CN1500873A - 沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种沙蚕蛋白酶,同时提供了其分离提取纯化方法,此酶的英文名称:N-V proteinase:在Swissprot中的登录名为N-V proteinase,登录号为P83433。其分子量在27000-35000之间,等电点在5-7.5之间,最适温度为45℃,最适pH为7.8。该酶分子内部10个肽段的氨基酸残基的序列,其特征是(1)AVYLAGMK(2)NFPNYYINLY(3)VYLAANPTASS(4)QTFNSDTL(5)VYILDTGI沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶,在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白,可做为溶栓药物和抗凝血药物,预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。
Description
技术领域:
本发明涉及一种溶血栓纤溶酶,特别是提供了一种沙蚕蛋白酶及其分离提取纯化方法和应用,涉及纤溶酶的分离提取纯化方法的生物化学技术领域。
背景技术:
血栓栓塞性是临床最常见的也是最严重的一种血液循环障碍疾病。治疗上述疾病,特别是在发病初期使用溶栓剂,降低纤维蛋白及纤维蛋白原含量、减少血小板凝集、溶解血栓、恢复血管再通,是最重要的治疗方法,能降低死亡率、减少后遗症。目前,国内外在临床上多用尿激酶和克栓酶、蛇毒降纤酶等溶栓性药物。这些药物价格都很昂贵,也有不同优缺点,如选择性差,半寿期长,抗原性强,毒性大,易引起继发出血性疾病。因此、发现研制新型溶栓类药物仍是制药工业非常有重要意义的科研项目,具有极大社会效益和经济效益。
发明内容:
本发明提供一种沙蚕蛋白酶,同时提供了该酶的分离提取纯化方法和应用,克服了常规溶栓剂药物价格昂贵,选择性差、半寿期短、抗原性强等缺点,并可以实现工业化生产。
沙蚕蛋白酶,英文名称:N-V proteinase(下文减称:N-V蛋白酶):此酶在Swiss prot中的登录名为N-V proteinase,登录号为P83433。其分子量在27000-35000之间,等电点在5-7.5之间,最适温度为45℃,最适pH为8-9。
该酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列,其特征是
(1)AVYLAGMK
(2)NFPNYYINLY
(3)VYLAANPTASS
(4)QTFNSDTL
(5)VYILDTGI
沙蚕蛋白酶是一种蛋白水解酶,在体内体外都能强烈地水解纤维蛋白原和纤维蛋白,可做为溶栓药物和抗凝血药物,预防和治疗心肌梗塞、脑动脉血栓形成等疾病的应用。
沙蚕蛋白酶系直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶,是从环节动物门Phylum Annelida毛虫钢Class Chaetopoda,多毛目polychaeta,沙蚕科Nereidae,分离纯化获得。
本发明提供五种沙蚕蛋白酶的分离提纯方法:
(一)纯化工艺1,包括以下步骤:
1)取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;
2)取N-V蛋白酶粗提液,置冰浴中冷却至0-10℃,在搅拌条件下,加入-20~0℃预冷的无水乙醇,使乙醇的浓度达5~15%,保持在冰浴中使其产生沉淀;-10~10℃,3000~9000转/分离心15~60分钟,弃沉淀;上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇,终浓度为25-45%,同样在冰浴中使其充分沉淀;-10~0℃,3000~9000转/分离心15~60分钟,弃上清液,沉淀尽可能抽干。保存方法,将沉淀溶于适量pH4.0~9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中,分装,-20℃保存,或将沉淀冷冻干燥,-20℃保存,取保存液用pH4.0~9.0,0.01~0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍,在截留值100000~10000之间超滤,获得超滤液;
3)分别用含5-10%乙醇的pH6.5-8.0、0.02~0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl,KCl等中性盐浓度从0~0.5mol/L),收集活性峰并冻干;
4)分别用含10-15%乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上样,采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl,KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L),收集活性峰并冻干,鉴定活性和纯度,进行蛋白定量,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(二)纯化工艺2,包括以下步骤:
1)超滤分离和浓缩:取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
2)CM-52纤维素柱层析:分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质;平衡液浓缩上柱,采用常液洗脱法洗脱;用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
3)QAE Sephadex A50柱层析:用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质;将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脱法洗脱,收集活性峰,分别测定A260和A280值,用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,PAGE鉴定纯度;
4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析:将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡;用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质;平衡液浓缩上样,采用线性梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5~0.05mol/L);收集活性峰,分别测定A260和A280值,用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(三)纯化工艺3,包括以下步骤:
1)超滤分离和浓缩:取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
2)采用pH 7.0-8.0,0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液,以常液洗脱方法,进行DEAE Sepharose Fast Flow层析,收集活性峰并超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH5.5-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液,NaCl浓度为0-0.5mol/L)组合,进行CMSepharose Fast Flow层析,超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
(四)纯化工艺4,包括以下步骤:
1)取沙蚕洗净后绞碎,加入1~5倍体积的pH6.0~8.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆;离心,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液经15-60%(NH4)2SO4盐析沉淀;
2)重新溶解沉淀,经Sephacryl S-100层析柱层析分离,收集活性峰;活性峰冻干浓缩;
3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析:用pH6.0~8.0,0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质;平衡液上样,采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L),收集活性峰,超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度。
(五)制备性分离提取纯化方法,包括以下步骤:
用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质,制成介质悬液;将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中,与凝胶颗粒悬液混合,于摇床中作用过夜后装柱;用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体;用乙醇胺过夜处理凝胶,以封闭残余活性基团;用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱,用上样缓冲液洗脱亲和介质;收集洗脱液进行蛋白定量,计算偶联率;将制备好的亲和介质装柱,以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品,以阶段洗脱方法,收集活性峰并冻干。
本发明沙蚕蛋白酶在用于制备血栓性疾病的预防和治疗药物。
本发明的药物组合物优选重量比为0.1%~99.5%活性成分。
本发明药物优选含有1%~99%的沙蚕蛋白酶和99%~1%的赋形剂。
本发明药物优选含有10%~90%的沙蚕蛋白酶和90%~10%的药用赋形剂。
本发明药物优选含有30%~80%的沙蚕蛋白酶和70%~20%的药用赋形剂。
本发明药物最好含有60%~70%的沙蚕蛋白酶和40%~30%的赋形剂。
本发明的药物含有治疗有效量的提取物为活性成分,以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
本发明可以组合物的形式通过静脉、肌肉注射、口服、直肠等给药方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种剂型如:注射剂、片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂、口服液体剂型。也可使其活性成分与一种或多种载体或药物混合,制成所需剂型。
上文的载体是指药学领域常规的药物载体,包括如:防腐剂、色素、稀释剂、赋形剂,填充剂,粘合剂,矫味剂,湿润剂,崩解剂,吸收促进剂,表面活性剂,吸附载体。
沙蚕蛋白酶的药物作用:
药效学实验:
1.体内血栓形成时间实验:
根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编,溶血栓药体内血栓溶解实验——颈动脉血栓形成法,以尿激酶为阳性对照药,以生理盐水为阴性对照,静脉给药后,用电刺激损伤大鼠颈动脉以形成血栓,观察血栓形成时间,同时测定凝血时间。
N-V蛋白酶的体内血栓实验研究表明:N-V蛋白酶和尿激酶在同等剂量的前提下,N-V蛋白酶的体内血栓形成时间长于尿激酶。
2.体外血栓形成
●体外血栓形成实验:根据国家新药(西药)临床前研究指导原则汇编,以尿激酶为阳性对照药,以生理盐水为阴性对照,大鼠静脉给药后,腹腔主动脉取血,置于体外血栓形成仪中旋转,测定血栓长度、湿重、干重。结果表明:N-V蛋白酶的体内抗血栓形成效果优于尿激酶。
3.凝血相关生化检验
参考N-V蛋白酶半数致死量,选择大、中、小三个剂量组静脉给药,时间、方法同步骤2。
●纤维蛋白原mg/dL对照组266,小剂量207,中剂量142,大剂量132,尿激酶153,差异显著;
●PT 对照组19.6,小剂量19.2,中剂量18.1,大剂量20.1,尿激酶19.3,差异不显著;
●APTT 对照组20.7,小剂量16.8,中剂量16.8,大剂量19.0,尿激酶19.9,差异不显著;
4.凝血时间实验:小鼠尾静脉注射N-V蛋白酶后摘出眼球,取血。
●玻片法 单位秒:对照组131,小剂量194,中剂量233,大剂量183秒;
●毛细管法单位秒:对照组124,小剂量180,中剂量329,大剂量211秒;
5.体内溶血实验:
●大鼠法:体内注射小、中、大三个剂量的N-V蛋白酶,不同时间后取腹主动脉血,柠檬酸钠抗凝,在试管中,离心3000转/秒,5分钟,血液分上下两层,上为清亮血浆,无溶血;
●家兔法:无溶血
制剂的热源实验
用鲎试剂检测无热源。
定性鉴定实验
N-V蛋白酶为抗原免疫家兔,分离抗血清。在琼脂板上做抗原抗体反应。N-V蛋白酶产生免疫沉淀线,其他蛋白质均无反应。
N-V蛋白酶的体外活性测定方法——纤维蛋白平板
1.材料
人血纤维蛋白原 (中国生物制品检定所)
人血凝血酶 (中国生物制品检定所)
人尿激酶 (中国生物制品检定所)
其它药品均为国产分析纯
2.方法:
(1)制备0.5%的纤维蛋白原溶液:100mg纤维蛋白原粉末溶于0.1MpH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
(2)制备20U/ml的凝血酶溶液:按标定单位,将凝血酶溶于0.1MpH7.4Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
(3)制备纤维蛋白平板:在用水平仪校正过的平面上放置直径9cm的平皿,加入9ml的0.5%的纤维蛋白原溶液和1.0ml 20u/ml的凝血酶溶液,混匀后静置15分钟。
(4)测定活性:取阴性对照药(生理盐水)、阳性对照药(尿激酶)和N-V蛋白酶各10ul,在纤维蛋白平板上点样,37℃下放置15分钟。
用卡尺测量溶斑的长短径,计算溶斑面积。
结果:
根据溶斑面积的大小,判断N-V蛋白酶活性的高低。溶斑面积越大,N-V蛋白酶的活性越高。
N-V蛋白酶的蛋白定量方法
1.方法:
(1)标准试剂的配制:
精称100mg的考马斯亮蓝G-250,溶于95%的乙醇中,再与100mlw/v的磷酸混合,0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液定容于1000ml的容量瓶中。
(2)分析方法:
常规分析法:取5ml标准试剂,加入0.1ml 0.01M pH7.0的磷酸盐缓冲液溶解的蛋白样品液中,充分混合,放置5分钟后,在595nm处测定吸光度。
微量分析法:取0.2ml标准试剂,加入0.8ml 0.01M pH7.0的磷酸盐溶解的蛋白样品液中,充分混合,放置5分钟后,在595nm处测定吸光度。
(3)备注:
常规分析法的蛋白含量线性范围:0.2~1.4mg/ml
微量分析法的蛋白含量线性范围:5~100ug/ml
(4)标准定量曲线
在常规分析法和微量分析法蛋白含量线性范围内均匀取浓度点,以蛋白浓度为横坐标、595nm处的吸光度为纵坐标,分别绘制常规和微量标准定量曲线,并做直线相关检验。
2结果:
在规定蛋白浓度范围内蛋白浓度与A595呈直线正相关(P<0.001)。
N-V蛋白酶温度影响实验
1.将2mgN-V蛋白酶电泳纯纯品溶解于1ml生理盐水。
2.分别放置在20、30、37、45、50、60、70℃水浴箱中保温1小时。
3.纤维蛋白平板测定活性(37℃,15分钟)。
激酶活性分析与纤溶酶原激活分析
(一)激酶活性分析
1.以10000截留值的超滤离心管,用10mM Tris pH7.4,150mM NaCl,10mM MgCl2缓冲液充分洗涤N-V蛋白酶的电泳纯纯品,洗涤三次。
2.吸取上清,在37℃条件下,加入ATP、[32P]ATP、以及偶氮酪蛋白、纤维蛋白原等底物,共同孵育15分钟。
3.加入SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上样液,煮沸终止反应,离心取上清。
4.进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以0.25%Coomassie blue(45%甲醇,10%乙酸配制)固定,于X光片曝光,检查磷酸化的底物带。结果表明,N-V蛋白酶无激酶活性。
纤溶酶原激活分析方法
1.以生理盐水配制纤溶酶原溶液、以pH7.4,0.1mol/L的磷酸盐缓冲液配制N-V蛋白酶溶液。以5μl、1U/mL纤溶酶原溶液与5μlN-V蛋白酶溶液(①液),以5μl生理盐水与5μl N-V蛋白酶溶液(②液),以5μl、10U/mL纤溶酶原溶液与5μl N-V蛋白酶溶液(③液),分别混合配制,并分为三份。
2.所有配液同(二)、1,但是在①液与③液加入ATP溶液,②液中不加。分别混合配制,并分为三份。
3.将上述两种方法制备的各三份配液,第一份在混合后直接在纤维蛋白平板上点样,第二份混合后于37℃下放置10分钟,在纤维蛋白平板上点样,第三份混合后于37℃下放置20分钟在纤维蛋白平板上点样。点样完成后,于37℃下放置15分钟,后测定活性。结果显示:
N-V蛋白酶无纤溶酶原激活作用。
N-V蛋白酶血块溶解实验
a)取Wister大鼠,麻醉后腹主动脉取血,放置于平皿,室温形成血栓,切割并称量血块,装入试管中。
b)将尿激酶和N-V蛋白酶加入血块试管中,37℃恒温,于不同时间观测溶解情况。结果表明:10小时内完全溶解,而磷酸盐缓冲液对照组无溶解。
具体实施方式:
实施例1
取200g沙蚕,洗净后绞碎,加入4.5倍体积的pH7.0,0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4,缓冲液制成匀浆;4℃,9000转/分离心30分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷却至0℃,在搅拌条件下,加入-20℃预冷的无水乙醇,使乙醇的浓度达5%,保持在冰浴中使其产生沉淀;-10℃,9000转/分离心30分钟,弃沉淀;上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇,终浓度为30%,同样在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,9000转/分离心30分钟,弃上清液,沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8,0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液中,分装。用前以pH8.0,0.02mol/L Tris-HCl缓冲液稀释5倍,在截留值100000-10000之间超滤,获得超滤液。分别用含5%乙醇的pH8.0、0.02mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L),收集活性峰并冻干,以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。分别用含15%乙醇的pH4.0、0.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L),以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.23‰。
实施例2
取200g沙蚕,洗净后绞碎,加入8倍体积的pH8.0,0.08mol/LTris缓冲液制成匀浆;4℃,6000转/分离心60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷却至0℃,在搅拌条件下,加入-20℃预冷的无水乙醇,使乙醇的浓度达10%,保持在冰浴中使其产生沉淀;-10℃,6000转/分离心60分钟,弃沉淀;上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇,终浓度为25%,同样在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,8000转/分离心30分钟,弃上清液,沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8,0.01mol/L HAC-NaAC缓冲液中,分装。用前以pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液稀释5倍,在截留值100000-10000之间超滤,获得超滤液。分别用含5%乙醇的pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L),收集活性峰并冻干,以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。分别用含25%乙醇的pH6.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L),以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.21‰。
实施例3
取200g沙蚕,洗净后绞碎,加入8倍体积的pH5.0,0.04mol/LHAC-NaAC,缓冲液制成匀浆;4℃,4000转/分离心60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。取N-V蛋白酶粗提液1000ml,置冰浴中冷却至0℃,在搅拌条件下,加入-20℃预冷的无水乙醇,使乙醇的浓度达10%,保持在冰浴中使其产生沉淀;-10℃,4000转/分离心60分钟,弃沉淀;上清液边搅拌边加入-20℃预冷的无水乙醇,终浓度为25%,同样在冰浴中使其充分沉淀;-10℃,6000转/分离心45分钟,弃上清液,沉淀尽可能抽干。将沉淀溶于适量pH5.8,0.01mol/LHAC-NaAC缓冲液中,分装。用前以pH7.8,0.04mol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液稀释5倍,在截留值100000-10000之间超滤,获得超滤液。分别用含20%乙醇的pH6.0,0.03mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0-0.5mol/L),收集活性峰并冻干,以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。分别用含25%乙醇的pH 4.0、0.02mol/L柠檬酸盐缓冲液充分平衡经上一步DEAE Sepharose Fast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(KCl浓度从0-0.5mol/L),以纤维蛋白平板法鉴定活性和以聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯度,进行蛋白定量。获得N-V蛋白酶产率为0.26‰。
实施例4
取沙蚕300g,洗净后绞碎,加入2倍体积的pH7.0,0.025mol/L磷酸盐缓冲液制成匀浆;4℃,9000转/分离心15分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液。分别用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱,采用常液洗脱法洗脱,超滤浓缩。用pH4.6 0.01mol/L柠檬酸-柠檬酸钠+0.01mol/L NaCl缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脱法洗脱,收集活性峰,超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.0 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5~0.05mol/L),收集活性峰,分别测定A260和A280值,超滤浓缩,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.3‰。
实施例5
取沙蚕300g,洗净后绞碎,加入5倍体积的pH5.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆;4℃,6000转/分离心30分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液。分别用pH5.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱,采用常液洗脱法洗脱,超滤浓缩。用pH5.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脱法洗脱,收集活性峰,超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/LNaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.025mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+1mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1~0.05mol/L),收集活性峰,分别测定A260和A280值,超滤浓缩,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.35%。
实施例6
取沙蚕300g,洗净后绞碎,加入10倍体积的pH6.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液制成匀浆;4℃,4000转/分离心60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液。分别用pH6.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质。平衡液浓缩上柱,采用常液洗脱法洗脱,超滤浓缩。用pH6.0,0.02mol/L乙酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质。将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脱法洗脱,收集活性峰,超滤浓缩。将活性峰浓缩液用pH7.5 0.01mol/L Na2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡。用pH7.5 0.01mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+0.5mol/L NaCl缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质。平衡液浓缩上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从0.5~0.05mol/L),收集活性峰,分别测定A260和A280值,超滤浓缩,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.33‰。
实施例7
1)抗原的获得:采用制备型电泳获得目标蛋白—沙蚕蛋白酶。连续***聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶浓度为10%。电泳结束后剥胶,切下一窄条胶块,放入染色液中染色10分钟,即可观察到活性带;剩余的凝胶块用保鲜膜包好,保存在4℃条件下。将染色的胶块与未染色的胶块在玻璃板上对齐,切下未染色的大胶块上与活性蛋白带相对应的胶条,切下的胶条封入透析袋中,内装少量缓冲液A,放入水平电泳槽电泳,80mA,电泳4小时。收集袋内液体,用蒸馏水透析除盐,离心,过微孔滤膜除菌,然后冻干,即获得电泳纯抗原。
2)免疫动物
2.1)卡介苗致敏:给每只家兔两后足皮内注射活卡介苗,每只1mg。
2.2)基础免疫:两星期后进行基础免疫。在高压灭菌的研钵中加入弗氏不完全佐剂,再滴加灭活的卡介苗,边滴加边研磨,制成弗氏完全佐剂(2mg卡介苗/ml弗氏完全佐剂);将冻干的抗原溶于适量的高压灭菌的缓冲液A中,滴加入完全佐剂中,边滴加边研磨,再加入青霉素钠溶液、硫酸链霉素溶液少许,研磨均匀,制成油包水乳剂,抗原浓度为100μg/ml乳剂。给每只兔子背部皮下多点注射,每只2ml。
2.3)加强免疫:每3周加强免疫一次,方法基本与基础免疫相同,不同的是用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂,加强注射的剂量可适当降低。每次加强免疫后7~10天,耳缘静脉取血,用双向琼脂扩散试验[31]测定抗血清效价,当效价≥8时,从耳缘静脉放血20~30ml/只。放血后继续饲养,继续免疫。效价稳定后,可每间隔1周从耳缘静脉放血20~30ml/只,直至血清效价下降,最后从兔主动脉取全血。
2.4)在用电泳纯溶栓素免疫四只兔子的同时,用沙蚕匀浆上清液免疫另外两只兔子,作为对照。
2.5)取抗血清
每次获得的血样收集于灭菌的离心管中(不加抗凝剂),于室温放置使之凝固。用一玻棒沿管壁旋松凝块,再室温放置数小时,使抗血清完全析出;5000转/分离心15分钟,上清即为抗血清。分装,-20℃贮存。
3)IgG的提纯
3.1)取适量抗血清冻融,加入等体积的预冷的缓冲液B混匀。冰浴条件下滴加饱和(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,使溶液的(NH4)2SO4饱和度达到50%,4℃静置2小时,4000转/分离心20分钟,弃上清。
3.2)沉淀用同体积的缓冲液B溶解,冰浴条件下逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液,边加边搅拌,使溶液的(NH4)2SO4饱和度达33%,4℃静置2小时,4000转/分离心20分钟,弃上清;重复4.2操作两次。
3.3)将沉淀溶于少量缓冲液B中,装入透析袋,4℃对缓冲液C透析除盐平衡,离心,上清为较纯的IgG溶液。
3.4)上步得到较纯的IgG过DEAE Sepharose Fast Flow柱层析,平衡缓冲液是缓冲液C,洗脱液是缓冲液D,常液洗脱,收集第一峰,用PEG20000浓缩。杂蛋白用缓冲液E洗脱。提纯的IgG用SDS-PAGE鉴定。
4)亲和层析介质的制备与亲和层析:用Epoxy-activated Sepharose6B为介质,制成介质悬液;将纯化的兔抗溶栓素抗体溶解于偶联缓冲液中,与凝胶颗粒悬液混合,于37℃摇床中作用16小时后装柱;用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体;用1M乙醇胺,37℃过夜处理凝胶,以封闭残余活性基团;用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱,用上样缓冲液洗脱亲和介质;收集洗脱液进行蛋白定量,计算偶联率。将制备好的亲和介质装柱,以溶栓素超滤液为上样样品,以阶段洗脱方法,收集活性峰并冻干。
实施例8
取沙蚕300g,洗净后绞碎,加入2倍体积的pH8.0,0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆;4℃,6000转/分离心30分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液。以pH8.0,0.03mol/L Tris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质,并进行常液洗脱,收集活性峰并超滤浓缩。以乙酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质,以0.02mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱,以pH6.5 0.02mol/L乙酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱,超滤浓缩。采用pH7.0,0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-50层析,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.32‰。
实施例9
取沙蚕300g,洗净后绞碎,加入2倍体积的含10%乙醇的pH8.0,0.03mol/L Tris缓冲液制成匀浆;4℃,6000转/分离心60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液。N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液。以pH7.5,0.025mol/LTris缓冲液充分平衡浓缩液和DEAE Sepharose Fast Flow层析介质,并进行常液洗脱,收集活性峰并超滤浓缩。以柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM Sepharose Fast Flow层析介质,以0.04mol/L乙酸盐缓冲液(pH4.5-pH6.5)进行pH梯度洗脱,以pH6.5 0.04mol/L柠檬酸盐缓冲液(NaCl 0-0.5mol/L)进行盐梯度洗脱,超滤浓缩。采用pH7.0,0.04mol/L磷酸盐缓冲液进行Sephadex G-75层析,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度。获得N-V蛋白酶产率为0.39‰。
实施例10
1)取500g沙蚕,洗净后绞碎,加入4.5倍体积的pH7.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆;4℃,9000转/分离心30分钟,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液经15-60%(NH4)2SO4盐析沉淀;
2)重新溶解沉淀,经Sephacryl S-100层析柱层析分离,收集活性峰;活性峰冻干浓缩;
3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析:用pH7.0、0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质;平衡液上样,采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L),收集活性峰,超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度。
实施例11
N-V蛋白酶制剂工艺
制剂种类和每瓶装量:冻干制剂,N-V蛋白酶1-3mg/瓶;
赋型剂种类和用量:甘露醇10-40mg,右旋糖苷10-40mg,L赖氨酸5-15mg,人血白蛋白2-10mg,各组成成分以上述用量任意配比,以单方或复方形式,冻干赋型。
冻干操作:一级冻干:-30~-20℃冻干16-48小时;二级冻干:0-10℃冻干16-24小时。
Claims (10)
1、一种沙蚕蛋白酶,直接水解于纤维蛋白、不具有激酶性质的蛋白水解酶,其分子量在27000-35000之间,等电点在5-7.5之间,最适温度为40-50℃,最适pH为8-9,N-V蛋白酶最适pH8-9,pH4-12均有活性,加热70℃10分钟,活性丧失,酶分子内部5个肽段的氨基酸残基的序列如下:
(1)AVYLAGMK
(2)NFPNYYINLY
(3)VYLAANPTASS
(4)QTFNSDTL
(5)VYILDTGI
2、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法,包括以下步骤:
1)取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;
2)取N-V蛋白酶粗提液,置冰浴中冷却至0-10℃,在搅拌条件下,加入-70-0℃预冷的无水乙醇,使乙醇的浓度达5-15%,保持在冰浴中使其产生沉淀;-10-0℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,弃沉淀;上清液边搅拌边加入预冷的无水乙醇,终浓度为25-45%,同样在冰浴中使其充分沉淀;-10-0℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,弃上清液,沉淀尽可能抽干。保存方法,将沉淀溶于适量pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液中,分装,-20℃保存,或将沉淀冷冻干燥,-20℃保存取保存液用pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液稀释10-50倍,在截留值100000-10000之间超滤,获得超滤液;
3)分别用含5-10%乙醇的pH6.5-8.0、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡N-V蛋白酶超滤液和DEAESepharose Fast Flow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl,KCl等中性盐浓度从0~0.5mol/L),收集活性峰并冻干;
4)分别用含10-15%乙醇的pH4.0-6.5、0.02-0.1mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液充分平衡经上一步DEAE SepharoseFast Flow层析柱纯化获得的冻干活性样品和CM Sepharose FastFlow层析介质。平衡液上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl,KCl等中性盐浓度浓度从0-0.5mol/L),收集活性峰并冻干,鉴定活性和纯度,进行蛋白定量,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
3、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法,包括以下步骤:
1)超滤分离和浓缩:取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
2)CM-52纤维素柱层析:分别用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡浓缩液和CM-52纤维素层析介质;平衡液浓缩上柱,采用常液洗脱法洗脱;用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
3)QAE Sephadex A50柱层析:用pH3-4.6 0.01-0.05mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液充分平衡QAE Sephadex A50层析介质;将浓缩液用这种缓冲液充分透析平衡,平衡液上柱,采用常液洗脱法洗脱,收集活性峰,分别测定A260和A280值,用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,PAGE鉴定纯度;
4)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析:将活性峰浓缩液用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡;用pH5.0-8.0 0.01-0.025mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液充分平衡Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质;平衡液浓缩上柱,采用直线梯度洗脱法洗脱(NaCl浓度从1.5~0.05mol/L);收集活性峰,分别测定A260和A280值,用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
4、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法,包括以下步骤:
1)超滤分离和浓缩:取沙蚕,洗净后绞碎,加入1-10倍体积的pH4.0-9.0,0.01-0.4mol/L磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris等缓冲液制成匀浆;0-10℃,3000-9000转/分离心15-60分钟,取上清液即N-V蛋白酶粗提液;N-V蛋白酶粗提液用300000MW膜超滤,滤出液由10000MW膜截留浓缩,得浓缩液,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度;
2)采用pH7.0-8.0,0.02-0.04mol/L磷酸盐、Tris等缓冲液,以常液洗脱方法,进行DEAE Sepharose Fast Flow层析,收集活性峰并超滤浓缩,分别测定A260和A260值,PAGE鉴定纯度;
3)采用pH梯度洗脱(pH 4.0-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液)与盐梯度洗脱方法(pH 5.5-6.5,0.01-0.02mol/L乙酸盐、柠檬酸盐缓冲液,NaCl浓度从0-0.5mol/L)组合,进行CMSepharose Fast Flow层析,超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度,获得N-V蛋白酶产率为0.2-0.7‰。
5、沙蚕蛋白酶的分离提取纯化方法,包括以下步骤:
1)取沙蚕洗净后绞碎,加入1~5倍体积的pH6.0~8.0,0.1mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液制成匀浆;离心,取上清液即溶栓素粗提液;粗提液经15-60%(NH4)2SO4盐析沉淀;
2)重新溶解沉淀,经Sephacryl S-100层析柱层析分离,收集活性峰;活性峰冻干浓缩;
3)Phenyl-Sepharose CL-4B柱层析:用pH6.0~8.0,0.025mol/LNa2HPO4-NaH2PO4+1mol/L(NH4)2SO4缓冲液充分平衡上述样品、Phenyl-Sepharose CL-4B层析介质;平衡液上样,采用线性梯度洗脱法洗脱((NH4)2SO4浓度从1-0.05mol/L),收集活性峰,超滤浓缩,分别测定A260和A280值,PAGE鉴定纯度。
6、沙蚕蛋白酶的制备性分离提取纯化方法,包括以下步骤:
用Epoxy-activated Sepharose 6B为介质,制成介质悬液;将纯化的兔抗沙蚕蛋白酶抗体溶解于偶联缓冲液中,与凝胶颗粒悬液混合,于摇床中作用过夜后装柱;用偶联缓冲液、蒸馏水等依次冲洗过量的抗体;用乙醇胺过夜处理凝胶,以封闭残余活性基团;用偶联缓冲液彻底冲洗亲和柱,用上样缓冲液洗脱亲和介质;收集洗脱液进行蛋白定量,计算偶联率;将制备好的亲和介质装柱,以沙蚕蛋白酶超滤液为上样样品,以阶段洗脱方法,收集活性峰并冻干。
7、沙蚕蛋白酶在制备血栓性疾病的预防和治疗药物。
8、沙蚕蛋白酶作为治疗有效量的活性成分,以及含有一种或多种药学上可接受的载体。
9、根据权利要求5、6所述的药物组合物,优选重量比为0.1%~99.5%活性成分。
10、根据权利要求5、6所述的药物,其特征在于:所说的药物是任何一种药剂学上所说的剂型。
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