CN1185174A

CN1185174A - 核酸类的制备方法

Info

Publication number: CN1185174A
Application number: CN96194140A
Authority: CN
Inventors: 臼田佳弘; 川崎寿; 岛冈惠; 宇多川隆
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1998-06-17
Anticipated expiration: 2016-03-22
Also published as: BR9607745A; HUP9801687A2; HUP9801687A3; US6673576B1; WO1996030501A1; EP0816491A1; JP3948027B2; KR19980703254A; DE69637616D1; CA2216172A1; EP0816491A4; PL322580A1; KR100376635B1; ES2311289T3; CN1130457C; EP0816491B1; PL184520B1

Abstract

本发明涉及利用可再生三磷酸腺苷(ATP)的微生物从肌苷和鸟苷或其前体制备可用于调味品的5′－肌苷酸或5′－鸟苷酸的制备方法,其中该微生物中含有编码具有从肌苷或鸟苷生成5′－肌苷酸或5′－鸟苷酸活性蛋白质的DNA;以及涉及具有肌苷—鸟苷激酶活性的新型蛋白质、编码该蛋白的基因,含有该基因的重组DNA及其转化的微生物。

Description

核酸类的制备方法

技术领域

本发明涉及利用可再生磷酸腺苷(ATP)的微生物，从肌苷或者鸟苷或它们的前体制备可用于调味品的5′-肌苷酸或者5′-鸟苷酸的制备方法，其中该微生物含有编码具有从肌苷或鸟苷生成5′-肌苷酸或5′鸟苷酸的活性的蛋白质的DNA。

另外，本发明还涉及具有肌苷-鸟苷激酶活性的新型蛋白质，及编码该蛋白质的基因，含该基因的重组DNA，及转化的微生物。

背景技术

已开发的用微生物磷酸化肌苷产生5′-肌苷酸的方法有如使用磷酸对硝基苯的方法(特公昭39-29858)，使用无机磷酸的方法(特公昭42-1186号，特公昭49-44350)，使用乙酰基磷酸的方法(特开昭56-82098)使用ATP的方法(特开昭63-230094)等等。但是，这样产生的5′-肌苷酸的积累并不能一定满足需要。

另外，作为用ATP磷酸化肌苷的改良方法，有取得到编码大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶的基因后利用重组DNA技术获得肌苷-鸟苷生成5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸的方法(WO91/08286)。但是必需另外培养可再生反应中消耗的ATP的微生物，从而希望有一种高效率的制备5′-肌苷酸及5′-鸟苷酸的方法。

而且，已知肌苷-鸟苷激酶基因只在大肠杆菌(普通微生物学杂志，135，1263-1273(1989))等部分微生物中存在。

本发明人对更有效地制备5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸的方法进行了开发，结果发现将编码肌苷-鸟苷激酶的基因导入到具有充分的再生反应中消耗的ATP功能的微生物中，从而可简便高积累地获得5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸。而且，发现了与得自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶有不同的氨基酸序列的新的肌苷-鸟苷激酶。

发明公开

本发明涉及从肌苷或者鸟苷或者它们的前体简便且高积累地制备可用作调味品等的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的方法。更具体地说，本发明通过用对反应中消耗的ATP有充分畀生能力的微生物中导入编码将肌苷和/或鸟苷转变为5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸的活性蛋白质的基因，不需要另外培养在反应液中消耗的有ATP再生能力的微生物，仅需在导入了前述基因的微生物的存在下就可简单、高效地获得5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸。

另外，本发明提供了可获自乙酰微小杆菌且具有将肌苷和/或鸟苷转化为5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸的活性的新型蛋白质，编码该蛋白质的基因，含有该基因的重组DNA，由该重组DNA转化的微生物，以及利用该微生物制备5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸的方法。

本发明所述的新蛋白质，是与已知的肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质相比氨基酸序列有大幅度变异的新型蛋白质。来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶是已知的。本发明人已发现可从尚不知道有肌苷-鸟苷激酶活性的微小杆菌属微生物中产生有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质。从中成功地分离了该蛋白并克服了编码基因。该蛋白与已知的蛋白质相比氨基酸序列有很大不同。

与以前的肌苷-鸟苷激酶活性蛋白相比，氨基酸序列有很大不同的蛋白质，其有同样的活性，这是本发明人的新发现。

即本发明涉及：

(1)5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其特征在于将导入了编码有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质基因的可再生ATP的微生物的转化子与肌苷或鸟苷或它们的前体、磷酸供体、能源接触反应，在反应液中生成和积累5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸并收集的方法；

(2)上述(1)的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中可再生ATP的微生物选自棒杆菌属、大肠杆菌属、糖酵母属、葡萄球菌属以及假丝酵母属；

(3)上述(1)的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中可再生ATP的微生物是产氨棒杆菌；

(4)上述(1)-(3)任一项所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来自乙酰微小杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因；

(5)上述(1)-(3)任一项所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因；

(6)在可再生ATP的微生物中导入了编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因的转化子；

(7)上述(6)的转化子，其中可再生ATP的微生物选自棒杆菌属、大肠杆菌属、糖酵母属、葡萄球菌属以及假丝酵母属；

(8)上述(6)的转化子，其中可再生ATP的微生物是产氨棒杆菌；

(9)上述(6)-(8)任一项的转化子，其中编码具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质的基因是来源于乙酰微小杆菌或者可与所述基因杂交的基因；

(10)上述(6)-(8)任一项的转化子，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因；

(11)可在产氨棒杆菌中复制并且含有编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因的重组DNA；

(12)上述(11)的重组DNA，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于乙酰微小杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因；

(13)上述(11)的重组DNA，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因；

(14)可从乙酰微小杆菌微生物得到并且具有以下性质的肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质：

①作用

在磷酸供体的存在下，可向核苷转移磷酸基生成核苷5′-磷酸；

②底物特异性

核苷三磷酸γ磷酸基被转移至其它的核苷；

③最适pH

pH7.7-9.9；

④pH稳定性

pH6.7-12.1；

⑤最适温度

30-50℃；

⑥要求金属

镁离子、锰离子、钴离子或铁离子；

⑦金属离子的影响

铜离子、汞离子强烈抑制其活性；

锌离子、镉离子也抑制其活性；

⑧Km值

对鸟苷Km 0.03mM

对肌苷Km 1mM

当用鸟苷作底物时，ATP的Km值是1.6mM；

⑨分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中约36kD。

(15)一种具有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质，其具有序列表中序列号2所记载的氨基酸序列，或者该氨基酸序列的一部分有氨基酸的缺失，取代或添加；

(16)编码上述(14)或(15)的蛋白质的基因；

(17)一种编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质，并具有序列表中序列号1所示的碱基序列，或者可与具有该碱基序列的基因杂交的基因。

下面在本说明书中，将利用ATP使肌苷或鸟苷磷酸化分别生成5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的活性，称为“肌苷-鸟苷激酶活性”。而且，具有同样活性的蛋白质也称为“肌苷-鸟苷激酶”。对反应中消费的ATP有充分再生能力的微生物称为“ATP生产菌”或“ATP再生菌”。

本发明更详细地说明如下。

本发明所谓的肌苷-鸟苷激酶，是催化用ATP磷酸化肌苷-鸟苷分别生成5′-肌苷酸及5′-鸟苷酸的反应的酶。该酶的来源没有特别限制，但优选来自微生物。不仅包含获自乙酰微小杆菌的新的酶，还包含已知的获自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶。

本发明的可获自乙酰微小杆菌等微生物，而且具有肌苷-鸟苷激酶活性的新型蛋白质，可通过培养该类微生物，将得到的菌体破碎后得到粗酶提出液，并从粗酶液纯化该酶。这类微生物的具体实例可举出：乙酰微小杆菌ATCC953。

而且，从分类学上讲，乙酰微小杆菌以前叫做乙酰短杆菌(伯杰氏***细菌学手册，第1301-1313页(1988))，但是基因分析的结果提议应将乙酰短杆菌归属到微小杆菌属称为乙酰微小杆菌。(国际***细菌学杂志44，74-82(1994))。

肌苷-鸟苷激酶的纯化方法，可使用任何一种只要不破坏肌苷-鸟苷激酶的活性的方法，一般使用液相柱层析的方法。具体地说，最好适当地组合使用利用氯化钾浓度梯度的离子交换层析，利用硫酸铵浓度梯度的疏水层析，利用磷酸缓冲液浓度梯度的吸附层析等等。

本发明的酶可获自乙酰微小杆菌等微生物，而且，具有肌苷-鸟苷激酶活性，其性质如下：

1.作用

在磷酸供体的存在下，向核苷转移磷酸基团生成核苷5′-一磷酸。

作为磷酸供体的核苷三磷酸可列举出：ATP、2′-脱氧腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、2′-脱氧鸟苷三磷酸和胸苷三磷酸等。

接受转移的磷酸基团的核苷可例举出：肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷等。

核苷5′-一磷酸即上述的核苷5′-一磷酸可举出：5′-肌苷酸、5′-鸟苷酸、2′-脱氧-5′-鸟苷酸等。

2.底物特异性

核苷三磷酸的γ位的磷酸基团被转移到了其它核苷。

核苷三磷酸可例举出：腺苷三磷酸、2′-脱氧腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、2′-脱氧鸟苷三磷酸、胸苷三磷酸等。

接受转移的磷酸基团的其它核苷可例举出：肌苷、鸟苷、2′-脱氧鸟苷等。

3.最适pH

最适pH值为pH7.7-9.9。

4.pH稳定性

在pH6.7-12.1范围内活性稳定。

5.最适温度

最适温度为30-50℃。

6.温度稳定性

40℃以上失活。

7.是否需要金属

在反应中需要金属离子。反应需要在镁离子、锰离子、钴离子或铁离子的存在下进行。

8.金属离子的影响

受铜离子、汞离子强烈抑制，也受锌离子、镉离子抑制。

9.Km值

对鸟苷Km值为0.03mM，对肌苷Km值为1mM，在用鸟苷为底物时，ATP的Km为1.6mM。

10.分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电解中约为36kD。

含有编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的结构基因的DNA片段，可利用纯化的蛋白质通过已知的方法制得。例如，制备上述蛋白质的抗体，筛选染色体基因的表达文库的方法，分析纯化的蛋白质的氨基酸序列，以此为基础合成探针筛选基因文库的方法。对于氨基酸序列来说，除了N末端序列之外，还可利用由适当的蛋白酶消化得到的片段而确定的内部的氨基酸序列。对探针来说，可使用：以N末端氨基酸序列或者内部氨基酸序列为基础合成的寡核苷酸，以N末端氨基酸或者内部氨基酸为基础制备的寡核苷酸作为引物通过聚合酶链反应扩增的对应于该区域的扩增产物，以N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列为基础分别合成的寡核苷酸为引物，用PCR方法扩增的对应于从N末端到内部的基因区域的扩增产物。另外，还有方法通过将染色体与称为盒的双链寡核苷酸序列连接，根据以N末端氨基酸序列为基础合成的寡核苷酸的引物以及以盒的序列为基础合成的引物通过PCR方法从而得到目的片段(分子和细胞探针，6,467(1992))。更具体地说，乙酰微小杆菌的编码有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因取得的如下：用PCR扩增N末端氨基酸序列对应的DNA片段，以此为基础合成引物，用盒以PCR扩增而得到。

来自乙酰微小杆菌ATCC 953的蛋白质N末端28个氨基酸的序列分析结果如序列表中序列号3所示(18位的氨基酸未确定)。

根据该N末端氨基酸序列，来自乙酰微小杆菌的蛋白质，与已知的来自大肠杆菌的WO91/08286中记述的肌苷-鸟苷激酶是完全不同的蛋白质。

对于目的基因的取得，还可以乙酰微小杆菌属微生物的染色体为模板，用在上述氨基酸序列基础上合成的引物通过PCR特异性扩增编码有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质N末端氨基酸序列部分的基因，并克隆之。对引物来说，满足条件为通常碱基组成是随机的，G+C含量在50％左右，不形成特异的二级结构，相互不互补，长度为16至30碱基。如序列表中序列号4和5所示，引物的结构是位于N末端氨基酸序列的两端。

但是，对序列号4来说，6位的核苷酸是T和C的混合物；9位的核苷酸是A和G的混含物；12位的核苷酸是T、C和A的混合物；15位的核苷酸是T、C、A和G的混合物。另外，对序列号5来说，3位和12位的核苷酸是T和C的混合物，6位的核苷酸是T、C、A和G的混合物，9位和15位的核苷酸是A和G的混合物。

接下来，用适当的限制性酶消化属于乙酰微小杆菌的微生物的染色体，将该消化产物与盒连接作为模板，利用编码N末端氨基酸序列部分基因的序列为基础合成的引物和在盒基础上合成的引物通过PCR方法特异性扩增含有肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的结构基因部分或其上游区域的DNA。可使用满足上述条件的引物，具体地如序列表中序列号6和7所示。

只要能在宿主大肠杆菌中自主复制载体均可用作基因克隆的载体。例如，可使用pUC19、pHSG298、pHSG398、pBR322等。任何适于载体复制的菌株都可作为所制备的重组DNA的接受菌，例如可使用HB101、JM109、DH5等大肠杆菌菌株。

通过确定***到载体中的DNA上的碱基序列，可确定存在于该DNA片段上的肌苷-鸟苷激酶的基因碱基序列及由其编码的蛋白质的氨基酸序列。乙酰微小杆菌ATCC953的肌苷-鸟苷激酶的碱基序列和氨基酸序列如序列表中序列号1和2所示。

本蛋白质由303个氨基酸组成，分子量约32.5kD。本发明的蛋白质不仅仅包括如序列表中序列号2所示的蛋白质，还包括可从属于乙酰微小杆菌的菌株中得到的蛋白质，以及其它具有肌苷-鸟苷激酶活性的其它天然变异体。

另外，对本领域的技术人员都知道，只要有肌苷-鸟苷蛋白酶活性，该氨基酸的一部分进行取代，一部分进行删除，更进一步地添加氨基酸或者蛋白质的一部分被修饰都是可以的。

另外，只要编码肌苷-鸟苷激酶，代替来自乙酰微小杆菌的基因，也可使用能与该基因杂交的基因。

可与来自乙酰微小杆菌的基因，杂交的基因可从下面的菌株中取得：

乙酰微小杆菌 ATCC35652

吉氏库特氏菌 ATCC43195

佐氏库特氏菌 JCM6101

该基因可用已知的利用同源性的方法获得，具体地可用下述方法取得。

首先，将上述微生物的染色体DNA用适当的限制酶消化，琼脂糖凝胶电泳。将切断的片段在适当的转移滤膜上印迹，用来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因作为探针用Sourthern杂交检测同源性片段，确定大小。

接着，在限制性酶消化的片段中纯化目的大小的片段。纯化方法一般用蔗糖密度梯度离心法或者用玻璃粉从琼脂糖凝胶中分离。将得到的纯化片段与适当的载体连接，得到大肠杆菌转化子。从该转化子中用菌落杂交方法选择含有肌苷-鸟苷激酶目的基因片段的菌株。

在本发明中可使用已知肌苷-鸟苷编码基因代替前述的新的肌苷-鸟苷激酶编码基因。

已知肌苷-鸟苷激酶基因有来自大肠杆菌的基因(普通微生物学，135，1263-1237(1989))例如可从下面的菌株中获得：

大肠杆菌ATCC 27325

已知的肌苷-鸟苷激酶编码基因可用已知的方法取得，以下述的方法可从大肠杆菌ATCC 27325的染色体DNA取得本发明所用的编码肌苷-鸟苷激酶的基因。

首先，根据序列表中序列号10所示的来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的序列(WO91/08286)合成引物。对于引物来说，通常碱基组成是随机的，G+C含量约50％左右，不形成特殊的二级结构，相互不互补，长度16-30碱基。引物的序列在肌苷-鸟苷激酶结构基因的两端，具体地如序列表中序列号11和12所示。

接下来，可从大肠杆菌染色体DNA用本引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增肌苷-鸟苷激酶基因并克隆之。载体可使用来自大肠杆菌的载体如pUC19、pBR322等。就制备的重组DNA的受体菌来说，只要适合载体复制即可，例如可使用HB101、JM109、DH5等大肠杆菌菌株。

这样，可获得***了含大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶基因的DNA片段的质粒。

而且，同乙酰微小杆菌一样，只要其编码肌苷-鸟苷蛋白激酶，可获得和使用与来自大肠杆菌的基因同源的可相互杂交的基因。

按上述方法得到的含编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因的DNA片段，可与其它适当的载体再次重组或***复制起点后，导入到可产生ATP的宿主细胞。

即，对宿主细胞可使用，有充分的能力从ATP前体再生在反应中消耗的ATP(称为ATP生产能力或ATP再生能力)的微生物(称为ATP生产菌或ATP再生菌)。

本发明中所说的有ATP再生能力的微生物来说，只要有可在将肌苷和/或鸟苷转换为5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸的反应中从ATP前体再生消耗的ATP即可。例如棒杆菌属、大肠杆菌属、葡萄球菌属、糖酵母属或假丝酵母属的微生物。特别地，优选使用属于ATP再生能力高的产氨棒杆菌的微生物。而产氨棒杆菌原先在分类上称为产氨短杆菌。

本发明中所使用的有ATP再生能力的微生物的具体例子可举出如下的菌株或其诱导的变异体：

产氨棒杆菌(旧名：产氨短杆菌)ATCC6872

产氨棒杆菌(旧名：产氨短杆菌)ATCC21295

产氨棒杆菌(旧名：产氨短杆菌)ATCC21477

谷氨酸棒杆菌ATCC13020

谷氨酸棒杆菌(旧名：黄色短杆菌)ATCC14067

谷氨酸棒杆菌(旧名：乳发酵短杆菌)ATCC13869

大肠杆菌B(ATCC11303)

啤酒糖酵母ATCC20018

金黄色短杆菌ATCC4012

延沫假丝酵母ATCC20356

嗜冷假丝酵母(旧名：嗜冷拟酵母)ATCC22163

而且，具有ATP再生能力的微生物优选其中肌苷和/或鸟苷降解活性弱或缺陷的微生物。上述的微生物中具有这样性质的微生物可举出如下微生物；

产氨棒杆菌ATCC21295

产氨棒杆菌ATCC21477

本发明的具有ATP再生能力的微生物，可使用除了具有再生ATP的能力之外，还具有能从肌苷或鸟苷前体生成肌苷或鸟苷的能力的微生物。在这种情况下，可用肌苷或鸟苷前体代替肌苷或鸟苷制备5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸。这样的前体可举出，葡萄糖、蔗糖、糖浆、淀粉水解物、醋酸等有机酸、甘油和乙醇等醇类。

能生产肌苷或鸟苷的ATP再生菌可例举出：

产氨棒杆菌ATCC21478

产氨棒杆菌ATCC21479

产氨棒杆菌ATCC21480

上述的整合入肌苷-鸟苷激酶编码基因的载体没有特别限制，只要其可在作为受体菌的ATP再生菌中能复制即可。例如，当ATP再生菌是棒杆菌属的细菌时，可举出能在该细菌中自主复制的质粒的例子。具体的实例有：pAM330(特开昭58-67699)、pHM1519(特开昭58-77895)pAJ655、pAJ611，pAJ1844(以上，特开昭58-192900)，pCG1(特开昭57-134500)，pCG2(特开昭58-35197)，pCG4，pCG11(特开昭57-183799)，pGA1(基因，107，69(1991))，pHK4，pHC4(特开平5-7491)等。另外，当ATP再生菌是大肠杆菌时，可使用例如CO1E质粒，p15A质粒，R因子质粒，F因子质粒，噬菌体质粒。具体的例子有pBR322(基因2，95(1977))，pUC19(基因，33，103(1985))，pACYC184(细菌学杂志，134，1141(1978))，pSC101(美国国家科学院院刊70，3240(1973))等。当使用啤酒糖酵母作为ATP再生菌株时，可使YEp质粒、YRp质粒、YLp质粒等。具体地可举例有YEp24、YRp7、YCp50等。当用金黄色葡萄球菌作为ATP再生菌时，可使用pRIT5(欧洲分子生物学联合会杂志4，1075(1985))。

为了高频率的表达肌苷-鸟苷激酶编码基因建议在肌苷-鸟苷激酶编码基因的上游配置启动子和SD序列，这类序列的导入方法没有特别限制，可使用携带启动子和SD序列的载体在这类序列的下游导入前述基因的方法，或者合成启动子和SD序列在上述基因的上游将其***的方法。启动子序列和SD序列无特别限制，当用棒杆菌属细菌作为ATP再生菌时，可举例出：来自大肠杆菌的tac、lac、trp启动子，或者来自棒杆菌属细菌的trp启动子(基因，53，191(1987))，fda启动子(分子微生物学，3，1625(1989))，ppc启动子(基因，77，1237(1989))，lysC启动子(分子微生物学，5，1197(1991))，gdh启动子(分子微生物学，6，317(1992))，csp1、csp2启动子(特表平6-502548)。当用大肠杆菌作为ATP再生菌时，可举例出来自大肠杆菌的tac、lac、trp启动子，λ噬菌体的PL噬菌体。当使用啤酒糖酵母作为ATP再生菌时，可例举出ADH1、ENO1、PEK1、GAP-DH、GAL1、GAL10、GAL7、PH05、MFα1启动子。在用金黄色葡萄球菌作为ATP再生菌时，可例举spa启动子(细胞学杂志，159，713(1984))。

向有ATP再生能力的微生物中导入本发明的含有编码具有将肌苷-鸟苷转换为5′-肌苷酸和/或5′-鸟苷酸活性蛋白质的基因的重组DNA的方法没有特别限制，可用常规方法进行。例如在用棒杆菌属细菌作为ATP再生菌时，原生质体法(特开昭57-183799)，电穿孔法(特开平2-207791)特别有效。当用大肠杆菌作为ATP再生菌时，可使用氯化钙法(分子生物学杂志，53，159(1970))，Hanahan法(分子生物学杂志，166，557(1983))，SEM法(基因，96，231(1990))，Chung等人的方法(美国国家科学院院刊，186，2172(1989))，电穿孔法(核酸研究，16，6127(1988))等方法。如在枯草芽孢杆菌中报道的那样，有方法向由增殖阶段的细胞制备的感受态细胞中导入DNA(C.H基因，1，153(1977))。或者如在枯草杆菌，放线菌类和酵母菌类中已知的那样，DNA受体菌的细胞被形成易被整合入重组DNA的原生质体或球形体从而重组DNA被导入(分子和普通遗传学，168，111(1979))，自然274，398(1978)，美国国家科学院院刊，75，1929(1978)。当用啤酒糖酵母作为ATP再生菌时，可用球状体法(美国国家科学院院刊，75，1929(1978))，乙酸锂法(细菌学杂志，153，163(1983))，电穿孔法(“酶学方法”194，182(1991))等导入重组DNA。在用金黄色葡萄球菌作为ATP再生菌时，可用原生质体法导入重组DNA(质粒，5，292(1981))。

在原生质体方法中，如上述在枯草杆菌中使用的方法可获得高频率。但是如在特开昭57-183799中所公开的那样，将再生体状态的属于棒杆菌细菌的细胞与聚乙二醇或聚乙烯醇之一和二价金属离子相接触而导入DNA。用羧甲基纤维素、葡萄糖、Ficol或Pluronic(由Serva社制)代替聚乙二醇或聚乙烯醇可增加DNA的吸收。

另外，可用电脉冲法(特开平2-207791)将重组DNA导入受体菌中。本发明实施例所用的方法是电脉冲方法。

进一步地，可将肌苷-鸟苷激酶基因整合入有ATP再生能力的微生物的染色体DNA中。整合染色体基因的方法没有特别限制，例如，将来自棒杆菌属细菌的温度敏感复制起点和肌苷-鸟苷激酶基因以及抗氯霉素等抗生素的标记***质粒载体中形成重组DNA，用该重组DNA转化杆菌属细菌。将转化子以温度敏感复制起点不起作用的温度培养在含抗生素的培养基中，以形成染色体DNA中整合有重组DNA的转化子(细菌学杂志，162，1196(1985)，特开平5-7491)。或者，也可使用来自棒杆菌属细菌的转移因子(“可移动的遗传因子”，学院出版社，纽约(1983)，WO93/18151)。

通过在普通培养基中培养如上得到的本发明的转化子可高水平的表达肌苷-鸟苷激酶活性，其中转化子中已被导入了含编码肌苷-鸟苷激酶蛋白质基因的重组DNA，其中普通培养基中含有碳源、氮源、无机盐类，以及必要的有机微量元素。

碳源包括如糖类：葡萄糖、蔗糖、糖浆和淀粉水解物；有机酸如乙酸和柠檬酸；和醇类如乙醇。氮源的实例包括尿素、氨盐、氨水和氨气。无机盐包括磷酸盐、钾盐、镁盐、铁离子和锰离子。微量有机元素包括氨基酸、维生素、脂肪酸和核酸，以及蛋白胨、酵母提取物和大豆蛋白水解产物。

在温度为25～37℃，pH控制在5～9，并通气的条件下培养10-40小时。

培养结束后，测定培养液中积累的肌苷-鸟苷激酶活性以确定滴度。活性测定可用如分子和普通遗传学143，85-91(1975)中所述的方法。即将离心收集的细胞超声或用弗氏压碎器处理破碎细胞，离心破碎的细胞去除细胞残渣，通过凝胶过滤回收低分子量物质。

这样得到的含有编码肌苷-鸟苷激酶的基因并且从ATP前体生物合成ATP能力的微生物培养物，从该培养物中分离的菌体或该菌体的处理产物，在能源和磷酸基团供体的存在下与肌苷或鸟苷或它们的前体接触，从而在反应液中生成5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸。可用离心的方法等从培养物中分离菌体。菌体的处理产物包括丙酮处理的菌体，固定化菌体破碎的菌体等。

本发明优选使用的物质如下所述。

作为肌苷或鸟苷的前体，可使用葡萄糖、蔗糖、糖浆、淀粉水解物等糖类，乙酸等有机酸，甘油、乙醇等醇类。

能源供体包括葡萄糖、蔗糖、淀粉水解物、糖浆等糖类；醋酸、柠檬酸等有机酸类；乙醇等醇类。

磷酸基团供体包括无机磷酸类如正磷酸、焦磷酸、多磷酸、三聚磷酸、聚甲基磷酸、六甲基磷酸；无机酸盐，和有机磷酸和苯基磷酸，乙酰基磷酸，氨基甲酰磷酸等。

另外，在反应液中加入ATP前体，表面活性剂，金属离子等可改善反应效率。

ATP前体有，腺苷二磷酸、腺苷酸、腺苷、腺嘌呤、腺嘌呤矿酸盐，核糖核酸水解产物。

表面活性剂可以是阳离子，阴离子或两性离子表面活性剂，只要其可增强肌苷或鸟苷的磷酸化。另外，金属离子可使用镁离子、锰离子等。

并且，在原来组合使用肌苷-鸟苷激酶和ATP再生菌的磷酸化反应中，一般需要在反应系中加入有机溶剂(特开昭63-230094，WO91/08286)，而在本发明中即使不加入有机溶剂反应也可有效地进行。

反应在25～37℃，pH6～8下通气培养10～30小时。

反应结束后，可将反应液中积累的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸进行离子交换树脂处理，结晶等以收集产物。实施发明的最佳方式

下面用实施例具体地说明本发明，但本发明不仅限于这些例子。实施例1

(来源于大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因表达质粒的构建以及向产氨棒杆菌中的导入)

(1)用PCR方法扩增肌苷-鸟苷激酶基因及其克隆

具有来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶5′-和3′-侧翼序列的寡核苷酸及限制性内切酶PstI和HindIII的切割位点分别如序列表中序列号11和12所示，可用亚磷酰胺方法通过DNA合成仪(Applied Biosystemic公司制造，394型)合成。

用0.25μmol该寡核苷酸作为引物，0.1μg齐藤三浦的方法(生物化学与生物物理学报，72，619(1963))制备的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)染色体DNA作为模板，向10mM N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷(下文称为Tris)-盐酸缓冲液(pH8.3)中加入2.5单位Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，60mM KCl，1.5mMMgCl₂和0.0001％明胶，于94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒进行25个循环的PCR反应。将反应液上琼脂糖凝胶电泳，用玻璃粉(宝酒造社制)回收目的DNA片段。约2μg该DNA片段及限制性内切酶PstI和HindIII各20单位与含10mMMgCl₂，100mM NaCl和1mM二硫苏糖醇的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)混合，于37℃消化2小时。消化液通过常规方法用苯酚抽提和乙醇沉淀。

将pHSG298质粒(宝酒造社制)DNA 1μg和限制性内切酶PstI和HindIII各20单位与含有10mM MgCl₂，100mM NaCl及1mM二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于37℃反应2小时。反应完成后，用常规方法即用苯酚抽提和乙醇沉淀，得到PstI和HindIII消化的pHSG298质粒。向含有6.6mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的66mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中加入用该PstI和HindIII消化的pHSG298 0.1μg，用PCR扩增的PstI和HindIII消化的片段0.5μg和1单位T₄ DNA聚合酶，于16℃反应8小时，将DNA连接上。接着用常规方法将该DNA混合物转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种在含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养物上得到转化子。

将该转化子用《分子克隆》(第2版)(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，第1.25(1989)页)所述的碱裂解法制备载体DNA，用常规方法进行琼脂糖凝胶电泳。选择在质粒pHSG298中***了肌苷-鸟苷激酶基因的重组质粒。该质粒被称为pIGK-1。

(2)大肠杆菌trp启动子的***

兮成了如序列表中序列号13所示的在5′-端和3′-端分别具有限制性内切酶Bam HI、PstI切割位点的寡核苷酸及与其互补的寡核苷酸。将得到的寡核苷酸各1μg混合。100℃处理5分钟，然后慢慢冷却以退火。将该寡核苷酸溶液与20单位Bam HI和含10mM MgCl₂，100mMNaCl和1mM二硫苏糖醇的20mM Tris-HCl(pH8.5)混合于30℃反应2小时得到消化液，该消化液用苯酚抽提和乙醇沉淀。将得到的沉淀同(1)中一样进行PstI消化，消化液用苯酚抽提和乙醇沉淀。以得到用Bam HI和PstI切割的并含大肠杆菌trp启动子的DNA片段。

同样地用Bam HI和PstI消化1μg前述(1)得到含肌苷-鸟苷激酶基因的重组质粒pIGK-1，反应结束后，用常规方法苯酚抽提，乙醇沉淀，得到Bam HI和PstI消化的质粒。向含有6.6mM MgCl₂，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中加入BamHI和PstI消化后的pIGK-10.1μg上述得到的Bam HI和PstI消化的片段0.5μg和1单位T₄ DNA聚合酶(宝酒造社制)，于16℃反应8小时，将DNA连接起来。接着将该DNA混合物转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种在含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养基上得到转化子。

将得到的转化子按碱裂解法制备质粒DNA，用常法上琼脂糖凝胶电泳，选择在质粒pIGK-1中***了大肠杆菌trp启动子DNA片段的重组质粒。将该质粒命名为pIGK-2。

(3)来源于棒杆菌的复制起点的***

将前述(2)中得到的含有肌苷-鸟苷激酶基因和trp启动子的重组质粒pIGK-21μg按前述(2)的反应组成的方式用Bam HI消化，用苯酚抽提，乙醇沉淀。为了防止Bam HI消化的质粒pIGK-2的再次接合，用《分子克隆，第2版》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis冷泉港实验室出版社p1.60(1989))的方法用细菌碱性磷酸酶处理该DNA片段使之脱磷酸化，并用苯酚抽提，乙醇沉淀。

一方面，向含10mM MgCl₂，及1mM二硫苏糖醇的10mMTris-HCl(pH7.5)中加入了在pHSG399(宝酒造社制)中***了来自产氨酸棒杆菌的复制起点的区域的质粒pHC4(特开平5-7491)1μg和限制性内切酶KpnI 10单位，于37℃反应2小时，将该反应液用苯酚抽提和乙醇沉淀。将该KpnI切割的pHC4用DNA末端平齐化试剂盒(宝酒造社制)用指定的方法将末端平齐化，接着用T₄多核苷酸连接酶与磷酸化的Bam HI接头连接。这样即可得到在来自谷氨基酸棒杆菌的质粒复制起点区域两侧具有Bam HI切割位点的DNA片段。将该DNA片段与20单位Bam HI在前项(2)所述的缓冲液混合，在30℃反应2小时。反应液用苯酚抽提和乙醇沉淀。

将上面得到的Bam HI消化的质粒pIGK-2 0.1μg及Bam HI消化的质粒pHC4由来的DNA片段0.2μg及1单位T₄ DNA连接酶(宝酒造社制)在前项(1)中所述的缓冲液中混合，于16℃反应8小时，该DNA连接起来。接着以该DNA混合物转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养板得到转化子。

将这样得到的转化子用碱裂解法制备质粒DNA，用常规方式琼脂糖凝胶电泳，选择在质粒pIGK-2中含有能在棒杆菌中自主复制的DNA片段的重组质粒，该质粒称为pIGK-3。

并且，将含有质粒pHC4的大肠杆菌AJ 12617于平成3年4月24日保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮区号305)工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM P-12215。于平成3年8月26日根据布达佩斯条约以保藏号FERM BP-3532保藏。

(4)pIGK-3向ATCC 214977菌株中的基因导入

将(3)中得到的pIGK-3 0.1μg用常规的电泳冲转化方法(特开平2-207791)导入产氨棒杆菌ATCC 21477中。将该菌体接种含1％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％NaCl，0.5％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的琼脂培养板上，得到转化子ATCC 21477/pIGK-3。

(5)重组体肌苷-鸟苷激酶活性的测定

将(4)中得到的产氨棒杆菌ATCC 21477/pIGK-3在50ml培养基(pH7.2)中培养，培养基中含有1％蛋白胨，1％酵母提取物，5％葡萄糖，0.4％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，0.5％硫酸铵，0.5％尿素，0.001％硫酸亚铁，0.001％硫酸锰，0.005g/l盐酸硫胺素，0.01g/l泠酸钙，30μg/l生物素，0.05％腺嘌呤和50mg/l卡那霉素，培养在32℃进行24小时。将培养液用常规方法离心分离收集菌体。

将该菌体用0.9％NaCl水溶液悬浮，离心洗涤菌体，重复上述操作2次。将该菌体在含20％甘油，100mM氯化钾，和5mM 2-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液中(pH7.9)悬浮，150W 20分贝超声波处理后(Kubota社制)，15000rpm离心30分钟，分离得到上清。将上清上Sephadex G-25(Pharmacia社制)层析柱，得到了去除了低分子量物质的粗酶液。

用由100mM Tris，10mM MgCl₂，1mM ATP，250mMKCl，0.2mM〔8-¹⁴C〕肌苷组成的反应液测定所得到的粗酶液中肌苷-鸟苷激酶活性。将其与粗酶液混合物，30℃反应30分钟后，将一部分反应混合物印迹到硅胶平板上(Merck公司制)，用正丁醇∶乙醇∶水体积比为2∶1∶1的展开液展开。用Bio-Image分析仪(富士胶卷公司)检测和测定5′-肌苷酸的斑点。另外，以牛血清白蛋白作为标准，用蛋白质分析试剂盒测定粗酶液的蛋白质浓度，并计算出酶的比活性。作为对照，测定带有质粒pHK4的转化子ATCC 21477/pHK4的比活性。结果如表1所示。ATCC 21477/pHK4的比活性没有检测出来，而ATCC21477/pIGK-3显示具有高活性。从该结果看，导入的来自大肠杆菌的基因在产氨棒杆菌中表达肌苷-鸟苷激酶活性。

并且，质粒pHK4具有从pIGK-3中去除了trp启动子和肌苷-鸟苷基因的结构，并被用作对照。

含有pHK4的大肠杆菌HB101菌株被命名为AJ13136。该菌株于1995年8月1日根据布达佩斯条约保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮区号305)工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏登记号FERMBP-5186。

表1

菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白)
菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白)	ATCC 21477/pHK4	未检出
ATCC 21477/pIGK-3	186.6	ATCC 21477/pHK4	未检出

实施例2(利用含有来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的菌株由肌苷生成5′-肌苷酸)

在450ml培养基中(pH7.2)接种产氨棒杆菌ATCC 21477/pIGK-3，于32℃培养24小时得到培养物，其中培养基中含有1％蛋白胨，1％酵母提取物，5％葡萄糖，0.4％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，0.5％硫酸铵，0.5％尿素，0.001％硫酸亚铁，0.001％硫酸锰，0.005g/l盐酸硫铵素，0.001g/l泛酸钙，30μg/l生物素，0.05％腺嘌呤和50mg/l卡那霉素。将培养物于7000rpm离心10分钟得到20g湿菌体沉淀。

将得到的菌体以200g/l悬浮于20ml反应液(pH7.2)中，其中反应液中含有50g/l肌苷，20g/l磷酸二氢钾，30g/l葡萄糖，5g/l硫酸镁，10g/l核酸(重量比50％)，4g/l Nymeen S-215和1g/l腺嘌呤。将混合物于32℃搅拌培养。用4N NaOH调节pH值至7.2，并向混合液中加入适量的所减少的磷酸二氢钾。反应用ATCC 21477/pHK4作对照。反应30小时后，用高效液相色谱测定反应液中的5′-肌苷酸的量。结果如表2所示。5′-肌苷酸的积累值以5′-肌苷酸二钠7.5水合物表示。从该结果看，在含有来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的ATCC21477/pIGK-3可将肌苷转化为5′-肌苷酸。

表2

菌株	5′-肌苷酸积累值(g/l)
菌株	5′-肌苷酸积累值(g/l)	ATCC 21477/pHK4	未检测到
ATCC 21477/pIGK-3	72.9	ATCC 21477/pHK4	未检测到

实施例3(用携带来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的菌株从肌苷生产5′-肌苷酸)

实施例2中得到的菌体以200g/l悬浮于50ml反应液(pH7.2)中，32℃通气搅拌进行反应，其反应液中含有肌苷60g/l，磷酸二氢钾20g/l，葡萄糖30g/l，MgSO₄ 5g/l，植酸(50％重量比)10g/l，Nymeen S-215 4g/l和腺嘌呤1g/l。通过PH计监测，用4N NaOH调节pH为7.2，并向反应混合物中加入适量的减少的KH₂PO₄。反应22小时后，积累值为112.8g/l，相对加入的肌苷其摩尔产率约为100％。实施例4(用含有来自大肠杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的菌株从鸟苷产生5′-鸟苷酸)

在反应液中用1g/l鸟苷代替肌苷，同实施例2一样进行反应。反应30小时后，用高效液相色谱对反应液中5′-鸟苷酸的量进行定量，结果在ATCC 21477/pIGK-3的反应液中，以5′-鸟苷酸二钠6.5水和物计算，5′-鸟苷酸的积累值为0.05g/l。实施例5(来自乙酰微小杆菌的具有肌苷-鸟苷激酶的蛋白质的分离纯化及其性质)

(1)菌体及粗酶提取液的制备

在100ml含1％蛋白胨，1％细菌培养用酵母提取物，0.5％葡萄糖及0.5％NaCl的培养基中接种乙酰微小杆菌ATCC 953，30℃培养8小时，得到的培养物7000rpm离心10分钟，沉淀物用0.9％NaCl洗涤2次得10g湿菌体。将该菌体在10ml含100mMCaCl₂和1mM二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲液(缓冲液A)中悬浮，接着放入直径为0.1mm的玻璃珠通过玻璃搅拌器(Bio-Rad公司制)破碎菌体。将破碎液于15000rpm离心10分钟分离，将上清用缓冲液透析得到粗酶的液约20ml。

粗酶提取液的肌苷-鸟苷激酶活性用以下的方法测定。

将粗酶提取液5μl加到50μl含5mM MgCl₂，5mM ATP，100mM KCl和0.2mM〔8-¹⁴C〕-肌苷的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，30℃反应30分钟。将2μl反应液印迹到硅胶板上(Merck公司制)以停止反应，用以正丁醇∶乙醇∶水＝2∶1∶1的体积比的展开液展开，用Bio-Image分析仪(富士胶片公司)测定斑点上5L肌苷酸的量。另外，以牛血清白蛋白作为标准，用蛋白质分析仪(Bio-Rad公司造)测定粗酶液的蛋白质浓度，计算出酶的比活性。粗酶提取物中肌苷-鸟苷激酶活性确定为0.45nmol/min/mg蛋白。

(2)具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质的纯化

将前项中得到的粗酶提取液上已用缓冲液A平衡过的DEAE-Toyopearl柱(由Tosoh公司造)，用缓冲液A洗涤后，用含200mM氯化钾的缓冲液A洗脱出具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质。向得到的活性级分25ml加入硫酸铵至30％饱和度。于4℃搅拌30分钟后，离心分离后去除沉淀。将得到的上清上已用含30％硫酸铵平衡后的Butyl-Toyopearl(由Tosoh公司制)柱。用同样的缓冲液洗涤之后，用200ml含30％～50％硫酸铵的缓冲液A的线性浓度梯度将有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质洗脱出来。将得到的洗涤级分15ml对21缓冲液pH(7.5)(缓冲液B)进行透析。缓冲液中含50mM氯化钾，1mM二硫苏糖醇和20％甘油和25mM Tris-HCl。

将该溶液以15000rpm离心10分钟后得到的上清上用含100mM氯化钾的缓冲液B平衡后的MonoQ FPLC HR5/5(Pharmacia公司造)柱。在用同一缓冲液洗涤后，用100-500mM线性浓度梯度将具有肌苷-鸟苷激酶的蛋白质洗脱出来。将得到的活性级分对2L含1mM二硫苏糖醇和20％甘油的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)(缓冲液C)透析，并上已用相同的缓冲液平衡过的羟基磷灰石TSK-GEL·HA-1000(Tosoh公司造)柱。用上述缓冲液洗涤后，用30ml 10mM～50mM线性浓度梯度的磷酸钾缓冲液将具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质洗脱出来。

得到的活性级分约6ml以同样的操作上羟基磷灰石柱，用30ml含10mM～200mM磷酸钾的缓冲液C的线性浓度梯度将具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质洗脱出来。将活性级分中高活性级分2ml上用含有1mM二硫苏糖醇，20％甘油及100mM氯化钾的25mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)平衡过的凝胶过滤Hiload Superdex 200pg 16/60(由Pharmacia公司造)柱，用相同的缓冲液洗脱出来。将2ml高活性级分中的5ml上SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染色(Nacalai Tesque公司)后检测得到36kD的蛋白质。这样即得到了来自乙酰微小杆菌的具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所测定的分子量为36kD。

(3)来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶的性质

将铵纯化的肌苷-鸟苷激酶加入到含5mM氯化镁，5mM ATP，100mM氯化钾，0.16mM鸟苷和0.04mM〔8-¹⁴C〕-鸟苷的100mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中；50μl该混合物作为基本组成，于30℃10分钟反应。该酶有下述性质。

1.作用

该酶将磷酸基团从作为磷酸供体的ATP，2′-脱氧腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、2′-脱氧鸟苷三磷酸和胸苷三磷酸等核苷三磷酸转移到鸟苷、肌苷和2′-脱氧鸟苷等核苷上，分别形成5′-鸟苷酸、5′-肌苷酸和2′-脱氧-5′-鸟苷酸等核苷-5′二磷酸。

(2)底物特异性

用0.5mM的各种核苷代替鸟苷，在ATP中加入〔γ-³²P〕ATP后进行反应。生成的核苷5′-磷酸测定结果如表3所示。鸟苷、肌苷及2′-脱氧鸟苷作为磷酸受体。

表3

核苷(0.5mM)	相对活性(％)
核苷(0.5mM)	相对活性(％)	鸟苷2′-脱氧鸟苷肌苷黄苷腺苷2′-脱氧腺苷	10045000

用5mM的各种核苷三磷酸代替ATP，磷酸供体的检查结果如表4所示。

除了ATP之外，2′-脱氧腺苷三磷酸、鸟苷三磷酸、2′-脱氧鸟苷三磷酸，以及胸苷三磷酸可作为磷酸供体。

表4

核苷三硝酸(5mM)	相对活性(％)
核苷三硝酸(5mM)	相对活性(％)	ATP2′-脱氧腺苷三磷酸鸟苷三磷酸2′-脱氧鸟苷三磷酸胞苷三磷酸尿苷三磷酸胸苷三磷酸无添加	10071596264350

3.最适pH

将反应缓冲液变更为100mM的醋酸钠-醋酸缓冲液(pH4.2～5.6)、2-吗啉代乙磺酸(下文称为“MES”)-氢氧化钠缓冲液(pH5.4-6.3)、3-吗啉代丙磺酸(MOPS)-氢氧化钠缓冲液(pH6.3-7.2)、Tris-HCl缓冲液(pH7.2-8.8)、环己基氨基丙磺酸(下文称为“CAPS”)-氢氧化钠缓冲液(pH8.8-10.4)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.3-11.0)进行反应。最适pH值为pH7.7-9.9。

4.pH稳定性

将酶在下述缓冲液中，室温下处理30分钟后测定活性。含2.5mg/ml牛血清白蛋白，25mM氯化钾，0.25mM二硫苏糖醇和5％甘油的250mM醋酸钠-醋酸缓冲液(pH1.5-5.6)、MES-氢氧化钠缓冲液(pH5.4-6.4)、MOPS-氢氧化钠缓冲液(pH6.3-7.3)、Tris-HCl缓冲液(pH7.2-8.8)、CAPS-氢氧化钠缓冲液(pH8.9-10.4)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.5-13.3)。在pH6.7～12.1之间活性稳定。

5.最适温度

在16-60℃范围内进行反应。最适温度为30-50℃。

6.温度稳定性

将酶在含5mg/ml牛血清白蛋白，50mM氯化钾，0.5mM二硫苏糖醇和10％甘油的12.5mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中于4-60℃反应30分钟后，测定残存的酶活性。在低于25℃处理时，残留有50％以上的活性，在40℃以上处理时，失去活性。

7.金属要求

将反应液中的氯化镁换成各种金属离子进行反应。结果如表5所示。发现金属离子比活性必需的，反应可与镁离子以外的其它离子如锰离子、钴离子和铁离子一起进行。

表5

金属盐(5mM)	相对活性(％)
金属盐(5mM)	相对活性(％)	无添加MgCl₂·6H₂OMnCl₂·4H₂OZnCl₂NiCl₂·6H₂OCaCl₂·2H₂OCoCl₂·6H₂OMgSO₄·7H₂OFeSO₄·7H₂O	1100551113610724

8.金属离子的影响

在反应混合物中分别加入1mM各种金属离子时的相对酶活性如表6所示。酶被铜离子和汞离子强烈抑制，也受锌离子和镉离子抑制。

表6

金属盐(1mM)	相对活性(％)
金属盐(1mM)	相对活性(％)	无添加MnCl₂·4H₂OZnCl₂·4H₂ONiCl₂·6H₂OCaCl₂·2H₂OCoCl₂·6H₂OBaCl₂CuCl₂·2H₂OCdCl₂HgCl₂MgSO₄·7H₂OFeSO₄·7H₂O	10081581137110310625432211095

9.Km值

改变反应组成中底物的浓度后测定的酶的Km值，对鸟苷为0.03mM，对肌苷为1mM，在鸟苷为底物时，对ATP的Km值为1.6mM。

10分子量

用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量结果，分子量为约36kD。实施例6(乙酰微小杆菌染色体中基因的分离)

(1)N末端氨基酸序列的确定

将实施例5(2)中得到的活性级分约2ml用Centrico-10(Amicon公司)在6000rpm离心3小时浓缩到约0.2ml。将该蛋白用Prospin(由Applied Biosystem公司制)通过离心印迹到滤膜上。将滤膜用20％甲醇洗3次，然后干燥，用蛋白质测序仪476A(Applied Biosystem公司)测N末端的氨基酸序列。确定的氨基酸序列和序列表中序列号3所示。Xaa指尚未确定。在已确定N-末端28个氨基酸中有一个氨基酸未确定。

(2)乙酰微小杆菌染色体DNA的制备及N末端区域的扩增

同实施例5(1)中一样在500ml培养液中培养乙酰微小杆菌ATCC953得到3g湿菌体。用齐藤，三浦的方法从该菌体中提取染色体DNA(生物化学与生物物理学报，72，619(1963))。

根据前项(1)中得到的N末端氨基酸序列合成寡核苷酸。根据核苷酸序列，考虑到密码子的简并性可使用序列表中序列号4和5所示寡核苷酸的混合物。

用0.25μmol该寡核苷酸作为引物，0.1μg乙酰微小杆菌ATCC 953的染色体DNA作为模板，向含有2.5个单位taq DNA聚合酶(宝酒造社制)及dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁及0.0001％明胶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)0.1ml，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟进行30个循环的PCR反应。将反应液上琼脂糖凝胶电泳，用玻璃粉(宝酒造社制)回收扩增的80个碱基长的DNA片段。将该DNA片段加入到50μl 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中于37℃进行末端平齐化反应30分钟，其中在缓冲液中含2单位的Klenow片段，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，1mM 2-巯基乙醇和7mM氯化镁。将反应液用苯酚抽提，用乙醇沉淀。将得到的沉淀的末端平齐化的DNA片段溶解在含10单位T₄多核酸激酶，10mM氯化镁，5mM二硫苏糖醇，0.1mM精胺和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.6)，于37℃进行末端磷酸化反应1小时。反应混合物用苯酚抽提乙醇沉淀。作为沉淀物回收具有磷酸化的平末端的PCR产物。

将质粒载体pUC18(宝酒造社制)1μg及限制性内切酶SmaI 20单位与50μl 33mM Tris-乙酸缓冲液(pH7.9)混合，于30℃反应2小时得到消化液，将消化液用常规方法苯酚抽提和乙醇沉淀，其中在上述Tris-乙酸缓冲液中含10mM乙酸镁，66mM乙酸钾，0.5mM二硫苏糖醇和0.01％牛血清白蛋白。之后，为了防止质粒载体来源的DNA片段的再结合，将DNA片段脱磷酸化，按常规方法苯酚抽提乙醇沉淀。

将该SmaI消化的pUC18 0.1μg，PCR产物的末端平齐及磷酸化物约0.1μg及T₄ DNA连接酶1单位(宝酒造社制)加入到20μl 66mM的含6.6mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，16℃反应8小时，连接DNA。接着以该DNA混合物用常规方法转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂培养基中以得到转化子。

用碱裂解法从得到的转化子制备质粒DNA。

该质粒DNA含有来自乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA的约80个碱基的DNA片段。用得到的质粒DNA确定该DNA片段的碱基序列。碱基序列的确定用根据Sanger方法(分子生物学杂志，143，161(1980))的Taq染色脱氧终止子循环测序试剂盒(Taq DyeDeoxyTerminator Cycle Sequencing Kit)(Perkin Elmer公司)进行测定。由此确定了乙酰微小杆菌ATCC 953肌苷-鸟苷激酶蛋白的N末端区域对应DNA的83个碱基的序列。

(3)乙酰微小杆菌肌苷-鸟苷激酶编码基因片段的分离

将前项(2)制备的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA 10μg与含有40单位Eco RI，10mM氯化镁，100mM氯化钠和1mM二硫苏糖醇50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，37℃反应2小时。反应液按常规方法苯酚抽提乙醇沉淀得到Eco RI消化的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA。该Eco RI消化后的DNA 1μg，Eco RI盒(宝酒造社制)0.05μg及T₄ DNA连接酶10单位(宝酒造社制)加入到含6.6mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的66mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，16℃反应18小时，连接DNA。反应液用苯酚抽提，乙醇沉淀得到Eco RI盒连接的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA消化物。

根据前项(2)决定的序列合成其序列如序列表序列号6和7所示的寡核苷酸S₁和S₂。

以寡核苷酸S₁为引物和盒式引物C₁(宝酒造社制)各0.2μmol，作为模板的Eco RI盒连接的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA消化物0.2μg及Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)2.5单位加入到含dGTP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁和0.0001％明胶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)0.1ml中，94℃30秒，55℃2分钟，72℃3分钟作25个循环进行PCR。将该反应液1μl为模板，以合成的寡核苷酸S₂和盒式引物C₂(宝酒造社制)各0.2μmol作为引物在同样条件下进行PCR。将反应液的一部分上琼脂糖凝胶电泳，约1000个碱基的片段被特异性的扩增，得到了含有从蛋白质N末端区域到基因的下游的Eco RI切割位点的DNA片段。

用玻璃粉(宝酒造社制)回收该DNA片段。约该DNA 0.2μg用Klenow片段于37℃反应30分钟使末端平齐化。反应液用苯酚抽提和乙醇沉淀。以沉淀物回收的DNA片段用T₄多核苷酸激酶在37℃1小时末端磷酸化。该反应液用苯酚抽提和乙醇沉淀，作为沉淀物回收末端平齐化及磷酸化的PCR产物。

质粒载体pUC18(宝酒造社制)1μg用限制性内切酶SmaI在30℃反应2小时得到消化液，常规方法苯酚抽提乙醇沉淀。之后，用细菌碱性磷酸酶处理该DNA片段使之磷酸化，苯酚抽提，乙醇沉淀。

将该SmaI消化的pUC18 0.1μg末端平齐且磷酸化的PCR产物约0.1μg及T₄ DNA连接酶1单位(宝酒造社制)在16℃反应8小时，使DNA连接起来。接着用该DNA混合物转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml的氨苄青霉素的L-琼脂培养基中得到转化子。

用碱裂解法从得到的转化子制备质粒DNA得到含PCR扩增片段的质粒。该质粒命名为pCS2。

合成与寡核苷酸S₁和S₂互补的寡核苷酸并分别称为S₄、S₃。

以寡核苷酸S₃和盒式引物C₁(宝酒造社制)为引物，以Eco RI盒连接的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA消化物为模板，在同样条件下进行PCR扩增。得到的反应液为模板，以寡核苷酸S₄和盒式引物C₂(宝酒造社制)作为引物，进行PCR，扩增得到了含蛋白质粒N末端区域到上游EcoRI切割位点的DNA片段的约2，300碱基的DNA片段。

将该DNA片段约0.2μg用Klenow片段于37℃反应30分钟使末端平齐化。将反应液苯酚抽提和乙醇沉淀。将作为沉淀回收的DNA片段与50μl含KpnI 10单位，10mM氯化镁及1mM二硫苏糖醇的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于37℃反应2小时得到消化液，将其用苯酚抽提和乙醇沉淀。

将质粒载体pUC18(宝酒造社制)1μg及限制性内切酶KpnI和HincII各5单位与含有10mM氯化镁，50mM氯化钠及1mM二硫苏糖醇的33mM Tris-乙酸的缓冲液(pH7.9)50μl混合，于37℃反应2小时，反应液用苯酚抽提，乙醇沉淀。

将KpnI和HincII消化的pUC18 0.1μg末端平齐化KpnI消化的产物0.1μg当T₄ DNA连接酶(宝酒造社制)在16℃反应8小时，将DNA连接起来。用该DNA混合物转化大肠杆菌JM109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂培养基上得到转化子。

用碱性裂解法从得到的转化子制备质粒DNA，选择含有从蛋白质N末端区域到基因上游KpnI切割位点约600碱基的DNA片段的质粒。该质粒命名为pKS4。

(4)乙酰微小杆菌ATCC 953的肌苷-鸟苷激酶基因碱基序列的确定

确定了前项(3)中得到质粒pCS2和pKS4的碱基序列。由此推定的开放阅读框的碱基序列如序列表中序列号1所示。另外，由该碱基序列推定的产物的氨基酸序列如序列表中序列号2所示。即，编码由序列表中序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因是乙酰微小杆菌ATCC 953的肌苷-鸟苷激酶基因。

将碱基序列，氨基酸序列分别与已知序列的同源性进行比较。所用的数据库是EMBL和SWISS-PROT。结果表明，序列表中序列号1所示的DNA及其编码的蛋白质是新的。并且该核酸序列与编码大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶的序列很少同源性，并且与其非常不同，其中该序列(编码大肠杆菌肌苷-鸟苷激酶)是已知的唯一的编码肌苷-鸟苷激酶的基因。

该基因编码的蛋白质由303个氨基酸组成的，由该序列推测的蛋白质的分子量为32.5kD。实施例7(来自乙酰微小杆菌ATCC 953的肌苷-鸟苷激酶基因的表达质粒的构建及向产氨棒杆菌中的导入)

(1)PCR方法扩增肌苷-鸟苷激酶基因及其克隆

合成了分别如序列表中序列号8和9所示的具有乙酰微小杆菌肌苷-鸟苷激酶基因侧翼序列及限制性内切酶PstI、SphI切割位点的寡核苷酸。

以0.25μmol该寡核苷酸作为引物，以实施例6(2)中所制备的乙酰微小杆菌ATCC 953染色体DNA 0.1μg作为模板，加入到0.1ml含2.5单位Taq DNA聚合酶(宝酒造社制)2.5单位加入到含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM，50mM氯化钾，1.5mM氯化镁及0.0001％明胶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)中，于94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒进行25个循环的PCR反应。将反应液上琼脂糖凝胶电泳，用玻璃粉(宝酒造社制)回收目的片段。将该DNA约2μg及限制性内切酶PstI及SphI各10单位与50μl含10mM氯化镁，100mM氯化钠及1mM二硫苏糖醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于37℃反应2小时得到消化液并用苯酚抽提及乙醇沉淀。

将质粒pHSG298(宝酒造社制)1μg及限制性内切酶PstI和SphI各20单位分别与含100mM氯化镁，100mM氯化钠及1mM二硫苏糖醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于37℃反应2小时。反应终了后，常规苯酚抽提乙醇沉淀得到PstI和SphI消化的pHSG298质粒。将该PstI及SphI消化的质粒pHSG298 0.1μg，由PstI及SphI消化的PCR扩增的片段0.5μg及T₄ DNA连接酶1单位(宝酒造社制)与含10mM ATP和6.6mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇的66mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于16℃反应8小时，将DNA连接起来。接着将该DNA混合物常规方法转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养板上，得到转化子。

用碱性裂解法从得到的转化子制备质粒DNA，上琼脂糖凝胶电泳，选择在质粒pHSG298中***了来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的重组质粒。该质粒命名为pBA-1。

(2)大肠杆菌trp启动子的***

同实施例1(2)中一样，得到含用BarmI和PstI切断的大肠杆菌trp启动子的DNA片段。

将***了含有前项(1)中得到的肌苷-鸟苷激酶基因的DNA片段的重组质粒pBA-1 1μg用BamI和PstI消化，反应终了后用苯酚抽提乙醇沉淀处理得到BamI和PstI消化的质粒。将该BamI和PstI消化后的pBA-1 0.1μg用1单位T₄ DNA连接酶(宝酒造社制)与含有已用BamI和PstI消化的大肠杆菌trp启动子的DNA片段连接，使DNA连接起来。接着用该DNA混合物转化大肠杆菌JM109(宝酒造社制)，将其接种到含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养板上得到转化子。

用碱性裂解法从上述得到的转化子制备质粒DNA，上琼脂糖凝胶电泳，选择在质粒pBA-1中***了大肠杆菌trp启动子的重组质粒，该质粒被命名为pBA-2。

并且带有质粒pBA-2的大肠杆菌AJ13094于平成7年4月24日根据布达佩斯条约保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮区号305)工业技术院生命工学工业技术研究所，登记号为FERM BP-5089。

(3)棒杆菌来源的复制起点的***

将前项(2)中得到的含有在肌苷-鸟苷激酶基因中***了trp启动子的DNA片段的重组质粒pBA-2 1μg在前项(2)的反应液组成中用BamI消化，然后苯酚抽提乙醇沉淀。将上述产物在实施例6(2)的反应组成中用KphI消化，然后苯酚抽提乙醇沉淀。得到的BamI和KpnI消化后的质粒pBA-2用细菌碱性磷酸酶处理DNA片段使其脱磷酸化，然后苯酚抽提，乙醇沉淀。

同时，特开平5-7491中所记载的质粒pHC4 1μg同样地用BamI和KpnI消化，然后苯酚抽提，乙醇沉淀。将上面得到的BamI和KpnI消化后的质粒pBA-2 0.1μg和BamI和KpnI消化后的质粒pHC4由来的DNA片段0.2μg及T₄ DNA连接酶(宝酒造社制)，于16℃反应8小时，连接DNA。接着用该DNA混合物转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，并将其接种到含100μg/ml的卡那霉素的L-琼脂培养板上得到转化子。

用碱裂解法从上述转化子制备质粒DNA，上琼脂糖凝胶电泳，选择在质粒pBA-2中含有来自棒杆菌属细菌的复制起点的重组质粒，该质粒被命名为pBA-3。

(4)pBA-3向ATCC 21477菌株中的导入

将前项中得到的pBA-3 0.1μg用常规的电脉冲转化方法，导入产氨棒杆菌ATCC 21477菌株中。将其接种到含1％蛋白胨，1％酵母提取物，0.5％氯化钠，0.5％葡萄糖和50μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养基上，得到转化子ATCC 21477/pBA-3。

(5)重组体肌苷-鸟苷激酶活性的测定

将前项中得到的产氨棒杆菌ATCC 21477/pBA-3接种到50ml培养基中，于32℃培养24小时，其中培养基中含有1％蛋白胨，1％酵母提取物，葡萄糖5％，磷酸二氢钾0.4％，0.1％硫酸镁，0.5％硫酸铵，0.5％尿素，0.001％硫酸亚铁，0.001％硫酸镁，0.005g/l盐酸硫铵素，0.01g/l泛酸钙，30μg/l生物素，0.05％腺嘌呤和50mg/l卡那霉素。用常规方法离心收集菌体。

将该菌体用0.9％氯化钠悬浮，重复离心操作2次洗涤菌体。该菌体用含20％甘油，100mM氯化钾的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)悬浮，并且用150W超声波破碎20分钟后，15,000rpm离心30分钟得到上清。将该细胞破碎液上Sephadex G-25(Pharmacia公司)层析柱，得到除去了低分子量物质的粗酶液。

用以质粒pHK4中同样转化得到的ATCC 21477/pHK4作为对照，以实施例5(1)中的方法测定所得到的粗酶液的肌苷-鸟苷激酶活性。结果如表7所示。相对于在ATCC 21477/pHK4中没有检测到活性，ATCC 21477/pBA-3表现出高活性。结果表明，导入了来自乙酰微小杆菌的基因的产氨棒杆菌中有肌苷-鸟苷激酶活性的表达。

另外，质粒pHK4被用作对照，其中在其结构从pBA-3中除去了trp启动子及肌苷-鸟苷激酶基因区域。

带有pHK4的大肠杆菌HB101菌株被命名为AJ13136，其于1995年8月1日根据布达佩斯条约被保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番1号(邮区号305)工业技术院生命工学工业技术研究所，登记号FERM BP-5186。

表7

菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白质)
菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白质)	ATCC 21477/pHK4	未检测
ATCC 21477/pBA-3	50.4	ATCC 21477/pHK4	未检测

实施例8(用带有来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的菌株从肌苷生产5′-肌苷酸)

在450ml培养基(pH7.2)中接种产氨棒杆菌ATCC 21477/pBA-3，32℃培养24小时得到培养物，其中培养基中含有1％蛋白胨，1％酵母提取物，5％葡萄糖，0.4％磷酸二氢钾，0.1％硫酸镁，0.5％硫酸铵，0.5％尿素，0.001％硫酸亚铁，0.001％硫酸锰，0.005g/l盐酸硫胺素，0.01g/l泛酸钙，30μg/l生物素，0.05％腺嘌呤和50mg/l卡那霉素。将该培养物于7000rpm离心10分钟得到沉淀物湿菌体20g。

将得到的菌体以200g/l悬浮于20ml反应液(pH7.2)中悬浮，边搅拌边在32℃反应，其中反应液含有50g/l肌苷，20g/l磷酸二氢钾，30g/l葡萄糖，5g/l硫酸镁，10g/l核酸(重量比50％)，4g/l NymeenS-215和1g/l腺嘌呤。用4N NaOH调pH值为7.2，并添加减少的磷酸二氢钾。ATCC 21477/pHK4作为对照，也进行同样的反应。反应30小时后，用高效液相色谱对反应液中的5′-肌苷酸进行定量。

结果如表8所示。5′-肌苷酸积累值以5′-肌苷酸二钠7.5水合物形式表示。从结果看，可表达肌苷-鸟苷激酶活性的ATCC 21477/pBA-3中将肌苷转化为5′-肌苷酸。

表8

菌株	5′-肌苷酸积累值(g/l)
菌株	5′-肌苷酸积累值(g/l)	ATCC 21477/pHK4	未检测
ATCC 21477/pBA-3	69.8	ATCC 21477/pHK4	未检测

实施例9(用带有来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的菌株将肌苷转化5′-肌苷酸)

将实施例8中得到的菌体以200g/l悬浮于50ml反应液(pH7.2)中，边通气搅拌边于32℃反应，其中反应液中含有肌苷60g/l，磷酸二氢钾20g/l，葡萄糖30g/l，硫酸镁5g/l，植酸(重量比50％)10g/l，NymeenS-215 1g/l和1g/l腺嘌呤。用pH计监测以4N NaOH调pH值为7.2，并加入减少量的磷酸二氢钾。反应30小时后，积累值为111.3g/l，对所添加的肌苷的摩尔收率为约100％。实施例10(用携带肌苷-鸟苷激酶基因的菌株将鸟苷酸转化为5′-鸟苷酸)

将实施例8中得到的菌体以200g/l悬浮于50ml反应液(pH7.2)中，边通气搅拌于32℃进行反应，其中反应液中含有鸟苷25g/l，磷酸二氢钾20g/l，葡萄糖30g/l，硫酸镁5g/l，植酸(重量比50％)10g/l，Nymeen S-215 4g/l，腺嘌呤1g/l。以pH计监测用4N NaOH调pH值为7.2。反应8小时后，5′-鸟苷酸的积累值为7.3g/l，相对所加入的鸟苷摩尔收率约为14％。实施例11(金橙黄微小杆菌，吉氏库特氏菌和佐氏库特氏菌肌苷-鸟苷激酶活性的检测)

在含有1％蛋白胨、1％细菌用酵母提取物，0.5％葡萄糖及0.5％氯化钠和1％碳酸钠的培养基中(pH9.7)中接种金橙黄微小杆菌ATCC35652。在50ml含有1％蛋白胨，1％细菌用酵母提取物，0.5葡萄糖，0.1氯化钠的培养基(pH7.2)中分别接种吉氏库特氏菌ATCC 43195和佐氏库特氏菌ATCC 33403，于30℃培养4小时得到培养物。将培养物用7000rpm离心10分钟沉淀物用0.9％氯化钠洗2次得到湿菌体。该菌体用13ml缓冲液A悬浮，超声波处理破碎。该破碎液用15,000rpm离心30分钟，上清上Sephadex G-25柱(Pharmacia公司造)脱盐，得到约3.5ml粗酶提取液。将5μl粗酶提取物加入到50μl Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中于30℃反应10分钟，其中反应液中含有5mM氯化镁，5mM ATP，100mM氯化钾，0.06mM鸟苷和0.04mM〔8-¹⁴C〕-鸟苷。对生成的5′-鸟苷酸进行定量。并测定肌苷-鸟苷激酶的比活性。结果如表9所示。对每一个菌株的肌苷-鸟苷激酶活性进行了检测。

表9

菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白)
菌株	比活性(nmol/min/mg蛋白)	金橙黄色微小杆菌	46.3
吉氏库特氏菌	6.64	金橙黄色微小杆菌	46.3
吉氏库特氏菌	6.64	佐氏库特氏菌	1.19

实施例12(金橙黄色微小杆菌，吉氏库特氏菌，佐氏库特氏菌染色体中与乙酰微小杆菌肌苷-鸟苷激酶同源性片段的检测)

同实施例11一样培养金橙黄色微小杆菌ATCC 35652，吉氏库特氏菌ATCC 43195和佐氏库特氏菌ATCC 33403，于30℃培养16小时，同实施例5(2)中一样分别制备染色体DNA。将该染色体DNA 10μg及限制性内切酶Eco RI 100单位与含有10mM氯化镁，100mM氯化钠和1mM二硫苏糖醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)混合，于27℃反应14小时。按常规方法用苯酚抽提乙醇沉淀。得到的Eco RI切割的染色体DNA上0.8％琼脂糖凝胶电泳，用《分子克隆，第2版》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社p9.31(1989))所记载的方法从琼脂糖凝胶印迹到尼布膜上(由Dupont公司制)。用含有来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的片段作为探针，在20％甲酰胺的存在下，于42℃杂交14小时。当该膜用0.2×SSC(0.03M氯化钠和3mM柠檬酸钠)和0.1％SDS洗膜后，在所有的菌株中检测到了同源性片段。其中，在乙酰微小杆菌染色体上检测到了显示最强烈同源性的约4.6kb的片段。实施例13(从金橙黄微小杆菌ATCC 35652分离与来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因同源的片段)

将18μg金橙黄微小杆菌ATCC 35652的染色体DNA与200单位限制性内切酶Eco RI一起于37℃反应3小时，然后用苯酚抽提，乙醇沉淀。将消化片段上琼脂糖凝胶电泳，用玻璃粉(宝酒造社制)回收约4.6kb的片段，得到金橙黄微小杆菌ATCC 35652的染色体片段。

将质粒载体pMW218(日本基因公司)1μg与限制性内切酶Eco RI20单位在37℃反应3小时，并将反应液用苯酚抽提，乙醇沉淀。之后，将DNA片段用碱性磷酸酶处理脱磷酸化，并用苯酚抽提和乙醇沉淀。

用T₄ DNA连接酶(宝酒造社制)将Eco RI消化后的pMW2180.2μg，Eco RI消化后的金橙黄微小杆菌染色体片段5μg连接起来。接下来用该DNA混合物通过常规方法转化大肠杆菌JM 109(宝酒造社制)，并将其接种到含100μg/ml卡那霉素的L-琼脂培养板上，得到约1000个转化子。

用克隆(菌落)杂交方法从得到的转化子中筛选能与探针DNA杂交的转化子。用碱裂解法从该转化子制备质粒DNA。该质粒DNA含有约4.6kb的来自金橙黄微小杆菌的染色体DNA片段。实施例14(来自金橙黄微小杆菌ATCC 35652的肌苷-鸟苷激酶基因的碱基序列的确定)

将实施例13中得到的质粒用各种限制性内切酶切断后，进行Sourthern杂交以确定能与探针DNA杂交的片段。结果表明能与Eco RI和PstI切割的约2.7kb的片段杂交。将该DNA片段与已用Eco RI和PstI切割的质粒载体pSTV28(宝酒造社制)连接，转化大肠杆菌JM109。用《分子克隆，第2版》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版，p1.90(1989))中记述的菌落杂交方法从得到的转化子中克隆可与探针DNA杂交的片段。携带有含该DNA片段的质粒的大肠杆菌菌体的粗酶提取液的肌苷激酶活性用实施例7(5)的方法测定，与含对照载体的菌株相比活性高约300倍，表明克隆化的片段是含有来自金橙黄微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因的片段。

用得到的质粒DNA确定Eco RI和PstI切割的片段的碱基序列。由已确定的碱基序列推定的开放阅读框如序列表中序列号14所示。另外，由该碱基序列推定产物的氨基酸序列如序列表中序列号15所示。尽管无论是碱基序列还是氨基酸序列都与来自乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因有很高的同源性，但仍是新的基因。即，编码由序列表中序列号15中的氨基酸序列组成的蛋白质的基因是来源于金橙黄微小杆菌ATCC35652的肌苷-鸟苷激酶基因。

如上所述，得到了能与来源于乙酰微小杆菌的肌苷-鸟苷激酶基因杂交的基因，并确认该基因编码有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：味之素株式会社

(ii)发明名称：核酸类的制备方法

(iii)序列数：15

(iv)通讯地址：

(A)收信人：味之素株式会社

(B)地址：京桥1丁目15番3号

(C)市：中央区

(D)州：东京都

(E)国：日本

(F)邮区：104

(v)计算机可读形式：

(A)介质：

(B)计算机：

(C)操作***：

(D)软件：

(vi)当前申请资料：

(A)申请号：JP

(B)申请日：1996年3月×日

(C)分类：

(vii)要求优先权的资料：

(A)申请号：特愿平7-102888号

(B)申请日：1995年3月24日

(C)申请号：特愿平7-177900号

(D)申请日：1995年6月9日

(viii)代理人/事务所信息：

(A)姓名：佐伯宪生

(B)登记号：10226

(ix)通讯信息：

(A)电话：03-5688-5136

(B)传真：03-5688-5137(2)序列号1的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：909碱基对

(B)序列类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：基因组DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)起源

(A)生物名：乙酰微小杆菌

(B)株名：ATCC 953

(ix)序列特征：

(A)表现特征的标记：CDS

(B)位置：1..909

(C)决定特征的方法：E

(xi)序列：SEQ ID NO：1：ATGAATAAAA TCGCGGTAAT CGGAAAAGTA TTCGTCGACA TAAAAGGAAC TTCGTTCGCT 60CCTTTGCATA AGGATGCGAA AAACGTAGGA GACATCACGT TTTCAAATGG AGGAACAGGA 120CGCAACGTAG CACAAAATCT AGCCGTCCTC GGGAATGAAG TTCGCTTTAT CTCGACGGTT 180ACGAATGATC AGATTGGCGT GGGAGTGCTC GATGAGCTGA AATCCTACGG TGCGAATGTG 240GATCACGTCG AAATGTTAGA AGATCATGGA ATGGGTATGT GGCTAGCTGT CATGGATAAC 300GAGGGTGACT TGCAAACATC GATCTCGAAA CAACCGGATG CCAAGTTGCT CGAAGAGGCG 360ATTTTACGTC AATCGATCTA TGCACTCGAT GGAGTCGATG CCGTTGCAAT CGATTTGGAT 420TTGTCCGTCA CGGTCTTAGA ACGTTTGATT CATTTATGTC GTAAGATGGA GTTGCCATTG 480TTTGGTGTTT GTGGTCACTT GAGCGTCATC GAACGAAATC GTCATCTGCT ACAAGGGTTC 540ACTGGATTCA TTTGTAGCCG AGAAGAGGCT GAAATTCTGT CTGATCTATC GATCGTGACG 600GTCGAAGATG CGATTCATGT AGCAAATGAG CTAGCGAAAA AGGGCGCTCC GTTTACGGTC 660GTGACGATGA GTGAACTGGG GGCGGTCTAC GTTGATCGTC GTACGGCGAC ATCAGGTCAC 720GTCGGAACGA AAAAAGTGAA GGTTGTCGAC TCAACGGGAG CAGGCGATTC CTTCTTCTCC 780GCAGTCTTGT CCGAATTGAC ACAGGAAAAG TCAGCAGAAG AGGCTTTGAA GCTTGGTATG 840AAGGTCGCAG CAGAAGTCAT CGCTTCAACA GAGAATGGAC TCGTTCCTGA AATGCTAGAT 900GCTCTTCAA 909(2)序列号2的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：303氨基酸

(B)序列类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：蛋白质

(xi)序列：SEQ ID NO：2：Met Asn Lys Ile Ala Val Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lys Gly

5 10 15Thr Ser Phe Ala Pro Leu His Lys Asp Ala Lys Asn Val Gly Asp Ile

20 25 30Thr Phe Ser Asn Gly Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Gln Asn Leu Ala

35 40 45Val Leu Gly Asn Glu Val Arg Phe Ile Ser Thr Val Thr Asn Asp Gln

50 55 60Ile Gly Val Gly Val Leu Asp Glu Leu Lys Ser Tyr Gly Ala Asn Val65 70 75 80Asp His Val Glu Met Leu Glu Asp His Gly Met Gly Met Trp Leu Ala

85 90 95Val Met Asp Asn Glu Gly Asp Leu Gln Thr Ser Ile Ser Lys Gln Pro

100 105 110Asp Ala Lys Leu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Arg Gln Ser Ile Tyr Ala

115 120 125Leu Asp Gly Val Asp Ala Val Ala Ile Asp Leu Asp Leu Ser Val Thr

130 135 140Val Leu Glu Arg Leu Ile His Leu Cys Arg Lys Met Glu Leu Pro Leu145 150 155 160Phe Gly Val Cys Gly His Leu Ser Val Ile Glu Arg Asn Arg His Leu

165 170 175Leu Gln Gly Phe Thr Gly Phe Ile Cys Ser Arg Glu Glu Ala Glu Ile

180 185 190Leu Ser Asp Leu Ser Ile Val Thr Val Glu Asp Ala Ile His Val Ala

195 200 205Asn Glu Leu Ala Lys Lys Gly Ala Pro Phe Thr Val Val Thr Met Ser

210 215 220Glu Leu Gly Ala Val Tyr Val Asp Arg Arg Thr Ala Thr Ser Gly His225 230 235 240Val Gly Thr Lys Lys Val Lys Val Val Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp

245 250 255Ser Phe Phe Ser Ala Val Leu Ser Glu Leu Thr Gln Glu Lys Ser Ala

260 265 270Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Met Lys Val Ala Ala Glu Val Ile Ala

275 280 285Ser Thr Glu Asn Gly Leu Val Pro Glu Met Leu Asp Ala Leu Gln

290 295 300(2)序列号3的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：28氨基酸

(B)序列类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：肽

(xi)序列：SEQ ID NO：3：Met Asn Lys Ile Ala Val Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lys Gly1 5 10 15

Thr Xaa Phe Ala Pro Leu His Lys Asp Ala Lys Asn

20 25(2)序列号4的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：17

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：4：

ATGAAYAARA THGCNGT 17(2)序列号5的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：17

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：5：

TTYTTNGCRT CYTTRTG 17(2)序列号6的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：23

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：6：

TAATCGGAAA AGTATTCGTC GAC 23(2)序列号7的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：21

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：7：

GGAACTTCGT TCGCTCCTTT G 21(2)序列号8的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：30

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：8：

GGCTGCAGGA ATGAATAAAA TCGCGGTAAT 30(2)序列号9的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：30

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：9：

GGGCATGCTG GAAAGACATA ATACGTTTCG 30(2)序列号10的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：1302碱基对

(B)序列类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：基因组DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(vi)起源

(A)生物名：大肠杆菌

(B)菌株名：HM 70

(ix)序列特征：

(A)表现特征的标记：CDS

(B)位置：1..1302

(C)决定特征的方法：E

(xi)序列：SEQ ID NO：10：ATGAAATTTC CCGGTAAACG TAAATCCAAA CATTACTTCC CCGTAAACGC ACGCGATCCG 60CTGCTTCAGC AATTCCAGCC AGAAAACGAA ACCAGCGCTG CCTGGGTAGT GGGTATCGAT 120CAAACGCTGG TCGATATTGA AGCGAAAGTG GATGATGAAT TTATTGAGCG TTATGGATTA 180AGCGCCGGGC ATTCACTGGT GATTGAGGAT GATGTAGCCG AAGCGCTTTA TCAGGAACTA 240AAACAGAAAA ACCTGATTAC CCATCAGTTT GCGGGTGGCA CCATTGGTAA CACCATGCAC 300AACTACTCGG TGCTCGCGGA CGACCGTTCG GTGCTGCTGG GCGTCATGTG CAGCAATATT 360GAAATTGGCA GTTATGCCTA TCGTTACCTG TGTAACACTT CCAGCCGTAC CGATCTTAAC 420TATCTACAAG GCGTGGATGG CCCGATTGGT CGTTGCTTTA CGCTGATTGG CGAGTCCGGG 480GAACGTACCT TTGCTATCAG TCCAGGCCAC ATGAACCAGC TGCGGGCTGA AAGCATTCCG 540GAAGATGTGA TTGCCGGAGC CTCGGCACTG GTTCTCACCT CATATCTGGT GCGTTGCAAG 600CCGGGTGAAC CCATGCCGGA AGCAACCATG AAAGCCATTG AGTACGCGAA GAAATATAAC 660GTACCGGTGG TGCTGACGCT GGGCACCAAG TTTGTCATTG CCGAGAATCC GCAGTGGTGG 720CAGCAATTCC TCAAAGATCA CGTCTCTATC CTTGGGATGA ACGAAGATGA AGCGGAAGCG 780TTGACCGGAG AAAGCGATCC GTTGTTGGCA TCTGACAAGG CGCTGGACTG GGTAGATCTG 840GTGCTGTGCA CCGCCGGGCC AATCGGCTTG TATATGGCGG GCTTTACCGA AGACGAAGCG 900AAACGTAAAA CCCAGCATCC GCTGCTGCCG GGCGCTATAG CGGAATTCAA CCAGTATGAG 960TTTAGCCGCG CCATGCGCCA CAAGGATTGC CAGAATCCGC TGCGTGTATA TTCGCACATT 1020GCGCCGTACA TGGGCGGGCC GGAAAAAATC ATGAACACTA ATGGAGCGGG GGATGGCGCA 1080TTGGCAGCGT TGCTGCATGA CATTACCGCC AACAGCTACC ATCGTAGCAA CGTACCAAAC 1140TCCAGCAAAC ATAAATTCAC CTGGTTAACT TATTCATCGT TAGCGCAGGT GTGTAAATAT 1200GCTAACCGTG TGAGCTATCA GGTACTGAAC CAGCATTCAC CTCGTTTAAC GCGCGGCTTG 1260CCGGAGCGTG AAGACAGCCT GGAAGAGTCT TACTGGGATC GT 1302(2)序列号11的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：30

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：11：

GGCTGCAGCC ATGAAATTTC CCGGTAAACG 30(2)序列号12的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：30

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：12：

GGAAGCTTAA CGATCCCAGT AAGACTCTTC 30(2)序列号13的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：72

(B)序列类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：其它核酸合成的DNA

(iii)假设：无

(iv)反义：无

(xi)序列：SEQ ID NO：13：GGGGATCCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC TAGTTAACAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA 60GGGTCTGCAG CC 72(2)序列号14的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：924碱基对

(B)序列类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ii)序列种类：基因组DNA(iii)假设：无(iv)反义：无(vi)起源

(A)生物名：乙酰微小杆菌

(B)株名：ATCC 35652(ix)序列特征：

(A)表现特征的标记：CDS

(B)位置：1..924

(C)决定特征的方法：E(xi)序列：SEQ ID NO：14：ATGAATACGA TTGCAGTAAT CGGCAAAGTG TTTGTCGACA TAAAAGGAAC GTCGTTCGCC 60CCCATCCATA AAGATGCGAA AAACGTCGGA GATATCGCCT TCTCAAACGG TGGCACCGGA 120CGAAACGTCG CTCAGAACTT AGGTGTCCTC GGTAACGATG TTCGGTTCGT CTCGACCGTG 180ACGAACGATC AAATCGGAAT CGGTGTCCTC GAAGAACTAC GCAGTTTGAA CGTCAATGTC 240GAACACGTCG ACTTGCTCGA AGACAACGGC ATGGGTATGT GGCTCGCGGT CATGGACAAT 300AACGGTGACC TCCAGACGTC AATCTCAAAA CAACCTGACG AGGCGATGAT GGAACAATGC 360ATCCTCCGTC GCATCGATAC CGTTTTCGCC GAGAGCACGG CTGTCGCCAT CGACCTCGAC 420TTATCGGTCA ACGTCTTAAA CGAGACGATT GAATTGTGCC GTGAGATGAA ACTCCCGCTA 480TACGGTGTAT GTGGTCACCT CTCGGTCATC GAACGCAACC GTCACTTGCT CCAAGGGTTC 540ACGGGCTTCA TCTGTAGCCG CGAAGAAGCC GAGATTCTCT CGGATATGTC CATCGTCACG 600GTTGACGATG CCCTTCGCGT CGCCGAGGTG CTCGCCATGA AAGGAGCGCC GCTCACGATT 660GTCACGATGA GCGAGCTCGG AGCCGTCTAC GTCGACCTTC GCACGAACGA ACAAGGTCAC 720GTGCCGACGA CGAAAGTGAA AGTTGCCGAC TCCACAGGCG CCGGGGATTC CTTCTTCTCT 780GCCGTTATTT CCGAGCTCAT GAAAGAGCAT TCGATTGAAG ATGCACTTCG TCTCGGCATG 840CGTGTCGCCG GGAAAGTCAT CGGCTCTCAT GACAACGGAC TGACGCCTGA GATGTATGCT 900TCACTTGAAC AACCAACACG TGAC 924(2)序列号15的序列信息：

(i)序列的特征：

(A)序列长度：308氨基酸

(B)序列类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)序列种类：蛋白质

(xi)序列：SEQ ID NO：15：Met Asn Thr Ile Ala Val Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lys Gly

5 10 15Thr Ser Phe Ala Pro Ile His Lys Asp Ala Lys Asn Val Gly Asp Ile

20 25 30Ala Phe Ser Asn Gly Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Gln Asn Leu Gly

35 40 45Val Leu Gly Asn Asp Val Arg Phe Val Ser Thr Val Thr Asn Asp Gln

50 55 60Ile Gly Ile Gly Val Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Asn Val Asn Val65 70 75 80Glu His Val Asp Leu Leu Glu Asp Asn Gly Met Gly Met Trp Leu Ala

85 90 95Val Met Asp Asn Asn Gly Asp Leu Gln Thr Ser Ile Ser Lys Gln Pro

100 105 110Asp Glu Ala Met Met Glu Gln Cys Ile Leu Arg Arg Ile Asp Thr Val

115 120 125Phe Ala Glu Ser Thr Ala Val Ala Ile Asp Leu Asp Leu Ser Val Asn

130 135 140Val Leu Asn Glu Thr Ile Glu Leu Cys Arg Glu Met Lys Leu Pro Leu145 150 155 160Tyr Gly Val Cys Gly His Leu Ser Val Ile Glu Arg Asn Arg His Leu

165 170 175Leu Gln Gly Phe Thr Gly Phe Ile Cys Ser Arg Glu Glu Ala Glu Ile

180 185 190Leu Ser Asp Met Ser Ile Val Thr Val Asp Asp Ala Leu Arg Val Ala

195 200 205Glu Val Leu Ala Met Lys Gly Ala Pro Leu Thr Ile Val Thr Met Ser

210 215 220Glu Leu Gly Ala Val Tyr Val Asp Leu Arg Thr Asn Glu Gln Gly His225 230 235 240Val Pro Thr Thr Lys Val Lys Val Ala Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp

245 250 255Ser Phe Phe Ser Ala Val Ile Ser Glu Leu Met Lys Glu His Ser Ile

260 265 270Glu Asp Ala Leu Arg Leu Gly Met Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Gly

275 280 285Ser His Asp Asn Gly Leu Thr Pro Glu Met Tyr Ala Ser Leu Glu Gln

290 295 300Pro Thr Arg Asp

Claims

1.一种5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其特征在于将编码具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质的基因导入可再生ATP的微生物中而得到的转化子与肌苷或鸟苷或其前体，能源及磷酸供体接触，于反应液中生成5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸并积累和收集。

2.权利要求1所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中可再生ATP的微生物是选自棒杆菌属、大肠杆菌属、糖酵母属、葡萄球菌属以及假丝酵母属的微生物。

3.权利要求1所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中可再生ATP的微生物是产氨棒杆菌。

4权利要求1-3任一项所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来自乙酰微小杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因。

5.权利要求1-3任一项所述的5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的制备方法，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因。

6.在可再生ATP的微生物中导入了编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因的转化子。

7.权利要求6的转化子，其中可再生ATP的微生物选自棒杆菌属、大肠杆菌属、糖酵母属、葡萄球菌属以及假丝酵母属。

8.权利要求6的转化子，其中可再生ATP的微生物是产氨棒杆菌。

9.权利要求6-8任一项的转化子，其中编码具有肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质的基因是来源于乙酰微小杆菌或者可与所述基因杂交的基因。

10.权利要求6-8任一项的转化子，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因。

11.可在产氨棒杆菌中复制并且含有编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因的重组DNA。

12.权利要求11的重组DNA，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于乙酰微小杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因。

13.权利要求11的重组DNA，其中编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因是来源于大肠杆菌的基因或者可与该基因杂交的基因。

14.可从乙酰微小杆菌微生物得到并且具有以下性质的肌苷-鸟苷激酶活性的蛋白质：

(1)作用

在磷酸供体的存在下，可向核苷转移磷酸基团生成核苷5′-磷酸；

(2)底物特异性

核苷三磷酸γ磷酸基团被转移至其它的核苷；

(3)最适pH

pH7.7-9.9；

(4)pH稳定性

pH6.7-12.1；

(5)最适温度

30-50℃

(6)金属需求性

镁离子、锰离子、钴离子或铁离子；

(7)金属离子的影响

铜离子、汞离子强烈抑制其活性；

锌离子、镉离子也抑制其活性；

(8)Km值

对鸟苷Km 0.03mM

对肌苷Km 1mM

当用鸟苷作底物时，ATP的Km值是1.6mM；

(9)分子量

在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中约36kD。

15.一种蛋白质，其具有肌苷-鸟苷激酶活性并具有序列表中序列号2所记载的氨基酸序列，或者该氨基酸序列的一部分有氨基酸的缺失，取代或添加。

16.编码权利要求14或15的蛋白质的基因。

17.一种编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质的基因，其具有序列表中序列号1所示的碱基序列，或者可与具有该碱基序列的基因杂交的基因。

一种基因，其编码肌苷-鸟苷激酶活性蛋白质并具有序列表中序列号1所示的碱基序列或可与具有该碱基序列的基因杂交。