JP2018526969A - 官能基化アルファ置換アクリレートおよびc4ジカルボキシレートのバイオベース産生 - Google Patents
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Abstract
Description
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である。
表A
官能基化アルファ置換C4カルボン酸の誘導体
金属触媒を、以下にそれぞれ示すような式II、III、もしくはIVの化合物
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
本方法は、前述の実施形態のいずれか1つで定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む。
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
本方法は、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含む。例えば、本方法は、上記の実施形態で定めた方法によってアルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を産生する工程をさらに含む。
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
または以下の式の化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上、例えば1〜6である。一実施形態では、R1はヒドロキシである。別の実施形態では、nは1または2である。例えば、R1はヒドロキシであり、nは1であるか、またはR1はヒドロキシであり、nは2である。
以下の実施例における分子生物学的処置の一般的方法ならびに緩衝液、溶液、および培地の配合は、非特許文献5に記載されている。記載されている場合、個々の製造業者からの指示をいくつかの処置に使用した。制限酵素は、特に明記しない限り、New England Biolabs(イプスウィッチ、マサチューセッツ州)から購入し、製造業者が提言するように適切な緩衝液中で使用した。全ての化学物質は、特に明記しない限り、Sigma Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。
で描かれた1つ以上の立体中心を含む化学構造は、化学構造中に存在する立体中心(単数または複数)の絶対立体化学を示すことを意味する。本明細書で使用される、単純な線で象徴される結合は、立体優先を示すものではない。反対に別段に示されない限り、絶対立体配置または相対立体配置を示さずに本明細書に例示される1つ以上の立体中心を含む化学構造は、化合物の全ての可能な立体異性体(例えば、ジアステレオマー、エナンチオマー)およびそれらの混合物を包含する。単一の太線または破線、および少なくとも1つの追加の単純な線を有する構造は、全ての可能なジアステレオマーの単一のエナンチオマー系を包含する。
本明細書中に記載の組み換え微生物は、それらが非天然量の図2に示される官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を生成することを可能にする酵素活性を提示する。いくつかの例では、組み換え微生物は、1種類より多くのアルファ置換ジカルボン酸、図2(a)、図2(b)、および図2(c)に示されているようなものなどを産生する。語句「非天然」量は、本明細書に記載の組み換え微生物が、組み換え核酸配列を導入するための出発点として使用された出発宿主細胞と比較して、より高濃度のアルファ置換C4ジカルボン酸を産生するという事実を指す。
表B.アミノ酸発酵の最高力価*
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるが、その範囲を限定することを意図しない。全ての部およびパーセンテージは、別段に指示がない限り重量による。
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である。
本方法は、金属触媒を、式II、III、IVの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにその保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1より大きい。
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である方法。
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
本方法は、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含み、ここで、アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸は以下の式:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である。例えば、3-ヒドロキシプロピオン酸は、本明細書で定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む方法によって産生される。
表C.
アルファ置換C4ジカルボン酸への記載経路の潜在的な宿主を、図2に示すように、官能基化アルファ置換ジカルボン酸に対する耐性を決定することによって特定した。特定の官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸化合物を選択し、細菌および真核生物宿主の耐性を評価した。
アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生に使用される微生物を、酵母および糸状菌を含む真菌ならびに細菌から選択することができる。非特許文献12に記載の微生物を、細菌の産生が望ましい場合のその後の遺伝子操作工程用のセリン過剰産生出発株として使用することができる。同様に、非特許文献13および特許文献21に記載の微生物を、真核生物の産生が望まれる場合のその後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。
当業者は、多くのトランスアミナーゼ酵素の活性が特性評価されており、トランスアミナーゼ活性検出のための当該技術分野で知られている任意の方法が使用され得ることを理解するであろう。具体的には、シロイヌナズナトランスアミナーゼの発現時に、非特許文献16により記載されているアッセイを用いてその活性を特性評価することができる。グリシンをアミノ基供与体として使用する反応量は、反応停止後に残った2-オキソ酸基質を測定することによって推定され、これはNADHおよび乳酸デヒドロゲナーゼを用いる分光光度法によって決定される。
シンターゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA(Life Technologies(旧Invitrogen))にクローニングした。試験したシンターゼ遺伝子は、表Gで見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドをBL21大腸菌細胞に形質転換した。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換した。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種した。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうし、その後タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間30℃で振とうさせながらインキュベートした。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存した。
プラスミドDNA分子を、化学的形質転換または電気穿孔法によって、上記実施例2に記載の参照経路で操作した標的大腸菌細胞に導入する。化学的形質転換では、600nmでの光学密度(0.5〜0.8)によって決定されるように、細胞を対数増殖段階中期まで増殖する。細胞を採取、洗浄し、最後にCaCl2で処理する。これらの大腸菌を化学的に形質転換させるために、精製されたプラスミドDNAを、氷上で微量遠心管内の細胞懸濁液と混合させる。熱ショックを混合物に与え、その後富栄養培地中での30〜60分間の回復インキュベーションが続く。電気穿孔法では、対数増殖段階中期まで増殖させた大腸菌細胞を水で数回洗浄し、最後に10%グリセロール溶液に再懸濁する。DNAをこれらの細胞に電気穿孔するために、細胞とDNAとの混合物を、電極を含有する使い捨てプラスチックキュベットにピペットで入れる。短い電気パルスを細胞に加え、DNAが入ることができる小さな穴を膜に形成する。次いで、細胞懸濁液を富栄養液体培地でインキュベートし、続いて固体寒天プレート上にプレートする。詳細なプロトコルは、非特許文献5で得ることができる。
実施例2に記載のDNA断片に加えて、ホスファターゼをコードするDNA断片が含まれる。ホスファターゼ遺伝子は、大腸菌由来のyeaB遺伝子またはSセレビシエ由来のGPP2から選択されるホスホヒドロキシピルビン酸ホスファターゼである(特許文献22、特許文献23)。得られたプラスミドは、ヒドロキシピルビン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。
イタ酒石酸とも呼ばれるアルファアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸を過剰産生する株を培養する。イタコン酸およびイタ酒石酸を過剰産生する株ならびに培養条件は、非特許文献1;非特許文献2および非特許文献3;ならびに非特許文献4に記載されている。別の繰り返しでは、イタコン酸オキシダーゼをコードするDNA断片が過剰産生される。イタコン酸オキシダーゼ遺伝子は、アスペルギルス属またはウスティラゴ属由来である(非特許文献1;非特許文献2および非特許文献3;ならびに非特許文献4)。得られたプラスミドは、イタ酒石酸とも呼ばれるアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。イタコン酸オキシダーゼ遺伝子の突然変異型は、活性の増加を示す(非特許文献18;非特許文献19;非特許文献20)。ラクトン形態のヒドロキシパラコン酸も産生される。
実施例2および3に列挙されたDNA断片に加えて、デヒドラターゼ(図4、行C)をコードするDNA断片が含まれる。概して図3に、およびより詳細には図9の工程Cに示されるように、デヒドラターゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、デヒドラターゼ遺伝子は、大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ(EC 4.2.1.3)である。アルファ(ヒドロキシルメチル)リンゴ酸から出発してアルファ(ヒドロキシルメチル)マレイン酸を産生するための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例2、3、および4に記載の生物に形質転換する。
デヒドラターゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA(Life Technologies(旧Invitrogen))にクローニングする。デヒドラターゼ候補は、表Iで見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドをBL21大腸菌細胞に形質転換させる。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換する。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種する。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうした後、タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間30℃で振とうさせながらインキュベートする。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存する。
表I.デヒドラターゼ候補。
実施例5に列挙されたDNA断片に加えて、イソメラーゼ(図4、行F)をコードするDNA断片が含まれる。概して図3に、およびより詳細には図9の工程Fに示されるように、イソメラーゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、イソメラーゼ遺伝子は、シュードモナス・プチダ由来のシス-トランスイソメラーゼ(EC 5.2.1.1)およびシェワネラ・オネイデンシス由来のprpF(非特許文献22)から選択される。3番目の候補は、ウスティラゴ・メイディス由来のAdi1(UMAG_11777)である(非特許文献23)。アルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸から出発してアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸を産生するための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例5に記載の生物に形質転換する。
セリン産生生物は実施例2に記載されている。実施例2、3、4、および5に列挙されたDNA断片に加えて、ヒドラターゼ(図4、行D)、デヒドロゲナーゼ(図4、行E)、シンターゼ(図4、行B)、デヒドラターゼ(図4、行C)をコードするDNA断片が含まれる。概して図3に、ならびにより詳細には図9の工程B、C、D、およびEに示されるように、ヒドラターゼ、デヒドロゲナーゼ、シンターゼ、およびデヒドラターゼ活性は、組み換え微生物において、組み換え核酸配列の導入によって増加する。具体的には、ヒドラターゼはシゾサッカロミセス・ポンべ由来のホモアコニット酸ヒドラターゼ(EC 4.2.1.36)であり、デヒドロゲナーゼはメタノカルドコックス・ヤンナスキイ由来のホモイソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.87)であり、シンターゼはシゾサッカロミセス・ポンべ由来のホモクエン酸シンターゼ(2.3.3.14)であり、デヒドラターゼは大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ(4.2.1.3)である。これらの酵素の操作された突然変異体が、スペーサー経路の中間体に対する特異性を高めるために構築される。
アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の産生に使用される微生物は、酵母および糸状菌を含む真菌ならびに細菌から選択することができる。実施例7に記載のスペーサー経路を使用し、トレオニン過剰産生微生物を利用して、ホモトレオニンを産生することができる。別の繰り返しでは、ilvA、leuA、leuCD、およびleuBの発現は、中間体4-ヒドロキシ-2-オキソ-ペンタン酸の産生をもたらす(非特許文献26)。この繰り返しは、非特許文献7による総説に記載のように、トレオニン過剰産生株で利用される。細菌の産生が望ましい場合、大腸菌またはセラチア・マルケンセンを、その後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。同様に、非特許文献27に記載の微生物を、真核生物の産生が望まれる場合のその後の遺伝子操作工程の出発株として使用することができる。
実施例2、3、および4に列挙されたDNA断片に加えて、デヒドラターゼ(図6、行A)、ヒドラターゼ(図6、行B)、レダクターゼ(図6、行C)、デカルボキシラーゼ(図6、行D)、およびアルデヒドレダクターゼ(図6、行E)をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図6の右端列に示す。具体的には、デヒドラターゼ遺伝子は、大腸菌由来のアコニット酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.3)であり、ヒドラターゼ遺伝子は、S.ポンべ由来のホモアコニット酸ヒドラターゼ(EC 4.2.1.36)であり、レダクターゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.37)であり、デカルボキシラーゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来の分枝鎖2-オキソ酸デカルボキシラーゼ(EC 4.1.1.72)であり、アルデヒドレダクターゼ遺伝子は、S.セレビシエ由来のアルデヒドレダクターゼ(EC 1.1.1.21)である。全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、実施例2、3、または4に記載の宿主生物に形質転換する。
流加発酵を、2Lの作業容量の発酵槽で実施する。温度、pHおよび溶存酸素は、PID制御ループによって制御する。増殖段階で発酵槽を囲むジャケットを通る温度調節された水の流れによって温度を37℃に維持し、その後産生段階が始まると27℃に調節する。pHを、5NのKOHおよび3NのH3PO4の添加によって所望のレベルに維持する。溶存酸素(DO)レベルは、空気供給量ならびに撹拌速度を調整することにより、空気飽和の20%に維持する。
実施例2、3、および4に記載のように細胞培養物から産生されたアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、すなわちイタ酒石酸を含有する発酵ブロスを、非特許文献3に記載の手順を用いて処理し、所望の生成物を分離する。発酵ブロスを濾過して細胞を除去し、次いで濃縮してシロップにする。得られたシロップを70℃で6時間減圧下で加熱し、アルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、すなわちイタタール酸の、環化型のヒドロキシパラコン酸(HP)へのラクトン化を触媒する。加熱酢酸エチルに激しい撹拌下で溶解した固体塊が得られる。溶媒層を分離し、次いで濃縮させ、結晶塊が形成されるまで乾燥させる。HPのさらなる精製は、酢酸エチルおよびクロロホルムでの結晶化によって実施される。最終生成物の純度をHPLCにより分析する。イタ酒石酸ナトリウム塩は、再結晶HPから、冷H2Oに溶解させて0.05NのNaOHで滴定することにより調製される。溶液を沸騰水浴中で10分間加熱し、次いで減圧下で濃縮し、最後に105℃のオーブン中で乾燥させる。最終生成物の純度をHPLCにより分析する。
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換を、Pt系触媒をホモクエン酸ナトリウムと接触させて2-メチレングルタル酸を産生することによって実施した。
実験は、5%Pt/Al2O3および0.1NのNaOH塩基の添加を用いて行った。触媒充填量は2.5mol%(Pt金属の乾燥粉末基準で計算)であり、使用した溶媒は0.1NのNaOHであった。450psiのN2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とした。別の反応は、純水中、Cu系触媒(Cu-金属に対して50mol%)で、オートクレーブ中でsod.ホモクエン酸塩を用いて500psiのH2ガス下で行った。
a. 180℃、400psiのN2下で2時間アニーリングし、
b. 180℃、200psiのH2下で2時間アニーリングする。
ホモクエン酸三ナトリウム塩を種々の金属触媒と接触させ、アルファ置換アクリル酸、特に2-メチレングルタル酸への変換を促進した。ホモクエン酸ナトリウムを5%Pt/Al2O3と接触させた実験の結果を、図24のクロマトグラムに示す。既知ピークには、出発原料、ホモクエン酸エステル、および所望のアクリレート生成物の水素化形態である2-メチルグルタル酸が含まれる。他の同定された生成物には、9.6分での1,2,4-ブタントリカルボン酸および9.834分でのラクトンエステルが、メチルエステル誘導体化後の保持時間10.044分での出発ホモクエン酸と共に含まれる。これらのピークのいくつかの質量スペクトル結果を、図25(a)、図25(b)および図26に示す。
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換は、Cu系触媒を2-イソプロピルリンゴ酸と接触させてアルファイソプロピルアクリル酸を得る工程によって成し遂げられた。
実験は、Cu触媒を用い、H2またはN2のいずれかの下で行った。触媒充填量は50重量%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用した溶媒はH2Oであった。前述の通り、450psiのH2またはN2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とした。GC/MS(Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI)を用いて反応生成物を分析した。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づくものであった。
a. 180℃、400psiのN2下で2時間アニーリングし、
b. 180℃、200psiのH2下で2時間アニーリングする。
出発原料の2-イソプロピルリンゴ酸をCu系触媒と接触させ、アルファ置換アクリル酸のアルファイソプロピルアクリル酸への変換を促進した。2-イソプロピルリンゴ酸を、H2下でCu系触媒と接触させた実験の結果を、図28(a)のクロマトグラムに示す。既知ピークには、所望のアルファ置換アクリル酸の水素化生成物であるブタン酸2,3-ジメチル,メチルエステルが含まれる。ブタン酸2,3-ジメチル,メチルエステルの質量スペクトルを、図28(b)/(c)の質量スペクトルに示す。別のピークは脱水されている可能性が高いと判断され、2-イソプロピルリンゴ酸の水素化誘導体、ジメチルエステル(1-メチルエチル)-ブタン二酸が続いた。7.435分のピークは、未反応の出発物質である、特定の反応条件下での2-イソプロピルリンゴ酸である(注:GCカラムの整備前に試料を分析したため、7.435分の保持時間は、図30(a)の7.329分の基準試料とわずかに異なる)。
官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の官能基化アルファ置換アクリル酸への変換は、CuまたはPt触媒をヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸と接触させてヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸を産生する工程によって行われる。具体的には、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸はアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸であり、生成物はアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸である。
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例12および13に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS(Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI)を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例12および13に記載のように実施する。
ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸への変換を促進する。具体的には、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸はアルファ(ヒドロキシメチル)リンゴ酸であり、生成物はアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸である。
実施例7の生成物であるアルファヒドロキシエチルリンゴ酸の、官能基化アルファ置換アクリル酸であるアルファヒドロキシエチルアクリル酸への変換は、CuまたはPt系触媒をヒドロキシアルキルアルファ置換C4二酸であるアルファヒドロキシエチルリンゴ酸と接触させてヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸を産生する工程によって行われる。ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸生成物であるアルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸は、ラクトン化されてツリパリンとなる。当業者には理解されるように、ラクトン化は、硫酸、塩酸などの任意の強酸触媒を用いて行われる。
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例12および13に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS(Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI)を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例12および13に記載のように実施する。
アルファ(2-ヒドロキシエチル)C4二酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、アルファ-(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸への変換を促進する。アルファ(2-ヒドロキシエチル)アクリル酸生成物は、ラクトン化されてツリパリンとなる。
実施例8の生成物であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸の、官能基化アルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸への変換は、CuまたはPt系触媒をアルファ置換C4二酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸と接触させて、アルファ置換アクリル酸であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸を産生する工程によって行われる。アルファ置換アクリル酸生成物であるアルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸は、ラクトン化されてMeMBLとなる。当業者には理解されるように、ラクトン化は、硫酸、塩酸などの任意の強酸触媒を用いて行われる。
実験は、CuまたはPt触媒を用いてN2またはH2下で行う。触媒がCuである場合、触媒充填量は50重量%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用される溶媒はH2Oである。触媒が5%Pt/Al2O3である場合、触媒充填量は2.5モル%(乾燥粉末基準で計算)であり、使用する溶媒は0.1NのNaOHである。いずれの触媒条件においても、450psiのN2またはH2下で、180℃の温度において、反応時間を16時間とする。反応は、実施例12および13に記載のように実施する。反応生成物を、GC/MS(Agilent、5975B、不活性、XL、EI/CI)を用いて分析する。触媒の評価は、GC/MSデータの定性的結果に基づいている。分析は、実施例12および13に記載のように実施する。
アルファ(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸をCu系またはPt系触媒と接触させ、アルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸への変換を促進する。アルファ(2-ヒドロキシプロピル)アクリル酸生成物は、ラクトン化されてMeMBLとなる。
アルファ置換アクリル酸への表示の経路の潜在的な宿主は、概して図1および図3に、より詳細には図9および10に示されるように、官能基化アルファ置換アクリル酸最終生成物に対する耐性を決定することによって同定した。表示の官能基化アルファ置換アクリル酸、官能基化アルファ置換アクリル酸エステル、および官能基化アルファ置換アクリル酸ラクトンを選択し、細菌および真核生物宿主の耐性を評価した(表KおよびL)。
実施例5に記載のDNA断片に加えて、デカルボキシラーゼ(図12、行I)をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図12の右端列に示す。具体的には、デカルボキシラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来のシスアコニターゼデカルボキシラーゼ、cadA(EC 4.1.1.6)である。全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、実施例5に記載のようにアルファ(ヒドロキシメチル)マレイン酸を産生する組み換え微生物に形質転換し、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を得る。デカルボキシラーゼプラスミドはまた、実施例6に記載のようにアルファ(ヒドロキシメチル)フマル酸を産生する細胞中で発現され、アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を生じる。
デカルボキシラーゼをコードする大腸菌最適化遺伝子を合成し、pTrcHisA(Life Technologies(旧Invitrogen))にクローニングする。デカルボキシラーゼ候補は表Mに見られる。最適化シンターゼ遺伝子を含むプラスミドを、BL21大腸菌細胞に形質転換した。空プラスミドpTrcHisAも陰性対照として形質転換する。発現および特性評価実験のために、40mLのTBを含有する振とうフラスコを一晩培養物から5%で接種する。フラスコを30℃、250rpmで2時間振とうした後、タンパク質産生を0.2mMのIPTGで誘導し、さらに4時間または一晩30℃で振とうしながらインキュベートする。細胞を遠心分離により収穫し、ペレットを-80℃で保存する。
この実施例で上に列挙されたDNA断片に加えて、エステラーゼ(図12、行H)をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、エステラーゼは、大腸菌由来のカルボキシルエステラーゼ(EC 3.1.1.1)である。アルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸エステルの産生のための全経路遺伝子の転写に成功する得られたプラスミドを、上記のアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸を産生する生物に形質転換する。
実施例9に列挙されたDNA断片に加えて、coAトランスフェラーゼ(図14、行F)、3HP-CoAデヒドラターゼ(図14、行G)、およびCoAトランスフェラーゼ(図14、行F)をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、CoAトランスフェラーゼは、クロロフレクサス・アウランティアクス由来のスクシニル-CoA-D-シトラマル酸CoAトランスフェラーゼ(EC 2.8.3.20)であり、3HP-CoAデヒドラターゼは、メタッロスパエラ・セデュラ由来の3-ヒドロキシピリオニル-CoAデヒドラターゼ(EC 4.2.1.116)であり、CoAトランスフェラーゼは、ドブネズミ由来のコハク酸ヒドロキシメチルグルタル酸CoAトランスフェラーゼ(2.8.3.13)である。得られたプラスミドは、アルファ(ヒドロキシメチル)3-ヒドロキシプロピオン酸から出発するアルファ(ヒドロキシメチル)アクリル酸の産生のための全経路遺伝子の転写に成功する。
デカルボキシラーゼ(図12、行I)をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図12の右端列に示す。具体的には、デカルボキシラーゼ遺伝子は、アスペルギルス・ニガー由来のシス-アコニターゼデカルボキシラーゼ、cadA(EC 4.1.1.6)である。全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、実施例5に記載のように、アルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸、アルファ(ヒドロキシエチル)マレイン酸、またはアルファ(ヒドロキシエチル)フマル酸を産生する組み換え微生物に形質転換する。
この実施例で上に列挙されたDNA断片に加えて、ラクトナーゼ(図12、行G)をコードするDNA断片が含まれる。具体的には、エステラーゼは、ホモ・サピエンス由来の1,4-ラクトナーゼ(EC 3.1.1.25)である。アルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸から出発するツリパリンの産生のための全経路遺伝子の転写を成功させる得られたプラスミドを、上記のアルファ(ヒドロキシエチル)アクリル酸を産生する生物に形質転換する。
微生物は、アルファ置換酢酸をアルファ置換アクリル酸に変換するのに必要な全酵素を発現する。一実施形態では、3-ヒドロキシプロピオン酸をアルファヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸に変換する。CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、レダクターゼ(図16、行J)、CoAトランスフェラーゼ図16、行L)、3HP CoA-デヒドラターゼ(図16、行E)、およびCoAトランスフェラーゼ(図16、行F)をコードするDNA断片を、発現ベクターにクローニングする。遺伝子候補およびそれらの配列を、図16の右端列に示す。
ヒドロキシメチルマロニル-CoAに変換された3HP-CoAの量を、ピルビン酸蓄積をもたらす共役反応を用いて測定した。大腸菌細胞を空ベクター(ptrc)またはRpPCCのいずれかで形質転換した。BeadBeater(BopSpec products、バートルズビル、オクラホマ州)を使用する機械的破壊を使用して、製造元の指示に従って細胞を溶解した。細胞溶解物を、遠心分離(14,000Gで5分間)により部分的に清澄化した。得られた清澄化溶解物のタンパク質濃度を、BioRad total Proteinアッセイにより、製造元の指示に従って測定した。溶解物を、100mMリン酸カリウム緩衝液、pH7.6中のタンパク質濃度によって標準化した。ピルビン酸共役カルボキシラーゼ反応アッセイは、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.6)、5μlピルビン酸キナーゼ(2.5単位/μl)、5mMホスホエノールピルビン酸、0.3mg/mlのBSA、5mMのMsCl2、50mMのNaHCO3、5mMのATP、および5mMの3HP-CoA基質を含む。反応混合物に添加した25μlの溶解物を用いて反応を開始し、総量100μlを得た。ピルビン酸蓄積をHPLCにより評価した。経時的にピルビン酸を蓄積したRpPCCを発現する溶解物は、ヒドロキシメチルマロニル-CoAを生じる3HP-CoAのカルボキシラーゼを表した(図33(b))。
実施例9および21においてなど、アルファ置換3-ヒドロキシメチル酸を産生する微生物の場合、この化合物を脱水してアルファ置換アクリル酸にする。一実施形態では、アルファ-ヒドロキシメチル3-ヒドロキシプロピオン酸(HM3HP)を脱水してアルファ-ヒドロキシメチルアクリル酸(HMA)にする。既知量のHM3HPを緩衝溶液に溶解した。溶液を3つのアリコートに分割し、それらをpH3、pH5、またはpH7に調整した。試料を-20℃、30℃、または70℃で一晩インキュベートした。NMR分析を使用し、脱水されてHMAになったHM3HPの量を測定した。最も多くのHMAへの変換がpH10で観察された(表O)。結果は、より塩基性のpHが、HM3HPのHMAへの変換を促進することを示している。溶液のpHは、HMAへの変換に対して、温度の変化よりも大きな影響を与えた。
イタコン酸からのアルファ(ヒドロキシエチル)リンゴ酸の産生に使用される微生物は、実施例4に記載のイタコン酸を産生する宿主から選択することができ、酵母および糸状菌ならびに細菌が含まれる。そのような生物には、S.セレビシエ、大腸菌、ならびにアスペルギルス株およびウスティラゴ株などの真菌株が含まれる。特定の真菌株には、A.ニガー、A.テレウス、およびウスティラゴ・メイディスが含まれる。イタコン酸産生は、生物に天然にあるか、またはクエン酸シンターゼ、アコニターゼ、およびシス-アコニット酸デカルボキシラーゼを含む、内因性および/または外因性の関連遺伝子を発現および/または過剰発現することによって産生される(非特許文献21、非特許文献51、非特許文献52)。
官能基化アルファ置換アクリル酸の産生のための発酵方法を、実施例10に記載のように実施する。官能基化アルファ置換アクリル酸の分離は、アニオン交換、逆浸透、結晶化、および膜抽出などの、発酵ブロスからイタコン酸を分離するために使用されるものと同様の方法により実施する(特許文献26、特許文献27、特許文献28)。より具体的には、ヒドロキシアルキルアクリル酸を調製する方法は、特許文献29および特許文献30に記載されている。
Claims (115)
- 官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸であって、該官能基化アルファ置換が、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸と、トランスアミナーゼ(図4、行A)、シンターゼ(図4、行B)、デヒドラターゼ(図4、行C)、ヒドラターゼ(図4、行D)、デヒドロゲナーゼ(図4、行E)、シストランスイソメラーゼ(図4、行F)、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ(図4、行G)、エステラーゼ(図4、行H)、レダクターゼ(図6、行C)、デカルボキシラーゼ(図6、行D)、およびアルデヒドレダクターゼ(図6、行E)から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- 前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸から選択される、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換が、2個の水素原子と会合した1個以上の炭素原子を含むスペーサーを追加的に含む、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 前記スペーサーが、-(CH2)2-、-(CH2)3-または-(CH2)4-から選択される、請求項3に記載の組み換え微生物。
- 前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アミノ酸側鎖から選択される官能基を含む、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも2つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも3つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項1に記載の組み換え微生物。
- 少なくとも2つの前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、同じ官能性置換基を含む、請求項5に記載の組み換え微生物。
- ベータ官能基化アルファケト酸をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも1つのアミノ酸を選択的に過剰産生する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファン、セレノシステイン、セリン、ホモセリン、ホモトレオニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸を産生する、請求項12に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を選択的に過剰産生する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を産生する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化ベータ置換アルファケト酸を産生する、請求項10に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換フマル酸を産生する、請求項8に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の官能基化アルファ置換マレイン酸を産生する、請求項8に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換リンゴ酸を産生する、請求項8に記載の組み換え微生物。
- 有機酸輸送体をコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が原核生物である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が真核生物である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換リンゴ酸の製造方法であって、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;該官能基化アルファ置換リンゴ酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
- 官能基化置換マレイン酸の製造方法であって、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;該官能基化置換マレイン酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
- 官能基化ベータ置換ケト酸の製造方法であって、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;該官能基化ベータ置換ケト酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
- アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸の製造方法であって、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;該官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
- 官能基化アルファ置換アクリレート、またはその塩もしくはエステルの製造方法であって、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸または官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸、もしくはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させることを含む、方法。
- 式Iの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり;
前記方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにその保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。 - 式Vの化合物:
式中:
各R1はHまたはCH3から選択され、R2およびR3はHまたは保護基から選択され、nは1以上であり;
該方法は、金属触媒を、式VI、VII、もしくはVIIIの化合物:
式中:
各R1はHまたはCH3から選択され、R2、R3、およびR4は個別にHまたは保護基から選択され、nは1以上である、方法。 - 官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の誘導体および式Iを有する化合物の製造方法であって、該方法は、式II、IIIおよびIVから選択される化合物またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含み、官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸の前記誘導体は、
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。 - 式Iを有する化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり、nが1より大きい場合、R1はカルボキシレートまたはメチルから選択されることができる化合物と;
官能基化アルファ置換C4カルボン酸の少なくとも1つの誘導体とを含む組成物の製造方法であって;
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIVの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2、R3、R4は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上である、方法。 - 少なくとも1つの前記化合物が、官能基化アルファ置換C4カルボン酸の少なくとも2つの誘導体を含む、請求項31に記載の方法。
- 式Iを有する化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり;
該方法は、金属触媒を、式II、III、もしくはIV、またはそれらの塩もしくはエステルから選択される官能基化アルファ置換ジカルボン酸と接触させる工程を含み、該官能基化アルファ置換ジカルボン酸のベータカルボキシレートが選択的に脱炭酸される、方法。 - ヒドロキシアルキルアルファ置換アクリル酸、またはその塩、ラクトンもしくはエステルの製造方法であって、ヒドロキシアルキルアルファ置換C4ジカルボン酸、またはその塩、エステルもしくはラクトンを金属触媒と接触させる工程を含む、方法。
- 式Iの化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合、ならびにそれらの保護基から選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり;
金属触媒を、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、官能基化アルファ置換フマル酸またはそれらの塩、エステルもしくはラクトンを含む組成物と接触させる工程を含む、方法。 - 前記金属触媒が不均一触媒である、請求項27〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が、Ni、Pd、Pt、Cu、Zn、Rh、Ru、Bi、Fe、Co、Os、Ir、V、および2つ以上のそれらの混合物からなる群より選択される金属を含む、請求項27〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が、CuまたはPtからなる群より選択される金属を含む、請求項27〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒がCuを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記金属触媒がPtを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記金属触媒が担持触媒である、請求項27〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が促進剤を含む、請求項27〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記促進剤が硫黄を含む、方法42に記載の方法。
- 前記方法が、少なくとも約100℃の温度で実施される、請求項27〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、約100℃〜約250℃の温度で実施される、請求項27〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、約150℃〜約200℃の温度で実施される、請求項27〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が該接触前に活性化される、請求項27〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が水素ガス下で活性化される、請求項47に記載の方法。
- 前記金属触媒が実質的に水素を含まない、請求項27〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記金属触媒が、約100℃〜約200℃の温度で活性化される、請求項47または48のいずれか一項に記載の方法。
- 官能基化アルファ置換アクリル酸またはその塩、エステルもしくはラクトン、およびアルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸またはそれらの塩もしくはエステルから選択される1つ以上の化合物を含む、組成物。
- 官能基化アルファ置換C4カルボン酸の1つ以上の誘導体をさらに含む、請求項51に記載の組成物。
- 式Iの化合物:
式中:各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、R2は個別にHおよび保護基から選択され、nは1以上であり;
官能基化アルファ置換3HPを加熱して官能基化アルファ置換3HPを脱水し、式Iを有する化合物を産生する工程を含む、方法。 - 官能基化アルファ置換アクリル酸であって、該官能基化アルファ置換が、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>2の場合に選択される官能基化アルファ置換アクリル酸と、トランスアミナーゼ(図12、行A)、シンターゼ(図12、行B)、デヒドラターゼ(図12、行C)、ヒドラターゼ(図12、行D)、デヒドロゲナーゼ(図12、行E)、シストランスイソメラーゼ(図12、行F)、シクラーゼ、ラクトナーゼ、ラクタマーゼ(図12、行G)、エステラーゼ(図12、行H)、デカルボキシラーゼ(図12、行I)、レダクターゼ(図14、行C)、デカルボキシラーゼ(図14、行D)、レダクターゼ(図14、行E)、CoAトランスフェラーゼ(図14、行F)、および3HP-CoAデヒドラターゼ(図14、行G)から選択される少なくとも1つの酵素をコードする少なくとも1つの組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、アルファ-(ヒドロキシメチル)リンゴ酸、アルファ-(2-ヒドロキシプロピル)リンゴ酸、アルファ-(1-ヒドロキシエチル)リンゴ酸およびアルファ-(2-ヒドロキシエチル)リンゴ酸から選択される、請求項54に記載の組み換え微生物。
- 前記官能基化アルファ置換が、2個の水素原子と会合した1個以上の炭素原子を含むスペーサーを追加的に含む、請求項55に記載の組み換え微生物。
- 前記スペーサーが、-(CH2)2-、-(CH2)3-または-(CH2)4-から選択される、請求項56に記載の組み換え微生物。
- 前記官能基化アルファ置換アクリル酸が、アミノ酸側鎖から選択される官能基を含む、請求項54〜57のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸をさらに含み、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される、請求項54に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも2つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、官能基化アルファ置換リンゴ酸、官能基化アルファ置換マレイン酸、および官能基化アルファ置換フマル酸から選択される少なくとも3つの官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を含む、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 少なくとも2つの前記官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸が、同じ官能性置換基を含む、請求項60に記載の組み換え微生物。
- ベータ官能基化アルファケト酸をさらに含む、請求項54〜62のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項54〜63のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも1つのアミノ酸を選択的に過剰産生する、請求項54〜64のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン、リジン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン酸、グルタミン、トリプトファン、セレノシステイン、セリン、ホモセリン、ホモトレオニン、チロシン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンから選択されるアミノ酸を産生する、請求項65に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を選択的に過剰産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換C4ジカルボン酸を産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化ベータ置換アルファケト酸を産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換フマル酸を産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の官能基化アルファ置換マレイン酸を産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の該官能基化アルファ置換リンゴ酸を産生する、請求項59に記載の組み換え微生物。
- 有機酸輸送体をコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項54〜72のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が原核生物である、請求項54〜73のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が真核生物である、請求項54〜73のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 官能基化アルファ置換アクリル酸の製造方法であって、請求項54〜75のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;該官能基化アルファ置換アクリル酸またはその塩を分離する工程とを含む、方法。
- ヒドロキシメチルマロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行C)、レダクターゼ(図16、行D)、デヒドロゲナーゼ(図16、行D)、3HP CoA-デヒドラターゼ(図16、行E)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行F)、カルボキシラーゼ(図16、行G)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行H)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、レダクターゼ(図16、行J)、デヒドラターゼ(図16、行K)およびCoAトランスフェラーゼ(図16、行L)から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- ヒドロキシメチルマロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行C)、レダクターゼ(図16、行D)、デヒドロゲナーゼ(図16、行D)、3HP CoA-デヒドラターゼ(図16、行E)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行F)、カルボキシラーゼ(図16、行G)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行H)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、レダクターゼ(図16、行J)、およびCoAトランスフェラーゼ(図16、行L)から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- 3-ヒドロキシプロピオン酸をさらに含む、請求項77または78に記載の組み換え微生物。
- トランスフェラーゼをコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項77〜79のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、3-ヒドロキシプロピオニル-CoAまたはヒドロキシメチルマロン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項77〜80のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、3ヒドロキシプロピオン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項77〜80のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- ヒドロキシメチルアクリレートをさらに含む、請求項77に記載の組み換え細胞。
- 前記微生物が原核生物である、請求項77〜83のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、大腸菌(E. coli)、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、およびパラコッカス属から選択される、請求項77〜83のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が真核生物である、請求項77〜83のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属から選択される、請求項77〜83のいずれか一項に記載の組み換え微生物。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ(S.ブルデリ)、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス(S.バヤヌス)、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ(S.セレビシエ)、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149(NRRL指定)、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス(S.クラタエゲンシス)が挙げられる。
- アルファヒドロキシメチルアクリレートの製造方法であって、請求項77に記載の組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;アルファヒドロキシメチルアクリレートを分離する工程とを含む、方法。
- 2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物と、オキシレダクターゼ(図18、表7、行A)、レダクターゼ(図18、表7、行B)、シクラーゼ(図18、表7、行C)、ラクトナーゼ(図18、表7、行C)、ラクタマーゼ(図18、表7、行C)およびそれらの組み合わせから選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも10g/Lの、2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物の存在下で生存可能である、請求項89に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のイタコン酸を産生する、請求項89または90に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間の2-メチレン-スクシニルセミアルデヒドを産生する、請求項89〜91のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のアルファヒドロキシエチルアクリレートを産生する、請求項89〜92のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記組み換え微生物が、少なくとも0.1g/L/時間のツリパリンAを産生する、請求項89〜93のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 2-メチレン-スクシニルセミアルデヒド、アルファヒドロキシエチルアクリレートおよびツリパリンAから選択される化合物の製造方法であって、請求項89〜94のいずれか一項に記載の組み換え微生物を炭素源で培養する工程と、該化合物を発酵ブロスから分離する工程とを含む、方法。
- アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸と、CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行C)、レダクターゼ(図16、行D)、デヒドロゲナーゼ(図16、行D)、カルボキシラーゼ(図16、行G)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行H)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、およびレダクターゼ(図16、行J)から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- アルファ置換マロニル-CoAと、CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行C)、レダクターゼ(図16、行D)、デヒドロゲナーゼ(図16、行D)、カルボキシラーゼ(図16、行G)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行H)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、およびレダクターゼ(図16、行J)から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- アルファ置換マロン酸セミアルデヒドと、CoAトランスフェラーゼ(図16、行A)、CoAカルボキシラーゼ(図16、行B)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行C)、レダクターゼ(図16、行D)、デヒドロゲナーゼ(図16、行D)、カルボキシラーゼ(図16、行G)、CoAトランスフェラーゼ(図16、行H)、オキシレダクターゼ(図16、行I)、およびレダクターゼ(図16、行J)から選択される酵素をコードする組み換え核酸配列とを含む、組み換え微生物。
- アルファ置換酢酸をさらに含む、請求項96〜98のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- トランスフェラーゼをコードする組み換え核酸配列をさらに含む、請求項96〜99のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、アルファ置換アセチル-CoAまたはアルファ置換マロン酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項96〜100のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、アルファ置換酢酸を、0.1g/L/時間を超える速度で追加的に産生する、請求項96〜101のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が原核生物である、請求項96〜102のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、大腸菌(E. coli)、エンテロバクター属、アゾトバクター属、エルウィニア属、バチルス属、シュードモナス属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、セラチア属、シゲラ属、リゾビウム属、ビトレオシラ属、およびパラコッカス属から選択される、請求項96〜102のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が真核生物である、請求項96〜102のいずれか一項に記載の組み換え微生物。
- 前記微生物が、カンジダ属、ピキア属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ジゴサッカロミセス属、クルイベロミセス属、デバリオミセス属、ピキア属、イサタケンキア属、ヤロウイア属およびハンゼヌラ属から選択される、請求項96〜102のいずれか一項に記載の組み換え微生物。特定の宿主酵母細胞の例には、C.ソノレンシス、K.マルキシアヌス、K.サーモトレランス、C.メタンソルボサ、サッカロミセス・ブルデリ(S.ブルデリ)、I.オリエンタリス、C.ランビカ、C.ソルボキシロサ、C.ゼムプリニナ、C.ゲオカレス、P.メンブラニファシエンス、Z.コンブチャエンシス、C.ソルボシボランス、C.ヴァンデルワルティ、C.ソルボフィラ、Z.ビスポラス、Z.レンツス、サッカロミセス・バヤヌス(S.バヤヌス)、D.カステリイ、C.ボイジニイ、C.エトケルシイ、K.ラクチス、P.ジャジニイ、P.アノマラ、サッカロミセス・セレビシエ(S.セレビシエ)、ピキア・ガレイホルミス、ピキア種YB-4149(NRRL指定)、カンジダ・エタノリカ、P.デセルティコラ、P.メンブラニファシエンス、P.ファーメンタンスおよびサッカロマイコプシス・クラタエゲンシス(S.クラタエゲンシス)が挙げられる。
- 以下の式のアルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
請求項96〜106のいずれか一項で定めた組み換え微生物を炭水化物の存在下で培養する工程と;アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸またはそのエステルもしくは塩を分離する工程とを含む、方法。 - 以下の式のアルファ置換アクリル酸:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上であり;
アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を脱水してアルファ置換アクリル酸を産生する工程を含む、方法。 - 請求項107に記載の方法によって前記アルファ置換3-ヒドロキシプロピオン酸を産生する工程をさらに含む、請求項108に記載の方法。
- 以下の式の化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である、化合物。 - 以下の式の化合物:
式中:
各R1は、アルキル(メチルよりも長い)、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、分岐ヒドロキシアルキル、アルコキシ、分岐アルキル、アミノ、分枝アミノアルキル、フェニル、アルキル置換フェニル、-S-、-SH、-SeH、-Se-、ヒドロキシ芳香族、アミノ芳香族、ホルミル、カルバモイル、インドリル、グアニジニル、およびカルボキシレートからn>1の場合に選択され、nは1以上である、化合物。 - R1がヒドロキシである、請求項110または111に記載の化合物。
- nが1または2である、請求項110〜112のいずれか一項に記載の化合物。
- R1がヒドロキシであり、nが1である、請求項110または111に記載の化合物。
- R1がヒドロキシであり、nが2である、請求項110または111に記載の化合物。
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