CN102002488B

CN102002488B - 革囊星虫纤溶酶及其制备方法

Info

Publication number: CN102002488B
Application number: CN 201010525002
Authority: CN
Inventors: 廖共山; 雷丹青; 唐景财; 李肖肖
Original assignee: Guangxi Medical University
Current assignee: Guangxi Medical University
Priority date: 2010-10-29
Filing date: 2010-10-29
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2030-10-29
Also published as: CN102002488A

Abstract

一种革囊星虫纤溶酶，从革囊星虫提取，同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其物化性能为：分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，对pH值的稳定范围在5.0～9.0。本发明所提供的革囊星虫纤溶酶，同时具有直接溶解纤维蛋白活性和激酶活性，提取工艺简单，制备成本不高，原料易得，可以开发成静脉注射剂，含有的纤溶酶可直接降解血栓，有望在导管辅助溶栓治疗外周动脉闭塞和深静脉血栓中获得更好的效果。

Description

革囊星虫纤溶酶及其制备方法

技术领域

本发明属生物药物特别是革囊星虫纤溶酶及其制备方法领域。

背景技术

血栓栓塞性疾病是如今严重威胁人类身体健康乃至生命的病症之一，该类疾病与血液凝血因子及凝固的纤维蛋白密切相关。药物溶栓是目前临床应用最为广泛、最有效的治疗手段。现应用于临床的溶栓药物主要有激酶类、降纤类及直接溶纤类等，激酶类以链激酶(Streptokinase SK)和尿激酶(Urokinase UK)为代表，其作用原理是通过激活纤溶酶原、使之转化为纤溶酶，水解血栓中的主要成分纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物，从而溶解血栓；其作用强，但缺乏特异性，在长期形成的血块和收缩性血块、如外周动脉闭塞和深静脉血栓，血块中缺乏纤溶酶原，溶栓效果受到限制，易导致发生出血等严重不良反应。降纤类以蛇毒降纤酶(类凝血酶)为代表，能分解血浆纤维蛋白原，生成非交联可溶性的纤维蛋白达到抗凝作用，但溶栓作用弱；且蛇毒的成分较为复杂，其含有的出血毒素和神经毒素在生产制备过程中有可能不能被完全除去，从而带入产品中成为引起各种毒副作用的主要原因。直接溶纤类以蛇毒纤溶酶、蚓激酶等为代表，蛇毒纤溶酶因具有较强出血毒性作用而未能应用于临床；蚓激酶是具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶，由于酶的活性随蚯蚓的类别和分离工艺的不同而呈现出较大差异，其提取工艺非常繁琐，难以开发成静脉注射剂，目前主要为多种同工酶混合物制成的胶囊制剂，如普恩复、百奥、博洛克、溶栓胶囊等，作用弱、起效慢。

因此寻找一种溶栓作用强、安全性好、疗效好、副作用小的天然来源的溶栓药物具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种对纤维蛋白具有强降解作用的革囊星虫纤溶酶及其制备方法。该纤溶酶可作为溶栓药物和抗凝血药物应用于临床相关疾病的预防和治疗。

本发明以如下技术方案解决上述技术问题：

革囊星虫纤溶酶从新鲜革囊星虫的体液和内脏组织提取，其物化性能为：同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，对pH值的稳定范围在5.0～9.0。

纤维蛋白溶解活性最适温度为40℃，最适pH值为8.0。

革囊星虫纤溶酶的提取步骤为：

第一步，采用生化层析方法提取纯化从革囊星虫获得纤溶酶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定纯度，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量，等电聚焦电泳测定等电点。

第二步，应用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定，测定热稳定性和pH稳定性。

第三步，体外血凝块溶解试验及小鼠皮下出血毒性试验。

革囊星虫纤溶酶的制备工艺为：

a.革囊星虫纤溶酶的分离和提取：

新鲜革囊星虫洗净，取内脏组织，加入预冷的pH6～8缓冲液，高速匀浆，离心，取上清液，选择分子量分离范围在2.7～3.5万的凝胶过滤填料和在pH6～8范围内能吸附革囊星虫纤溶酶的阴离子交换填料进行层析分离，收集具有纤溶酶活性的组分；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度和分子量，等电聚焦电泳测定等电点；

b.用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定：以尿激酶为对照品，纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性与活力；分别将尿激酶(阳性对照品)和纯化的纤溶酶加到加热和不加热纤维蛋白平板中测定纤溶酶活性，在4℃～80℃范围测定温度对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适温度；在pH3～12范围测定pH对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适pH。

c.体外血凝块溶解试验：从兔子颈总动脉取血，体外制备血凝块称重后放入编号的试管中，加入生理盐水和不同活力的纤溶酶溶液(1000U、500U、250U)及1000U尿激酶，置37℃水浴保温24h后取出称重，计算血凝块的溶解率。

小鼠皮下出血毒性试验：在小鼠背部皮下注射革囊星虫纤溶酶0.1ml/点，24小时后剥皮观察皮下是否出现瘀血斑。注射前革囊星虫纤溶酶用生理盐水稀释成500U/ml。

d.结果评定：

本发明提供的革囊星虫纤溶酶，在加热板上和不加热板上都有纤维蛋白溶解圈，不加热板上溶解圈大于加热板，尿激酶仅在不加热板上有纤维蛋白溶解圈；由此证实此蛋白酶同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，此纤溶酶的纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，最适温度为40℃；其对pH值的稳定范围为5.0～9.0，最适pH值为8.0。

本发明所提供的革囊星虫纤溶酶，同时具有直接溶解纤维蛋白活性和激酶活性，提取工艺简单，制备成本不高，原料易得，可以开发成静脉注射剂，含有的纤溶酶可直接降解血栓，有望在导管辅助溶栓治疗外周动脉闭塞和深静脉血栓中获得更好的效果。

附图说明

图1为在不加热板上测定革囊星虫纤溶酶活性的测定图。图中：1、2为尿激酶，3、4为革囊星虫纤溶酶。

图2为在加热板上测定革囊星虫纤溶酶活性的测定图。图中：5、6为尿激酶，7、8为革囊星虫纤溶酶。

具体实施方式

本发明的革囊星虫纤溶酶(拉丁文名称为：phascolosoma fibrinolytic enzyme，PFE)，是以我国有着丰富资源的海洋动物革囊星虫的副产物-革囊星虫体腔液和内脏组织为原料提取，可直接降解血栓，为血栓塞性疾病患者增加了一种有明显效果的治疗新药。

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)，属于星虫动物门(Sipuncula)、革囊星虫纲(Pha-scolosomatidea)、革囊星虫目(Phascoloso-maliformes)、革囊星虫科(Phascolosomati-dae)，俗称海丁、海蚂蝗、泥丁、土笋等，是我国的特有种，主要分布于广东、广西、海南岛、福建、浙江沿海，有些地方的潮间带栖息密度较大。

由革囊星虫提取的革囊星虫纤溶酶的物化性能为：同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，最适温度为40℃；其对pH值的稳定范围在5.0～9.0，最适pH值为8.0。

革囊星虫纤溶酶的制备工艺步骤为：

a.革囊星虫纤溶酶的分离和提取：

新鲜革囊星虫洗净，取体腔液和内脏组织，按提取纤溶酶的常规比例加入预冷的pH6～8缓冲液，高速匀浆，离心，取上清液，选择分子量分离范围在2.7～3.5万的凝胶过滤填料和在pH6～8范围内能吸附革囊星虫纤溶酶的阴离子交换填料进行层析分离，收集具有纤溶酶活性的组分；通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度和分子量，等电聚焦电泳测定等电点。

b.用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定：以尿激酶为对照品，纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性与活力；将尿激酶(阳性对照品)和纯化的纤溶酶分别加到加热和不加热纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性，在4℃～80℃范围测定温度对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适温度；在pH3～12范围测定pH对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适pH值。

d.结果：

本发明提供的革囊星虫纤溶酶，在加热板上和不加热板上都有纤维蛋白溶解圈，不加热板上溶解圈大于加热板，尿激酶仅在不加热板上有纤维蛋白溶解圈。由此证实此蛋白酶同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性。其分子量在27000-35000之间，等电点在4.5-6.6之间；温度、pH值对酶活性的影响：此纤溶酶的纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，最适温度为40℃，而其对pH值的稳定范围确定在5.0～9.0，最适pH值为8.0。革囊星虫纤溶酶能明显溶解体外血凝块，作用强于尿激酶。小鼠皮下出血毒性试验结果：革囊星虫纤溶酶无明显出血毒性。

体外血凝块溶解试验结果如下表：

实施例1：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取体腔液和内脏组织，加入2倍体积的pH8.0，0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液上QAE-Sephadex A-25柱，用pH8.0 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含1.0mol·L^-1NaCl的缓冲液洗脱，收集含纤溶活性组分上Sephacryl S300柱用pH8.00.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液进行洗脱，收集含纤溶活性第二组分上QAE-Sephadex A-25柱，用pH8.00.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第三组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.测定革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为31000，等电点为5.1；

(2)热稳定性和pH稳定性：在30～70℃和pH5.0～9范围内表现出良好的纤溶活性，最适反应温度为40℃，最适反应pH8.0。

实施例2：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取内脏组织，加入2倍体积的pH7.5，0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液上DEAE-Sepharose CL-6B柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含1.0mol·L^-1NaCl的缓冲液洗脱，收集含纤溶活性组分上Sephadex G-100柱用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液进行洗脱，收集含纤溶活性第二组分上DEAE-Sepharose CL-6B柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第三组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为31200，等电点为4.9；

(2)热稳定性和pH稳定性同实施例1。

实施例3：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取体腔液和内脏组织，加入2倍体积的pH8.0，0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液上DEAE-Sepharose F.F.柱，用pH8.0 0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡洗脱，再用含1.0mol·L^-1NaCl的缓冲液洗脱，收集含纤溶活性组分上SephacrylS-100HR柱用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液进行洗脱，收集含纤溶活性第二组分上DEAE-Sepharose CL-6B柱，用pH8.0 0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第三组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为29500，等电点为5.6。

(2)热稳定性和pH稳定性同实施例1。

实施例4：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取体腔液和内脏组织，加入2倍体积的pH7.5，0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液上DEAE Sephadex A-50柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡洗脱，再用含1.0mol·L^-1NaCl的缓冲液洗脱，收集含纤溶活性组分上SephadexG-150柱用pH7.5 0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液进行洗脱，收集含纤溶活性第二组分上DEAE-Sepharose CL-6B柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Tris-HCl缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第三组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为31100，等电点为5.0。

(2)热稳定性和pH稳定性同实施例1。

实施例5：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取体腔液和内脏组织，加入2倍体积的pH7.00.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液加入硫酸铵至70％的饱和度搅拌30min，置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，取沉淀用pH7.0 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，上SephadexG-150柱，用pH7.0 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，收集含纤溶活性第二组分上Q Sepharose H.P.，用pH7.0 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第四组分上QAE-Sephadex A-25柱，用pH7.0 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第二组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为28000，等电点为4.6。

(2)热稳定性和pH稳定性同实施例1。

实施例6：

1.匀浆：取新鲜革囊星虫100克洗净，取体腔液和内脏组织，加入2倍体积的pH6.5，0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆液置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，弃沉淀物，收集上清液。

2.柱层析：取上述上清液加入硫酸铵至70％的饱和度搅拌30min，置冷冻离心机离心20min(4℃，8000rm)，取沉淀用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液，上SephadexG-200柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，收集含纤溶活性第二组分上DEAE-Sephadex A-25，用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第三组分上DEAE-Sephadex A-50柱，用pH7.5 0.02mol·L^-1Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡洗脱，再用含0.05～0.5mol·L^-1NaCl的缓冲液作线性梯度洗脱，收集含纤溶活性第二组分即为革囊星虫纤溶酶。进行酶活性及纯度鉴定，滤菌、冻干保存。

3.革囊星虫纤溶酶理化性质：

(1)分子量和等电点：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳测定，革囊星虫纤溶酶分子量为30500，等电点为5.1。

(2)热稳定性和pH稳定性同实施例1。

Claims

1.一种革囊星虫纤溶酶，其特征是革囊星虫纤溶酶从新鲜革囊星虫的体腔液和内脏组织提取，其物化性能为：同时具有直接溶解纤维蛋白及激酶的双重活性；其分子量在28000-32000之间，等电点在4.6-6.6之间，纤维蛋白溶解活性在30～70℃温度范围下活性变化不大，对pH值的稳定范围在5.0～9.0。

2.如权利要求1所述的革囊星虫纤溶酶，其特征是纤维蛋白溶解活性最适温度为40℃，最适pH值为8.0。

3.如权利要求1所述的革囊星虫纤溶酶的制备方法，其特征是革囊星虫纤溶酶的制备步骤为：

第一步，采用生化层析方法提取纯化从革囊星虫获得纤溶酶，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定纯度，通过SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量，等电聚焦电泳测定等电点；

4.如权利要求3所述的革囊星虫纤溶酶的制备方法，其特征是制备工艺为：

a.革囊星虫纤溶酶的分离和提取：

新鲜革囊星虫洗净，取体腔液和内脏组织，按比例加入预冷的pH6.5～8缓冲液，高速匀浆，离心，取上清液，选择分子量分离范围在2.7～3.5万的凝胶过滤填料和在pH6.5～8范围内能吸附革囊星虫纤溶酶的阴离子交换填料进行层析分离，收集具有纤溶酶活性的组分；通过SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度和分子量，等电聚焦电泳测定等电点；

b.用纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性及其纤溶性质鉴定：以尿激酶为对照品，纤维蛋白平板法测定纤溶酶活性与活力；分别将尿激酶和纯化的纤溶酶加到加热和不加热纤维蛋白平板中测定纤溶酶活性，在4℃～80℃范围测定温度对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适温度；在pH3～12范围测定pH对纤溶酶稳定性和活力的影响以及最适pH。