacgctggc gtaactaaga tgtcattacg taacgttggt 240

gttgacaaca ttgatatgga caaggctaag gaattaggtt tccaaattac caatgttcct 300

gtttactcac caaacgctat tgctgaacat gctgctattc aggctgcacg tgtattacgt 360

caagacaagc gcatggacga aaagatggct aaacgtgact tacgttgggc accaactatc 420

ggccgtgaag ttcgtgacca agttgtcggt gttgttggta ctggtcacat tggtcaagta 480

tttatgcgta ttatggaagg tttcggtgca aaggttattg cttacgatat cttcaagaac 540

ccagaacttg aaaagaaggg ttactacgtt gactcacttg acgacttgta caagcaagct 600

gatgtaattt cacttcacgt accagatgtt ccagctaacg ttcacatgat caacgacaag 660

tcaatcgctg aaatgaaaga cggcgttgta attgtaaact gctcacgtgg tcgacttgtt 720

gacactgacg ctgtaatccg tggtttggac tcaggcaaga tcttcggctt cgttatggat 780

acttacgaag acgaagttgg tgtatttaac aaggattggg aaggtaaaga attcccagac 840

aagcgtttgg cagacttaat tgatcgtcca aacgtattgg taactccaca caccgccttc 900

tacactactc acgctgtacg taacatggtt gttaaggcat tcaacaacaa cttgaagtta 960

atcaacggcg aaaagccaga ttctccagtt gctttgaaca agaacaagtt ttaa 1014

Claims

1.来自不能自然积累丙酮酸的种的一种重组酵母细胞，它含有整合到其基因组内的至少一个外源D-乳酸脱氢酶基因，其中该D-乳酸脱氢酶基因与功能启动子和终止子序列有效连接。

2.权利要求1的重组酵母细胞，它属于假丝酵母属(Candida)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)。

3.权利要求2的重组酵母细胞，其中该细胞属于C.sonorensis或马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)种。

4.权利要求1的重组酵母细胞，其中所述启动子序列与对于该酵母种而言天然的启动子至少90％同源。

5.权利要求4的重组酵母细胞，其中所述终止子序列与对于该酵母种而言天然的终止子至少90％同源。

6.权利要求4的重组酵母细胞，其中所述酵母种含有一个具有天然PDC启动子的天然PDC基因，所述启动子序列与天然PDC启动子至少90％同源。

7.权利要求6的重组酵母细胞，其中所述天然PDC基因含有一个天然PDC终止子，所述终止子序列与天然PDC终止子至少90％同源。

8.权利要求7的重组酵母细胞，其中所述天然PDC基因缺失。

9.权利要求1的重组酵母细胞，其中所述酵母种含有天然PDC基因，且天然PDC基因缺失。

10.权利要求1的重组酵母细胞，其中所述核苷酸序列编码D-乳酸脱氢酶蛋白质，该蛋白质来源于瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。

11.权利要求10的重组酵母细胞，其中所述启动子来源于克鲁维酵母属或酵母属的酵母种。

12.权利要求11的重组酵母细胞，其中所述启动子来源于马克斯克鲁维酵母。

13.权利要求11的重组酵母细胞，其中所述启动子来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

14.权利要求1的重组酵母细胞，它显示降低的PDC活性。

15.权利要求8的重组酵母细胞，其中所述D-LDH基因整合到缺失的PDC基因的基因座处。

16.一种将碳水化合物发酵为乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养权利要求1的细胞。

17.一种将碳水化合物发酵为乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养权利要求8的细胞。

18.一种将碳水化合物发酵为乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养权利要求9的细胞。

19.一种将碳水化合物发酵为乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的碳水化合物的培养基中培养权利要求14的细胞。

20.根据权利要求16、17、18或19的方法的一种方法，它还包括将至少一部分乳酸转化为丙交酯的步骤。

21.权利要求20的方法，它还包括聚合丙交酯形成一种聚丙交酯聚合物或共聚物的步骤。

22.一种生产乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求1的细胞。

23.一种生产乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求8的细胞。

24.一种生产乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求9的细胞。

25.一种生产乳酸的方法，包括在发酵条件下在含有可被该细胞发酵的糖的培养基中培养权利要求14的细胞。

26.根据权利要求22、23、24或25的一种方法，它还包括将至少一部分乳酸转化为丙交酯的步骤。

27.权利要求26的方法，它还包括聚合丙交酯形成一种聚丙交酯聚合物或共聚物的步骤。