CN1537015A - 稳定的抗体液体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了适于胃肠外施用的稳定抗体液体制剂。还提供了具有高浓度治疗性抗体的水溶液，其可以用于制备治疗性液体制剂。本发明还涉及此稳定液体制剂的用途(如医药用途)和此稳定液体制剂的制备方法。

Description

稳定的抗体液体制剂
发明领域
本发明涉及具有高浓度治疗性抗体的水溶液；以及以此抗体水溶液为基础的稳定的液体制剂；本发明还涉及该稳定的液体制剂的用途，例如医用用途；以及其制备方法。
发明背景
稳定的抗体液体制剂可用于肠胃外施用，例如静脉(i.v.)、肌内(i.m.)或皮下(s.c.)施用。这样的制剂必须满足两个关键的要求：1)必须达到所需的药物浓度，和2)药物应为理化稳定的以便具有足够的保存期限。
为了使蛋白质保持生物活性，制剂必须保持蛋白质构象的完整性并且同时防止蛋白质的多个功能基团发生降解。蛋白质的降解途径会牵涉到化学不稳定性和物理不稳定性。例如，化学不稳定性可由如脱酰胺、水解、氧化、β-消除或二硫键交换引起，而物理不稳定性可由如变性、聚集、沉淀或吸附引起。聚集是蛋白质最常见降解途径之一。
当前抗体的绝大多数稳定制剂不是液体制剂，例如专利WO97/04801中公开了一种抗-lgE抗体的稳定冻干制剂。蛋白质在水性制剂中的稳定性对于制药工业具有普遍重要意义。这一问题通过使蛋白质干燥(如通过冻干的方法)来解决。对需要每日注射抗体的患者来讲，产品易于操作、定量和注射是重要的。由于干燥的抗体制剂是以干粉形式分装和储存的，患者或医务人员在使用前必须将干粉在溶剂中重构(reconstitution)，这对于患者而言是不便的。
因此，提供在使用前无需重构的抗体液体制剂是有利的。
此外，冻干法是一种耗费资源和时间的方法，如果制备市售的抗体制剂时能够省略该步骤将是有益的。
而且，如果最终的药用溶液仅含少量或不含添加剂，对治疗性产品的生产和配制也是有益的。
因此，市场上需要稳定的、液体的、可注射的抗体制剂；特别是，需要高浓度的、稳定的、液体的、可注射的抗体制剂。
此外，还需要可以在制备本发明的稳定液体抗体制剂的方法中用作起始原料或中间体的包含高浓度抗体蛋白质的稳定水溶液。
发明概述
本发明提供稳定的水溶液，其包含浓度至少50mg/ml的抗体，还包含至少一种酸性成分。
此外，本发明提供了包含所述水溶液的适宜递送***。
此外，本发明提供了所述水溶液在喷鼻剂或缓释制剂中的用途。
此外，本发明提供了所述水溶液在干燥或冻干工艺中的用途。
本发明提供的稳定水溶液可以用作配制治疗性制剂的中间体，例如为获得最终的治疗性制剂，可以向此水溶液中加入其它可药用成分。不过，本发明的稳定水溶液本身亦可以作为治疗性制剂使用；即不含或仅含少量的附加添加剂。
可以添加至本发明的稳定水溶液中的附加成分可以为无治疗活性的纯粹的药物添加剂，或也可以为治疗活性物质。而且，在本发明的水溶液中可以存在副产品，也可以不存在副产品。因此，本发明的稳定水溶液可以包含如下成分、或基本上由如下成分组成或由如下成分组成：浓度至少50mg/ml的抗体和至少一种酸性成分。
本发明还提供了使用本发明的水溶液制备治疗性制剂的方法。
因此，一方面，本发明提供了用于制备包含抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，第一步，制备包含浓度至少50mg/ml的抗体和至少一种酸性成分的水溶液；第二步，向所述水溶液中加入至少一种可药用添加剂。
此外，本发明还提供了用于制备包含浓度至少50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，第一步将适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml；第二步，将在第一步得到的浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液(任选含有MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜的添加剂)恒容过滤(diafiltration)；第三步，将在第二步得到的溶液进一步浓缩至浓度大于50mg/ml。
本发明还提供用于制备包含浓度大于50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，
-第一步，将在适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml；
-第二步，将在第一步得到的浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第三步，将在第二步得到的溶液进一步浓缩至约100mg/ml至200mg/ml，优选约100mg/ml至150mg/ml的中间浓度；
-第四步，将在第三步得到的中间浓缩溶液用含有MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第五步，将在第四步得到的溶液进一步浓缩至浓度大于150mg/ml。
发明详述
I.抗体的高浓度水溶液和液体制剂
本发明提供了抗体的高浓缩水溶液及以此为基础的液体制剂。本发明的浓缩水溶液包含治疗性抗体和至少一种酸性成分。因此，此水溶液的pH通常低于pH7.0。其可含有、也可不含有其它盐或添加剂。其可以在制备本发明的治疗性液体制剂的方法中用作中间体，但其本身也可以是适宜的治疗性液体制剂，即不加入其它可药用添加剂。
一方面，本发明提供了一种稳定的水溶液，其包含浓度至少50mg/ml的抗体，还包含至少一种酸性成分。优选的抗体浓度为至少80mg/ml，100mg/ml，140mg/ml，160mg/ml，180mg/ml，200mg/ml，220mg/ml，250mg/ml或甚至300mg/ml。
蛋白质溶液的高粘度是开发高浓度稳定抗体水溶液的一大障碍。例如，在生理盐水或缓冲液中，抗体溶液(例如单克隆抗体E25溶液)浓度大于50mg/ml就可能开始变粘稠和/或混浊。粘度随蛋白质浓度的增加而增加。从医学角度来看，抗体溶液的高粘度是不利的，因为例如重构抗体冻干物的时间可能长达30分钟。此外，将干燥制剂重构和注射后，可能会在小瓶和注射器中留在约30％的抗体，这将大大增加治疗费用。
本发明现提供制备具有高蛋白质浓度及低粘度的包含抗体(如抗-lgE抗体)的稳定液体药物制剂的方法。
尽管我们不希望为任何理论推理所限制，但有一种现象对所观察到的抗体水溶液的粘性有影响，即抗体的自身缔合作用，或称“聚集”。抗体的聚集物可能是可溶性的，也可能是不溶性的，这两种形式的聚集物都可能是共价的或是非共价的。聚集物可能产生乳白色溶液，但也可能是仅可用化学方法才能揭示的不可见的聚集。
除增加粘度外，聚集还可能在许多方面都是不利的。例如，在蛋白质制剂中的共价聚集可能是实质上不可逆的，并可能导致产生非活性物质，这种非活性物质还可能有免疫原性。非共价聚集可能因沉淀而导致活性丧失。
本发明意义上的“稳定的”水溶液或液体制剂意味着在储存过程中，溶液或制剂中的抗体在实质上保持其物理和化学稳定性和完整性。在现有技术中有很多测定蛋白质稳定性的分析技术。可以在选定的温度下和选定的时间间隔内测定稳定性。为快速筛选，制剂可以在40℃保存2周至1个月，并在此时测定其稳定性。如果制剂需要在2-8℃储存，则该制剂通常应该在30℃或40℃下至少稳定1个月和/或在2-8℃至少稳定1年。例如，在一优选的实施方案中，本发明的水溶液在约4℃下至少稳定1年。粘性和/或聚集程度可以作为表征蛋白质稳定性的指标。例如，“稳定的”制剂可以是在其中以聚集形式存在的蛋白质少于约10％，优选少于约5％，更优选少于约2％或甚至少于约1％的制剂。聚集程度可以用例如大小排阻色谱法测定。
本发明溶液的稳定不仅仅就聚集而言，还涉及抗体的化学稳定性。化学稳定性可以用例如疏水作用色谱法(HIC)测定，例如用木瓜蛋白酶消化后以HIC-HPLC测定。例如，与储存前的抗体溶液比较，在约4℃下储存至少1年后，经木瓜蛋白酶消化后在HIC-HPLC中代表未改变的抗体的峰降低不超过20％，优选为不超过10％，更优选为不超过5％或甚至不超过1％。
本领域技术人员很容易明了，还有其它适于测定本发明溶液稳定性的方法。例如，还可以用毛细管电泳法测定溶液的化学稳定性。
化学不稳定可以损害所论及抗体的活性。化学不稳定的例子是抗体降解或抗体分子在三级结构和/或四级结构的改变。在优选的实施方案中，本发明的溶液和制剂在约4℃的适宜条件下储存时，在1年的时间内其抗体活性损失少于50％，优选少于30％，更优选少于20％，更优选少于10％或甚至少于5％或1％。抗体活性可以用针对具体抗体的适宜抗原结合试验测定。
酸性成分在高蛋白质浓度下产生稳定抗体液体溶液的能力可以通过制备包含待测酸性成分的溶液，然后在22℃储存24小时而测定。例如，如果经过这段时间后溶液保持清澈，则该酸性成分对抗体有稳定作用，为适于在本发明的水溶液中使用的酸性成分。
所获得的稳定程度依赖于使用的酸和它的浓度，抗体浓度，以及储存温度。通常，抗体浓度越高，储存温度越高，聚集发生的时间越早。较高浓度的抗体通常需要较高浓度的酸性成分。
因此，本发明发现，可在特定酸性成分存在下，制备粘度可为治疗应用所接受的、包含抗体的稳定水溶液和液体制剂。
本发明的水溶液或液体制剂优选在剪切速率γ＝100(1/S)时，粘度低于200mPa·s，优选低于100mPa·s，优选低于70mPa·s，更优选低于50mPa·s，更优选低于20mPa·s或甚至低于10mPa·s。另一个适宜测定抗体溶液粘度的剪切速率为γ＝220(1/S)。
这种粘度的减小使本发明的水溶液或液体制剂可以有更高的相应抗体浓度。因此，有利的是，同样量的抗体可以以较小的体积施用。而且，这种较小的体积可以有利地允许制备预填充的递送装置以包含全部治疗剂量的相应抗体。而且，如果使用体积小，液体制剂就不需要为避免患者疼痛而制成等渗的。但是，在一优选的实施方案中，本发明的水溶液是等渗的。“等渗”意味着目的制剂有与人体血液实质相同的渗透压。等渗的制剂通常有约250至350mOsm的渗透压。等渗性可以通过例如蒸气压式或冰冻式(ice-freezing type)的渗压计测定。
根据本发明，酸性成分和酸的用量的选择依据所述高浓缩蛋白质溶液所期望达到的粘度和稳定性来进行。可以选择的适宜的酸包括有机酸和无机酸。本发明的有机酸可以是羧酸，如一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸、四元羧酸、氢羧酸(hydrocarboxylic acids)或酚类。本发明优选的酸为弱有机酸，例如pK值在3.0和6.0之间，优选在4.5和5.0之间的一元有机羧酸。本发明酸性成分的优选例子是乙酸、柠檬酸、草酸、丁二酸、酒石酸、乳酸、羟基丁二酸、羟基乙酸和反丁烯二酸。在一特别优选的实施方案中，水溶液中包含的酸性成分是乙酸。
优选地，所述水溶液或液体制剂的pH高于pH3，如在pH3和pH7之间，更优选在pH3和pH6之间，更优选在pH4和pH6之间或甚至在pH5和pH6之间。在一优选的实施方案中pH为约pH5.0或约pH6.0。尤其优选某些pH范围，例如优选低于pH6.0，或低于pH5.8，或低于pH5.6，或低于pH5.4的pH，和高于pH4.0，或高于pH4.2，或高于pH4.4，或高于pH4.6，或高于pH4.8，或高于pH5.0的pH。
优选地，本发明的酸性成分，例如乙酸，以最终浓度至少为0.001％，优选至少0.01％，更优选0.01％至0.2％存在。在本发明的一个实施方案中，在本发明的水溶液或液体制剂中没有附加缓冲剂。在本发明的另一个实施方案中，在本发明的水溶液或液体制剂中没有钠盐例如乙酸钠存在。
抗体(例如抗-lgE抗体，例如E25(如下文所述))的浓度大于50mg/ml，例如可以在100至200mg/ml之间，并可以达到300mg/ml。优选浓度至少为80、100、140、160、180、200、220、250或甚至300mg/ml。对于注射用溶液，一个优选范围是100至200mg/ml。如果蛋白质应经鼻或甚至口服途径递送，则优选的浓度为至少250mg/ml或甚至300mg/ml，因为对于经鼻或口服途径递送特别期望高的浓度。
当治疗的具体适应症需要时，本发明的水溶液或液体制剂还可以包含一种以上抗体，优选那些不会彼此产生不利影响的具有互补活性的抗体。这里的水溶液或液体制剂还可以包含其它非抗体治疗性蛋白质。这些抗体或蛋白质适宜以可有效达到预期目的的量联合存在。当在水溶液中包含另一蛋白质成分时，在选择酸性成分浓度时应考虑蛋白质的总浓度。
本发明一方面还提供一种稳定水溶液，其仅由浓度至少50mg/ml的抗体和酸性成分组成。但是，另一方面，此稳定水溶液也可基本上由浓度至少50mg/ml的抗体和酸性成分组成，特别是，它还可以包含副产品或治疗上无活性的添加剂。
优选地，本发明的水溶液或液体制剂还包含CaCl2和/或MgCl2。在一优选的实施方案中CaCl2o的浓度在50至200mM范围内，更优选在50至130mM范围内，优选100至130mM，最优选约100mM。在另一优选的实施方案中MgCl2的浓度在50至200mM范围内，更优选在50至130mM范围内，优选100至130mM，最优选为约100mM。包含MgCl2的稳定水溶液或液体制剂是本发明的特别优选的实施方案。在更优选的实施方案中这些水溶液或液体制剂还包括去污剂和/或糖。
II.抗体
本发明使用广泛意义上的术语“抗体”。术语“抗体”特别包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)，有多表位特异性的抗体组合物，双特异性抗体，二聚抗体(diabodies)，单链分子以及抗体片段和/或衍生物，如Fab，F(ab’)2和Fv片段或其它抗原结合片段。例如，抗体衍生物可以是聚乙二醇(PEG)化(PEGylated)形式的抗体或抗体片段。
在一优选的实施方案中，本发明的水溶液中使用的抗体的等电点在pH6至pH8之间。
术语“单克隆”指从基本上同质抗体群中得到的抗体的特征，而不应解释为需要用任何特定方法制备此抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法或重组DNA方法制备。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库中分离。
这里的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其它部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；还包括这种抗体的片段，只要其显示所期望的生物活性即可。
非人抗体的“人源化”形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，如Fv、Fab、Fab’F(ab’)2或抗体的其它抗原结合亚序列，其包含最低限度的源自非人免疫球蛋白的序列。通常，人源化抗体为人免疫球蛋白，在该蛋白中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种的互补决定区(CDR)的残基代替。在一些情况下，此人免疫球蛋白的Fv构架区残基由相应的非人残基代替。源自非人物种的互补决定区(CDR)残基也可以由相应的人残基代替。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体和输入的CDR或构架序列中都没有的残基。
在一特别优选的实施方案中，抗体或抗体衍生物选自抗lgE抗体，如E25、E26、E27(分别是WO99/01556公开的rhuMAbE-25、rhuMAbE-26、rhuMAbE-27)或它们的片段和衍生物。优选的抗lgE抗体为人源化鼠抗体或完全的人抗体。最优选的抗lgE抗体是Omalizumab，也叫“E25”。另一优选的抗lgE抗体名为“E26”，在下文中作进一步定义。
通常，抗lgE抗体在现有技术中已有描述，并且在WO93/04173和WO99/01556的国际申请中有更详细描述。例如，WO99/01556在图12和SEQ ID No.13-14中具体描述了Omalizumab，即E25。在WO99/01556中描述了包含E26序列的抗体分子，其选自图12-15中的F(ab)片段(SEQ IDNos.19-20)、sFv片段(SEQ ID No.22)和F(ab)’2片段(SEQ ID Nos.24-25)。本发明中术语E25和E26应作相应的解释。优选的本发明lgE抗体不导致肥大细胞或嗜碱性粒细胞的组胺释放。
此外，美国专利5449760概述了与可溶性lgE结合、而不与B细胞或嗜碱性粒细胞表面上的lgE结合的抗lgE抗体。诸如这些的抗体可与可溶性lgE结合，并通过例如阻断lgE受体结合位点、阻断抗原结合位点和/或简单的将lgE从循环中除去而抑制lgE活性。在美国专利5656273中描述了其它抗lgE抗体和源自此抗lgE抗体的lgE结合片段。在美国专利5543144中还描述了适用于本发明的抗lgE抗体，尤其是可以与可溶性lgE及在表达lgE的B细胞上的膜结合lgE发生结合，但不与嗜碱性粒细胞上结合的lgE相结合的抗lgE抗体。
III.包含适宜添加剂的抗体水溶液(液体制剂)
我们惊奇地发现，在根据本发明制备高浓度抗体酸水溶液后，可向其中加入不同组分而不实质性增加粘度。抗体酸溶液能与例如糖、去污剂和/或其它添加剂混合。因此，本发明还描述了适于制备包含这些添加剂的长期稳定的抗体液体制剂的方法。而且本发明还提供了包含这些添加剂的水溶液本身。
本领域技术人员将明了，多种赋形剂都可以用作添加剂。可以用作添加剂的成分为如：
a)液体溶剂、共溶剂，例如醇、如异丙醇；
b)糖或糖醇，例如甘露醇、海藻糖、蔗糖、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖或葡聚糖；
c)去污剂，如Tween20、60或80(聚山梨醇酯20、60或80)
d)缓冲剂，如醋酸盐缓冲液
e)防腐剂，如苯扎氯铵、氯化苄乙氧铵、叔铵盐和醋酸洗必泰
f)等渗调节剂(isotoning agents)，如氯化钠
g)载体，如聚乙二醇(PEG)，重组人血清白蛋白
h)抗氧化剂，如抗坏血酸和蛋氨酸
i)螯合剂，如EDTA
j)生物可降解聚合物，如聚酯
k)成盐抗衡离子，如钠
本发明的“防腐剂”为能加入到稀释剂中以实质减少重构制剂中的细菌作用的化合物，这样该化合物有助于例如生产可多次使用的重构制剂。例如防腐剂可以有利地包含在适于经鼻施用的溶液中或与多笔式注射器一起使用的溶液中。
优选的作为附加添加剂加入的化合物为去污剂(例如Tween20)，糖(例如蔗糖、果糖、甘露醇)和防腐剂。优选地，在本发明的制剂中不包括动物来源的添加剂如明胶或血清白蛋白(如BSA)。
通常，可接受的添加剂在使用的剂量和浓度下对接受者没有毒性。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这很容易经无菌滤膜过滤达到，或者，整个混合物的无菌也可以通过例如在约120℃对成分(蛋白质除外)高压灭菌约30分钟达到。
使用的酸溶液的百分比和添加剂的用量可以根据预期用途而变化。例如在不同生产步骤中酸溶液的浓度可能与最终产品的浓度不同。
应该指出的是，某些添加剂(例如乙醇、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或柠檬酸盐缓冲液)可以在某些pH条件下引起所论及的抗体胶凝、粘度增加和/或聚集。如果这些问题不能通过常规的pH值改变避免，则应优选不使用这些添加剂来制备本发明的组合物。
液体制剂可以，例如，向抗体水溶液中加入添加剂，然后搅拌溶解而制备。可以使用任何合适的搅拌器，如漩涡混合器。优选将抗体溶解在酸的水溶液中，然后加入添加剂的水溶液。优选在惰性气氛(如氮气或氩气)下进行搅拌，产生的液体优选进行真空脱气。惰性气氛和脱气都有助于延长溶液的稳定性。溶液制备后可以储存在玻璃或塑料容器中。
优选地，本发明的水溶液或液体制剂还包含CaCl2和/或MgCl2。在一优选的实施方案中CaCl2的浓度在50至200mM范围内，更优选50至130mM，优选100至130mM，最优选约100mM。在另一优选的实施方案中MgCl2的浓度在50至200mM范围内，更优选50至130mM，优选100至130mM，最优选约100mM。
在一优选的实施方案中本发明的水溶液或液体制剂还包含去污剂，例如Tween20、Tween60或Tween80。
在另一优选的实施方案中本发明的水溶液或液体制剂还包含至少一种糖。在更优选的一个实施方案中本发明的水溶液或液体制剂还包含至少一种选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖和葡聚糖的糖。但是，在本发明的一个实施方案中本发明的水溶液或液体制剂不包含麦芽糖。
在另一实施方案中本发明的水溶液或液体制剂还包含至少一种缓冲剂。
这里公开一种期望的抗lgE抗体水溶液，其包含100至200mg/ml的抗lgE抗体(优选约190mg/ml或约220mg/ml)和50至200mM的CaCl2或MgCl2(优选约50mM或约100mM)，以及任选地缓冲剂和任选地去污剂如Tween20——浓度为例如约0.02％。优选地，这种抗lgE制剂在8℃至少稳定1年。
IV.装置
本发明的水溶液或液体制剂可以使用例如标准安瓿、小瓶、预填充的注射器或多施用***。在优选的实施方案中，水溶液可以通过皮下施用于患者。例如，为此目的，可以用注射器注射制剂。但是，也可以使用其它注射装置(例如注射笔)和皮下贴剂递送***(如芯片装置)施用此制剂。但是，水溶液也可以通过吸入装置施用于患者。经鼻通道和肺递送分子的常规***包括药物定量吸入器、液体喷射器和超声雾化器。
因此，本发明一方面还提供包含水溶液的递送***，其选自一次性注射器和吸入装置。
递送***包含容器。合适的容器包括如瓶、小瓶(例如双室瓶)，注射器(例如双室注射器)和试管。容器可以由多种材料制成，例如玻璃或塑料。容器容纳水溶液而容器上带有或附有的标签可以显示使用说明。标签可以标示例如，该水溶液用于或预期用于皮下施用。装有制剂的容器可以是多次用小瓶，这允许水溶液的重复施用(如2至6次)。
因此，本发明还提供了本发明的水溶液或液体制剂在制备用于治疗疾病的递送***中的用途。
在本发明的另一实施方案中，本发明提供包含本发明水溶液并提供了其使用说明的产品。因此，这里提供产品，其包括：
a)盛放抗体浓缩水溶液的容器；
b)用稀释剂稀释此浓缩水溶液以使稀释后制剂中的蛋白质浓度至少约50mg/ml的说明书。此件产品还可包括盛放稀释剂(例如包含芳香醇的抑菌注射用水)的另一容器。
此件产品还可包括从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和有使用说明的包装说明书。
V.特定制剂
本发明另一方面提供包含本发明水溶液或液体制剂的缓释制剂。优选选自纳米聚合物或微粒或选自凝胶的缓释制剂。
在一特别优选的实施方案中缓释制剂为凝胶如透明质酸凝胶。
除了方便外，缓释制剂对于蛋白质药物递送还有其它优点，包括保护蛋白质延迟其降解或清除和能够将蛋白质局部递送至特定位置或身体区室从而降低药物的全身性接触。
本发明还考虑到例如可注射的储库型(depot)制剂，其中的蛋白质包埋在生物可降解聚合基质中。可以使用的聚合物为均聚物和乳酸与羟基乙酸的共聚物(PLGA)。PLGA通过水解途径降解，最终得到酸的单体，而且PLGA在制备(如微球)使用的条件下为化学惰性的，因此不会改变蛋白质。皮下或肌内注射后，蛋白质通过扩散和聚合物的降解而释放。通过使用具有不同组成和分子量的聚合物，可以使水解速率不同，因此使释放持续数天至数月。
在另一方面，本发明提供包含本发明的水溶液或液体制剂的喷鼻剂。
VI.用途和制备方法
本发明另一方面还提供了酸性成分在制备包含浓度至少50mg/ml的抗体的水溶液中的用途。
本发明还提供制备本发明水溶液的方法，其包括将抗体与酸性成分混合。
本发明还提供制备包含抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，第一步，制备包含浓度至少50mg/ml的抗体和至少一种酸性成分的水溶液；第二步，向所述水溶液中加入至少一种可药用添加剂。
本发明还提供了制备包含抗体的治疗性制剂的方法，其包括在制备所述抗体的最终纯化步骤中加入酸性成分。此最终步骤可以是如洗脱步骤、缓冲液交换步骤或包含连续恒容过滤的步骤。
此外，本发明提供了制备包含浓度大于50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，第一步将在适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml；第二步，将第一步制得的浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤，所述溶液任选地包含MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜的添加剂；第三步，将第二步取得的溶液进一步浓缩至浓度大于50mg/ml。
例如，至少一种酸性成分的水溶液可以是乙酸溶液，例如浓度在约0.01％和约0.1％之间的乙酸溶液。MgCl2和/或CaCl2浓度可以在50至200mM范围内，优选50至130mM，更优选100至130mM，最优选约100mM。在一更优选的实施方案中这些水溶液还包含去污剂和/或糖。
本发明还提供了制备包含浓度大于50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的方法，其中，
-第一步，将在适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml的浓度；
-第二步，将在第一步得到的浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第三步，将在第二步得到的溶液进一步浓缩至约100至约200mg/ml，优选约100至150mg/ml的中间浓度；
-第四步，将在第三步得到的中间浓缩溶液用含有MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第五步，将在第四步获得的溶液进一步浓缩至浓度大于150mg/ml。
恒容过滤通常以恒定的滞留物体积(retentate volume)用至少5体积或优选8体积的恒容过滤缓冲液进行。
在一优选的实施方案中将MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的溶液直接加到在上述5步骤方法之第三步获得的中间浓缩溶液中。如果将MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂直接加入，且如果不需要进一步调节盐和/或添加剂的相应浓度，则其后的第四步(即用含有MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤)可以省略。通常，仅向抗体的中间浓缩溶液中加入盐和/或添加剂的本发明5步骤方法可以避免该方法的溶液中出现凝聚和/或浑浊现象。
在一优选的实施方案中，在第四步将MgCl2(或CaCl2)的浓缩水溶液(如浓度1M)直接加入到超滤***中，以近似得到所需的最终浓度(如50mM或100mM)。
在本发明方法的优选实施方案中，羧酸如乙酸被用作酸性成分。在这些方法的优选实施方案中，没有加入羧酸盐。特别地，在这些实施方案中优选不加入相应的羧酸盐。
VII.医药用途
在一方面，本发明还提供了本发明的水溶液在医药中的用途。具体地，提供了该水溶液在制备用于治疗疾病(如***反应疾病)的药物中的用途。
蛋白质的适宜剂量将取决于如待治疗的病症、其严重程度和病程、施用蛋白质的目的是为了预防还是治疗、以往的治疗、患者病史和对蛋白质的反应、使用的抗体类型和主治医生的判断。抗体适宜一次或作为系列治疗施用于患者，并且可以自诊断后的任何时间给药。抗体可以作为唯一疗法施用或与在所论及的病症的治疗中有用的其它药物或疗法联合施用。
包含抗lgE抗体的制剂的用途包括，例如治疗或预防lgE介导的***反应病、寄生生物感染、间质性膀胱炎和哮喘，尤其是例如过敏性哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。依据待治疗的疾病或病症，给患者施用治疗有效量的抗lgE抗体。
在另一方面，本发明提供了本发明的水溶液在干燥或冻干工艺中的用途。
参照下面的实施例可更完全地理解本发明。但它们不应被理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
将产品缓冲液(10mM组氨酸缓冲液，10％蔗糖)中40mg/ml的E25溶液用大量水和0.01％乙酸透析。所得的E25在水和在0.01％乙酸中的溶液经过滤浓缩。得到的E25水溶液(99mg/ml E25，pH7.04)比E25的0.01％乙酸溶液(98mg/ml E25，pH5.4)粘度大得多。
乙酸在所获溶液中降低粘度的有益效果得到进一步证实。例如，可以容易地在0.1％乙酸中得到浓度为160mg/ml的E25(最终蛋白质溶液的pH为4.8)，或在0.01％乙酸中得到浓度为183mg/ml的E25。浓度为170mg/ml的E25水溶液也可制备，但它比上述所有乙酸溶液的粘度都大得多。
这些溶液在8℃储存10天后，用毛细管区带电泳(CZE)没有检测到化学降解。
实施例2
将产品缓冲液(10mM组氨酸缓冲液10％蔗糖)中浓度40mg/ml的E25溶液的缓冲液在恒容过滤设备中替换成0.1％乙酸。然后通过超滤将E25溶液浓缩至161mg/ml。溶液是流体，没有看到聚集或乳白色。收率非常好，约95％。将上述浓度为161mg/ml的溶液经Centricone管离心过滤进一步浓缩。得到浓度为214mg/ml以及297mg/ml的E25在0.1％乙酸中的流体澄清溶液。溶液可以容易地通过注射针头操作，且允许开发小体积(如0.5ml至1ml)的一次性预填充注射器。
实施例3
在最终产品缓冲液(含0.02％Tween20)中的40mg/ml E25溶液经0.1％乙酸透析。所得的E25的0.1％乙酸溶液(仍含0.02％Tween20去污剂)经Centricone管离心过滤浓缩，得到浓度为243mg/ml的E25溶液。溶液流动性与无Tween20的溶液的流动性相似，表明此去污剂与高蛋白质浓缩制剂是相容的。
实施例4
乙酸的未曾预料到的益处能够用下述试验举例说明。浓度为161mg/ml的E25的0.1％乙酸(17.5mM)溶液(pH4.8)相对于i)pH7.4的含145mMNaCl的17.5mM磷酸盐缓冲液(PBS)；ii)pH4.8的17.5mM乙酸盐缓冲液；和iii)pH4.8的17.5mM柠檬酸盐缓冲液分别透析。未曾预料到的是，在pH4.8的柠檬酸盐缓冲液中E25发生聚集，溶液变成白色浑浊。这在其它溶液中没有发生。磷酸盐缓冲液比乙酸盐缓冲液的粘度高。磷酸盐缓冲的E25溶液在室温下一天后变为乳白色。
实施例5
测量不同E25溶液的粘度。在23℃，用Paar Physica锥板型流变仪进行所有测量。结果见表1和表2。
表1
E25样品 在剪切速率γ＝100(l/s)下的粘度η(mPa·s) 在剪切速率γ＝225(l/s)下的粘度η(mPa·s) 备注
97.4mg/ml，0.01％乙酸 22.4 21.2 0.01％乙酸相对于水的有益效果
99mg/ml，水中 33.9 32.0
222mg/ml，0.1％乙酸 126 123
222mg/ml，0.1％乙酸，50mM CaCl2 66.6 63.2
222mg/ml，0.1％乙酸，100mM CaCl2 59.2 55 CaCl2可降低粘度
222mg/ml，0.1％乙酸，50mM MgCl2 79.5 77.2
222mg/ml，0.1％乙酸，100mM MgCl2 67.9 64.5 MgCl2可降低粘度
222mg/ml，0.1％乙酸，50mM NaCl 109 103
222mg/ml，0.1％乙酸，100mM NaCl 114 112
222mg/ml，0.1％乙酸，150mM NaCl 117 118 NaCl无作用
表2
E25样品 在剪切速率γ＝1下的粘度η(mPa·s) 备注
222mg/ml，0.1％乙酸， 368
222mg/ml，0.1％乙酸，50mM NaCl 351
222mg/ml，0.1％乙酸，100mM NaCl 1080
222mg/ml，0.1％乙酸，150mM NaCl 2140 在剪切速率很低时NaCl使粘度增大
实施例6
将浓度为161mg/m的E25的0.1％乙酸溶液在玻璃小瓶中冻干。冻干后得到的E25饼很难用0.1％乙酸溶解，但是，可以用含100mM CaCl2的0.1％乙酸重构溶液很快溶解冻干的E25。冻干的E25以235mg/ml重构。(重构溶液的体积比原来的溶液体积小)。这个实施例显示CaCl2在溶解E25冻干物时具有意想不到的益处。
实施例7：制备高浓缩液体制剂的一般方法
起始溶液为在水性缓冲液中的低浓度(比本发明的高浓度低)的纯化抗体溶液，所述缓冲液为例如由前面的加工步骤得到的缓冲液(如对E25：含约200mM NaCl的25mM TRIS缓冲液，pH8)。用酸(例如5％乙酸)将此溶液的pH调至低于抗体的等电点(如调至pH5)。然后将所得的溶液浓缩，用超滤法进行恒容过滤，优选在切向流过滤***中，使用能定量地保留抗体的膜，如具30kD或10kD的截断值的膜进行。
通常使用下述3步骤过程：
·第一步，将抗体溶液浓缩至中间浓度，例如40mg/ml。正常情况下所获滞留物因抗体聚集为乳白色。
·第二步，将浓缩溶液用含MgCl2或CaCl2(如浓度50mM或100mM)和任选的其它添加剂(如糖)的乙酸水溶液(如0.01％或0.1％的乙酸)恒容过滤。恒容过滤通常以恒定滞留物体积用至少5体积或优选8体积的恒容过滤缓冲液进行。恒容过滤时抗体溶液是浑浊的。
·第三步，将恒容过滤后的溶液进一步浓缩至高浓度，如大于或等于240mg/ml。从此超滤***中回收最终的浑浊滞留物。
在任选加入添加剂(如去污剂和最终地其它赋形剂，如糖、缓冲剂)后，以及在通过0.2μm过滤器过滤后，得到高浓缩液体制剂，在约4℃下储存时该制剂澄清、稳定。在此一般方法的优选实施方案中，为了得到浑浊度更小的溶液，使用下述5步聚方法：
·第一步，将抗体溶液浓缩至中间浓度，如40mg/ml。滞留物因抗体
聚集通常为乳白色。
·第二步，将浓缩溶液用仅含乙酸的水溶液(如0.01％或0.1％乙酸)恒容过滤。恒容过滤通常以恒定滞留物体积用至少5倍或优选8倍体积的恒容过滤缓冲液进行。通常在恒容过滤过程中可看到浑浊减少，溶液变澄清。
·第三步，将恒容过滤后的溶液进一步浓缩至较高的中间浓度，优选约120至130mg/ml。然后，直接向超滤***中加入MgCl2(或CaCl2)的浓水溶液，如浓度为1M，以近似得到期望的最终浓度(如50mM或100mM)。通过滞留物再循环进行混合后，由于所获粘度的降低，可观察到滞留物压力的减小。所得的滞留物保持澄清或轻微浑浊。
·第四步，用与首次恒容过滤所用相同的乙酸溶液(如0.01％或0.1％乙酸)对溶液恒容过滤，但这次乙酸溶液中还含有期望浓度的MgCl2(或CaCl2)(如50mM或100mM)，以确切地调节滞留物中的此浓度。恒容过滤通常以恒定滞留物体积用至少5体积或优选8体积恒容过滤缓冲液进行。
·第五步，将恒容过滤后的溶液进一步浓缩至高浓度，如大于或等于240mg/ml。然后，从超滤***中回收最终的澄清或微浑浊滞留物。
在任选加入添加剂(如去污剂和最终地其它赋形剂，如糖、缓冲剂)后以及在通过0.2μm的过滤器过滤后，得到高浓缩液体制剂，在约4℃下储存时该制剂澄清、稳定。
实施例8：含乙酸和MgCl2的制剂的制备和粘度
根据实施例7描述的5步骤方法，在切向流过滤***中经超滤(膜面积：150cm2，膜截断值：10kD，***滞留体积(hold up volume)：9ml，滞留物压力：2至3巴)制备约12ml液体制剂[257mg/ml E25，0.1％乙酸，50mM MgCl2]。
起始溶液为在含约200mM NaCl的25mM TRIS缓冲液(pH8)中的浓度为4.8mg/ml的纯化E25抗体溶液。在用5％乙酸调节pH至pH5后，进行如下操作：
·第一步，将溶液浓缩至40mg/ml。
·第二步，将浓缩溶液以恒定滞留物体积用8倍体积的0.1％乙酸恒容过滤。
·第三步，将恒容过滤后的溶液浓缩至127mg/ml，在滤液管(filtrate line)关闭的5分钟期间，将滞留物再循环，之后取样测定样品粘度。然后，直接将1M MgCl2水溶液加入到超滤***中，以近似得到50mM最终MgCl2浓度。再浓缩至初始滞留体积(即加入MgCl2前的体积)并在滤液管关闭的3分钟期间将滞留物再循环，之后对滞留物取样测定其粘度。
·第四步，将溶液以恒定滞留物体积用含50mM MgCl2的8体积0.1％乙酸恒容过滤。
·第五步，将恒容过滤后的溶液浓缩至约260mg/ml。将滞留物从超滤***中回收并经0.2μm的过滤器过滤后，取样测定样品粘度。将另一份样品用含50mM MgCl2的0.1％乙酸稀释至200mg/ml，也测定其粘度。
在23℃、剪切速率为220s-1时，用Paar Physica锥板型流变仪测定样品粘度，结果如下：
步骤：                        E25浓度    pH    粘度
在0.1％乙酸中，加MgCl2前：    127mg/ml    4.43   12.1mPa·s
在0.1％乙酸中，加MgCl2后：    127mg/ml    4.48   8.27mPa·s
在0.1％乙酸中，50mM MgCl2：   257mg/ml    3.84   135mPa·s
在0.1％乙酸中，50mM MgCl2：   200mg/ml    3.82   37.1mPa·s
实施例9：E25制剂的粘度相对于乙酸浓度
将在实施例8中所述的同样试验进行数次，仅改变恒容过滤缓冲液使用的乙酸浓度，但保持最终MgCl2浓度等于50mM。然后用相应恒容过滤缓冲液(即含50mM MgCl2的相应乙酸溶液)将所得的不同高浓缩E25溶液稀释至约200mg/ml，测定pH和粘度。
在23℃、剪切速率为220s-1时，用Paar Physica锥板型流变仪测定粘度。结果如下：
制剂缓冲液：                E25浓度      pH       粘度
0.1％乙酸，50mM MgCl2：     200mg/ml      3.82      37.1mPa·s
0.05％乙酸，50mM MgCl2：    200mg/ml      4.03      31.4mPa·s
0.025％乙酸，50mM MgCl2：   206mg/ml      4.26      33.8mPa·s
0.01％乙酸，50mM MgCl2：    195mg/ml      4.63      38.3mPa·s
0.005％乙酸，50mM MgCl2：   197mg/ml      4.83      54.5mPa·s
0.0025％乙酸，50mM MgCl2：  205mg/ml      5.01      106mPa·s
0.001％乙酸，50mM MgCl2：   201mg/ml      5.13      115mPa·s
0％乙酸，50mM MgCl2:        198mg/ml      5.35      200mPa·s
由结果可看出，当将乙酸浓度从0.1％降低至0％(抗体浓度恒定，MgCl2浓度恒定)时，粘度在0.1％至0.01％的浓度范围内基本保持恒定，但进一步降低乙酸浓度时粘度将急剧增加。
我们发现，约0.0075％乙酸的此“转变浓度”相应于1.3mM，该摩尔浓度相应于200mg/ml的E25的摩尔浓度。因此，在本发明的一个实施方案中，选择本发明酸性成分的浓度以约等于或大于本发明制剂或水溶液的抗体摩尔浓度。
实施例10：含乙酸和MgCl2或CaCl2的制剂的粘度
根据实施例7所述的3步骤方法，在切向流过滤***中经超滤(膜面积：150cm2，膜截断值：10kD，***滞留体积：10ml，滞留物压力：2.5至4巴)制备约18ml液体制剂[237mg/ml E25，0.01％乙酸，50mM MgCl2]。
起始溶液为在含约200mM NaCl的25m MTRIS缓冲液(pH8)中的浓度为4.8mg/ml的纯化E25抗体溶液。用5％乙酸调节pH至pH5后，进行如下操作：
·第一步，将溶液浓缩至40mg/ml。
·第二步，将浓缩的溶液以恒定滞留物体积用含50mM MgCl2的8倍体积0.01％乙酸恒容过滤。
·第三步，将恒容过滤后的溶液浓缩至230至240mg/ml。滞留物从超滤***中回收并经0.2μm的过滤器过滤后，取两份样品测定其粘度(第一份如此测定，第二份加入0.02％Tween20后测定)。再将另外两份样品用含50mM MgCl2的0.01％乙酸稀释至约210mg/ml后测定其粘度(第一份即如此测定，第二份加入0.02％Tween20后测定)。
重复同样的试验，但用CaCl2代替MgCl2，得到液体制剂[233mg/mlE25，0.01％乙酸，50mM CaCl2]。
在23℃、剪切速率220s-1时，用Paar Physica锥板型流变仪测定粘度。结果如下：
制剂缓冲液：                                E25浓度               粘度
0.01％乙酸，50mM MgCl2：                    237mg/ml               83.5mPa·s
0.01％乙酸，50mM MgCl2，0.02％Tween20：     237mg/ml               86.6mPa·s
0.01％乙酸，50mM CaCl2：                    233mg/ml               60.5mPa·s
0.01％乙酸，50mM CaCl2，0.02％Tween20：     233mg/ml               59.1mPa·s
0.01％乙酸，50mM MgCl2：                    211mg/ml               40.5mPa·s
0.01％乙酸，50mM MgCl2，0.02％Tween20：     211mg/ml               42.1mPa·s
0.01％乙酸，50mM CaCl2：                    207mg/ml               34.8mPa·s
0.01％乙酸，50mM CaCl2，0.02％Tween20：     207mg/ml               31.6mPa·s
结果显示，如果用CaCl2代替MgCl2，粘度值稍微偏低。而且，浓度为0.02％的Tween20对粘度无影响。
实施例11：高浓缩液体制剂的制备和稳定性
根据实施例7描述的5步骤方法，经超滤制备下述三种高浓缩液体制剂(每种约65ml，初始原料为不含Tween的E25药物)：
制剂#批号#     F1NVP-IGE025-01PP01   F1NVP-IGE025-01PP02   F1NVP-IGE025-01PP03
组成：E25乙酸MgCl2乙酸镁海藻糖Tween20 196mg/ml0.1％50mM-27mg/ml0.02％ 201mg/ml0.1％50mM30mM-0.02％ 167mg/ml0.05％50mM45mM-0.02％
pH张力粘度(在220s-1；23℃)     4.50273mOsm/kg39.9mPa·s   4.95252mOsm/kg48.3mPa·s   5.20277mOsm/kg19.5mPa·s
经测定这些制剂的稳定性发现，这些制剂在5℃储存6个月(研究还在继续进行中)后稳定。我们进行了下述试验：SEC(大小排阻色谱)，HIC(木瓜蛋白酶消化后的疏水作用色谱)和生物测定试验(lgE受体结合抑制试验)：
制剂#     F1     F2     F3
SEC：起始1月(5℃)3月(5℃)6月(5℃)   ％单体：99.198.599.198.7   ％单体：98.998.698.998.3   ％单体：99.198.699.098.7
HIC：起始1月(5℃)3月(5℃)6月(5℃)   ％未改变：63636059   ％未改变：62626061   ％未改变：58636062
生物测定：起始1月(5℃)3月(5℃)6月(5℃)   ％比活性：1057597111   ％比活性：107799599   ％比活性：100799985
结果显示，在5℃下，这三种制剂至少在6个月内稳定。
实施例12：仅含低浓度乙酸的高浓度E25水溶液的粘度
根据实施例7所述的5步骤方法中的前三步，在切向流过滤***中经超滤(膜面积：150cm2，膜截断值：10kD，***滞留体积：9ml，滞留物压力：2至3巴)制备约31ml水溶液[127mg/ml E25，0.1％乙酸]。
起始溶液为在含约200mM NaCl的25mM TRIS缓冲液(pH8)中的浓度为4.8mg/ml的纯化E25抗体溶液。用5％乙酸调节pH至pH5后，进行如下操作：
·第一步，将溶液浓缩至40mg/ml。
·第二步，将浓缩溶液以恒定滞留物体积用8倍体积0.1％乙酸恒容过滤。
·第三步，将恒容过滤后的溶液浓缩至约120mg/ml，取样测定样品粘度。
数次重复同样试验，仅改变用于恒容过滤的乙酸浓度。
在23℃、剪切速率220s-1时，用Paar Physica锥板型流变仪测定粘度。结果如下：
乙酸浓度                E25浓度            粘度
0.1％(即17.3mM)          127mg/ml            12.1mPa·s
0.1％(即17.3mM)          111mg/ml            7.4mPa·s
0.05％(即8.7mM)          118mg/ml            9.4mPa·s
0.025％(即4.3mM)         121mg/ml            13.8mPa·s
0.01％(即1.7mM)          121mg/ml            17.8mPa·s
0.005％(即0.87mM)        120mg/ml            24.4mPa·s
0.0025％(即0.43mM)       115mg/ml            25.4mPa·s
0.001％(即 0.17mM)       120mg/ml            26.7mPa·s
0％(即仅有水)            116mg/ml            47.2mPa·s
结果显示，乙酸与水相比的益处即使在乙酸浓度低至0.17mM时也可看到，这使得可以制备粘度明显低于50mPa·s(即仅用水得到的相应粘度)的浓度为120mg/ml的抗体溶液。
实施例13：仅含0.1％乙酸的E25水溶液的粘度，抗体浓度的函数
在恒容过滤步骤中使用0.1％乙酸重复进行如实施例12的相同试验，但此次将恒容过滤溶液浓缩至约240mg/ml(代替120mg/ml)。滞留物从超滤***中回收并经0.2μm的过滤器过滤后，取样测定样品粘度。同时取其它样品，用0.1％乙酸经各种稀释步骤后测定粘度。
在23℃、剪切速率220s-1时，用Paar Physica锥板型流变仪测定粘度。结果如下：
乙酸浓度       E25浓度            粘度
0.1％           240mg/ml            225mPa·s
0.1％           220mg/ml            125mPa·s
0.1％           200mg/ml            63mPa·s
0.1％           180mg/ml            40mPa·s
0.1％           170mg/ml            35mPa·s
0.1％           148mg/ml            20mPa·s
0.1％           127mg/ml            12mPa·s
0.1％           85mg/ml             6mPa·s
结果显示，乙酸的有益作用使得可以制备浓度达到约180mg/ml且粘度显著低于50mPa·S的抗体溶液。
实施例14：柠檬酸作为酸性成分的用途
用与实施例7描述的3步骤方法类似的方法，在切向流过滤***中经超滤(膜面积：150cm2，膜截断值：10kD，***滞留体积：10ml，滞留物压力：2至3巴)制备浓度约155mg/ml的约19ml E25水溶液，其中所述水溶液为在用柠檬酸调节pH为4.4至4.6的纯化水中的溶液：
起始溶液为在含约200mM NaCl的25mM TRIS缓冲液(pH8)中的浓度为4.8mg/ml的纯化E25抗体溶液。用0.5M柠檬酸调节pH至pH4.7(相当于柠檬酸的最终浓度为约6.6mM)后，进行如下操作：
·第一步，尝试将溶液浓缩至40mg/ml。但滤液流量立即迅速降低，以至于不可能在pH4.7下进行此浓缩步骤。为了恢复正常的滤液流量，逐步加入少量的0.5M柠檬酸，使溶液pH降低。pH4.4和pH4.2都不够低以致不能获得满意的滤液流量。最后，仅当pH降低至4.0后才可以进行此浓缩步骤，这相当于约9mM的柠檬酸最终浓度。
·第二步，将浓缩溶液以恒定滞留物体积用8倍体积预先用几滴0.5M柠檬酸将pH调节至约4.4的纯化水进行恒容过滤(相当于柠檬酸最终浓度在约0.05至0.1mM范围内)。
·第三步，将恒容过滤后的溶液尽可能浓缩。滞留物从超滤***中回收并经0.2μm的过滤器过滤后，取样测定样品浓度和pH值。
浓度最大可达155mg/ml，最终pH为4.5。相比之下，用0.1％乙酸(没有其它添加剂)使用相同超滤设备得到的最大浓度为约240mg/ml。
此外，从这种浓缩溶液(155mg/ml，pH4.5)取样加入pH4.5的柠檬酸钠缓冲液以达到预设的17.5mM的最终缓冲液浓度。但加入头几滴(pH4.5的1M柠檬酸钠缓冲液)后，E25就立即凝聚，溶液变成白色浑浊，不久变成白色固体凝胶。如果向实施例14的最终浓缩溶液中加入1MMgCl2(代替pH4.5的1M柠檬酸钠)(至MgCl2最终浓度为50mM)，溶液保持澄清。

Claims (49)

1.稳定的水溶液，其包含浓度至少50mg/ml的抗体，还包含至少一种酸性成分。
2.权利要求1的水溶液，其由或基本上由浓度至少50mg/ml的抗体和酸性成分组成。
3.权利要求1或2的水溶液，其中酸性成分以至少0.001％，优选至少0.01％的最终浓度存在。
4.权利要求1至3之任一项的水溶液，其中酸性成分为乙酸。
5.权利要求1至4之任一项的水溶液，其中所述水溶液的pH大于3，优选在pH3至pH6之间。
6.权利要求1至5之任一项的水溶液，其中抗体的等电点在pH6和pH8之间。
7.权利要求1至6之任一项的水溶液，其中抗体选自抗-IgE抗体E25、E26、E27或它们的生物学活性片段或衍生物。
8.权利要求1至7之任一项的水溶液，其在约4℃下至少稳定1年。
9.权利要求1至8之任一项的水溶液，其还包含CaCl2。
10.权利要求1至9之任一项的水溶液，其还包含MgCl2。
11.权利要求1至10之任一项的水溶液，其还包含至少一种添加剂。
12.权利要求11的水溶液，其中添加剂为Tween20。
13.权利要求11的水溶液，其中添加剂为糖。
14.权利要求13的水溶液，其中糖选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖和葡聚糖。
15.权利要求11的水溶液，其中添加剂为缓冲剂。
16.权利要求1至15之任一项的水溶液，其中所述水溶液为等渗的。
17.喷鼻剂，其包含上述权利要求之任一项的水溶液。
18.缓释制剂，其包含上述权利要求之任一项的水溶液。
19.权利要求18的缓释制剂，其选自纳米聚合物或微粒，或选自凝胶。
20.权利要求19的缓释制剂，其中的凝胶为透明质酸凝胶。
21.包含上述任一项权利要求的水溶液的递送***，其选自一次性注射器和吸入装置。
22.权利要求1至16之任一项的水溶液在制备用于治疗疾病的递送***中的用途。
23.酸性成分在制备包含浓度至少50mg/ml的抗体的水溶液中的用途。
24.权利要求1至16之任一项的水溶液在干燥或冻干工艺中的用途。
25.权利要求1至16之任一项的水溶液的制备方法，其包括将抗体与酸性成分混合。
26.包含抗体的治疗性液体制剂的制备方法，其中，第一步制备包含浓度至少50mg/ml的抗体和至少一种酸性成分的水溶液，第二步向所述水溶液中加入至少一种可药用添加剂。
27.包含浓度大于50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的制备方法，其中，
-第一步，将在适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml的浓度；
-第二步，将在第一步得到的浓缩溶液用任选包含MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第三步，将在第二步得到的溶液进一步浓缩至浓度大于50mg/ml。
28.包含浓度大于50mg/ml的抗体的治疗性液体制剂的制备方法，其中，
-第一步，将在适宜缓冲液中的抗体溶液浓缩至约10mg/ml至约50mg/ml的浓度；
-第二步，将在第一步得到的浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤；
-第三步，将在第二步得到的溶液进一步浓缩至约100至约200mg/ml的中间浓度，优选约100至约150mg/ml；
-第四步，将在第三步得到的中间浓缩溶液用至少一种酸性成分的水溶液恒容过滤，其中所述水溶液还包含MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂；
-第五步，将在第四步得到的溶液进一步浓缩至浓度大于150mg/ml。
29.权利要求28的方法，其中将MgCl2和/或CaCl2和/或其它适宜添加剂的溶液在第三步和第四步之间直接加入到在第三步获得的中间浓缩溶液中。
30.权利要求25至29的方法，其中酸性成分以至少0.001％，优选至少0.01％的最终浓度存在。
31.权利要求25至30的方法，其中酸性成分为乙酸。
32.权利要求25至31的方法，其中所述水溶液的pH大于3，优选在pH 3和pH 6之间。
33.权利要求25至32的方法，其中抗体的等电点在pH 6和pH 8之间。
34.权利要求25至33的方法，其中抗体选自抗-IgE抗体E25、E26、E27或它们的生物学活性片段或衍生物。
35.治疗性液体制剂，其是通过权利要求26至34之任一项的方法获得的。
36.治疗性液体制剂，其可通过权利要求26至34之任一项的方法获得。
37.权利要求35或36的治疗性液体制剂，其在约4℃下至少稳定1年。
38.权利要求35至37的治疗性液体制剂，其还包含浓度在50mM至200mM之间的CaCl2。
39.权利要求35至38的治疗性液体制剂，其还包含浓度在50mM至200mM之间的MgCl2。
40.权利要求35至39的治疗性液体制剂，其还包含至少一种添加剂。
41.权利要求40的治疗性液体制剂，其中添加剂为Tween20。
42.权利要求40的治疗性液体制剂，其中添加剂为糖。
43.权利要求42的治疗性液体制剂，其中糖选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、果糖、麦芽糖、乳糖和葡聚糖。
44.权利要求40的治疗性液体制剂，其中添加剂为缓冲剂。
45.权利要求35至44之任一项的治疗性液体制剂，其中所述液体制剂为等渗的。
46.包含抗体的治疗性液体制剂的制备方法，其包括在制备所述抗体的最后纯化步骤加入酸性成分。
47.权利要求1至16之任一项的水溶液，其用于医药用途。
48.权利要求1至16之任一项的水溶液在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
49.权利要求1至16之任一项的水溶液在制备用于治疗***反应疾病的药物中的用途。
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