WO2005035574A1 - IgM高濃度安定化溶液 - Google Patents

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WO2005035574A1
WO2005035574A1 PCT/JP2004/014935 JP2004014935W WO2005035574A1 WO 2005035574 A1 WO2005035574 A1 WO 2005035574A1 JP 2004014935 W JP2004014935 W JP 2004014935W WO 2005035574 A1 WO2005035574 A1 WO 2005035574A1
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igm
concentration
ion
nacl
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PCT/JP2004/014935
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Tomoyuki Igawa
Yasuo Sekimori
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Definitions

  • the present invention relates to a high-concentration IgM stabilizing solution and its production.
  • IgG immunoglobulins in many higher animals
  • IgA immunoglobulin A
  • IgM immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgE immunoglobulins of each class differ in properties such as size, charge, amino acid composition, sugar content and the like.
  • IgM accounts for about 10% of total plasma immunoglobulin.
  • IgM is a major component of the initial antibody produced against cell membrane antigens with complex antigenicity, infectious microorganisms, and in the case of soluble antigens.
  • HgM has a pentameric structure.
  • the five subunits that make up the pentameric structure of IgM also have four-chain structural power similar to IgG.
  • the HM chain of IgM differs from the ⁇ chain of IgG H chain in the following amino acid sequence.
  • the ⁇ chain has one extra domain of the constant region than the ⁇ chain.
  • the number of oligo chains in the ⁇ chain is four more than in the ⁇ chain.
  • IgM has a polypeptide chain called J chain that is not found in IgG.
  • the J chain is thought to assist ⁇ chain association before IgM also secretes antibody-producing cell power.
  • a chimeric antibody is an antibody having a structure in which a variable region is recombined with a variable region derived from a different species.
  • a “chimeric antibody” having a variable region of an animal species other than human and a constant region of a human antibody Non-patent Document 1Z
  • CDRs complementarity determining regions
  • IgM is extremely unstable compared to IgG and has low solubility, so that it is difficult to prepare a highly concentrated and stable solution of IgM.
  • Cytotherapy, 2001, 3 (3), 233-242 reports that IgM precipitation and activity reduction occurred upon dissolution even when IgM was stored at ⁇ 20 ° C.
  • the document describes that IgM is liable to cause binding and precipitation during storage.
  • Patent Document 1 discloses an antibody high-concentration stable preparation containing an acidic component, and uses MgCl, CaCl2 to stabilize an antibody.
  • the antibody stabilization method in the publication relates to an IgG preparation and does not refer to IgM.
  • IgM exists as a multimer, unlike IgG, and unlike IgG, which is inherently stable, easily associates with each other. Therefore, it is extremely difficult to increase the concentration.
  • Non-Patent Document 5 In Immunological Methods, 111 (1988) 17-23 (Non-Patent Document 5), IgM precipitates under low salt concentration and redissolves in phosphate buffer or Tris-HCl buffer under weak alkaline buffer and high salt concentration It has been reported that Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38 (8): 759-764 (Non-Patent Document 3) states that IgM easily precipitates at pH 5 and is difficult to handle. It has been suggested that the solution may be pessimistic with respect to IgM solution, and therefore it is possible to provide a highly concentrated solution of IgM as a drug or its drug substance. No indication is given of the possibility.
  • Non-Patent Document 5 also describes the re-dissolution of insoluble aggregates of antibodies that are euglobulin precipitates, but their solubility is lOmg / mL or less. And the solubility of IgM is low. Furthermore, there is no description about the stability of a water-soluble aggregate.
  • Non-patent Document 6 discloses IgM stabilization using PVP-added kamugi, but stabilization of high-concentration antibodies.
  • the Journal of Immunological Methods 1995, 181 (1), 37-43 discloses that a freeze-dried preparation using trehalose-added cucumbers is not stable. Sufficient, there is no description of the stability of the antibody at high concentrations.
  • Non-Patent Document 1 Pro Natl. Acad. Sci. USA, (1984) 81: 6851
  • Non-Patent Document 3 Clin.Chem.Lab.Med.2000; 38 (8): 759-764
  • Non-Patent Document 4 BIOTECHNOLOGY 1993, 11, 512-515
  • Non-Patent Document 5 Journal of Immunological Methods, 111 (1988), 17-23
  • Non-Patent Document 6 Pharmaceutical Research 1994, 11 (5), 624-632
  • Non-Patent Document 7 Journal of Immunological Methods 1995, 181, 37-43
  • Non-Patent Document 8 Cytotherapy, 2001, 3 (3), 233-242
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object thereof is to stabilize a high concentration of IgM in a solution. More specifically, an object of the present invention is to provide a method for stabilizing a high concentration of IgM, a solution in which a high concentration of IgM is stabilized, and a method for producing the same.
  • an embodiment provides an aqueous solution in which the increase in water-soluble aggregates is suppressed.
  • a high-concentration IgM preparation having stability that can be used as a pharmaceutical is provided.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, using a compound containing a polyvalent cationic ion such as magnesium chloride or arginine hydrochloride as an additive, the IgM in the solution was And found that a stable high concentration solution of IgM can be prepared.
  • a compound containing a polyvalent cationic ion such as magnesium chloride or arginine hydrochloride
  • the present invention relates to a method for stabilizing high-concentration IgM, a solution in which high-concentration IgM is stabilized, and a method for producing the same. More specifically, the present invention provides the following invention.
  • the solution according to (1) containing IgM at a concentration higher than 1 mg / mL.
  • the solution according to (1) which is an aqueous solution.
  • step (b) step comprising freezing or freeze-drying the solution stabilized by step (a). How to stabilize drug formulations.
  • a method of high concentration of immunoglobulins to produce a stabilized solution, immunoglobulin is I g M, a method of adding a polyvalent cationic ions in solution.
  • step (b) A method for producing a pharmaceutical preparation, comprising a step of freezing or freeze-drying the solution produced in step (a).
  • FIG. 1 is a diagram showing, as ⁇ aggregate, a value obtained by subtracting an aggregate content in an initial state from an aggregate content at 25 ° C. for one month and at 25 ° C. for two months in each sample.
  • FIG. 2 is a view showing an associated state content of each sample in an initial state at 4 ° C. for 3 months.
  • FIG. 3 is a diagram showing the associated body content in the initial state of each sample, 4 ° C. for 4 months, and 25 ° C. for 4 months.
  • FIG. 7 shows the SEC aggregate content% on day + 4 ° C.-3 days, freeze-dried Z40 ° C.-8 days + 4 ° C.-3 days + re-lyophilized Z50 ° C.-8 days.
  • FIG. 5 is a diagram showing the SEC aggregate content% in the initial state of each sample, freeze-dried at Z40 ° C for 2 months.
  • FIG. 6 is a view showing a chromatogram obtained by GPC-MALLS analysis of MABON-01 and a calculated molecular weight.
  • IgM refers to an immunoglobulin having a ⁇ -chain constant region as an H-chain constant region and having a pentamer or hexamer structure.
  • the origin of the variable region constituting IgM in the present invention is not limited. Therefore, in addition to the variable region derived from the chain, the variable region derived from IgG and its partial structure can be included. As the partial structure of the variable region, a framework or CDR can be shown.
  • IgM refers to an exogenous IgM gene expression product introduced into a transformed cell.
  • the animal species from which the constant region constituting IgM of the present invention is derived is not limited. That is, the IgM of the present invention comprises an IgM constant region from any animal species having an IgM-type immunoglobulin.
  • the constant region is preferably derived from the same species as the species to be administered. Therefore, for the purpose of administration to humans, it is desirable that at least the constant region be derived from humans.
  • An IgM composed of a human-derived constant region and a variable region derived from another animal species or human but from another individual is called a chimeric antibody.
  • IgM in which the framework of the variable region in addition to the constant region is derived from humans is more preferable as IgM for administration to humans.
  • An antibody that retains the framework structure of the variable region and has only the CDRs recombined with antibodies from other animal species is called a humanized antibody.
  • high concentration of immunoglobulin (IgM) means that the content of IgM in a solution is higher than lmg / mL.
  • the solution of the present invention preferably has an IgM content of lmg / mL-200mg / mL. According to the present invention, it is possible to stabilize IgM even at a concentration higher than 10 mg / mL (for example, 20 mg / mL or more, 25 mg / mL or more, 40 mg / mL or more, 50 mg / mL or more). it can.
  • a polyvalent cationic ion when suppressing an increase in the water-soluble aggregate, it is preferable to add a polyvalent cationic ion.
  • the “multivalent cationic ion” that can be used in the present invention is 2 It is a cationic ion having a valency or higher, and for example, Mg ++, Ca ++, Zn ++, Fe ++, basic amino acid and the like can be used.
  • the basic amino acid for example, Arginine, Lysine, L-lysine L-glutamate (L-Lysine L-Glutamate), L-arginine L-glutamate (L-Arginine L-Glutamate) or the like may be used. Can be.
  • Preferred polyvalent cationic ions include Mg ++ or Arginine.
  • the cationic ion excluding the “polyvalent cationic ion” that can be used in the present invention is a monovalent cationic ion, and includes, for example, Na + and K +.
  • the concentration of a cationic ion or a polyvalent cationic ion added to the solution is usually ImM-IOOOmM, preferably 10mM-500mM, and more preferably 50mM-200mM.
  • the solution of the present invention may contain a saccharide in addition to a cationic ion or a polyvalent cationic ion.
  • Preferred saccharides include trehalose, sucrose, and sorbitol.
  • examples of buffer solutions that can be used include a phosphate buffer, an acetate buffer, and a citrate buffer.
  • stabilization in the present invention refers to suppressing the increase in water-soluble IgM aggregates generated during storage and increasing the amount of Z or insoluble IgM aggregates (precipitates) generated during storage. Suppressing and maintaining the function of Z or water-soluble IgM, preferably suppressing the increase in water-soluble IgM aggregates that occur during storage.
  • the “water-soluble aggregate” in the present invention refers to a water-soluble multimer such as a dimer or trimer of IgM.
  • the water-soluble aggregate can be detected by, for example, gel filtration chromatography.
  • the stability of the IgM high-concentration solution can be measured, for example, by the inhibition rate of increase in the aggregate, which is obtained by the following formula.
  • the solution of the present invention is obtained by adding polyvalent cationic ions to a solution containing high-concentration IgM.
  • the rate of increase in association increase is preferably 10% or more, more preferably 30% or more, further preferably 50% or more, and still more preferably 80% or more.
  • the solution of the present invention is preferably a solution that does not contain other human-derived proteins other than IgM. More preferably, the solution is a solution containing no protein other than IgM and not less than an amount capable of exhibiting an effect as a stabilizer.
  • the solution of the present application is a pharmaceutical preparation, it is preferable that the solution be a human-derived protein other than IgM and do not contain a drug substance of the drug and Z or a protein in an amount exceeding the amount acceptable for the pharmaceutical. No.
  • the dosage form of the pharmaceutical preparation of the present invention is not particularly limited, and may be any dosage form.
  • Examples of the dosage form include a solution preparation and a lyophilized preparation.
  • Solution preparations include cold storage preparations, room temperature storage preparations, and frozen preparations.
  • any administration route that does not limit the administration route of the pharmaceutical preparation of the present invention can be used. Therefore, oral or parenteral administration can be used depending on the intended use of the pharmaceutical preparation.
  • Specific dosage forms for parenteral administration include injection dosage forms, nasal dosage forms, pulmonary dosage forms, transdermal dosage forms, and the like.
  • injection forms include systemic or local administration, for example, by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the IgM stabilized by the method of the present invention can be administered as a drug formulated by a known pharmaceutical method in addition to directly administering itself to a patient.
  • a drug formulated by a known pharmaceutical method in addition to directly administering itself to a patient.
  • it can be used in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of a suspension.
  • a suitable combination with a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, an emulsifier, a suspending agent, a surfactant, a stabilizer, a vehicle, a preservative, or the like.
  • It can be formulated by mixing in the unit dosage form required for accepted pharmaceutical practice. The amount of the active ingredient in these preparations can be adjusted so as to obtain an appropriate dose in the specified range.
  • a sterile composition for injection can be formulated using a vehicle such as distilled water for injection according to normal pharmaceutical practice.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, saline, An isotonic solution containing dextrose and other auxiliaries is used.
  • Specific examples of the auxiliary agent include sucrose, D-sorbitol, D-mannose, D-mantol, sodium salt and the like.
  • a suitable solubilizing agent may be added to the pharmaceutical composition.
  • alcohols and nonionic surfactants are preferred as solubilizers.
  • alcohols include ethanol and polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol.
  • nonionic surfactant for example, polysorbate 80, polysorbate 20, poloxamer 188, HCO-50, or the like can be used.
  • a cationic surfactant such as Shii-Dani Benzalko-Pharm can be used.
  • the oily liquid includes sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent. It may also be combined with a buffer such as a phosphate buffer and a sodium acetate buffer, a soothing agent such as proforce hydrochloride, and a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol and an antioxidant.
  • a buffer such as a phosphate buffer and a sodium acetate buffer
  • a soothing agent such as proforce hydrochloride
  • a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol and an antioxidant.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate vial or ampoule.
  • the solution of the present invention is used as a pharmaceutical preparation, it is preferably pH 5-8, particularly preferably pH 5-7.
  • the dose of the pharmaceutical preparation can be appropriately selected depending on the target disease, the age of the patient, and the symptoms. For example, it is possible to select from O.OOOlmg to 100000 mg / kg body weight at a time. Alternatively, for example, the dose can be selected within the range of 0.001 to 100000 mg / body per patient.
  • the pharmaceutical formulations of the present invention are not limited to these dosages.
  • For the preparation of the solution preparation of the present invention see WO2002 / 096457.
  • Example 1 the recombinant anti-gandarioside GM3 human antibody (hereinafter referred to as “MABON-01”) prepared in Reference Example 1 was used as IgM.
  • the MABON-01 solution was concentrated to prepare a high concentration solution of about 9 mg / mL. This was dialyzed against a dialysis membrane SLIDE-A-LYZER Dialysis Cassette 10000 MWCO (PIERCE), and dialyzed against the following buffer of 1.1.6 to replace the buffer.
  • the residual monomer ratio of the sample was calculated from the values of the peak area of the aggregate and the peak area of the monomer in the gel filtration chromatography. Table 1 shows the residual monomer ratio at 4 ° C for 2 months, where the residual monomer ratio in the initial state of each sample was 100%.
  • a stable high-concentration MABON-01 solution could be prepared in a citric acid or acetate buffer solution containing 300 mM NaCl at a pH of 5.0 to pH 6.0.
  • the MABON-01 solution was concentrated to prepare a high concentration solution of about 18 mg / mL. This was dialyzed against a dialysis membrane SLIDE-A-LYZER Dialysis Cassette 10000 MWCO (PIERCE), and the buffer was replaced with a solution of 20 mM citric acid, 300 mM NaCl, pH 5.5. Liquid type and pH have been optimized). This high-concentration MABON-01 solution was dialyzed against the following buffer solution 1.1 through dialysis using EasySep (TOMY) to replace the buffer solution.
  • TOMY EasySep
  • the obtained solution was recovered, the concentration of MABON-01 in each sample was unified to 18.5 mg / mL, and the sample was filled in a storage container Multiply- Safecup 0.1 ml Biosph. (SARSTEDT). Stability tests of these samples were performed at 25 ° C. The samples were evaluated in the initial state, 25 ° C-1 month, and 25 ° C-2 months. The stability of the sample was evaluated by the change (increase) in the content of the aggregate by gel filtration chromatography. Gel filtration chromatography is used as a column.
  • G4000SWxl (TOSOH) was used.
  • Stabilizing effect is recognized, including divalent aeon. 4. Stabilizing effect of Na SO is 2. NaCl
  • L-glutamic acid sodium salt which is the same ionic amino acid, is contained. 5. Although L-daltamic acid sodium salt does not show a stabilizing effect, L-glutamic acid L-glutamate is a divalent cation. Including arginine hydrochloride 6. In L-arginine hydrochloride, 3. stable equivalent to MgCl
  • the MABON-01 solution was concentrated to prepare a highly concentrated MABON-01 solution of about 19 mg / mL. This was dialyzed against the following buffer (1) to (9) using dialysis membrane EasySep (TOMY) to replace the buffer.
  • TOMY dialysis membrane EasySep
  • Stabilizing effect was obtained by adding 100 mM trehalose.
  • the MABON-01 solution was concentrated to prepare a highly concentrated MABON-01 solution of about 27 mg / mL. This was dialyzed against the following buffer (1) to (3) using the dialysis membrane EasySep (TOMY) to replace the buffer.
  • TOMY dialysis membrane EasySep
  • the obtained solution was recovered, the concentration of MABON-01 in each sample was unified to 26.8 mg / mL, and the solution was filled in a storage container Multiply-Safecup 0.1 ml Biosph. (SARSTEDT). Stability tests were performed on these samples. Samples were evaluated at initial conditions, 4 ° C-4 months and 25 ° C-4 months. The stability of the sample was evaluated by changing (increase) the content of the aggregate by gel filtration chromatography. Gel filtration chromatography used G4000SWxl (TOSOH) as a column. A solution of 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.4 was used as the mobile phase.
  • G4000SWxl TOSOH
  • the aggregate content of the sample was calculated from the values of the peak area of the aggregate and the peak area of the monomer in gel filtration chromatography.
  • Fig. 3 shows the association content of each sample in the initial state, 4 ° C-4 months and 25 ° C_4 months.
  • Tretreose which is known as a general protein stabilizer and has been shown to have a stabilizing effect on IgM during lyophilization in the Journal of Immunological Methods 1995, 181 (1), 37-43, has almost no effect. Unacceptable power (Figure 3).
  • VIVASPIN6 5000MWCO VIVASCIENCE ⁇ VS061
  • himac CF8DL Hitachi ⁇ No.
  • ArgHCl and MgCl were incubated at 50 ° C compared to NaCl at the same concentration.
  • MABON-01 50mg / mL
  • the gene encoding the H chain of the human antibody that binds to gandarioside GM3 is obtained from total RNA extracted from human B cells transformed with Epstein-Barr virus (hereinafter referred to as B cells expressing anti-gandarioside GM3 human antibody). And amplified by the RT-PCR method.
  • LMH-f3 SEQ ID NO: 7
  • LMH-r3 SEQ ID NO: 8
  • RNA was amplified by dividing it into 5 ′ end and 3 ′ end using SMART RACE cDNA Amplification Kit (manufactured by CLONTECH).
  • the synthetic oligonucleotide LMH-r3 was used for amplification of the 5 'terminal gene, and the synthetic oligonucleotide LMH- was used for amplification of the 3' terminal gene.
  • the reverse transcription reaction was performed at 42 ° C for 1 hour and 30 minutes.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below. 5 ⁇ L of 10X Advantage 2 PCR Buffer,
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the PCR product was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), agarose gel-purified, and then cloned into a pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega).
  • a fragment containing about l.lkbp obtained by digesting the vector containing the 5 'terminal gene with the restriction enzymes Apal (Takara Shuzo) and SacII (Takara Shuzo), and the 3' terminal gene The fragment containing about l.lkbp obtained by digesting the vector containing the restriction enzymes Apal (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo) is mixed, and cloned into pBluescript KS + vector (Toyobo), A full-length anti-gandarioside GM3 human antibody H chain gene was obtained.
  • LMH-fxho hybridizes with the forward primer to the 5 'end of the anti-gandarioside GM3 human antibody H chain gene, and has an Xhol restriction enzyme recognition sequence and Kozak sequence.
  • SEQ ID NO: 12 was designed to have a Sal restriction enzyme recognition sequence at the 3 ′ end of the anti-gandarioside GM3 human antibody H chain gene using a rear primer.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below. 5; z L 10 X PCR Buffer ⁇
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified gene fragment is digested with restriction enzymes Xhol (Takara Shuzo) and restriction enzyme Sail (Takara Shuzo), purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN), and digested with pUCAG restriction enzyme. It was ligated to the Xhol site and closed.
  • This vector pUCAG was ligated to a 2.6 kbp fragment obtained by digesting pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) with the restriction enzyme BamHI to the restriction enzyme BamHI site of the pUC19 vector (manufactured by Toyobo), It is a vector that has been cloned.
  • the completed plasmid was designated as pUCAG / L612H.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the anti-gandarioside GM3 human antibody H chain contained in this plasmid are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the gene encoding the light chain of the anti-gandarioside GM3 human antibody was amplified by RT-PCR using total RNA extracted from B cells expressing the anti-gandarioside GM3 human antibody. Total RNA was extracted from B cells expressing anti-gandarioside GM3 human antibody in the same manner as described above. Two oligonucleotides (LML-fl, LML-rl) were designed based on the nucleotide sequence of the anti-gandarioside GM3 human antibody gene reported by Hoon et al. (Cancer Research 1993; 53: 5244-5250).
  • LML-fl (SEQ ID NO: 9) was synthesized in the sense direction, and LML-rl (SEQ ID NO: 10) was synthesized in the antisense direction.
  • LML-fl (SEQ ID NO: 9) was synthesized in the sense direction
  • LML-rl (SEQ ID NO: 10) was synthesized in the antisense direction.
  • the gene fragment was amplified at the 5 'end and the 3' end.
  • the synthetic oligonucleotide LML-rl was used for amplification of the 5'-end gene
  • the synthetic oligonucleotide LML-fl was used for amplification of the 3'-end gene.
  • the reverse transcription reaction was performed at 42 ° C for 1 hour and 30 minutes.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below.
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the PCR product was purified by agarose gel using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN) and then cloned into a pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega).
  • LML-feco (SEQ ID NO: 13) hybridizes with the forward primer to the 5 'end of the anti-gandarioside GM3 human antibody L chain gene, and has an EcoRI restriction enzyme recognition sequence and a Kozak sequence. Number: 14) is a rear primer, anti-gandarioside GM3 human antibody Each was hybridized to the 3 'end of the L chain gene and designed to have a Notl restriction enzyme recognition sequence.
  • composition of the PCR reaction solution (50 ⁇ L) is shown below.
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified gene fragment is digested with EcoRI (Takara Shuzo) and Notl (Takara Shuzo) and then purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) to obtain pCXND3 Were ligated to EcoRI and Notl cleavage sites, and clawed.
  • a vector in which the DHFR gene expression site of pCHOI was cloned to the restriction enzyme Hindlll site of pCXN (Niwa et al., Gene 1991; 108: 193-200) was named pCXND3.
  • the L chain gene fragment was cloned into PCXND3, and the completed plasmid was named pCXND3 / L612L.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the anti-gandarioside GM3 human antibody L chain contained in this plasmid are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • a fragment of about 4.0 kbp obtained by digesting pUCAG / L612H with the restriction enzyme Hindlll (Takara Shuzo) was ligated to the restriction enzyme Hindlll cleavage site of pCXND3 / L612L. Crawling.
  • the completed plasmid was named pCXND3 / L612IgM. This plasmid expresses the neomycin resistance gene, DHFR gene and anti-gandarioside GM3 human antibody gene in animal cells.
  • the gene encoding the J chain of the anti-gandarioside GM3 human antibody was amplified by RT-PCR using total RNA extracted from B cells expressing the anti-gandarioside GM3 human antibody. Total RNA was extracted from B cells expressing anti-gandarioside GM3 human antibody in the same manner as described above.
  • Two oligonucleotides J-fl, J-rl were designed and synthesized based on the nucleotide sequence of the human antibody J chain gene registered in GenBank (GenBank number: M12759).
  • J-fl SEQ ID NO: 15
  • J-rl hybridizes to the human antibody J chain gene Exon4 in the antisense direction
  • the gene fragment was amplified at the 5 'end and the 3' end.
  • the synthetic oligonucleotide J-rl was used for amplification of the 5 'terminal gene
  • the synthetic oligonucleotide J-fl was used for amplification of the 3' terminal gene.
  • the reverse transcription reaction was performed at 42 ° C for 1 hour and 30 minutes.
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • reaction product was heated at 72 ° C for 7 minutes.
  • the PCR product was purified using a QIAquick Gel Extraction Kit (manufactured by QIAGEN), purified from agarose gel, and then cloned into a pGEM-T Easy vector (manufactured by Promega).
  • the vector containing the 5 'terminal gene was digested with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) to obtain a fragment of about 0.5 kbp, and the vector containing the 3' terminal gene was restricted.
  • EcoRI EcoRI
  • J-feco (SEQ ID NO: 17) has a forward primer, is hybridized to the 5 'end of the anti-gandarioside GM3 human antibody J chain gene, and has an EcoRI restriction enzyme recognition sequence and a Kozak sequence.
  • -rxba (SEQ ID NO: 18) was hybridized to the 3 'end of the anti-gandarioside GM3 human antibody J chain gene with a rear primer, and each was designed to have an Xbal restriction enzyme recognition sequence.
  • dNTPs 0.2 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP),
  • the reaction temperature conditions are as follows.
  • reaction product was heated at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified gene fragment was digested with restriction enzymes EcoRI (Takara Shuzo) and restriction enzyme Xbal (Takara Shuzo), purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN), and purified with pCOSII. -Ligation to EcoRI and Xbal restriction sites of Zeo
  • This vector pCOSII-Zeo removes the DHFR gene expression site of pCHOI described above,
  • the completed plasmid was designated as pCOSII-Zeo / J chain.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of the anti-gandarioside GM3 human antibody J chain contained in this plasmid are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • DG44 line a stable expression cell line using CHO cells (DG44 line) was performed as follows.
  • the gene was introduced by an electoral-portation method using Gene Pulserll (manufactured by BioRad).
  • J chain The expression of the J chain is not described below.
  • the cells subjected to electoral poration were suspended in 40 mL of a CHO-S-SFMII medium (manufactured by Invitrogen) containing HT supplement (manufactured by Invitrogen) at a 1-fold concentration. It became cloudy.
  • a 50-fold diluted solution was prepared in the same medium, and dispensed in a 96-well culture plate (100 / l / well). After culturing for 24 hours in a CO incubator (5% CO),
  • the IgM amount in the culture supernatant of the wells in which colonies of transformed cells showing Geneticin resistance were observed was measured by the concentration determination method described in Reference Example 1.6.
  • the anti-gandarioside GM3 human antibody high expression cell lines were sequentially expanded and cultured to obtain anti-gandarioside GM3 human antibody stable expression cell lines CA02, CA15, CA19, CA20, and CA24.
  • a 50-fold diluted solution was prepared in the same medium, and the solution was dispensed at 100 ⁇ l / well into a 96-well culture plate. After culturing in a CO incubator (5% CO 2) for 24 hours,
  • the measurement of the IgM concentration in the culture supernatant was performed as follows. Anti-Human IgM (manufactured by BIOSORCE) at 1 ⁇ g / ml Coating Buffer (0.1 M NaHCO, 0.02% NaN
  • Rinse Buffer 200 ⁇ L / well of Diluent Buffer was added and reacted for 1 hour or more at room temperature to block.
  • the compositions of Rinse Buffer and Diluent Buffer are as follows.
  • the culture supernatant appropriately diluted with the Diluent Buffer was collected at 100 ⁇ L / well, and allowed to react at room temperature for 1 hour.
  • Goat Anti-Human IgM, Alkaline Phosphatase conjugated was diluted 4000-fold with Diluent Buffer, diluted with 100 ⁇ L / well, and reacted at room temperature for 1 hour.
  • alkaline phosphatase substrate manufactured by SIGMA
  • SIGMA alkaline phosphatase substrate
  • BioRad spectrophotometer Benchmark Plus
  • IgM forms a multimer among immunoglobulins
  • recombinants have low expression levels and are considered difficult to prepare in large quantities.From these results, high production in CHO cells It was revealed that recombinant IgM-expressing cells could be prepared.
  • Detection was at 280 absorbance and sample injection was 10 ⁇ g.
  • Table 5 shows the aggregate peak area value and monomer peak area value (peak assignment was performed separately) of the obtained chromatogram. [0100] [Table 5]
  • Table 6 shows the calculation results of the aggregate peak area ratio and the monomer peak area ratio with respect to the total peak area value.
  • the aggregate peak area ratio and monomer peak area ratio are shown on the left of each cell.
  • the mobile phase buffer of pH 7.4 was used as compared with the analysis using the mobile phase buffer of PH 6.2-7.1.
  • the effect of salt species and salt concentration is reduced when the mobile phase buffer contains both KC1 and NaCl salts.
  • Mobile phase buffer containing KC1 compared to mobile phase buffer containing NaCl. V, it was evident that the effects of salt concentration or mobile phase pH were sometimes suppressed.
  • the mobile phase conditions for gel filtration chromatography analysis of MABON-01 were set to 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.4.
  • the mobile phase was a buffer of 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH 7.4, and the column was TSKgel G4000SW. Flow rate is 0.3 mL / min, detection is absorbance at 280 nm, sample injection volume is 113
  • the molecular weight of the resultant force was also calculated by the Debye method.
  • the average molecular weight of peak 2 was 21.5-22.0 minutes, and the average molecular weight of peak 1 was 24.5-25.0 minutes, and the average molecular weight was obtained. Since the average molecular weights of peaks 1 and 2 are close to the theoretical molecular weights of the monomer and dimer, respectively, and the average molecular weight of peak 2 is about twice the average molecular weight of peak 1, MABON is included in peak 1. -01 monomer power Peak 2 was found to contain a dimer.
  • high-concentration IgM can be stabilized in a solution.
  • a pharmaceutical preparation containing IgM as an active ingredient can be stably stored for a long period of time, the present invention can greatly contribute to the preparation of an antibody preparation in particular.

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Abstract

　塩化マグネシウムや塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いることによって、溶液におけるIgMの会合化を抑制し、IgMの安定な高濃度溶液を調製しうることを見出した。

Description

明 細 書
IgM高濃度安定ィ匕溶液
技術分野
[0001] 本発明は、 IgM高濃度安定化溶液およびその製造に関する。
背景技術
[0002] 多くの高等動物の免疫グロブリンには、 5種類の異なったクラス IgG、 IgA、 IgM, IgD 、および IgEが存在する。各クラスの免疫グロブリンは、大きさ、電荷、アミノ酸組成、糖 含量等の性状が異なっている。これらのクラスの中で、 IgMは血漿免疫グロブリン全体 の約 10%を占めている。 IgMは、複雑な抗原性を持つ細胞膜抗原、感染性微生物、あ ¾ ヽは溶解性抗原に対して産生される初期抗体の主成分である。
[0003] ヒ HgMは、通常、 5量体構造を有している。 IgMの 5量体構造を構成する 5つのサブ ユニットは、 IgGに類似した 4本鎖構造力もなつている。 IgMの H鎖である 鎖は IgGの H鎖である γ鎖とアミノ酸配列が異なる以外にも次のような相違を有する。
• μ鎖は、定常領域のドメインを、 γ鎖よりも一つ余分に持っている。
• μ鎖は、オリゴ糖鎖の数が γ鎖と比較して 4箇所多い。
[0004] IgMは、 IgGには見られない J鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。 J鎖は、 IgMが抗 体産生細胞力も分泌される前に、 μ鎖の会合を補助すると考えられている。
[0005] 近年、モノクローナル抗体技術および組換え DNA技術の発展により、純粋な免疫グ ロブリンを大量に生産することが可能になった。更に遺伝子組み換え技術は、キメラ 抗体やヒト化抗体生産を可能にした。キメラ抗体とは、可変領域を異なる種に由来す る可変領域に組み換えた構造を有する抗体である。たとえば、ヒト以外の動物種の可 変領域とヒト抗体の定常領域を有する「キメラ抗体」（非特許文献 1Z
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851)が公知である。更に、他の動物種の相補 '性決定領域 (complementarity determining regions ;CDR)をヒトイムノグロブリンに移植 したヒト化抗体も公知である (非特許文献 2ZNature (1986)321:521)。
[0006] 実際に、抗腫瘍抗体に関して列挙すると、抗 CD20ヒトキメラ抗体であるリツキサン (Rituxan:IDEC社)ゃ抗 HER2/neuヒト化抗体であるハーセプチン (Herceptin:Genentech社)が臨床試験を終了し、既に承認'販売されている。 IgGおよ び IgMのエフェクター機能として抗体依存性細胞障害活性 (以下、 ADCC活性と表記 する)や補体依存性細胞障害活性 (以下、 CDC活性と表記する）が知られて ヽる。 IgMの CDC活性は IgGと比較して高 ヽことから、 CDC活性を主薬効とする抗腫瘍抗体 となる可能性が極めて高いと思われる。しかし上述のとおり、 IgMは IgGと異なり多量体 を形成する。そのため、組換え体 IgMを工業的規模で生産することは困難であると考 えられていた。
[0007] また、 IgMは、 IgGに比べて極めて不安定であり、また溶解度が低いことから、 IgMの 高濃度且つ安定な溶液を作製することは困難である。例えば、 Cytotherapy, 2001, 3(3), 233-242 (非特許文献 5)は、 IgMの- 20°C保存においても溶解時に IgMの沈殿お よび活性低下が起こったことを報告している。また、同文献には、 IgMは保存時に会 合ィ匕および沈殿を起こしやすいことが記載されている。特に、 IgMについては、緩衝 液種と pHの最適化のみでは、医薬品としての使用に耐えうる安定性を確保するのは 困難であった。
[0008] そこで、緩衝液種と pHの最適化以外で、抗体を安定化させる種々の試みがなされ ている。例えば、 WO2002/096457 (特許文献 1)においては、酸性成分を含有する抗 体高濃度安定製剤が開示され、抗体の安定ィ匕のために MgCl、 CaCl
2 2を添加剤とし て使用している。しかし、該公報における抗体安定ィ匕は、 IgG製剤に関するものであ つて、 IgMへの言及はない。上述したように IgMは IgGと異なり多量体として存在し、本 来的に安定な IgGとは異なり会合しやす 、ために高濃度化が極めて困難であると!/、う 特有の課題がある。
[0009] また、 Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759- 764 (非特許文献 3)および Journal of
Immunological Methods, 111 (1988) 17- 23 (非特許文献 5)で、 IgMは低塩濃度下で 沈殿し、リン酸緩衝液あるいはトリス塩酸緩衝液の弱アルカリ性緩衝液かつ高塩濃度 下で再溶解することが報告されている。 Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759-764 (非特許文献 3)においては、 pH 5付近では IgMは沈殿しやすく取扱が困難なことが 述べられ、弱酸性側の緩衝液にぉ 、て IgM溶液に対しては悲観的であることが示唆 されており、したがって、 IgMの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供でき る可能性については何ら示されていない。また、本文献では、 IgMを高濃度で含有す るヒト血清を水で希釈すると euglobulin沈殿として不溶性の凝集体が生じて濁度が上 昇するが、 NaCl、 Arginine等の添カ卩により塩濃度を上げると euglobulin沈殿が再溶解 することが報告されている。しかし、本文献は euglobulin沈殿の再溶解に関するもので あり、 IgMの水溶性会合体の増加抑制に関しては何ら開示されていない。さらに、本 文献では患者血清を精製せずに用いており種々の血清タンパク質が存在するため、 生じる不溶性の凝集体には IgM以外のタンパク質が含まれる可能性があり、他のタン パク質非存在下での IgM溶液に対する効果にっ 、ては示されて 、な 、。
[0010] Journal of Immunological Methods, 111 (1988) 17-23 (非特許文献 5)では、
euglobulin沈殿の再溶解に 0.1 M Tris- HC1, 1 M NaCl, pH 8の緩衝液が用いられて いるが、 IgMの回収率は抗体あるいはバッチによって 40 %から〉90 %の範囲であり再 現性が低いと記述されている。また、方法の項で 4°Cおよび 20°Cにおいて 5-10 mg/mLの精製抗体を保存したことが記述されて ヽるが、結果の項では 20°Cにお!/ヽ て数ケ月間、機能低下なく保存できたことのみ記述されており、通常、安定性の確保 が困難な 4°Cある!/、はそれ以上の保存温度につ!ヽては何ら記載されて ヽな 、。した がって、本文献では、 IgMの高濃度溶液を医薬品あるいはその原薬として提供するた めには、沈殿再溶解の再現性の困難さと保存安定性の確保の困難さが示されている
[0011] また、 BIOTECHNOLOGY 1993, 11, 512-515 (非特許文献 4)および Journal of
Immunological Methods, 111 (1988) 17- 23 (非特許文献 5)においても、 euglobulin沈 殿である抗体の不溶性凝集体の再溶解にっ ヽて記載されて ヽるが、その溶解度は lOmg/mL以下であり、 IgMの溶解度は低い。また、水溶性の会合体の安定ィ匕につい ては何ら記載されていない。
[0012] さらに、 Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624-632 (非特許文献 6)においては 、 PVP添カ卩による IgMの安定ィ匕が開示されているが、高濃度の抗体の安定化ではなく 、また、 Journal of Immunological Methods 1995, 181(1), 37- 43. (非特許文献 7)にお いては、トレハロース添カ卩による凍結乾燥製剤が開示されている力 抗体の安定性不 十分であり、高濃度の抗体の安定ィヒに関する記載はない。 非特許文献 1 : Pro Natl.Acad.Sci.U.S.A, (1984)81:6851)
非特許文献 2 : Nature (1986)321:521)
非特許文献 3 : Clin. Chem. Lab. Med. 2000; 38(8):759- 764
非特許文献 4 : BIOTECHNOLOGY 1993, 11, 512-515
非特許文献 5 Journal of Immunological Methods, 111 (1988), 17-23
非特許文献 6 Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624-632
非特許文献 7 Journal of Immunological Methods 1995, 181, 37-43
非特許文献 8 : Cytotherapy, 2001, 3(3), 233-242
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、高濃度の IgM を溶液中にて安定ィ匕させることにある。より詳しくは、本発明は、高濃度の IgMを安定 化する方法、高濃度の IgMが安定化された溶液およびその製法を提供することを目 的とする。
[0014] 高濃度の IgMが安定ィ匕された溶液の好ま U、態様にぉ 、ては、水溶性の会合体増 加が抑制されている水溶液を提供する。他の好ましい態様においては、医薬品とし ての使用に耐えうる安定性を有する IgM高濃度製剤を提供する。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行なった結果、塩化マグネシウム や塩酸アルギニン等の多価カチオン性のイオンを含む化合物を添加物として用いる こと〖こよって、溶液における IgMの会合ィ匕を抑制し、 IgMの安定な高濃度溶液を調製 しうることを見出した。
[0016] 即ち、本発明は、高濃度の IgMを安定ィ匕する方法、高濃度の IgMが安定ィ匕された溶 液およびその製法に関し、より詳しくは、下記発明を提供するものである。
(1) 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液であって、免疫グロブリンが IgMで ある溶液。
(2) IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（1)に記載の溶液。 (3) 水性溶液である、（1)に記載の溶液。
(4) 医薬品製剤である、（1)に記載の溶液。
(5) 多価カチオン性イオンを含有する、（1)に記載の溶液。
(6) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有する、（5)に記載の溶液
(7) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、 (5)に記載の溶液。
(8) さらに糖類を含有する、（5)に記載の溶液。
(9) pHが 5— 8である、（1)に記載の溶液。
(10) IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（1)に記載の溶 液。
(11) IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（1)に記載の溶液。
(12) (1)から（11)に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。
(13) 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グ ロブリンが IgMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
(14) 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（13)に記載の方法。
(15) 溶液が水性溶液である、（13)に記載の方法。
(16) 溶液が医薬品製剤である、（13)に記載の方法。
(17) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多 価カチオン性イオンを添加する、（13)に記載の方法。
(18) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、（13)に記載の方 法。
(19) さらに糖類を添加する、（13)に記載の方法。
(20) 溶液の pHが 5— 8である、（13)に記載の方法。
(21) 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（13)に 記載の方法。
(22) 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（13)に記載の方法。
(23) (a) (13)から（22)のいずれかの方法を実施する工程、
(b)工程 (a)により安定化された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医 薬品製剤の安定化方法。
(24) 高濃度の免疫グロブリンが安定化された溶液を製造する方法であって、免疫 グロブリンが IgMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
(25) 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、（24)に記載の方法。
(26) 溶液が水性溶液である、 (24)に記載の方法。
(27) 溶液が医薬品製剤である、（24)に記載の方法。
(28) 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多 価カチオン性イオンを添加する、 (24)に記載の方法。
(29) 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、 (24)に記載の方 法。
(30) さらに糖類を添加する、（24)に記載の方法。
(31) 溶液の pHが 5— 8である、（24)に記載の方法。
(32) 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、（24)に 記載の方法。
(33) 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、（24)に記載の方法。
(34) (24)から（33)の ヽずれかの方法により製造された溶液。
(35) (a) (24)から（33)のいずれかの方法を実施する工程、
(b)工程 (a)により製造された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬 品製剤の製造方法。
図面の簡単な説明
[図 1]各サンプルにおける 25°C-1ヶ月、及び、 25°C-2ヶ月の会合体含有率から初期 状態における会合体含有率を差し引いた値を Δ aggregateとして示す図である。
[図 2]各サンプルの初期状態、 4°C-3ヶ月における会合体含有率を示す図である。
[図 3]各サンプルの初期状態、 4°C-4ヶ月、 25°C-4ヶ月における会合体含有率を示す 図である。
[図 4]各サンプルの初期状態、液体 Z40°C-8日、液体 Z40°C-8日 +4°C-3日、凍結乾 燥 Z40°C-8日、凍結乾燥 Z40°C-8日 +4°C-3日、凍結乾燥 Z40°C-8日 +4°C-3日 +再 凍結乾燥 Z50°C-8日における SEC会合体含有率％を示す図である。 [図 5]各サンプルの初期状態、凍結乾燥 Z40°C-2ヶ月における SEC会合体含有率％ を示す図である。
[図 6]MABON- 01の GPC- MALLS分析により得られたクロマトグラムおよび算出された 分子量を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明にお 、て「IgM」とは H鎖の定常領域として μ鎖の定常領域を有し、かつ 5量 体または 6量体の構造を持つィムノグロブリンを言う。一方、本発明における IgMを構 成する可変領域の由来は限定されない。したがって、 鎖由来の可変領域に加えて 、 IgG由来の可変領域やその部分構造を含むことができる。可変領域の部分構造とし ては、フレームワークや CDRを示すことができる。なお本発明における IgMは、形質転 換細胞に導入された外来性の IgM遺伝子の発現産物を言う。
[0019] さらに、本発明の IgMを構成する定常領域が由来する動物種も限定されない。つま り本発明の IgMは、 IgMタイプのィムノグロブリンを有するあらゆる動物種に由来する IgM定常領域を含む。 IgMを体内への投与に用いる場合には、少なくともその定常領 域は、投与対象となる種と同じ種に由来することが望ましい。したがって、ヒトへの投 与を目的とする場合には、少なくとも定常領域がヒト由来であることが望ましい。ヒト由 来の定常領域と、他の動物種、あるいはヒト由来であるが他の個体に由来する可変 領域とで構成される IgMは、キメラ抗体と呼ばれる。定常領域に加えて、可変領域の フレームワークもヒト由来とした IgMは、ヒトへの投与用の IgMとして更に好ましい IgMで ある。可変領域のフレームワークの構造を維持し、 CDRのみを他の動物種の抗体と 組み換えられた抗体は、ヒト化抗体と呼ばれて ヽる。
[0020] 本発明において「高濃度の免疫グロブリン (IgM)」とは、溶液中の IgMの含有量が lmg/mLより高濃度であることを意味する。本発明の溶液は、 IgMの含量が lmg/mL— 200mg/mLであることが好ましい。本発明によれば、 10mg/mLより高濃度（例えば、 20mg/mL以上、 25mg/mL以上、 40mg/mL以上、 50mg/mL以上）であっても、 IgMの安 定ィ匕を図ることができる。
[0021] 本発明にお 、て、水溶性会合体の増加を抑制する場合は、多価カチオン性イオン を添加することが好ましい。本発明において使用できる「多価カチオン性イオン」は、 2 価以上のカチオン性イオンであり、例えば、 Mg++、 Ca++、 Zn++、 Fe++、塩基性ァミノ 酸等を使用することができる。塩基性アミノ酸としては、例えば、 Arginine, Lysine, L- リジン L-グルタミン酸塩（L- Lysine L- Glutamate)、 L -アルギ-ン L-グルタミン酸塩（ L-Arginine L-Glutamate)等を使用することができる。好ましい多価カチオン性イオン としては、 Mg++又は Arginineが挙げられる。本発明において使用できる「多価カチォ ン性イオン」を除くカチオン性イオンとしては、 1価のカチオン性イオンであり、例えば Na+、 K+が挙げられる。
[0022] 溶液に添加されるカチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンの濃度は、通常 、 ImM— lOOOmMであり、好ましくは 10mM— 500mMであり、さらに好ましくは 50mM— 200mMである。
[0023] 本発明の溶液は、カチオン性イオンあるいは多価カチオン性イオンにカ卩えて、糖類 を含有してもよい。好ましい糖類としては、トレハロース、スクロース、ソルビトールを挙 げることができる。
[0024] 本発明にお 、て使用できる緩衝液種としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液 、クェン酸緩衝液が挙げられる。
[0025] 本発明における「安定化」とは、保存中に生じる水溶性の IgM会合体の増加を抑制 すること、及び Z又は、保存中に生じる不溶性の IgM会合体 (沈殿物）の増加を抑制 すること及び Z又は、水溶性の IgMの機能を保持していることをいい、好ましくは、保 存中に生じる水溶性の IgM会合体の増加を抑制することを 、う。
[0026] 本発明における「水溶性の会合体」とは、 IgMの 2量体、 3量体などの多量体で水溶 性のものをいう。水溶性の会合体は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーで検出する ことができる。 IgM高濃度溶液の安定化は、例えば、次の式により求まる会合体増加 抑制率により測定することができる。
会合体増加抑制率 =(A-B)/AX 100
A：多価カチオン性イオンを添加しな 、IgM高濃度溶液 (コントロール)の会合体増加 率
B：多価カチオン性イオンを添加した IgM高濃度溶液 (被験試料)の会合体増加率 [0027] 本発明の溶液は、高濃度の IgMを含有する溶液に多価カチオン性イオンを添加し てから 1ヶ月後の会合体増加抑制率力 好ましくは 10%以上、より好ましくは 30%以上、 さらに好ましくは 50%以上、更に好ましくは 80%以上のものである。
[0028] 本発明の溶液は、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を含有しない溶液であること が好ましい。さらに好ましくは、 IgM以外のタンパク質であって、安定化剤としての効 果を示し得る量以上のタンパク質を含有しな 、溶液である。本願の溶液が医薬品製 剤である場合は、 IgM以外のヒト由来のタンパク質であって、医薬品の原薬及び Z又 は医薬品として許容される量以上のタンパク質を含有しない溶液であることが好まし い。
[0029] 本発明の医薬品製剤の剤形に特に限定はなぐ任意の剤形とすることが可能であ る。剤形としては、例えば、溶液製剤、凍結乾燥製剤を挙げることができる。また、溶 液製剤としては、冷所保存製剤、常温保存製剤、凍結製剤などが挙げられる。また、 本発明の医薬品製剤の投与ルートにも限定はなぐ任意の投与ルートを用いることが 可能である。したがって、医薬品製剤の使用目的に応じて、経口、非経口投与のい ずれでもありうる。
[0030] 非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤 型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注 射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与するこ とがでさる。
[0031] 本発明の方法により、安定ィ匕した IgMは、それ自体を直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化した薬剤として投与することもできる。例えば、水も しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の 形で使用できる。また、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には 、滅菌水や生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、べヒクル、防腐剤な どと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で 混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量 は、指示された範囲の適当な容量が得られるように調節することができる。
[0032] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実 施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブ ドウ糖やその他の補助剤を含む等張液などが利用される。補助剤には、具体的には 、例えば、スクロース、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウ ム等を利用することができる。医薬組成物には、適当な溶解補助剤を加えることもで きる。例えばアルコールや非イオン性界面活性剤は、溶解補助剤として好ましい。ァ ルコールとしては、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコ ール、ポリエチレングリコール等を示すことができる。また非イオン性界面活性剤とし ては、例えば、ポリソルベート 80、ポリソルベート 20、ポロキサマー 188、あるいは HCO- 50などを用いることができる。また、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等の陽イオン性界面 活性剤も使用できる。
[0033] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸 ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジルアル コール、フエノール、酸ィ匕防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当 なバイアルある 、はアンプルに充填される。
[0034] 本発明の溶液を医薬品製剤とする場合は、 pH5— 8であることが好ましぐ特に好ま しくは pH5— 7である。
[0035] 医薬品製剤は、対象疾患、患者の年齢、症状により適宜投与量を選択することがで きる。例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可 能である。あるいは、例えば、患者あたり 0.001— 100000mg/bodyの範囲で投与量を 選ぶことができる。し力しながら、本発明の医薬品製剤はこれらの投与量に制限され るものではない。その他、本発明の溶液製剤等の調製に関しては、 WO2002/096457 を参照のこと。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0036] 以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
[実施例 1] 以下の実施例では、 IgMとして、参考例 1で作製した組換え型抗ガンダリオシド GM3ヒ ト抗体（以下、「MABON- 01」という）を使用した。 MABON- 01溶液を濃縮し、約 9 mg/mLの高濃度溶液を調製した。これを透析膜 SLIDE-A- LYZER Dialysis Cassette 10000MWCO (PIERCE)により透析を行い、以下の 1.一 6.の緩衝液に透析し、緩衝液 置換を行った。
1. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.0 I酢酸塩 pH5.01.
2. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.5 I酢酸塩 pH5.52.
3. 20mM酢酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH6.0 I酢酸塩 pH6.03.
4. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.0 /タエン酸塩 pH5.04.
5. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH5.5 /タエン酸塩 pH5.55.
6. 20mMクェン酸ナトリウム、 300mM NaCl、 pH6.0 /タエン酸塩 pH6.01.
[0037] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 8.4 mg/mLに統一し、 保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプル の安定性試験を 4°Cで実施した。サンプルは初期状態、 4°C-2ヶ月で評価した。サン プルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる単量体残存率の変化により評価 した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過 クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の単量体 残存率を算出した。各サンプルの初期状態における単量体残存率を 100%とし、 4°C -2ヶ月の単量体残存率を表 1に示した。
[0038] [表 1] 残存率 ％
PH 酢酸塩 クェン酸塩
5.0 99.33 99.16
5.5 99.51 99.3
6.0 98.92 98.9
[0039] これより、 300mM NaClを含む pH5.0— pH6.0のクェン酸あるいは酢酸緩衝液におい て、安定な高濃度 MABON-01溶液を調製することができた。
[0040] 以下の実施例において、クェン酸緩衝液を用いた pH5.5の溶液に多価カチオンを 添加することでさらに水溶性の会合体の増加を抑制し安定ィ匕した高濃度 MABON-01 溶液を示す。
[0041] [実施例 2]
MABON-01溶液を濃縮し、約 18 mg/mLの高濃度溶液を調製した。これを透析膜 SLIDE- A-LYZER Dialysis Cassette 10000MWCO (PIERCE)により透析を行い、 20 mMクェン酸， 300 mM NaCl, pH 5.5の溶液に緩衝液置換を行った（添加物なしの状 態では、緩衝液種、 pHを最適化してある）。この高濃度 MABON-01溶液を以下の 1. 一 9.の緩衝液に透析 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩衝液置換を行った。
1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.5 Iなし
2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 900 mM NaCl, pH5.5 I NaCl
3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.5
2 I MgCl
2
4. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM Na SO , pH5.5
2 4 I Na SO
2 4
5. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM L-グルタミン酸ナトリウム塩， pH 5.5 I L-グルタミン酸ナトリウム塩
6. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩， pH 5.5
I L-アルギニン塩酸塩
7. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 100 mM N-ァセチルトリプトフアンナトリ ゥム塩， pH5.5 I N-ァセチルトリプトファンナトリウム塩
8. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 10mM尿素， pH 5.5 I尿素
9. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, lOOmMトレハロース， pH 5.5 Iトレハロ ース
[0042] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 18.5 mg/mLに統一し、 保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプル の安定性試験を 25°Cで実施した。サンプルは初期状態、 25°C-1ヶ月、及び、 25°C-2 ヶ月で評価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有 率の変化 (増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、
G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶 液を移動相として使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体 ピーク面積の値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの 25°C-1ヶ月、及 び、 25°C-2ヶ月の会合体含有率から初期状態における会合体含有率を差し引いた 値を Δ aggregateとして、図 1に示した。
[0043] その結果、 1.なし (300mM NaClを含む)に比べて、 2. NaCl(900mM NaClを含む)は 会合体の増加が抑制された。これより、 NaCl濃度を高くすることによって、会合体の増 加を抑制できることが分力つた。
[0044] 一方、 2. NaCl(900mM NaClを含む)、 3. MgCl (300mM NaCl+200mM MgClを含む）
2 2
、 4. Na SO (300mM NaCl+200mM Na SOを含む)において、これらは同じイオン強度
2 4 2 4
(いずれもイオン強度 0.9M)であるにも関わらず、 2価のカチオンを含む MgClは著し
2 い安定ィ匕効果が認められ、 2価のァ-オンを含む 4. Na SOの安定化効果は 2. NaCl
2 4
と同程度であった。
[0045] また、同じイオン性のアミノ酸である L-グルタミン酸ナトリウム塩を含む 5. L-ダルタミ ン酸ナトリウム塩では安定ィ匕効果が認められないにも関わらず、 2価のカチオンである L-アルギニン塩酸塩を含む 6. L-アルギニン塩酸塩では、 3. MgClと同等の安定ィ匕
2
効果が認められた。
[0046] このような結果から、 NaCl等の塩をカ卩ぇイオン強度を高くすることによって、会合体 を抑制できることが分力つた。さらに、同じイオン強度においても、 2価のカチオンであ るマグネシウムイオンやアルギニンを用いることによってさらに高い会合体抑制効果 が得られることが分かった。一方、 2価のァ-オンである硫酸イオンやグルタミン酸で は高い会合体抑制効果が得られない。すなわち、マグネシウムイオンやアルギニン 等の 2価のカチオンが MABON- 01と相互作用することで、 MABON- 01の会合化を著 しく抑制し、安定な高濃度溶液を調製することが出来た。
[0047] [実施例 3]
MABON-01溶液を濃縮し、約 19 mg/mLの MABON- 01高濃度溶液を調製した。これ を以下の 1.一 9.の緩衝液に透析膜 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩衝液置換を 行った。
1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.51.
2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 10 mM MgCl , pH5.52. 3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 50 mM MgCl , pH5.53.
2
4. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.54.
2
5. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , lOOmMトレハロース，
2
pH5.55.
6. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 10 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.56.
7. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 50 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.57.
8. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 pH5.58.
9. 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM NaCl, 100 mM L-アルギ-ン塩酸塩、 lOOmMト レノヽロース、 PH 5.5
[0048] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 18.9 mg/mLに統一し、 保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプル の安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、 4°C-3ヶ月で評価した。サンプルの 安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変化 (増加）により評価 した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相として使用した。ゲルろ過 クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の値より、試料の会合体 含有率を算出した。各サンプルの初期状態、 4°C-3ヶ月における会合体含有率を図 2 に示した。
[0049] その結果、 MgClと L-アルギニン塩酸塩の濃度依存的に会合体抑制効果が見られ
2
た。すなわち、 MgClと L-アルギニン塩酸塩の濃度を高くすることによって、大きな安
2
定ィ匕効果が得られた。さらに、トレハロース単独では安定ィ匕効果がないものの（実施 例 2及び実施例 4) 200 mM MgClあるいは 100 mM L-アルギニン塩酸塩存在下に
2
100 mM trehaloseを添加することによって、安定化効果が得られた。
[0050] [実施例 4]
MABON- 01溶液を濃縮し、より高濃度の約 27 mg/mLの MABON- 01高濃度溶液を調 製した。これを以下の 1.一 3.の緩衝液に透析膜 EasySep (TOMY)を用いて透析し、緩 衝液置換を行った。
1. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, pH5.5 Iなし 2. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, 200 mM MgCl , pH5.5 I MgCl
2 2
3. 20 mMクェン酸ナトリウム， 300 mM NaCl, lOOmMトレハロース， pH 5.5 Iトレハロ ース
[0051] 得られた溶液を回収し、各サンプルの MABON- 01の濃度を 26.8 mg/mLに統一し、 保存容器 Multiply- Safecup 0.1ml Biosph.(SARSTEDT)に充填した。これらのサンプル の安定性試験を実施した。サンプルは初期状態、 4°C-4ヶ月および 25°C-4ヶ月で評 価した。サンプルの安定性は、ゲルろ過クロマトグラフィーによる会合体含有率の変 ィ匕（増加）により評価した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、 G4000SWxl (TOSOH)を用いた。 50 mMリン酸ナトリウム， 500 mM KC1, pH 7.4の溶液を移動相と して使用した。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の 値より、試料の会合体含有率を算出した。各サンプルの初期状態、 4°C-4ヶ月および 25°C_4ヶ月における会合体含有率を図 3に示した。
[0052] その結果、 4°Cと 25°Cにおいて、ともに MgClの安定ィ匕効果が認められた。一方、
2 一 般的なタンパク質の安定化剤として知られ、 Journal of Immunological Methods 1995, 181(1), 37-43において凍結乾燥時の IgMの安定化効果が認められている trehalose に関しては、ほとんど効果が認められな力つた（図 3)。
[0053] [実施例 5]
ぐ準備 >
「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl, pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMク ェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCU pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMタエン酸ナ トリウム、 180 mM MgCl、 pH5.5、 5%スクロース」において MABON- 01の大規模な透
2
析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。 VIVASPIN6 5000MWCO (VIVASCIENCEゝ VS061)を用いて、 himac CF8DL (Hitachiゝ No.
SZGEQ054)により 3000 rpmで遠心を行った。濃縮および回収後、 UV吸光度（ ε = 1.40)で濃度を測定した。次いで、緩衝液を用いてサンプルを 48.4 mg/mLに希釈し た。さら〖こ 1%ポリソルベート 80溶液を加え、 0.01%ポリソルベート製剤を得た。上記サ ンプルをそれぞれ 500 μ Lずつ 5 mLガラスバイアルに充填し、それぞれ 30 μ Lずつ Multiply-Safecup 0.1 ml Biosph. (SARSTEDT)に充填した。下記の条件において、 5 mLガラスバイアルを凍結乾燥した。初期サンプルとして 1 mg/mL MABON- 01を使 用し、分析時まで 4°Cで保管した。
[表 2] 温度 C】 時間 [hr]
-50 24
-20 0.02
-20 18
23 2.5
23 28
30 0.25
30 10
1=1 B l 82.77
[0055] く実験の条件〉
"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルべ ート 80"
"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソル ベー卜 80"
"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM MgCl
2、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルべ ート 80"
MABON- 01： 48.4 mg/mL
溶液/ 40°C- 8日
溶液/ 40°C-8日 +4°C-3日
凍結乾燥/ 40°C-8日
凍結乾燥/ 40°C-8日 +4°C-3日（再溶解後）
凍結乾燥/ 40°C-8日 +4°C-3日（再溶解後) +再凍結乾燥/ 50°C-8日
[0056] 〈分析〉
インキュベーション後、希釈溶液（1/50希釈溶液: 4+296 L)力も一 lmg/mLを用い て SECによって 10 μ Lを分析した。「50 mMクェン酸ナトリウム、 500 mM KC1、 pH7.4j を移動相（流量 0.3 ml/分、 280 nmまたは 220 nmで検出）として使用し、 G4000SWxl (TOSOH)によって SEC分析を行った（図 4)。
同濃度の NaClに比べて、 ArgHClおよび MgClは、 50°Cでインキュベーションされて
2
いる間も、凍結乾燥の安定ィ匕効果が高力つた。
[0057] [実施例 6]
ぐ準備 >
「50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl、 pH5.5、 5%スクロース」または「50 mMク ェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCU pH5.5、 5%スクロース」において MABON- 01の大 規模な透析を行った。透析後、フィルター遠心法によって溶液を濃縮した。
VIVASPIN6 5000MWCO (VIVASCIENCEゝ VS061)を用いて、 himac CF8DL (Hitachi 、 No. SZGEQ054)により 3000 rpmで遠心を行った。濃縮および回収後、 UV吸光度（ ε = 1.40)で濃度を測定した。さら〖こ、 1%ポリソルベート 80溶液を加え、 0.01%ポリソ ルベート製剤を得た。また、サンプルを希釈し、 50 mg/mL製剤を得た。上記のサンプ ルをそれぞれ 300 L、 3本の 5 mLガラスバイアルに充填した。下記の条件において 5 mLガラスバイアルを凍結乾燥した。凍結乾燥製剤は初期サンプルとして、分析時 まで 4°Cで保管した。
[0058] [表 3] 温度 c】 時間 [hr]
-50 24
-20 0.02
-20 18
23 2.5
23 28
30 0.25
30 10
口 PT 82.77
[0059] く実験の条件〉
"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM NaCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソルべ ート 80"
"50 mMクェン酸ナトリウム、 180 mM ArgHCl、 pH5.5、 5%スクロース、 0.01%ポリソル ベー卜 80"
MABON-01： 50mg/mL
凍結乾燥/ 40°C_2ヶ月
[0060] 〈分析〉
インキュベーション後、希釈溶液（1/50希釈溶液: 4+296 L)力らー lmg/mLを用い て SECによって 10 μ Lを分析した。「50 mMクェン酸ナトリウム、 500 mM KC1、 pH7.4」 を移動相（流量 0.3 ml/分、 280 nmまたは 220 nmで検出）として使用し、 G4000SWxl ( TOSOH)によって SEC分析を行った（図 5)。
40°C-2ヶ月の長期加速試験でも、同濃度の NaClに比べて、 ArgHClは高い安定ィ匕 効果を示した。
[0061] [参考例 1]ガンダリオシド GM3に対する組換え型ヒト抗体の作製
1.1 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子の構築
ガンダリオシド GM3に結合するヒト抗体の H鎖をコードする遺伝子は、 Epstein-Barrゥ ィルスで形質転換されたヒト B細胞（以下、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞と 表記する）より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。
[0062] Total RNAは、 RNeasy Plant Mini Kits (QIAGEN社製）を用いて 1 X 107細胞の抗ガ ングリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出した。 Hoonらが報告して 、る抗ガンダリ オシド GM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Cancer Research 1993 ;53 : 5244- 5250)に基 づいて、 2本のオリゴヌクレオチド（LMH-f3、 LMH-r3)を設計した。 LMH-f3 (配列番 号： 7)はセンス方向で、 LMH-r3 (配列番号： 8)はアンチセンス方向でそれぞれ合成 した。 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit ( CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LMH-r3を用い、 3'末端側遺伝子の 増幅は合成オリゴヌクレオチド LMH- を用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間 反応させた。
[0063] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。 5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix、
(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）
2.5 Lの逆転写反応産物、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LMH- βまたは LMH- r3
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回
94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復
94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復
最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。
[0064] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル 力 精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。塩基配 列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 Apal (宝酒造社製)及び SacII (宝酒造社製)で消化して得られる約 l.lkbpの断片、および 3'末端側遺伝子を 含むベクターを制限酵素 Apal (宝酒造社製)及び Notl (宝酒造社製)で消化して得ら れる約 l.lkbpの断片を混合し、 pBluescript KS +ベクター（東洋紡社製）へクローニン グし、完全長抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子を得た。
[0065] 動物細胞発現用ベクターへクローニングするために、合成オリゴヌクレオチド
LMH-fxho, LMH-rsalを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。 LMH-fxho (配列番 号： 11)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子の 5'末端にハイ ブリダィズし、かつ Xhol制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、また LMH-rsal (配列番号： 12)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝 子の 3'末端にノ、イブリダィズし、 Sal淛限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計し た。
[0066] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。 5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
ImM MgSO、
4
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—
(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖遺伝子を含む pBluescript KS + ベクター
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LMH- fxho、 LMH- rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 2分間、
94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0067] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 Xhol (宝酒造社製)および制限酵素 Sail (宝酒造 社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精製 し、 pUCAGの制限酵素 Xhol部位に連結し、クローユングした。本ベクター pUCAGは、 pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108 : 193-200)を制限酵素 BamHIで消化して得られる 2.6kbpの断片を pUC19ベクター (東洋紡社製)の制限酵素 BamHI部位に連結し、クロ 一ユングしたベクターである。完成したプラスミドを pUCAG/L612Hと命名した。本プラ スミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 H鎖の塩基配列およびアミノ酸配列を 配列番号： 1及び配列番号： 2に示す。
[0068] 1.2 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の構築
抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の L鎖をコードする遺伝子は抗ガンダリオシド GM3ヒト 抗体発現 B細胞より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。 Total RNAは、上記と同様にして抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出し た。 Hoonらが報告している抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列（Cancer Research 1993 ;53 : 5244- 5250)に基づいて、 2本のオリゴヌクレオチド（LML- fl、 LML-rl)を設計した。 LML-fl (配列番号： 9)はセンス方向で、 LML-rl (配列番号： 1 0)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。 [0069] 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (
CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド LML-rlを用い、 3'末端側遺伝子の増 幅は合成オリゴヌクレオチド LML-flを用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反 応させた。
[0070] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）
2.5 Lの逆転写反応産物、
1 Opmoleの合成オリゴヌクレオチド LML-flまたは LML- r 1
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間、
94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復
94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復、
94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復
最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。
[0071] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル 力 精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。塩基配 列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消 化して得られる約 0.7kbpの断片、および 3'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 0.9kbpの断片を混合し、合成オリゴヌタレ ォチド LML-feco、 LML-rnotを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。 LML-feco ( 配列番号： 13)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の 5'末 端にハイブリダィズし、かつ EcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つよう に、また LML-rnot (配列番号： 14)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖遺伝子の 3'末端にハイブリダィズし、 Notl制限酵素認識配列を持つようにそれぞ れ設計した。
[0072] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
ImM MgSO、
4
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—
(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製）
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド LML- feco、 LML- rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 2分間
94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0073] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Notl (宝酒 造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精 製し、 pCXND3の制限酵素 EcoRIおよび Notl切断部位に連結し、クローユングした。
[0074] 本ベクター pCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。 DHFR- Δ
E-rvH- PMl-f (W092/19759参照）の抗体 H鎖遺伝子とベクターを分割するために、 制限酵素 EcoRI/Smal部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、
EcoRI- Notl- BamHI adaptor (宝酒造社製）をクローユングした。このベクターを pCHOI と命名した。
[0075] pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を pCXN (Niwaら、 Gene 1991； 108： 193-200)の制 限酵素 Hindlll部位にクローユングしたベクターを pCXND3と命名した。また、 L鎖遺伝 子断片を PCXND3にクローユングし、完成したプラスミドを pCXND3/L612Lと命名した 。本プラスミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 L鎖の塩基配列及びアミノ酸配 列を配列番号： 3および配列番号： 4に示す。 [0076] 1.3 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の発現ベクターの構築
抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現ベクターを作製するために、 pUCAG/L612Hを制 限酵素 Hindlll (宝酒造社製）で消化して得られる約 4.0kbpの断片を pCXND3/L612L の制限酵素 Hindlll切断部位に連結し、クローユングした。完成したプラスミドを pCXND3/L612IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝 子、 DHFR遺伝子、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体遺伝子を発現する。
[0077] 1.4 抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖遺伝子および発現ベクターの構築
抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の J鎖をコードする遺伝子は抗ガンダリオシド GM3ヒト 抗体発現 B細胞より抽出した Total RNAを用いて、 RT-PCR法によって増幅した。 Total RNAは、上記と同様にして抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現 B細胞より抽出し た。 GenBankに登録されているヒト抗体 J鎖遺伝子の塩基配列（GenBank番号： M12759)に基づいて、 2本のオリゴヌクレオチド (J-fl、 J-rl)を設計し、合成した。 J-fl (配列番号： 15)はセンス方向でヒト抗体 J鎖遺伝子 Exon3にハイブリダィズし、 J-rl ( 配列番号： 16)はアンチセンス方向でヒト抗体 J鎖遺伝子 Exon4にハイブリダィズする
[0078] 1 μ gの Total RNAを使用して、 SMART RACE cDNA Amplification Kit (
CLONTECH社製)を用い 5'末端側と 3'末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。 5' 末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチド J-rlを用い、 3'末端側遺伝子の増幅 は合成オリゴヌクレオチド J-flを用いた。逆転写反応は 42°Cで 1時間 30分間反応させ た。
[0079] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 μ Lの 10 X Advantage 2 PCR Buffer,
5 μ Lの 10 X Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1 μ Lの Advantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分は!、ずれも CLONTECH社製）
2.5 Lの逆転写反応産物、
1 Opmoleの合成オリゴヌクレオチド J- flまたは J- r 1 また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 30秒間
94°C/5秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復
94°C/5秒間、 70°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 5回反復
94°C/5秒間、 68°C/10秒間、 72°C/3分間のサイクルを 25回反復
最後に反応産物を 72°Cで 7分間加熱した。
[0080] PCR産物は QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製）を用いて、ァガロースゲル 力ら精製した後、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）へクローユングした。
[0081] 塩基配列決定の後、 5'末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素 EcoRI (宝酒造社 製)で消化して得られる約 0.5kbpの断片、および 3'末端側遺伝子を含むベクターを制 限酵素 EcoRI (宝酒造社製)で消化して得られる約 l.Okbpの断片を混合し合成オリゴ ヌクレオチド J-feco、 J-rxbaを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。
[0082] J-feco (配列番号： 17)は前方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖遺伝子 の 5'末端にノ、イブリダィズし、かつ EcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を 持つように、また J-rxba (配列番号： 18)は後方プライマーで抗ガンダリオシド GM3ヒト 抗体 J鎖遺伝子の 3'末端にハイブリダィズし、 Xbal制限酵素認識配列を持つようにそ れぞれ設計した。
[0083] PCR反応溶液 (50 μ L)の組成を次に示す。
5 ;z L 10 X PCR Bufferゝ
ImM MgSO、
4
0.2mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)、
1ユニットの DNAポリメラーゼ KOD— Plus—
(以上の成分は!、ずれも東洋紡社製）
5'末端側遺伝子断片、
3'末端側遺伝子断片、
lOpmoleの合成オリゴヌクレオチド J- feco、 J-rxba
また反応温度条件は次のとおりである。
94°Cの初期温度にて 2分間 94°C/15秒間、 60°C/30秒間、 68°C/2分間のサイクルを 30回反復
最後に反応産物を 72°Cで 5分間加熱した。
[0084] 増幅した遺伝子断片は、制限酵素 EcoRI (宝酒造社製)および制限酵素 Xbal (宝酒 造社製）で消化した後に、 QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社製）を用いて精 製し、 pCOSII- Zeoの制限酵素 EcoRIおよび Xbal切断部位に連結し、クローユングした
[0085] 本ベクター pCOSII-Zeoは、上述の pCHOIの DHFR遺伝子発現部位を除去し、
Zeocin耐性遺伝子発現部位をクローユングしたベクターである。完成したプラスミドを pCOSII-Zeo/J chainと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体 J鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号： 5および配列番号： 6に示す。
[0086] 1.5 動物細胞を用いた抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体の発現
CHO細胞 (DG44株）を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。 Gene Pulserll (BioRad社製）を用いたエレクト口ポレーシヨン法により遺伝子導入した。
[0087] J鎖を発現しな!ヽ細胞株の遺伝子導入につ!、て以下に述べる。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体発現ベクター pCXND3/L612IgM (25 μ g)と PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 107細胞/ ml)の 0.75mlを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した 後に 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを与えた。
[0088] 室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen社製）を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen社製） 40mLに懸濁した。同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プレート〖こ 100 1/ゥエルで分注した。 COインキュベーター（5%CO )で 24時間培養後、
2 2
Geneticin (Invitrogen社製）を 0.5mg/mLになるように添カ卩して 2週間培養した。
[0089] Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたゥエルの培養上清中 の IgM量にっ 、て参考例 1.6に示す濃度定量法で測定した。抗ガンダリオシド GM3ヒト 抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞 株 CA02、 CA15、 CA19、 CA20、および CA24を得た。
[0090] また、 J鎖を発現する細胞株の遺伝子導入につ!、て以下に述べる。抗ガンダリオシ ド GM3ヒト抗体発現ベクター pCXND3/L612IgM (25 μ g)および J鎖発現ベクター pCOSII- Zeo/J chain (20 μ g)と PBSに懸濁した CHO細胞（1 X 107細胞/ ml)の 0.75mlを 混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに移した後に 1.5kV、 25 μ FDの容量 にてノ レスを与えた。
[0091] 室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を、 HT supplement (Invitrogen社製）を 1倍濃度で含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen社製） 40mLに懸濁した。
[0092] 同様の培地で 50倍希釈溶液を作製し、 96ゥエル培養用プレートに 100 μ 1/ゥエルで 分注した。 COインキュベーター（5%CO )で 24時間培養後、 0.5mg/mL濃度の
2 2
Geneticin (Invitrogen社製）および 0.6mg/mL濃度の Zeocin (Invitrogen社製）を添カロし て 2週間培養した。 Geneticin, Zeocin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察さ れたゥエルの培養上清中の IgM量について参考例 1.6に示す濃度定量法で測定した 。抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞株（CJ15、 CJ25、 CJ38、 CJ45、 CJ67)を得た。
[0093] 1.6 培養上清中の IgM濃度の測定
培養上清中の IgM濃度の測定は以下のように行った。 Anti-Human IgM ( BIOSORCE社製）を 1 μ g/mlになるように Coating Buffer (0.1M NaHCO、 0.02%NaN
3
)で希釈し、 96ゥエル ELISA用プレートに 100 μ 1/ゥエルでカ卩え、 4°Cで 24時間以上反
3
応させ、コーティングを行った。
[0094] さらに、 Rinse Bufferで洗浄した後に、 200 μ L/ゥエルの Diluent Bufferをカ卩え、室温 で 1時間以上反応させ、ブロッキングした。 Rinse Bufferおよび Diluent Bufferの組成は それぞれ次のとおりである。
Rinse Buffer:
PBS (-)、
0.05% Tween20
Diluent Buffer:
50mM Tris、
ImM MgCl、
2
0.15M NaCl、 0.05% Tween20、
0.02% NaN
3、
1% BSA
[0095] その後、 Diluent Bufferで適当に希釈した培養上清を 100 μ L/ゥエルでカ卩え、室温 で 1時間反応させた。 Rinse Bufferで洗浄した後に、 Goat Anti-Human IgM, Alkaline Phosphatase conjugated (BIOSORCE社製）を Diluent Bufferで 4000倍に希釈し、 100 μ L/ゥエルでカ卩え、室温で 1時間反応させた。最後に Rinse Bufferで洗浄した後にァ ルカリフォスファタ一ゼ基質（SIGMA社製）をカ卩え、吸光光度計 Benchmark Plus ( BioRad社製）を用いて、測定波長 405nm、対照波長 655nmの吸光度を測定した。 IgM 濃度は抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体精製品（Hoonら、 Cancer Research 1993； 53： 5244-5250)との比較で算出した。
[0096] 各種抗ガンダリオシド GM3ヒト抗体安定発現細胞株を 75cm2培養フラスコ内で初発 細胞密度 2xl05 cells/mLで培養し、培養上清中の IgM濃度を上記の方法で測定した 。結果を表 4に示す。 IgM産生量は培養 3日目で約 20mg/L、培養 7日目で約 50mg/L であり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は 5— 19pg/cell/dayであった。 IgMは ィムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低ぐ大量 に調製することが困難であるとされていた力 今回の結果より、 CHO細胞において高 い産生量の組換え型 IgM発現細胞が作製できることが明らかになった。
[0097] [表 4]
J鎖発現 細胞株 培養 3日間の 培養 7日間の 産生能
産生量 (mg/L) 産生量 (mg/L) (pg/cel l/day)
CA02 24.1 36.9 14.1
CA15 11.8 39.7 4.9 無し
CA19 27.1 62.3 13.1
CA20 20.2 35.4 10.5
CA24 25.0 41.5 10.7
CJ15 29.4 N. T. 19.4
CJ25 24.4 N. T. 18.1 有り
CJ38 14.9 N. T. 12.4
CJ45 26.4 N. T. 18.7
CJ67 18.0 N. T. 12.8
N T : Not Tested
[0098] [参考例 2] 会合体の測定 (1)
以下の緩衝液を移動相として用いて、 MABON- 01のゲル濾過クロマトグラフィー分析 を行った。何れの分析でもカラムは TSKgel G4000SW を用い、流速は 0.3 mL/min
XL
検出は 280 における吸光度、試料注入量は 10 μ gとした。
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.21.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.52.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH6.83.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.14.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.45.
1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH6.56.
1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM KC1, pH7.47.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH6.58.
1. 50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH7.49.
1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH6.510
1. 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH7.411
[0099] 得られたクロマトグラムの会合体ピーク面積値と単量体ピーク面積値 (ピークの帰属 は別途行った)を表 5に示す。 [0100] [表 5]
KC I NaC l
500 mM 300 mM 500 mM 300 mM
3073386 ― 全ピーク面積値 pH6. 2
146342 2927044 ― ― ― ― 会合体 単量体
3096904 2959509 3044989 2818198
PH6. 5
155304 2941600 124880 2834629 127467 2917522 82928 2735270
3074760 ― 一 ―
pH6. 8
153682 2921078 ― 一 ― ― ― ―
3033846 ― 一 一 pH7. 1
154085 2879761 一 一 一 一 一 一
3074597 3098757 3130093 2948932 pH7. 4
163747 2910850 157320 2941437 144630 2985463 1 12427 2836505 各セルの上段に全ピーク面積値、下段左に会合体面積値、下段右に単量体面積値 を示した。
[0101] また、全ピーク面積値に対する会合体ピーク面積比率ならびに単量体ピーク面積 比率を算出した結果を表 6に示す。
[0102] [表 6]
Figure imgf000030_0001
各セルの左に会合体ピーク面積比率、単量体ピーク面積比率を示した。
[0103] これらの結果から、全ピーク面積値ならびに会合体ピーク面積比率、何れに関して も、 PH6.2-7.1の移動相緩衝液を用いた分析に比べて pH7.4の移動相緩衝液を用い た時に塩種ならびに塩濃度の影響が抑えられ、また KC1、 NaCl何れの塩を含む移動 相緩衝液でも塩濃度が 300 mMの移動相緩衝液に比べて 500 mMの時に pHの影響 が抑えられ、更に NaClを含む移動相緩衝液に比べて KC1を含む移動相緩衝液を用 V、た時に塩濃度もしくは移動相 pHの影響が抑えられることがわ力つた。以上から、 MABON- 01のゲル濾過クロマトグラフィー分析の移動相条件を、 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.4と設定した。
[0104] [参考例 3] 会合体の測定 (2)
MABON- 01の GPC- MALLS分析を行い、各ピークの分子量を測定した。移動相は 50 mM sodium phosphate, 500 mM KC1, pH7.4の緩衝液を、カラムは TSKgel G4000SW を用いた。流速は 0.3 mL/min、検出は 280nmにおける吸光度、試料注入量は 113
XL
μ gとした。得られた結果力も Debye法によって分子量を算出した。
[0105] 得られたクロマトグラムおよび算出された分子量を重ねて図 6に示す。また、図中ピ ーク 1ならびにピーク 2の平均分子量と、 MABON- 01のアミノ酸配列から算出した理 論分子量を表 7に示す。
[0106] [表 7] 平均分子量 理論分子量
M. W. [kDa] M. W. [kDa]
ピ-ーク 1 1， 109 単里体 1 , 034
ピ—ク 2 2, 193 ―里体 2, 068
[0107] 尚、ピーク 2は 21.5-22.0分、ピーク 1は 24.5-25.0分の分子量を平均し、平均分子量 とした。ピーク 1ならびにピーク 2の平均分子量がそれぞれ単量体ならびに二量体の 理論分子量に近いこと、またピーク 2の平均分子量がピーク 1の平均分子量の約 2倍 であることから、ピーク 1には MABON- 01単量体力 ピーク 2には二量体が含まれるこ とがわかった。
産業上の利用の可能性
[0108] 本発明により、高濃度の IgMを溶液中にて安定ィ匕することが可能となった。本発明 によれば、 IgMを有効成分とする医薬製剤を長期間安定に保存することが可能である ため、本発明は特に抗体製剤の調製に大きく貢献しうるものである。

Claims

請求の範囲
[I] 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液であって、免疫グロブリンが IgMである 溶液。
[2] IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 1に記載の溶液。
[3] 水性溶液である、請求項 1に記載の溶液。
[4] 医薬品製剤である、請求項 1に記載の溶液。
[5] 多価カチオン性イオンを含有する、請求項 1に記載の溶液。
[6] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有する、請求項 5に記載の溶液
[7] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 5に記載の溶液。
[8] さらに糖類を含有する、請求項 5に記載の溶液。
[9] pHが 5— 8である、請求項 1に記載の溶液。
[10] IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 1に記載の溶液
[II] IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 1に記載の溶液。
[12] 請求項 1から 11に記載の溶液を凍結又は凍結乾燥して得られる医薬品製剤。
[13] 高濃度の免疫グロブリンを含有する溶液を安定化する方法であって、免疫グロブリン 力 ¾Mであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
[14] 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 13に記載の方法。
[15] 溶液が水性溶液である、請求項 13に記載の方法。
[16] 溶液が医薬品製剤である、請求項 13に記載の方法。
[17] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチ オン性イオンを添加する、請求項 13に記載の方法。
[18] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 13に記載の方法。
[19] さらに糖類を添加する、請求項 13に記載の方法。
[20] 溶液の pHが 5— 8である、請求項 13に記載の方法。
[21] 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 13に記 載の方法。
[22] 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 13に記載の方法。
[23] (a)請求項 13から 22のいずれかの方法を実施する工程、
(b)工程 (a)により安定化された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品 製剤の安定化方法。
[24] 高濃度の免疫グロブリンが安定ィ匕された溶液を製造する方法であって、免疫グロプリ ンが IgMであり、溶液に多価カチオン性イオンを添加する方法。
[25] 溶液が IgMを lmg/mLより高濃度で含有する、請求項 24に記載の方法。
[26] 溶液が水性溶液である、請求項 24に記載の方法。
[27] 溶液が医薬品製剤である、請求項 24に記載の方法。
[28] 多価カチオン性イオンを ImM— lOOOmMの濃度で含有するように、溶液に多価カチ オン性イオンを添加する、請求項 24に記載の方法。
[29] 多価カチオン性イオン力 Mgイオン又は Argイオンである、請求項 24に記載の方法。
[30] さらに糖類を添加する、請求項 24に記載の方法。
[31] 溶液の pHが 5— 8である、請求項 24に記載の方法。
[32] 溶液が、 IgM以外のヒト由来の他のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 24に記 載の方法。
[33] 溶液が、 IgM以外のタンパク質を本質的に含有しない、請求項 24に記載の方法。
[34] 請求項 24から 33の 、ずれかの方法により製造された溶液。
[35] (a)請求項 24から 33の 、ずれかの方法を実施する工程、
(b)工程 (a)により製造された溶液を凍結又は凍結乾燥する工程を含む、医薬品製 剤の製造方法。
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