ES2642928T3 - Proceso de fermentación usando velocidades de incorporación de oxígeno específicas como un control del proceso - Google Patents
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Description
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DESCRIPCION
Proceso de fermentacion usando velocidades de incorporacion de ox^geno espedficas como un control del proceso Antecedentes de la invencion
Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud provisional de EE.UU no. 60/384.333 presentada el 30 mayo de 2002.
Esta invencion se hizo bajo el apoyo del gobierno de EE.UU. con el contrato No. DE-FC-36-00GO10598, concedido por el departamento de energfa. El gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos en esta invecion.
El acido lactico presenta una amplia aplicabilidad industrial, que incluye usos en la smtesis y el procesamiento qmmicos, los productos cosmeticos, los productos farmaceuticos, los plasticos y la produccion de alimentos. La mayona de los procesos a escala industrial para preparar acido lactico son procesos de fermentacion. En esos procesos de fermentacion se han usado diversas bacterias productoras de acido lactico.
En una reciente investigacion se ha estudiado el uso de cepas de levadura recombinantes en procesos de fermentacion para acido lactico. Las levaduras recombinantes pueden proporcionar potencialmente varias ventajas sobre las fermentaciones bacterianas. Algunas cepas de levadura son mas resistentes a temperaturas mas elevadas. Esto permite potencialmente fermentaciones a mayores temperaturas, lo que se puede traducir en mayores velocidades de las fermentaciones. Una mayor resistencia a temperaturas elevadas puede hacer mas sencillo purgar un medio de fermentacion de los microbios contaminantes ya que el medio puede ser simplemente calentado a una temperatura a la que mueren las especies indeseadas pero que las especies deseadas pueden tolerar. Bacterias productoras de acido lactico tales como los lactobacilos requieren un medio de fermentacion complejo para poder producir eficazmente. La complejidad del medio de fermentacion aumenta los costes de las materias primas y hace mas diffcil y costoso separar el acido lactico del medio. El empleo de levaduras recombinantes ofrece la posibilidad de reducir los costes al usar un medio de fermentacion simplificado.
Porro y colaboradores han intentado disenar una levadura productora de acido lactico insertando un gen LDH (lactato deshidrogenasa) exogeno en celulas de levadura de las especies S. cerevisiae, K. lactic, T. delbrueckii y Z. bailii y alterando la ruta natural del piruvato de las celulas. Veanse Porro et al., "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", Biotechnol. Prog., mayo-junio de 1995, 11 (3): 294-8; Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol., septiembre de 1999, 65 (9): 4211-5; y Bianchi et al., "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactic strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol., diciembre de 2001, 67 (12): 5621-5. Porro fue capaz de producir una levadura recombinante que produce acido lactico, pero las cepas casi no se comportaban lo bastante bien para su implementacion en un proceso comercial. Para su calificacion para uso en un entorno industrial, la cepa debe generar buenos rendimientos de acido lactico (es decir, una elevada conversion del sustrato en acido lactico) y una elevada productividad (es decir, un rapido metabolismo del sustrato a acido lactico). La levadura es preferiblemente capaz de tolerar un medio que tiene un tftulo elevado de acido lactico.
Mas recientemente, Rajgarhia y colaboradores han creado una levadura recombinante que presenta unos rendimientos y unas productividades mayores que los de Porro. Veanse, por ejemplo, los Documentos WO 00/71738, WO 02/42471 y PCT/US02/16223. El trabajo de Rajgarhia, como se describe en el Documento WO 00/71738, intenta aprovecharse del llamado fenotipo "Crabtree negativo" presentado por ciertas especies de levadura. El efecto Crabtree se define como la aparicion de metabolismo fermentativo bajo condiciones aerobicas a causa de la inhibicion del consumo de oxfgeno por un microorganismo cuando es cultivado a altas velocidades de crecimiento espedficas (efecto de larga duracion) o en presencia de glucosa en altas concentraciones (efecto de corta duracion). Los fenotipos Crabtree negativos no presentan este efecto y, por lo tanto, son capaces de consumir oxfgeno incluso en presencia de glucosa en altas concentraciones o bajo altas velocidades de crecimiento. De este modo, los cultivos de microorganismos Crabtree negativos, al menos en teona, pueden ser convertidos de una fase de crecimiento en una fase de fermentacion (produccion) a traves de la manipulacion del suministro de oxfgeno. En presencia de una aireacion significativa, los microorganismos crecen para producir biomasa y CO2, mientras que, bajo condiciones anaerobicas, las celulas fermentan en cambio el sustrato disponible para producir acido lactico u otros productos de fermentacion.
Sin embargo, hemos hallado que ciertas cepas no fermentan tan eficazmente como sena deseable bajo condiciones estrictamente anaerobicas. Esto es cierto, por ejemplo, en cepas de levadura modificadas en que la ruta de la piruvato descarboxilasa (PDC) esta suprimida o alterada. Sin embargo, el uso de tales especies modificadas es por otro lado muy deseable en las fermentaciones lacticas (asf como en otras en que el producto deseado no es etanol) ya que la alteracion de la ruta de la PDC reduce la cantidad de etanol que se produce. En consecuencia, sena deseable obtener un proceso de fermentacion mejorado en que una cepa que no fermenta eficazmente bajo condiciones estrictamente anaerobicas pudiera producir economicamente un producto de fermentacion deseado.
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Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un grafico que ilustra el efecto de la velocidad de incorporacion de ox^geno (OUR; del ingles, oxygen uptake rate) sobre el consumo de glucosa y sobre la produccion y el rendimiento de acido lactico para cierta especie de K. marxianus geneticamente modificada.
La Figura 2 es un grafico que ilustra el efecto de la OUR sobre el consumo de glucosa y sobre la produccion y el rendimiento de acido lactico para otra especie de K. marxianus geneticamente modificada.
Sumario de la invencion
En un primer aspecto, esta invencion es un proceso que comprende
a) determinar un intervalo optimo de valores de OUR en los que las celulas de levadura modificadas geneticamente que tienen una alteracion de la PDC fermentan un carbohidrato hasta un producto de fermentacion deseado;
b) cultivar las celulas de levadura modificadas geneticamente que tienen una alteracion de la PDC en un medio que comprende un carbohidrato que las celulas de levadura son capaces de metabolizar y uno o mas nutrientes, mientras se airea el medio de manera que cuando las celulas crecen y se reproducen, la concentracion de oxfgeno disuelto (DO) en el medio se reduce a menos del 1% de la cantidad de saturacion y las celulas presentan una velocidad de incorporacion de oxfgeno espedfica de al menos 10 milimoles de O2/g de peso de celulas en estado seco/hora (milimoles de O2/gdw/h); y luego
c) cultivar las celulas en un medio tamponado bajo unas condiciones de fermentacion que incluyen unas condiciones de microaireacion suficientes para obtener el cultivo con una velocidad de incorporacion de oxfgeno (OUR) espedfica dentro del intervalo optimo.
En otro aspecto, la invencion es un proceso de fermentacion que comprende
a) cultivar celulas de levadura modificadas que tienen una ruta alterada de la PDC y un gen exogeno que permite a la celula producir un producto de fermentacion deseado en un medio que comprende un carbohidrato que la celula es capaz de metabolizar, mientras se airea el medio de manera que cuando las celulas crecen y se reproducen, se reduce la cantidad de oxfgeno disuelto en el medio a cero y las celulas presentan una velocidad de incorporacion de oxfgeno espedfica de al menos 10 milimoles de O2/g de peso de celulas en estado seco/hora (milimoles de O2/gdw/h); y luego
b) cultivar las celulas en un medio tamponado bajo unas condiciones de fermentacion que incluyen unas condiciones de microaireacion suficientes para obtener el cultivo con una velocidad de incorporacion de oxfgeno (OUR) espedfica de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 3,0 milimoles de O2/gdw/h y una concentracion de oxfgeno disuelto menor que 1% de la cantidad de saturacion.
Sorprendentemente, el uso de unas condiciones de microaireacion en que se emplean las velocidades de incorporacion de oxfgeno como un parametro de control del proceso permite la optimizacion del proceso de fermentacion, equilibrando unos elevados rendimientos relativos al producto de fermentacion deseado con unas buenas velocidades de produccion. Las mediciones de la OUR pueden ser utilizadas para establecer y controlar ciertos parametros del proceso de fermentacion con objeto de mantener unas condiciones optimas durante una fase de produccion de un proceso de fermentacion.
Descripcion detallada de la invencion
La OUR es la velocidad de consumo de oxfgeno (O2) por unidad de peso del microorganismo de produccion en estado seco por unidad de tiempo. La OUR se determina convenientemente a partir de la cantidad de oxfgeno que se consume por unidad de tiempo y a partir de la masa de las celulas durante ese periodo de tiempo. El consumo de oxfgeno se determina convenientemente midiendo la cantidad de oxfgeno suministrado a, y retirado de, el recipiente de fermentacion por unidad de tiempo. Luego se determina la OUR dividiendo el consumo de oxfgeno por la masa [peso en estado seco (dw; del ingles, dry weight)] de la biomasa en el caldo. Se puede determinar el peso de biomasa tomando una muestra y midiendo la concentracion de celulas (peso/volumen) y multiplicando por el volumen total de caldo. La cantidad de oxfgeno suministrado puede ser sencillamente medida determinando las velocidades de aireacion. La cantidad de oxfgeno que sale del recipiente de fermentacion puede ser medida usando diversos metodos analfticos, de entre los cuales la espectroscopfa de masas es particularmente util. La diferencia entre oxfgeno suministrado y oxfgeno retirado es la cantidad consumida por las celulas. La OUR se calcula dividiendo el consumo de oxfgeno por el peso de las celulas en estado seco y por unidad de tiempo. Se expresa convenientemente en unidades de milimoles de O2/gramos de celulas [peso en estado seco (dw)]/hora.
En su aspecto mas general, la invencion acarrea medir la OUR durante la fase de produccion de una fermentacion y controlar al menos un parametro de la fermentacion en respuesta a los valores de OUR medidos. El parametro que se controla en respuesta a la OUR medida estara tfpicamente relacionado con la aireacion del caldo de fermentacion, tal como velocidades de aireacion, velocidades de agitacion, composicion del gas de aireacion (por
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ejemplo, aumentando o disminuyendo la concentracion de ox^geno en el gas) o algun otro parametro que afecte a la velocidad a la que los microorganismos del caldo consumen oxfgeno.
Las celulas fermentadoras son cultivadas bajo diversas condiciones de aireacion para establecer empmcamente un intervalo optimo de OUR para el tipo particular de celula. En general, para el intervalo de OUR que es optimo se tendran en cuenta diversos factores, de los cuales tres tienden a ser primordiales: el rendimiento del producto de fermentacion deseado con respecto al sustrato de fermentacion (expresado normalmente en gramos de producto/gramos de sustrato consumidos), la productividad espedfica del producto de fermentacion deseado (expresada normalmente en peso de producto/peso de celulas en estado seco/unidad de tiempo), y las velocidades de consumo de sustrato (expresadas normalmente en peso de sustrato consumido/unidad de tiempo). No todos estos factores estan normalmente optimizados bajo las mismas condiciones de aireacion. Por ejemplo, las velocidades de consumo de sustrato aumentan a veces al aumentar la OUR, pero los rendimientos tienden a caer, contrarrestandose por ello las mayores velocidades de produccion con unas mayores perdidas de rendimiento y danandose la econoirna global del proceso. El establecimiento de un intervalo optimo de valores de OUR implicara generalmente equilibrar las velocidades con el rendimiento para optimizar la economfa global del proceso. Una vez que se ha establecido un intervalo deseado de valores de OUR, se seleccionan las condiciones de fermentacion en una fase de produccion de una fermentacion para establecer y mantener la OUR dentro de ese intervalo. Como antes, se mide la OUR durante el proceso y se controlan uno o mas parametros de fermentacion para que la OUR se mantenga dentro del intervalo.
Durante esta fase de produccion, la concentracion de oxfgeno disuelto se mantiene en aproximadamente cero, lo que refleja el estado en que las celulas estan consumiendo oxfgeno a aproximadamente la misma velocidad a la que se esta disolviendo en el caldo de fermentacion. La concentracion de oxfgeno disuelto durante la fase de produccion es generalmente inferior al 1% de la cantidad de saturacion (es decir, la cantidad maxima que se puede disolver en el caldo bajo las condiciones de temperatura y presion que se emplean). Tfpicamente, son adecuados los contenidos de oxfgeno disuelto inferiores a aproximadamente 10 micromoles/l, mas preferiblemente inferiores a 5 micromoles/l. Lo mas preferiblemente, el contenido de oxfgeno disuelto es esencialmente cero. El oxfgeno disuelto se mide convenientemente usando un electrodo de oxfgeno con una membrana permeable a los gases (electrodo Clark), tal como el fabricado por Ingold y vendido por B Braun bajo los numeros de artfculo 33182418 y 33182400. Se considera que el funcionamiento con contenidos de oxfgeno disuelto por debajo del lfmite de deteccion de instrumentos tales como estos refleja una concentracion de oxfgeno disuelto de aproximadamente cero para los propositos de esta invencion.
En un aspecto especialmente preferido de esta invencion, se cultiva una celula de levadura modificada geneticamente que tiene una alteracion de la PDC bajo diferentes condiciones de crecimiento y produccion. En la fase de crecimiento la levadura modificada geneticamente que tiene una alteracion de la PDC se desarrolla aerobicamente. Las celulas se desarrollan en un medio que contiene agua, un carbohidrato que la celula puede metabolizar tanto en la fase de crecimiento como en la de produccion, y diversos nutrientes como los descritos mas adelante con mayor detalle. Las condiciones de aireacion se seleccionan de modo que (1) las celulas presenten una velocidad de incorporacion de oxfgeno (OUR) espedfica de al menos 10 milimoles de O2/gdw/h y (2) al final de la fase de crecimiento, y la concentracion de oxfgeno disuelto (DO) en el medio se reduzca a menos del 1% de la cantidad de saturacion mientras se mantiene una OUR de al menos 10 milimoles de O2/gdw/h. La OUR es preferiblemente al menos 15 y mas preferiblemente al menos 18 milimoles de O2/gdw/h. Lo mas preferiblemente, durante la fase de crecimiento la oUr es lo mas elevada que las celulas puedan generar. Por lo tanto, la OUR maxima dependera en cierta medida de la particular celula de levadura modificada que se emplee. En general, se espera que la OUR maxima sea aproximadamente 20-30 milimoles de 02/gdw/h. Las celulas de K. marxianus que tienen una alteracion de la PDC y un gen LDH exogeno tienden a presentar una OUR maxima en el intervalo de aproximadamente 20-22 milimoles de 02/gdw/h.
El DO puede ser, y es preferiblemente, superior a cero durante la mayor parte de la fase de crecimiento con tal de que se reduzca a aproximadamente cero al final de la fase. De este modo, durante la mayor parte de la fase de crecimiento, particularmente durante el periodo en que las celulas experimentan un crecimiento exponencial, se puede introducir en el medio un exceso de oxfgeno con respecto al requerido para mantener la oUr requerida. Puesto que la incorporacion total de oxfgeno aumenta durante la fase de crecimiento porque las celulas se reproducen y se acumula biomasa, aumentara la cantidad total de oxfgeno requerida para mantener una OUR constante. Sin embargo, puesto que el DO puede ser positivo antes del final de la fase de crecimiento, un modo preferido de llevar la aireacion a cabo es suministrar un exceso del oxfgeno requerido al inicio y durante la etapa exponencial de la fase de crecimiento. Conforme se acumula biomasa, el oxfgeno total consumido por las celulas aumenta hasta el punto en que el oxfgeno suministrado se equipara mucho al consumido por las celulas, y el DO cae como resultado. Por lo tanto, se pueden usar unas condiciones de aireacion constantes durante la fase de crecimiento si esas condiciones se seleccionan de manera que el DO caiga a cero con la OUR requerida cuando se ha producido la cantidad deseada de biomasa. Alternativamente, se pueden variar las condiciones de aireacion durante la fase de crecimiento con tal de que la OUR se mantenga y el DO llegue a ser aproximadamente cero al final de la fase de crecimiento.
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Una vez que el DO ha cafdo a aproximadamente cero y se ha producido la cantidad deseada de biomasa, se prefiere mantener aquellas condiciones de aireacion (OUR de al menos 10 milimoles de 02/gdw/h y DO igual a cero) durante un periodo de tiempo antes del cambio a la fase de produccion. Un periodo de tiempo adecuado es aproximadamente de 15 minutos a 2 horas, y un periodo de tiempo preferido es aproximadamente de 30 a 90 minutos. Un periodo de tiempo muy preferido es aproximadamente 45-75 minutos. Si se cambia el organismo demasiado rapidamente a la fase de produccion, las celulas tienden a presentar malas velocidades de produccion. Si se mantienen estas condiciones de aireacion durante demasiado tiempo, las celulas tienden a presentar malos rendimientos relativos al producto de fermentacion deseado asf como malas velocidades de produccion.
El cultivo se cambia a la fase de produccion a traves de un cambio en las condiciones de aireacion. En la fase de produccion, se seleccionan unas condiciones de microaireacion para que la OUR se mantenga dentro de un intervalo predeterminado, como se discutio anteriormente. Parece que algunas levaduras modificadas geneticamente que tienen una alteracion de la PDC necesitan metabolizar una pequena cantidad de oxfgeno con objeto de promover la vitalidad y la salud celulares globales. Los ejemplos de tales celulas de levadura geneticamente modificadas que tienen una alteracion de la PDC, incluyen aquellas que tienen un gen exogeno que las permite producir un producto de fermentacion concreto. En condiciones completamente anaerobicas, las velocidades de consumo de sustrato y de produccion del producto de fermentacion mostradas por estas celulas son normalmente muy pequenas. Ademas, los rendimientos del producto de fermentacion deseado se ven afectados. Bajo condiciones microaerobicas, con ciertos valores de OUR que dependen de la cepa particular, las celulas son capaces de metabolizar el sustrato mucho mas rapidamente. Esto da lugar a velocidades aumentadas de consumo de sustrato y de produccion del producto de fermentacion deseado. Sin embargo, cuando el consumo de oxfgeno aumenta mas alla de cierto valor, los rendimientos relativos al producto deseado disminuyen a medida que mas sustrato se convierte en dioxido de carbono. Ademas, las velocidades de produccion tienden a nivelarse o incluso disminuir cuando la OUR aumenta mas alla de cierto valor, por lo que las perdidas de rendimiento no son compensadas por las velocidades aumentadas. En consecuencia, el mantenimiento de la OUR dentro de ciertos intervalos durante la fase de produccion permite que se alcance un equilibrio economicamente optimo entre rendimientos y velocidades de produccion.
El valor optimo de la OUR depende en cierto modo del organismo particular, aunque, en general, el intervalo de OUR es de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 3 milimoles de O2/gdw/h. Los valores de OUR optimos para un organismo particular son facilmente determinados empmcamente. Un extremo inferior preferido del intervalo de OUR es aproximadamente 1,0 milimoles de O2/gdw/h y mas preferiblemente aproximadamente 1,2 milimoles de O2/gdw/h. Un extremo superior preferido del intervalo de OUR es aproximadamente 2,5 milimoles de O2/gdw/h, mas preferiblemente aproximadamente 2,0 milimoles de O2/gdw/h.
La OUR mostrada por un cultivo depende en gran medida del propio microorganismo y de las condiciones de aireacion. Las condiciones de aireacion afectan a la cantidad de oxfgeno que llega a disolverse en el medio y, por lo tanto, resulta asequible al organismo. Para un organismo dado, se favorece una OUR aumentada (1) incrementando la velocidad a la que se suministra oxfgeno y (2) mediante la formacion de pequenas burbujas de oxfgeno (para mejorar la transferencia masica de moleculas de oxfgeno en la fase lfquida). La formacion de pequenas burbujas se alcanza facilmente por medio de burbujeo y/o agitacion.
Los ejemplos de velocidades de aireacion durante la fase de crecimiento son aproximadamente al menos 0,2 volumenes de aire/volumen de medio de fermentacion/minuto (vvm), preferiblemente de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 2 vvm, incluso mas preferiblemente de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 1 vvm. En la fase de produccion son generalmente adecuados los volumenes de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1 vvm, preferiblemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,75 vvm, especialmente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,5 vvm. Si se emplea oxfgeno como gas de aireacion, los volumenes seran proporcionalmente mas pequenos. La aireacion se realiza preferiblemente bajo condiciones tales como un burbujeo que provoca la formacion de burbujas gaseosas finas. Preferiblemente se mantiene la agitacion, particularmente cuando se desean valores de oUr elevados. Tfpicamente, para alcanzar la OUR deseada se seleccionan conjuntamente las velocidades de aireacion y las condiciones de agitacion.
Cuando el producto de fermentacion es un acido, el medio es tamponado durante la fase de produccion de modo que el pH se mantenga en el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0, preferiblemente de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,0. Los agentes de tamponamiento adecuados son materiales basicos que neutralizan el acido lactico conforme se forma, e incluyen, por ejemplo, hidroxido calcico, carbonato calcico, hidroxido sodico, hidroxido potasico, carbonato potasico, carbonato sodico, carbonato amonico, amoniaco, hidroxido amonico y similares. En general, tambien son adecuados en esta memoria aquellos agentes de tamponamiento que han sido utilizados en procesos de fermentacion convencionales.
Otras condiciones de fermentacion tales como la temperatura, la densidad celular, la seleccion de sustrato(s), la seleccion de nutrientes, y similares no se consideran cnticas para la invencion y se seleccionan generalmente para obtener un proceso economico. Las temperaturas durante cada una de las fases, la de crecimiento y la de produccion, pueden variar desde por encima de la temperatura de congelacion del medio hasta aproximadamente 50 °C, aunque la temperatura optima dependera en cierto modo del microorganismo particular. Una temperatura
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preferida, particularmente durante la fase de produccion, es aproximadamente 30-45 °C. Cuando la celula es una celula de K. marxianus modificada, puede tolerar temperaturas relativamente elevadas (tales como por encima de 40 °C y hasta 50 °C, especialmente hasta 45 °C). Otra especie preferida de celula, C. sonorensis, puede tolerar temperaturas de hasta aproximadamente 40 °C. Este intervalo de temperaturas proporciona la posibilidad de llevar a cabo la fermentacion a tales mayores temperaturas (reduciendose por ello los costes de refrigeracion) sin una perdida significativa de productividad. Otra ventaja proporcionada por la buena tolerancia a altas temperaturas es que, si se llega a contaminar la fermentacion con un microorganismo indeseado, el microorganismo indeseado puede ser selectivamente matado en muchos casos calentando el medio de fermentacion a 40 °C o mas, especialmente a 45 °C o mas, sin danar significativamente las celulas deseadas de la invencion.
Durante la fase de produccion, la concentracion de celulas en el medio de fermentacion esta tipicamente en el intervalo de aproximadamente 1-150, preferiblemente de aproximadamente 3-10, aun mas preferiblemente de aproximadamente 3-6, gramos de celulas en estado seco/litro de medio de fermentacion.
Los carbohidratos concretos que se emplean dependen de la celula huesped particular y de si la celula huesped ha sido modificada para que metabolice cualquier carbohidrato concreto hasta piruvato. Se prefieren azucares hexosas tales como glucosa, fructosa y oligomeros de glucosa tales como maltosa, isomaltosa, maltotriosa, almidon y maltodextrinas. En el caso de azucares oligomericos, puede resultar necesario anadir enzimas al caldo de fermentacion con objeto de que digieran aquellos hasta el azucar monomerico. La xilosa es un ejemplo de un azucar pentosa adecuado. La glucosa es muy preferida.
En una fermentacion tamponada, los productos de fermentacion acidos tales como el acido lactico son neutralizados hasta la correspondiente sal de lactato conforme se forman. Por lo tanto, la recuperacion del acido implica regenerar el acido libre. Esto se realiza tfpicamente separando las celulas y acidulando el caldo de fermentacion con un acido fuerte tal como el acido sulfurico. Se forma un subproducto salino (yeso en el caso de que una sal de calcio sea el agente neutralizante y el acido sulfurico sea el agente acidulante) que es separado del acido. Luego se recupera el acido por medio de tecnicas tales como extraccion lfquido-lfquido, destilacion, absorcion, etc., tal como se describe en T. B. Vickroy, volumen 3, capttulo 38 de Comprehensive Biotechnology (redactado por M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta et al., FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16: 221-231; las Patentes de EE.UU. numeros 4.275.234, 4.771.001, 5.132.456, 5.420.304, 5.510.526, 5.641.406 y 5.831.122; y la Solicitud de Patente Internacional n° WO 93/00440.
El medio contendra tipicamente nutrientes como los requeridos por la celula particular, incluyendo una fuente de nitrogeno (tal como aminoacidos, protemas, fuentes de nitrogeno inorganicas tales como amomaco o sales de amonio, y similares) y diversas vitaminas, minerales y similares.
El proceso de la invencion puede ser llevado a cabo continua o discontinuamente, o mediante cierta combinacion de estas formas.
El microorganismo utilizado en el proceso de la invencion, es cualquiera que (1) fermenta un carbohidrato hasta un producto de fermentacion deseado y (2) fermenta mas eficazmente en presencia de condiciones microaerobicas que en condiciones estrictamente anaerobicas. Son celulas de particular interes ciertas celulas de levadura geneticamente modificadas y caracterizadas por tener (1) una ruta alterada de la PDC y (2) al menos un gen exogeno funcional que permite a la celula producir el producto de fermentacion deseado. Dichas celulas de levadura modificadas adecuadas se describen, por ejemplo, en Porro et al., "Development of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae cells for the production of lactic acid", Biotechnol. Prog., mayo-junio de 1995, 11 (3): 2948; Porro et al., "Replacement of a metabolic pathway for large-scale production of lactic acid from engineered yeasts", App. Environ. Microbiol., septiembre de 1999, 65 (9): 4211-5; Bianchi et al., "Efficient homolactic fermentation by Kluyveromyces lactic strains defective in pyruvate utilization and transformed with the heterologous LDH gene", App. Environ. Microbiol., diciembre de 2001, 67 (12): 5621-5; los documentos WO 00/71738, WO 02/42471 y PCT/US02/16223; y la Solicitud Provisional de EE.UU. n° 60/384.333, presentada el 30 de mayo de 2002. La celula tambien presenta preferiblemente el fenotipo Crabtree negativo, por lo que respira y crece bajo condiciones de aireacion en presencia de altas concentraciones de glucosa y con elevadas velocidades de crecimiento espedficas.
Por "alterada" se quiere significar que una ruta nativa de la PDC ha sido cambiada para que la funcion de la ruta de la PDC se reduzca en al menos 90%. La alteracion puede ser llevada a cabo cambiando la ruta (o uno o mas genes asociados con la ruta) para que su funcion se reduzca o elimine, o eliminando uno o mas genes necesarios para que la ruta funcione. La celula de levadura modificada geneticamente de la invencion tiene una delecion de un gen PDC.
Un gen exogeno preferido es un gen de lactato deshidrogenasa (LDH). El gen se integra preferiblemente en el genoma de la celula. La celula de levadura modificada puede tener una sola copia o multiples copias del gen LDH exogeno. Puede contener dos o mas genes LDH exogenos diferentes. En una realizacion especialmente preferida, el gen se integra en el genoma de la celula en la posicion de un gen PDC nativo, que esta suprimido. En la realizacion especialmente preferida, el gen LDH esta bajo el control funcional de secuencias promotoras y terminadoras operativas que tienen una homologfa de al menos 90% con respecto a secuencias promotoras y terminadoras (particularmente secuencias promotoras y terminadoras de PDC) que son nativas de la celula. Estas
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celulas preferidas y especialmente preferidas se describen mas detalladamente en la Solicitud Provisional de EE.UU. n° 60/384.333, presentada el 30 de mayo de 2002 y se incorpora en la presente memoria por referencia.
Lactobacillus helveticus, Pediococcus acidolactid, Lactobacillus casei, Kluyveromyces thermotolerans, Torulaspora delbrueckii, Schizosaccharomyces pombii y B. megaterium son cepas que tienen genes de L-lactato deshidrogenasa adecuados que pueden ser clonados para uso en la produccion de la levadura modificada. Dos genes de L-lactato deshidrogenasa preferidos son los de L-lactato deshidrogenasa de L. helveticus y B. megaterium. Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus pentosus son cepas que tienen D-lactato deshidrogenasas adecuadas que pueden ser clonadas para uso en la levadura modificada. Un gen de D-lactato deshidrogenasa preferido es el de D-lactato deshidrogenasa de L. helveticus.
Para que fuera comercialmente util, la celula de levadura modificada geneticamente que tiene una alteracion de la PDC debena presentar varias caractensticas. La levadura debena convertir una proporcion significativa del carbohidrato en el producto de fermentacion deseado (es decir, producir el producto con elevado rendimiento). Debena presentar una elevada productividad espedfica, es decir, producir una gran cantidad de producto de fermentacion por peso de celula por unidad de tiempo. Preferiblemente, la celula tambien es tolerante a elevadas concentraciones del producto de fermentacion. Esta ultima propiedad permite que en el proceso de fermentacion se empleen altas concentraciones del carbohidrato de partida.
En general, es deseable que el proceso de fermentacion de la invencion proporcione algunas de las caractensticas siguientes, o todas:
A. Un rendimiento de al menos 30, preferiblemente al menos 40, mas preferiblemente al menos 60, aun mas preferiblemente al menos 75, gramos de producto de fermentacion por gramo de sustrato. El rendimiento deseado teorico es 100%, pero los ftmites practicos de los rendimientos son aproximadamente 98%.
B. Una productividad espedfica de al menos 0,1, preferiblemente al menos 0,3, mas preferiblemente al menos aproximadamente 0,4, especialmente al menos aproximadamente 0,5, gramos de producto de fermentacion/gramo de celulas/hora. Las productividades espedficas son deseablemente lo mas elevadas posibles.
C. Un tftulo (concentracion maxima de producto de fermentacion) de al menos 15 gramos/litro de medio de fermentacion, preferiblemente al menos 20 g/l, mas preferiblemente al menos 40 g/l, aun mas preferiblemente al menos 80 g/l, hasta 150 g/l, preferiblemente hasta aproximadamente 120 g/l. En el caso del acido lactico, la temperatura del medio de fermentacion afecta de algun modo al extremo superior de los tftulos facilmente alcanzables, ya que las disoluciones de acido lactico muy concentradas (es decir, con mas de aproximadamente 150 g/litro) tienden a volverse muy viscosas o a gelificar a temperaturas por debajo de aproximadamente 35 °C. El uso de una mayor temperatura de fermentacion, tal como de aproximadamente 35-50 °C, permite tftulos mayores sin gelificacion ni un excesivo aumento de viscosidad.
Ademas, en el proceso de fermentacion de la invencion se alcanza preferiblemente una elevada productividad volumica. La productividad volumica se expresa como la cantidad de producto producido por unidad de volumen de medio de fermentacion por unidad de tiempo, tfpicamente como gramos de producto/litro de medio/hora. Son deseables unas productividades volumicas de al menos 1,5 g/l/h, preferiblemente de al menos 2,0 g/l/h, mas preferiblemente de al menos 2,5 g/l/h. Con densidades celulares preferidas de hasta 3-6 g de celulas/litro de medio de fermentacion, las productividades maximas tienden a ser hasta aproximadamente 5,0 g/l/h, y mas tfpicamente hasta aproximadamente 4,0 g/l/h. Es muy preferido llevar la fermentacion a cabo de modo que se alcancen estas productividades volumicas cuando el pH del medio o la temperatura, o ambos parametros, estan dentro de los intervalos descritos en el parrafo precedente.
El acido lactico producido de acuerdo con la invencion es util para producir lactida, un antftdrido dclico de dos moleculas de acido lactico. Dependiendo del estereoisomero del acido lactico, la lactida puede ser D-lactida (preparada a partir de dos moleculas de acido D-lactico), L-lactida (preparada a partir de dos moleculas de acido L- lactico) o D-L-lactida (preparada a partir de una molecula de acido L-lactico y una molecula de acido D-lactico). Un metodo conveniente para producir lactida a partir de acido lactico es a traves de un metodo de polimerizacion/despolimerizacion como el descrito en la Patente de EE.UU. n° 5.142.023, concedida a Gruber et al.
A su vez, la lactida es particularmente util como un monomero para la produccion de poftmeros [PLA; del ingles, 2oly(]actic acid)] y copoftmeros de polilactida. En la Patente de EE.UU. n° 5.142.023, concedida a Gruber et al., tambien se describen procedimientos para preparar estos poftmeros. Los productos de PLA preferidos son poftmeros estables en estado fundido como los descritos en la Patente de EE.UU. n° 5.338.822, concedida a Gruber et al. El PLA puede ser semicristalino o amorfo.
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar ciertas realizaciones de la invencion y no limitan su alcance ni su espftitu. Todas las partes y porcentajes son en peso a menos que se indique otra cosa.
Ejemplo 1
Se prepara una reserva madre para inoculacion de una celula de levadura modificada, denominada CD 587, en un matraz sacudido de 250 ml de capacidad que contiene 100 ml de medio de extracto de levadura (10 g/l) - peptona (20 g/l) tamponado con CaCO3 (42 g/l), con 100 g/l de glucosa. A una OD600 = 10, las celulas son recolectadas por 5 centrifugacion y son posteriormente resuspendidas en una disolucion de glicerol al 15% (peso/volumen) y almacenadas a -80 °C en partes alfcuotas de 1,5 ml.
La celula CD 587 es una celula de K. marxianus que tiene su gen PDC suprimido y un gen D-LDH exogeno de L. helveticus integrado en su genoma, en el sitio del gen PDC suprimido, bajo el control de secuencias promotoras y terminadoras de PDC nativas. La celula CD 587 y su preparacion se describen mas detalladamente en la Solicitud 10 Provisional de EE.UU. n° 60/384.333, presentada el 30 de mayo de 2002.
La fase de crecimiento se inicia inoculando una reserva madre de 1,5 ml en glicerol en un fermentador de 3 l de capacidad, lo que da lugar a una OD600 inicial de 0,05. La fase de crecimiento se lleva a cabo aerobicamente burbujeando continuamente aire a un caudal de 1,5 l/min (0,5 vvm), con una velocidad constante del agitador de 800 rpm. Se continua el crecimiento hasta que el DO se reduce al 5% de la saturacion de aire. Esto coincide con una 15 concentracion constante de CO2 en el gas desprendido. Se mide la OUR determinando la cantidad de aire suministrado y analizando el oxfgeno de los gases desprendidos por medio de espectrometna de masas. Durante la fase de crecimiento, la OUR es aproximadamente 20,8 ± 2,5 milimoles de 02/gdw/h. Bajo estas condiciones, la OUR viene limitada por la capacidad de la celula para metabolizar el oxfgeno disponible. La densidad celular final es aproximadamente 4 g/l.
20 Una vez que el DO ha alcanzado el valor de cero, se mantienen las condiciones de aireacion durante una hora antes de comenzar la fase de produccion. La fase de produccion se inicia cambiando instantaneamente el caudal de aire a 0,1 l/min (0,033 vvm) y disminuyendo la velocidad del agitador a 500 rpm. Este cambio en las condiciones de aireacion da lugar a una OUR de 1,5 ± 0,1 milimoles de O2/gdw/h y un DO de cero durante la fase de produccion. Se continua la fermentacion durante aproximadamente 60 horas. Se miden la velocidad de consumo de glucosa, la 25 velocidad de produccion de lactato y el rendimiento a lactato extrayendo periodicamente muestras para analisis por HPLC/IC/GC-MS. En la Tabla 1 se muestran los resultados en la fase de produccion.
Tabla 1
- Tftulo maximo de acido lactico
- 106 ± 3,1 g/kg
- Velocidad de consumo de glucosa
- 1,2 ± 0,05 g/gdw/h
- Velocidad de produccion de acido lactico
- 1,1 ± 0,04 g/gdw/h
- Rendimiento a acido lactico (fase de produccion)
- 0,92 ± 0,03 g de acido lactico/g de glucosa
- % de carbono recuperado (fase de produccion)
- 99% ± 3,0
- Pureza optica del acido lactico
- > 99,9
Este experimento se repite varias veces variando las condiciones de aireacion en la fase de produccion con objeto 30 de obtener valores de OUR de aproximadamente 1,2, 2,2, 2,8, 3,0 y 3,2 en ensayos sucesivos. Los resultados se
muestran graficamente en la Figura 1. Como se muestra en la Figura 1, el rendimiento (curva 1) disminuye continua y drasticamente al aumentar la OUR a traves del intervalo de 1,2 a 3,0, viendose un aumento (posiblemente una anomalfa) antes de otra disminucion significativa a una OUR de 3,2. Estos rendimientos disminuidos son consistentes con una respiracion celular aumentada conforme se dispone de cada vez mas oxfgeno. Las 35 velocidades de produccion de lactato (curva 3) aumentan ligeramente dentro de un intervalo de OUR de 1,2 a aproximadamente 2,2 y luego caen cuando se aumenta la OUR a 2,8 antes de aumentar. Sin embargo, el beneficio de unas velocidades de produccion aumentadas a valores de OUR de 3 o mas se pierde a causa de la creciente perdida de rendimiento. Las velocidades de utilizacion de glucosa (curva 2) aumentan algo conforme la OUR aumenta de 1,2 a 2,8 y aumentan sustancialmente a una OUR superior a 3,0 a causa de una rapida respiracion 40 celular. Los datos de la Figura 2 sugieren que, para esta cepa, un valor de OUR optimo esta en el intervalo de
aproximadamente 0,8 a 2,2, y especialmente de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 1,5.
Ejemplo 2
Se repite el Ejemplo 1 varias veces utilizando una cepa denominada CD 558. La cepa CD 558 es una celula de K. marxianus que tiene suprimido su gen PDC. Contiene un gen D-LDH exogeno de L. helveticus aleatoriamente 45 integrado en su genoma. El gen LDH esta bajo el control de un promotor PGK-1 de S. cerevisiae y secuencias terminadoras Gal-10 de S. cerevisiae. En cada ensayo, la OUR es aproximadamente 20,5 milimoles de O2/gdw/h en la fase de crecimiento. Las condiciones de aireacion durante las fases de produccion son variadas de ensayo a ensayo controlando las velocidades de burbujeo y agitacion, con objeto de variar la OUR. Los valores de OUR para los diferentes ensayos son aproximadamente 0,6, 1,4, 1,7 y 2,2. Para una OUR de 1,7 en la fase de produccion, los
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resultados son como se muestran en la Tabla 2:
Tabla 2
- Tftulo maximo de acido lactico
- 111 g/kg
- Velocidad de consumo de glucosa
- 0,94 g/gdw/h
- Velocidad de produccion de acido lactico
- 0,83 g/gdw/h
- Rendimiento a acido lactico (fase de produccion)
- 0,89 g de acido lactico/g de glucosa
- % de carbono recuperado (fase de produccion)
- 95,6
- Pureza optica del acido lactico
- > 99,9
La Figura 2 ilustra como la variacion de OUR afecta a las velocidades de produccion y los rendimientos. Para esta cepa, el rendimiento a acido lactico (curva 1) presenta una dependencia muy acusada de la OUR en el intervalo de 0,7 a 2,2, alcanzando un maximo cuando la OUR es alrededor de 1,4. Las velocidades de produccion de lactato (curva 3) alcanzan similarmente el maximo a ese valor de OUR. Las velocidades de consumo de glucosa (curva 2) aumentan hasta que la OUR es aproximadamente 2,2 y luego se nivelan. Para esta cepa, los datos de la Figura 2 sugieren que la OUR optima esta en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,7, especialmente en el intervalo de aproximadamente 1,2-1,5.
Ejemplo 3
Se repite tres veces el Ejemplo 1. El primero de estos ensayos (3A) se lleva a cabo del modo descrito en el Ejemplo 1 con la excepcion de que la OUR durante la fase de produccion es 2,1 milimoles de O2/gdw/h. Durante el segundo de estos ensayos (3B), se cambia inmediatamente el cultivo a la fase de produccion cuando el DO durante la fase de crecimiento alcanza un valor de cero. La OUR es 1,8 milimoles de O2/gdw/h bajo las mismas condiciones de aireacion que en el Ejemplo 3A. En el tercer ensayo (3C), se continua la aireacion al final de la fase de crecimiento durante mas de 1,5 horas una vez que el DO ha alcanzado un valor de cero, y la OUR en la fase de produccion es 1,4 milimoles de O2/gdw/h bajo las mismas condiciones de aireacion que en el Ejemplo 3A. Los resultados se resumen en la Tabla 3.
Tabla 3
- Propiedad
- Numero de ejemplo
- 3A 3B 3C
- Tiempo de permanencia, DO de cero
- 1 h 0 > 1,5 h
- OUR, fase de produccion (milimoles/gdw/h)
- 2,1 1,8 1,4
- Tftulo maximo de acido lactico (g/kg)
- 112,3 84 94
- Velocidad de consumo de glucosa (g/gdw/h)
- 1,22 1,06 0,40
- Velocidad de produccion de lactato (g/gdw/h)
- 1,20 0,93 0,32
- Rendimiento a acido lactico (fase de produccion, g/g)
- 0,89 0,84 0,79
- % de recuperacion de carbono (fase de produccion)
- 105 104,3 98
- Pureza optica (%)
- > 99,9 > 99,9 > 99,9
Bajo las condiciones de aireacion dadas durante la produccion, la OUR es un indicador de la actividad metabolica del microorganismo. La disminucion de la OUR cuando el tiempo de permanencia es cero o excede de 1,5 horas (con respecto a aquella despues de un periodo de permanencia de 1 hora) indica que el microorganismo actua menos bien bajo esas condiciones. Esto se ve tambien reflejado en una disminucion del consumo de glucosa, la produccion de lactato y los rendimientos.
Ejemplo 4
Se cultiva aerobicamente una reserva madre para inoculacion de una celula de levadura CD 587 en un biorreactor de laboratorio de 14 litros de capacidad usando un medio mineral tamponado (pH de 5,5) y complementado con 160 g/l de glucosa. Se suministra aireacion burbujeando aire con agitacion a un caudal de 5 litros/minuto. El DO durante esta fase de crecimiento inicial es inicialmente 100% y disminuye a 20% durante el ciclo. La OUR se mantiene a aproximadamente 20 milimoles de O2/gdw/h. Cuando la OD600 = 10, se transfieren 4 litros del caldo a un fermentador a escala de produccion, de 240 litros de capacidad, que contiene 220 litros adicionales del medio de crecimiento complementado con 170 g/l de glucosa. Las celulas son adicionalmente cultivadas bajo condiciones aerobicas a una
temperatura de 42 °C y un pH de 5,5 durante aproximadamente 8 horas. Durante este tiempo el DO se reduce de un valor de partida de 100 hasta cero. Se mantiene la OUR a 20 milimoles de O2/gdw/h mediante aireacion con 15 litros/minuto de aire. Se mantiene el cultivo con un DO de cero durante una hora. Luego se cambia el cultivo a la fase de produccion reduciendo la aireacion para alcanzar una OUR de 1,5-1,7 milimoles de 02/gdw/h. Se anade 5 agente de tamponamiento adicional [Ca(OH)2] segun sea necesario para mantener el pH en 5,5 ± 0,1. El DO permanece en 0% durante la fase de produccion. La glucosa se consume en un periodo de 30 horas, lo que proporciona un tttulo de lactato de 114 g/kg. La velocidad espedfica media de consumo de glucosa durante la fase de produccion es 1,1 g/g DW.h-1. La velocidad espedfica media de produccion de acido lactico es 0,8 g/g DW .h-1, con un rendimiento de produccion de 0,76 g de acido lactico/g de glucosa y un rendimiento global (incluyendo la fase 10 de crecimiento) de 0,67 g de acido lactico/g de glucosa.
Claims (15)
- 5101520253035REIVINDICACIONES1. Un proceso que comprende a) determinar un intervalo optimo de valores de OUR en los que las celulas de levadura modificadas geneticamente que tienen una alteracion de la PDC fermentan un carbohidrato hasta un producto de fermentacion deseado; b) cultivar las celulas de levadura modificadas geneticamente que tienen una alteracion de la PDC en un medio que comprende un carbohidrato que las celulas de levadura son capaces de metabolizar y uno o mas nutrientes, mientras se airea el medio de manera que cuando las celulas crecen y se reproducen, la concentracion de oxfgeno disuelto en el medio se reduce a menos del 1% de saturacion y las celulas presentan una velocidad de incorporacion de oxfgeno espedfica de al menos 10 milimoles de 02/g de peso de celulas en estado seco/hora (milimoles de 02/gdw/h); y luego c) cultivar las celulas en un medio tamponado bajo unas condiciones de fermentacion que incluyen unas condiciones de microaireacion suficientes para obtener el cultivo con una velocidad de incorporacion de oxfgeno (OUR) espedfica dentro del intervalo optimo.
- 2. El proceso de la reivindicacion 1, en el que la celula de levadura exhibe un fenotipo Crabtree negativo.
- 3. El proceso de la reivindicacion 2, en el que la celula de levadura es del genero Kluyveromyces o Candida.
- 4. El proceso de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la celula de levadura tiene al menos un gen exogeno funcional que permite a la celula producir un producto de fermentacion deseado.
- 5. El proceso de la reivindicacion 4, en el que el gen exogeno es un gen de lactato deshidrogenasa.
- 6. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la OUR en la etapa a) es al menos 18 mmol 02/gdw/h.
- 7. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el carbohidrato incluye un azucar hexosa.
- 8. El proceso de la reivindicacion 7, en el que el azucar hexosa incluye glucosa.
- 9. Un proceso de fermentacion que comprende a) cultivar celulas de levadura modificadas que tienen una ruta alterada de la PDC y un gen exogeno que permite a la celula producir un producto de fermentacion deseado en un medio que comprende un carbohidrato que la celula es capaz de metabolizar, mientras se airea el medio de manera que cuando las celulas crecen y se reproducen, se reduce la tension de oxfgeno disuelto en el medio a cero y las celulas presentan una velocidad de incorporacion de oxfgeno espedfica de al menos 10 milimoles de 02/g de peso de celulas en estado seco/hora (milimoles de 02/gdw/h); y luego b) cultivar las celulas en un medio tamponado bajo unas condiciones de fermentacion que incluyen unas condiciones de microaireacion suficientes para obtener el cultivo con una velocidad de incorporacion de oxfgeno (OUR) espedfica de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 3,0 milimoles de O2/gdw/h y una concentracion de oxfgeno disuelto menor que 1% de la cantidad de saturacion.
- 10. El proceso de la reivindicacion 9, en el que la celula de levadura es un fenotipo Crabtree negativo.
- 11. El proceso de la reivindicacion 10, en el que el gen exogeno es un gen lactato deshidrogenasa (LDH).
- 12. El proceso de la reivindicacion 11, en el que la celula de levadura es del genero Kluyveromyces o Candida.
- 13. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la OUR en la etapa a) es al menos 18 mmol O2/gdw/h.
- 14. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que el carbohidrato incluye un azucar hexosa.
- 15. El proceso de la reivindicacion 14, en el que el azucar hexosa incluye glucosa.
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